病理切片的制作过程
病理切片的制作过程 Document serial number【UU89WT-UU98YT-UU8CB-UUUT-UUT108】
1.7.1 修整组织
将手术切取的乳腺肿瘤切成一个平整面，各组织块不宜太大，以便固定剂穿透和组织脱水等操作，通常以10 mm×10 mm×3mm或
5mm×5mm×3mm为宜。找到不同的部位切取2块，以备后用。
1.7.2 组织洗涤
组织经修整后，组织中的福尔马林等必须冲洗干净，尤其是含有重金属的物质存在。因为残留在组织中的福尔马林，有的不利于染色，有的产生沉淀或结晶影响观察，所以组织修整后应冲洗12h左右。
1.7.3 组织脱水
组织经洗涤后，组织中含有大量水分，由于水与石蜡不能互溶，所以必须将组织中的水分除去。
80%乙醇溶液：2h
95%乙醇溶液:1h
95%乙醇溶液:1h
100%乙醇溶液:30min
100%乙醇溶液:30min
1.7.4 组织透明
由于乙醇与石蜡不相溶，而二甲苯既能溶于乙醇又能溶于石蜡，所以脱水后还要经过二甲苯以过渡。当组织中全部被二甲苯占有时，光线可以透过，组织呈现出不同程度的透明状态。
二甲苯Ⅰ：30min
二甲苯Ⅱ：10min
1.7.5 组织浸蜡
浸蜡的目的是除去组织中的透明剂（如二甲苯等），使石蜡渗透到组织内部达到饱和程度以便组织包埋。浸蜡时间根据组织的透蜡时间较长，需3h左右。浸蜡应在恒温箱内进行，并保持箱内温度在55℃左右，注意温度不要过高，以免组织发脆。
石蜡Ⅰ：1h
石蜡Ⅱ：1h。
石蜡Ⅲ：1h
1.7.6 组织包埋
将经过透蜡的组织连同熔化的石蜡，一起倒入容器内，然后立即投入冷水中，使其立刻凝固成蜡块的过程。包埋时，将纸盒放在温箱旁边，用镊子夹取组织平放于纸盒底部，，再用温镊子轻轻拨动组织，从温箱中取出盛放纯石蜡的蜡杯，沿壁倒入包埋用的纸盒中，速度要慢。待石蜡凝固（约30min）后放入冰箱保鲜层内以备后用。包埋时应根据组织材料、切片厚度、气候条件等因素，选择不同熔点的石蜡，新的石蜡一般要熬顿几次，以免石蜡固定后有气泡，影响切片。用于包埋的石蜡的熔点在50~60℃之间。
1.7.7 组织切片
（1）从冰箱里拿出蜡块，进行修快
（2）将已固定和修好的石蜡块台木装在切片机的夹物台上。
（3）将切片刀固定在刀夹上，刀口向上。
（4）摇动推动螺旋，使石蜡块与刀口贴近，但不可超过刀口。
（5）调整石蜡块与刀口之间的角度与位置，刀片与石蜡切片约成15度左右。
（6）调整厚度调节器到所需的切片厚度，先调约为25um，待切平后改为5um。
（7）一切调整好后方可以开始切片。此时右手摇动转轮，让蜡块切成蜡带，左手持毛笔将蜡带提起，摇转速度不可太急，通常以40-
60r/min。
（8）切成的蜡带到10-20cm长时，右手用另一支毛笔轻轻地将蜡带挑起，以免卷曲，并牵引成带，平放在蜡带盒上，靠刀面的一面较光滑，朝下，较皱的一面朝上。
（9）感觉效果较好的蜡片一小段，用单面刀片切取，再放入约43℃的水浴锅中展片，观察切片是否良好。
（10）切片工作结束后，应将切片刀取下用氯仿擦去刀上沾着的石蜡，把切片机擦拭干净妥为保存。
1.7.8 贴片
（1）取清洁的载玻片一片，滴一滴粘片剂于玻片中央，然后用洗净的手指加以涂抹，便成均匀薄层。
（2）然后用载玻片直接去滤已经展开的蜡片，将蜡片贴在均匀的粘片剂薄层上。注意蜡片光亮平整的一面贴于玻片上，并使之处于稍偏玻片的一端，一端便于后面的染色步骤，另一端便于粘贴标签。
1.7.9 烘片
把载玻片摆好片位置，放在平盘上置于60℃温箱烘干，经过5小时干燥后即可取出存放于切片盒待染。
1.7.10 脱蜡
