基因治疗技术综述指南

中央民族大学生命与环境科学学院分子生物学论文

2013年4月27日

姓名：曾宇翔

学号：1044002

专业：10生物技术

指导教师：徐小静

基因治疗技术综述

基因治疗技术综述

曾宇翔

（中央民族大学生命与环境科学学院北京 100081）

摘要：基因治疗是一种新的治疗手段，具有广阔的发展前景。基因治疗有望成为治疗遗传病，癌症，心血管病及其他难治性疾病的有效手段，目前以取得一定进展。本文主要对基因治疗技术的现状、方法、问题和未来发展等几方面进行综述。

关键词：基因治疗；策略；方法；应用。

20世纪是科技空前发展的时代，同样也是“生物大发现”的时代，而21世纪是基因治疗技术发展的时代。自1989年人类史上首次基因治疗方案在北京实施以来，到目前为止，基因治疗技术已经在世界各国广泛开展。基因治疗作为一种安全的、新的疾病治疗手段，在一定程度上取得了重大进展。然而基因治疗啊依然存在诸如缺少高效的传递系统、缺少持续稳定的表达和寄主免疫等一系列问题。但我们相信随着科学家对基因的不断深入研究，基因治疗一定会给人类健康事业做出巨大的贡献。本文从以下几方面将国内外近年基因治疗技术的研究情况做一综述。

1 基因治疗概念

基因治疗是向靶细胞引入正常有功能的基因，以纠正或补偿治病基因锁产生的缺陷，从而达到治疗疾病的目的的生物学高新技术。基因治疗有着狭义和广义的概念，狭义概念指用具有正常功能的基因置换或增补患者体内有缺陷的基因，因而达到治疗疾病的目的；广义概念指把某些遗传物质转移到患者体内，使其在体内表达，最终达到治疗某种疾病的方法。实施基因治疗的所需步骤大致有：(1)目的基因的筛选和植被；（2）基因载体的选择；（3）靶细胞的选择；（4）细胞转染：（5）基因的表达检测。

2 基因治疗的方法

目前基因治疗有二种形式：一是体内疗法，把一个将抗的基因拷贝插入靶细胞以补偿缺陷基因；二是体外疗法，引进经过改造的基因赋予细胞新的特征。这两者都属于体细胞基因治疗，还有一种生殖细胞基因治疗，通过干细胞或者生殖细胞进行介导的治疗手段，由于涉及一系列伦理学问题，目前仍属禁区。

体内疗法将外源基因导入受体体内有关的器官组织和细胞内，以达到治疗疾病的目的。这是一种简便易行的方法，体细胞基因治疗通过载体直接传送，将治疗性转基因制作出来，然后包装入载体中，直接注射到病人体内，到达靶器官。但其缺点是基因转染率较低。

目前研究和应用较多的还是体外疗法，即将有基因缺陷的细胞取出，在体外将外源基因导入到载体细胞，然后将基因转染后的细胞输给受着，使携有外源基因的载体细胞在体内表达治疗产物，以达到治疗目的。

3 基因治疗的策略

3.1基因矫正功能

对于致病基因中的异常碱基进行精确恢复，而正常部分予以保留，使细胞恢复正常。这种方式在操作中要求高，实践中有一定难度。

3.2基因置换

指用正常基因通过同源重组技术，原位替换致病基因，使细胞内的DNA 完全恢复正常状态。这是最理想的基因治疗策略，尚处于基础研究阶段，未能从理论和技术上得到突破。

3.3基因增补

不删除突变的致病基因，而在基因组内额外插入正常基因，致病基因仍在其中，正常基因在体内表达出功能正常的蛋白，达到治疗疾病的目的，是目前主要使用的基因治疗策略。

3.4基因失活

向患者体内导入有抑制基因表用的反义RNA、核酸，干扰RNA等，通过这类物质抑制或降解相应的mRNA，在转录和翻译水平阻断某些基因的异常表达，而实现治疗的目的。

3.5自杀基因

在某些病毒或细菌中的某基因可产生一种酶，它可将原无细胞毒或低毒药物前体转化为细胞毒物质，将细胞本身杀死，此种基因称为“自杀基因”。

3.6免疫治疗

将某种抗体、抗原或者细胞因子的基因导入病人体内，从而改变病人的免疫状态，达到预防和治疗疾病的目的。比如将白细胞介素-2导入肿瘤病人体内，提高病人IL-2的水平，激活体内免疫系统的抗肿瘤活性，达到防治肿瘤复发的目的。