染色液多数为水溶液，因此，染色前必须将蜡脱去，使切片中的材料由有机相进入到水相。一般采用二甲苯脱蜡，逐级复水与脱水浸蜡过程正好相反，但是，由于蜡片较薄，所需时间比脱水浸蜡要短的多。
（1）石蜡切片经二甲苯Ⅰ脱蜡10min；
（2）石蜡切片经二甲苯Ⅱ脱蜡10min；
1.7.11 渗水
放入100%、95%、80%等各级酒精溶液中浸泡，再放入蒸馏水中，使水渗进切片组织。
（1）无水乙醇浸泡1min；
（2）无水乙醇浸泡1min；
（3）95%乙醇浸泡2min；
（4）95%乙醇浸泡2min；
（5）80%乙醇浸泡2min；
（6）自来水洗2min；
1.7.12 染色
切片放入苏木精中染色约7min。染色时间应根据染色剂的成熟程度及室温高低，适当缩短或延长。室温高时促进染色，染色时间可短些，否则可适当延长时间，冬季室温低时可放入恒温箱中染色。
1.7.13 水洗
用自来水流水冲洗约2min。冲洗过程中使切片颜色发蓝，此操作要注意流水不能过大，以防切片脱落，并可以随时用显微镜检查见颜色变蓝为止。
1.7.14 分化
就是将细胞质着的色褪去，使细胞核着色更加鲜明，也称分色。将切片放入1%盐酸乙醇液（盐酸1份+70%乙醇100份）中褪色，见切片变红，颜色较浅即可，约数秒至数十秒钟。这一步骤是H.E.染色成败的关键，，如分化不当会导致染色不匀，或深或浅，得到的切片染色效果差。如果染色适中，可取消此步骤。本次实验操作在0.5%盐酸乙醇中浸泡30s；
1.7.15 漂洗
切片再放入自来水流水中使其恢复蓝色。低倍镜检查见细胞核呈蓝色、结构清楚；细胞质或结缔组织纤维成分无色为标准。然后放入蒸馏水中漂洗一次2min。
1.7.16 反蓝
在饱和碳酸锂中浸泡2min；再用自来水洗2min；
1.7.17 复染
用0.5%伊红乙醇液对比染色2~5min。伊红主要染细胞质，着色浓淡程度应与苏木精染细胞核的浓淡程度相配合，如果细胞核染色较浓，细胞质也应浓染，以获得鲜明的对比。反之，如果细胞核染色较浅，细胞质也应淡染。可在伊红乙醇液中滴加数滴冰醋酸助染，促使细胞质容易着色，并且经乙醇脱水时不易褪色。本次操作伊红染色6min；
1.7.18 逐级脱水
（1）80%乙醇脱水30s；
（2）90%乙醇脱水30s；
（3）95%乙醇脱水1min；
（4）95%乙醇脱水1min；
（5）无水乙醇脱水2min；
（6）无水乙醇脱水2min；
1.7.19透明
将经过脱水后的切片放入纯二甲苯Ⅰ、Ⅱ中各3~5min。二甲苯应尽量保持无水，应经常更换，或用纱布包无水硫酸铜放入染色缸内吸收水分。切片如在二甲苯中出现白雾现象，说明脱水未尽，应退回乙醇中重新脱水，否则切片难以镜检。本次操作为：
（1）二甲苯Ⅰ5min；
（2）二甲苯Ⅱ10min；
1.7.20 封藏：中性树胶封存
切片经染色、脱水、透明后，即可用封藏剂将其封藏起来，目的是永久保存切片，便于镜检。常用的封藏剂一类为干性封藏剂如中性树胶、加拿大树胶等，另一类为湿性封藏剂如甘油明胶等。如果切片是经二甲苯透明，则用树胶作为封藏剂，树胶可以用二甲苯稀释至合适的稠度。如果切片是直接从水中或水溶液中取出，则常用甘油明胶作为封藏剂，可用于短期保存标本。
封藏的方法：封片前应根据材料的大小，选用不同规格的盖玻片。材料透明后，按照下列方法进行封藏。在桌上放一张洁净的吸水纸，将含材料的载玻片从二甲苯中取出放在纸上（切片的一面向上），迅速地在切片的中央滴一滴树胶（千万不能待二甲苯干燥后再进行），用右手持小镊子轻轻地夹住盖玻片的右侧，稍为倾斜使其左侧与封藏剂接角，然后再缓慢地将盖玻片放下，这样就可以减少或避免产生气泡。如胶液不足，可以用玻棒再滴一滴树胶从盖玻片边缘补足。如胶液过多，可在干燥以后用刀刮去，并用纱布蘸二甲苯拭去残留的树胶。
1.7.21镜检