3.7耐药治疗

耐药基因治疗是在肿瘤治疗时，为提高机体耐受化疗药物的能力，把产生抗药物毒性的基因导入人体细胞，以使机体耐受更大剂量的化疗。

4 基因治疗载体

有效的基因治疗依赖于外源基因在受体中高效、稳定的表达，而这很大程度上取决于所用的载体系统。目前外源基因的转移方法主要有病毒法和非病毒法：

4.1病毒载体

病毒具有一些独特的性质如多数病毒可感染特异的细胞，在细胞内不易降解；RNA病毒能整合到染色体上等。因此病毒载体是良好的基因运转载体，现在绝大多数基因治疗临床项目采用病毒载体。

4.1.1RAN病毒载体

最常见的RNA病毒载体来源于逆转录病毒，逆转录病毒属于正练RNA病毒，可高效地感染许多类型的宿主细胞，它虽然是RNA病毒名单是有逆转录酶，可使RNA转录为DNA，在整合到宿主细胞。逆转录病毒是最先且最广泛的基因治疗载体，逆转录病毒表面的糖蛋白能被很多哺乳动物细胞膜上的特异性受体所识别，因而可以高效地将基因转移到感染细胞。它能感染光谱动物物种而无严格的组织特异性。被转移的外来基因能整合到感染细胞中而不丢失。

慢病毒载体是以HIV-1为基础发展起来的基因治疗载体。区别一般的逆转录病毒载体，他对分裂细胞和非分裂细胞都具有感染能力，它能再不存在细胞因子的情况下转换造血前体细胞。目前以在动物模型上取得了较好的结果。此外，慢病毒载体治疗神经疾病具有较大的应用前景。

4.1.2腺病毒载体

腺病毒是线性双链DNA病毒，在自然界中分布广泛。DNA每条链上都有重叠的转录单位。病毒基因组通过核孔进行转运，使初始转录的启动更容易。腺病毒载体具有容量大，可感染分裂和不分裂细胞，感染效率高，无插入致变性，增殖多等优点。但也存在一些问题，比如腺病毒如何绕开人体的免疫系统，宿主范围广泛使得腺病毒难以针对某一特定组织。4.1.3单纯疱疹病毒载体

人单纯疱疹病毒是大分子量双链DNA，可容纳大片段外源DNA。I型单纯疱疹病毒(HSV-1)属于人嗜神经病毒，可在神经元内建立潜伏感染。HSV-1可被改造成两类载体：一是扩增子载体。即仅把HSV的复制起点和包装信号序列插入到细菌质粒中；当其转染到细胞，用HSV辅助病毒超感染，便可获得含有扩增子的假病毒。另一类为重组载体，即删除了与复制相关及非必须基因，以减少细胞毒性，然后插入外源基因，用于宿主神经细胞长期表达外源基因。