在光镜下观察染色结果，细胞核被苏木素染成蓝色，细胞质被伊红染色呈粉红色。
组织切片过程中的注意事项
1）固定组织所用的固定液要充足,至少相当于标本总体积的5倍以上，标本容器及其口径有适当大小，使标本能原形进行固定，避免使标本遭受挤压。
2）组织块透明在制片中是很重要的环节，如果组织不能透明，其原因可能有脱水未尽、组织太厚、透明时间不够以及与某些组织本身性质有关等。所以从多方面考虑，尽可能使组织达到透明目的，通常根据透明时间与眼观相结合判断透明程度。
3）凡是陈旧、腐败或干枯的组织不易制成好切片，所以制片过程中要保护好组织。
4）固定失时或固定不当的组织，染色时常出现核染色质着色浅、轮廓不清，出现程度不等的片状发白区。
5）组织脱水、透明和浸蜡过度，会造成组织过硬过脆，特别是小动物组织应严格控制。
6）切片刀不锋利，切片时会自行卷起或皱起，不能顺利连成蜡带。切片刀有缺口，易造成切片断裂、破损、不完整及刀痕等现象，不利于切片和观察。
7）组织切片机各个零件盒螺丝应旋紧，切片刀牢牢固定，否则将会产生振动，以致出现切片厚薄不匀和横皱纹等现象。
石蜡切片的基本操作流程
石蜡切片的基本操作流程 一、取材选取目的组织块，修剪到合适的大小； 二、固定 将组织块放入福尔马林固定液（10%甲醛溶液），固定时间由组织块大小而定，一般不少于24h；体积1cm3的组织块，一般为3-7天； 三、冲水自来水洗几下，泡1小时； 四、系列酒精脱水 50%酒精，1h； 70%酒精，1h； 80%酒精，1h； 90%酒精，1h； 100%酒精（I），1h； 100%酒精（II），1h； 五、透明 酒精：二甲苯=1：1溶液，过夜； 二甲苯，1h； 六、包埋 二甲苯：石蜡=1：1，65-70 ℃，2h； 新鲜石蜡（I），65-70 ℃，1h； 新鲜石蜡（II），65-70 ℃，4h； 新鲜石蜡包埋； 七、切片切片厚度为5-7um； 八、展片温水（40-42 ℃）展片； 九、捞片将展好的片子贴于载玻片上； 十、烘片42 ℃将片子上的水烘干； 十一、烤片60 ℃烤片12-24h； 十二、脱腊 二甲苯（I）：2min； 酒精：二甲苯=1：1溶液：2min； 十三、水化 100%酒精（I）：1min； 100%酒精（II）：1min； 95%酒精：1.5min； 80%酒精：1.5min； 70%酒精：1.5min； 50%酒精：1.5min； 自来水洗：2min 十四、H&E染色 Hematoxylin染色3-5min(2.5min时取出观察染色效果)，自来水洗3次，盐酸分化（2/3杯玻璃缸+3滴1N盐酸），10s；自来水洗蓝化，镜下观察染色效果；（伊红）Eosin染色30-50s，直接脱水（90%酒精-----100%酒精I，100%酒精II各1分------酒精：二甲苯=1：1溶液：1-1.5min）；十五、脱水 90%酒精-100%酒精-100%酒精，各1min； 十六、透明 二甲苯：酒精：1-1.5min；二甲苯：2min；
石蜡切片制作标准程序
动物病理组织学 石蜡切片制作标准操作程序（SOP） 一、\器材和试剂准备 （一）载玻片和盖玻片的清洁 1.载玻片和盖玻片清洗方法 (1)锅内倒入适量清洗液（100 mL水+30 m L洗洁精+30 mL 84消毒液）； (2)将玻片逐片放入锅中, 加热至沸腾10 min, 停止加热, 自然冷却; (3)捞出玻片流水冲洗10min,彻底冲净泡沫（弹簧夹上后，单片过水）; (4)将玻片从水中取出, 用蒸馏水冲洗三遍（最好单片过水）; (5)将玻片放入 95%乙醇（分析纯）中浸泡； （6）取出玻片，码在切片盒，自然干燥（或无风适度高温干燥）备用； 注意：由于盖玻片很薄，不能同载玻片放在一起处理；盖玻片从95%乙醇溶液中取出后要放在吸水纸上摊开，干燥后，放在小盒子中备用。 2.粘片剂（蛋白甘油）的制作及载玻片的预处理 （1）蛋白甘油的制作取新鲜鸡蛋，先将其尖端用眼科剪或拨针挑破一小孔，再将蛋的另一端挑破一小孔并稍加扩大，大孔端朝下，使蛋白流入100~200毫升的烧杯中（不要蛋黄），以玻棒打拌蛋白完全变为雪花状泡沫，然后倒入垫有几层纱布的漏斗中过滤而得到透明、清凉的的蛋白液，再加入等量甘油，振摇使之充分混合，加入1%麝香草酚或樟脑防腐。一般将其盛入滴瓶或树胶瓶中备用，不用时盖好防尘。 或1个鸡蛋的蛋清+500mL双蒸馏水，混匀，加10mL浓氨水。 （2）将蛋白甘油倒在小烧杯中，载玻片用弹簧夹夹上后侵入蛋白甘油中，贴壁刮干，放在切片盒内晾干备用。 二、石蜡组织切片的制作 （一）取材 注意事项： 1.材料质量：材料必须新鲜，应争取在死后半小时内处理完毕。 2.取材体积：组织块力求小而薄（厚度不要超过5mm，以2mm最佳） 3.取材力度：取材器具锋利。勿使组织块受挤压，切割时不可来回挫动。夹取组织时，切勿猛压，以免挤压损伤组织。取材时，组织块可稍大一点，以便在固定后，将组织块的不平整部分修去。 4.固定形状：固定尽量保持组织的原有形态新鲜组织经固定后，或多或少会产生收缩现象，有时甚至完全变形。为此可将组织展平，以尽可能雅持原形。对神经、肌肉、皮肤组织等，则可将其两端用线扎在木片上或硬纸片上固定。 5.切向选择：选好组织块的切面应熟悉器官组织的结构并据此决定其切面的走向。纵切或横
石蜡切片的制作
说明 石蜡切片法包括取材、固定、洗涤和脱水、透明、浸蜡、包埋、切片与粘片、脱蜡、染色、脱水、透明、封片等步骤。一般的组织从取材固定到封片制成玻片标本需要数日，但标本可以长期保存使用，为永久性显微玻片标本。文档来自于网络搜索 取材 应根据要求选取材料来源及部位。例如植物细胞有丝分裂多选取洋葱根尖，细胞分裂快又便于切取；猪的肝小叶边界清晰明确；耳蜗以豚鼠的内耳易于定位和剥离。材料必须新鲜，搁置时间过久则产生蛋白质分解变性，导致细胞自溶及细菌的滋生，而不能反映组织活体时的形态结构。文档来自于网络搜索 固定 用适当的化学药液——固定液浸渍切成小块的新鲜材料，迅速凝固或沉淀细胞和组织中的物质成分、终止细胞的一切代谢过程、防止细胞自溶或组织变化，尽可能保持其活体时的结构。固定能使组织硬化，有利于切片的进行，而且也有媒浸作用，有利于组织着色。固定液的种类很多，其对组织的硬化收缩程度以及组织内蛋白质、脂肪、糖类等物质的作用各不相同。例如纯酒精可固定肝糖而能溶解脂肪，甲醛能固定一般组织，但溶解肝糖和色素。固定液可分为单一固定液及混合固定液。前者有甲醛（蚁醛、福尔马林）、酒精、醋酸或冰醋酸、升汞、锇酸（四氧化锇）、重铬酸钾及苦味酸等，单一固定液不能固定细胞中的所有成分；混合固定液可以互补不足，常用的混合固定液有Bouin氏液、Zenker氏液、FAA液、Carnoy氏液、SuSa 液（配方见有关技术书籍）。因此，应根据所要显示的内容来选择适宜的固定液。10％福尔马林（4％甲醛）或10％磷酸缓冲福尔马林是病理切片常规使用的固定液，不仅适用于常规HE（苏木精-伊红）染色，还可以用于组织学有关的其他技术的切片染色。固定液的用量通常为材料块的20倍左右，固定时间则根据材料块的大小及松密程度以及固定液的穿透速度而定，可以从1小时至数天，通常为数小时至24小时。文档来自于网络搜索 洗涤与脱水 固定后的组织材料需除去留在组织内的固定液及其结晶沉淀，否则会影响以后的染色效果。多数用流水冲洗；使用含有苦味酸的固定液固定的则需用酒精多次浸洗；如果组织经酒精或酒精混合液固定，则不必洗涤，可直接进行脱水。固定后或洗涤后的组织内充满水分，如不除去水分就无法进行以后的透明、浸蜡与包埋，因为透明剂多数是苯类，苯类和石蜡均不能与水相