4.2非病毒载体

迄今已完成的基因治疗临床研究结果都不尽如人意，其最大困难在于开发无毒、高效地基因治疗载体。虽然多数研究仍采用转染效率较高的病毒载体，但其非靶向性，有限携带能

力、生产安全等问题，使得非病毒基因治疗载体倍受关注。非病毒载体包括裸DNA，脂质体，纳米颗粒及其他一些方式，以脂质体与阳离子聚合物使用较多。

5 基因治疗技术的应用

5.1遗传性疾病的基因治疗

1991 年美国批准了人类第一个对遗传病进行体细胞基因治疗的方案,即将腺苷脱氨酶（ADA ）导入一个 4 岁患有严重复合免疫缺陷综合征（SCID ）的女孩.。采用的是反转录病毒介导的间接法,即用含有正常人腺苷脱氨酶基因的反转录病毒载体培养患儿的白细胞, 8 个月后,患儿体内ADA 水平达到正常值的25 ％,未见明显副作用.此后又进行第 2 例治疗获得类似的效果.。我国复旦大学等单位对乙型血友病的基因治疗也进行了有意义的探索,他们在兔模型的基础上,将人第Ⅸ因子基因通过重组质粒（pcmvix ）或重组反转录病毒（N2CMVIX ）导入自体皮肤成纤维细胞,获得可喜的阶段性成果。对于其他遗传病如杜氏营养不良症、帕金森等疾病的研究，也已取得一定进展。相信未来基因治疗会取得巨大成功。

5.2恶性肿瘤的基因治疗

许多癌症的发生是由于癌基因的激活过度而表达的，因此可以通过影响癌基因的转录反义等过程来达到扰乱癌基因的功能。采用基因失活策略，将反义RNA，进入癌细胞，阻止特定mRNA序列表达，使其丧失产生癌基因蛋白质的能力，通过研究表明对癌细胞具有明显的作用。通过基因免疫治疗癌症是目前最为广泛的一种方法，通过向患者体内引进能增强患者免疫功能的基因，增强患者自身的免疫系统以达到治愈癌症的目的。

5.3其他方面的基因治疗

1994年，肥胖有关的瘦基因的发现，为肥胖的基因治疗展示了美好的前景，这项技术已在老鼠身上取得成功。歇顶相关基因的发现，为很多秃顶男性带来福音。基因治疗将来有可能治疗人们受伤的肌肉或骨折，初期的人体试验已经开始，专家们相信这种试验会发展到治疗阶段。基因治疗还在创伤修复、减少疤痕、抗衰老以及器官移植等方面有着相当明显的作用。

6 基因治疗技术存在的问题

过去几年里，全球基因治疗临床试验取得了很大的进步。实际上也遇到了很多困难。除了道德伦理问题之外，目前尚存的主要问题是：

6.1基因治疗的副作用

自2000年以来，法国巴黎内克尔医院对17名患有严重联合免疫缺陷病的儿童实施基因疗法，将正常的基因植入患儿体内，修复有缺陷的免疫系统。但从2003年开始，有5名患者出现白血病症状，后有一名患病儿童死亡。至此，人们开始意识到基因治疗可能具有潜在的、长期的副作用。因此，大量基因治疗临床试验被搁浅，人们对于基因治疗的期望也跌入低谷。

6.2基因治疗的不可控

病毒侵入染色体后的位置是随即的，谁也无法保证它不会突然碰触到某些癌基因，所以说存在治病不成的可能。导入基因治疗的载体一般为病毒载体，存在着安全隐患，如在病毒载体中可能产生有传染性、野性或辅助性病毒。

6.3用于治疗的基因过少

目前在以用于灵川实验的治疗基因集中于少数基因，对大多数疾病致病基因有待阐明。，目前许多未知功能的基因，及其表达调控序列的确定还有待基因组学进一步的发展。

6.4载体转移基因的效率和靶向性

目前基因治疗没有获得满意的结果，目的基因在涕泪不能持续表达和表达水平不高是影响治疗的重要因素。载体的特异性识别，如何能保证载体能将外源基因送入到指定的靶细胞，从而在该细胞中表达，也是癌症研究的一大热点。

6 基因治疗技术前景展望

尽管基因治疗存在诸多问题有待解决，公众和学术界对其也褒贬不一，但我们相信，作为一种对人类健康影响宽广而深远的新兴的治疗方式，正朝着治愈更大范围疾病的方向迈进，为很多不治的疾病得患者带来了希望。基因治疗存在巨大潜力已被人们广泛看好，也始终相信这项技术最终会取得成功，成为人类生物工程史上又一里程碑。

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