组织切片制作步骤
徒手切片法： 徒手切片法是指手持刀片将新鲜的或固定的实验材料切成薄片的制作方法。徒手切片法是指不需要专门的仪器设备，试样也不需要特殊的化学试剂处理，而直接将新鲜的或固定的材料(一般为木质化程度较低的植物)切成薄片的方法。 基本信息： 徒手切片前，应先准备好一个盛有清水的培养皿。在切片时，用左手的拇指与食指、中指夹住实验材料，大拇指应低于食指2～3mm，以免被刀片割破。材料要伸出食指外约2～3mm，左手拿材料要松紧适度，右手平稳地拿住刀片并与材料成垂直。然后，在材料的切面上均匀地滴上清水，以保持材料湿润。将刀口向内对着材料，并使刀片与材料切口基本上保持平行，再用右手的臂力（不要用手的腕力）向自身方向拉切。此时，左手的食指一侧应抵住刀片的下面，使刀片始终平整。连续地切下数片后，将刀片放在培养皿的水中稍一晃动，切片即漂浮于水中。当切到一定数量后，可在培养皿内挑选透明的薄片用低倍镜观察检查。好的切片应该是薄且比较透明、组织结构完整，否则要重新进行切片。 对经检查符合要求的切片，如果只作临时观察，可封藏在水中进行观察。若要更清楚地显示其组织和细胞结构，可选择一些切片进一步通过固定、染色、脱水、透明及封藏等步骤，做成永久玻片标本。 徒手切片技巧 如果不想切斜，要注意两点，一个是左手拿的露出来那截要短，
尽量只能连续切2刀的样子(一般是可以切4，5刀的），一个是切口一定要水平，同时右手的刀片也要水平，拉刀的时候保持在一个平面上（拉快点容易做到）。这是根和茎的切法，不过每次的量会有所减少。对于叶，有三种切法，一个是直接切；一个是卷成管状，当茎来切；还有就是用三层刀片夹起来。其中，第一种适合于裸子植物那种针叶，方法要领和上面说的差不多；第二种适合于比较软的叶片，要领是要卷的细，中间的洞不要太大（大了容易斜）；第三种适用于比较坚韧，硬的叶片，绝对要放在载玻片之类的地方，要用划的，凌空切会很不顺，容易切不断。还有一种特殊的方法是切成小块的先，再夹到萝卜里面（事先挖个洞或切条槽），再一起切，这个适用于全部，根茎叶，软的硬的均可（就是那种针叶不太好用它，我都切不好）。所以克服柔软就是要注意，想办法使它变厚变硬（对叶：卷，夹，或者垫玻璃；对根茎，夹，或者用左手捏紧一点，捏上面一点，使它不会晃）。至于弯曲，我觉得不用太在意，要么舍弃掉这一段，要么用手压紧，关键只是上面要平。还有，如果切含有楞或者有叶脉的部分，一定要从这些地方开始切，先切硬的部分（朝向刀口）。平时切两到三层差不多，一层的细胞会破损，有空洞；这样也比较适合染色。 徒手切片的优缺点 徒手切片是用手持双面刀片或剃刀，将新鲜材料或预先固定好的材料（切前水洗）切成薄片，不经染色或经简单染色后，用水封片作临时装片观察。徒手切片法的优点是不需要复杂的设备，方法简便，制片迅速，而且能观察到植物组织的自然色泽和活体结构，常用于研
石蜡切片的制作过程(精)
石蜡切片的制作 目的要求:了解生物制片的基本原理和方法;了解石蜡切片制作的基本过程;学会制作石蜡切片。 一、生物制片的基本原理 (一生物制片的目的与发展概况 生物制片是研究生物有机体微观结构的基础方法,其目的是提供在显微镜下以适度的样品,有效地对其进行形态和功能观察研究。 (二生物制片的方法 当我们研究生物体的组织或细胞时,除了某些生物体可用相差显微镜或偏光显微镜等方法达到观察目的外,其余大部分生物体,因为组织较厚,光线不易透过内部等关系而达不到观察的要求,为了达到此目的,就必须将生物体的组织切成薄切片或不切片,经过一系列处理,使光线易于透过,即可进行观察。因此,根据标本的制作方法分为切片法和非切片法两种。这些方法,各有优缺点,应该适当的配合使用,才能获得比较理想的结果。 1.切片法 (1切片法的种类 切片法就是利用锐利的刀具,将器官组织或幼小个体分割成许多极薄的薄片,而制成切片标本的一种方法。切片法在切成薄片以前必须设法使组织内渗透某种支持物质。使组织保持一定的硬度,然后利用切片机进行切片。根据所用支持物质的不同切片法又可分为石蜡切片法、火棉胶切片法、冰冻切片法、炭蜡切片法等类型。现分述如下: ⅰ.石蜡切片法
石蜡切片法即用石蜡作为支持剂进行切片的方法。石蜡切片法是一般组织学、病理学等常规制片方法,因此用得最多,它有很多优点:比较省时间,容易操作,可切成极薄的切片(4um 以下,能制作连续切片,组织块可包埋在石蜡中永久保存。缺点是只能用于较小的组织块,较大的组织块不易切好,容易破碎,组织在脱水透明过程中产生收缩并易变脆。制片时间太长。 ⅱ.火棉胶切片法 火棉胶切片法是以火棉胶为支持剂进行切片的方法。此法的优点是包埋过程中不用二甲苯及石蜡,不经高温,可避免组织收缩及变脆,适于精细材料(如脑的切片,也引火棉胶有韧性切片不知有折卷或破裂,适宜于大块组织及多空洞的组织(脑、眼球,硬度较高的组织(骨、肌腱。缺点:手续麻烦、费时间,切片不能切薄,起码在10um以上,不能作连续切片,因此,在生物制片技术上已经不经常采用。 ⅲ.冰冻切片法 冰冻切片法是利用液体二氧化碳或其它药剂(如氯乙烷在变成气体时吸收大量的热使组织迅速结成冰块而后再进行切片的方法。目前国内外用半导体致冷调节器来代替二氧化碳的冰冻,冷冻速度更快更为方便。 冰冻切片法的优点是较前两种方法简便,组织不经脱水、透明、包埋等手续即可切片,因而可节省很多时间,十分钟左右即能制成切片。常用于临床病理手术诊断,银材料不经溶媒处理就可直接进行切片,材料不受试剂的激烈刺激及温度影响,所以组织没有显著的收缩,细胞形态不致有大的改变,也引冰冻切片不需有机溶剂处理,所以能保存脂肪、类脂等成分,所以冰冻切片法常用于组织化学,尤其是神经组织,临床病理学等方面的研究。 新鲜的组织或已经固定的组织,经短时间处理后即可进行切片。用任何固定及处理的材料均适合冰冻切片,但一般的经验用福尔马林固定的材料最适合冰冻切片,而用酒精、甘油保存的材料必须充分水洗后才易于冰冻,否则不易切成完整的切片
组织切片石蜡切片过程
石蜡切片过程 一、石蜡包埋: 1.脱水：组织水洗后便可酒精脱水，70% →80% →90% →95%→ 100%酒精（无水乙醇）→100%酒精，各级酒精脱水时间30-45 min。（注意：80%酒精内组织可留之较久，当天如果来不及做完就可以暂时保存一晚上，次日再继续做下去。70%的酒精可作为更久的保存剂。） 2.透蜡：脱水后组织：50%酒精+50%二甲苯30 - 45min. 二甲苯（组织透明即可停止) 15min. 50%二甲苯+50%石蜡20-30min. 纯石蜡1 45min. 纯石蜡2 45min.（透腊之前做好准备工作：准备腊杯，烘箱温度保持55—60℃左右，使石腊熔化，温度不宜过高，以免使组织发脆。） 3.包埋： a.折好纸盒，准备小镊子、酒精灯、解剖针、冷水等。 b.用温热吸管吸取石蜡注入纸盒。等待底稍微凝固，温镊子夹住样品放入盒子中央，面朝底(可以将蜡一次倒入纸盒，然后待蜡表面起膜后，用温镊子夹住样品放入蜡中，待冷却即可，整个操作过程中，切勿让蜡中起气泡)。 c.两手拿着两端，入冷水一半，吹气，使表面石蜡形成移较厚腊层，然后急速全部进入冷水中3分钟。 d.修正蜡块（上下两个面一定要平行并且光滑） e.固着蜡块
二、切片 1.切片（切片时，可以在刀片以及刀片周围涂上一点甘油） 2.贴片烤片（甘油蛋白=1/2甘油+1/2鸡蛋清）（在贴片时，用细吸管取一点点甘油蛋白（越少越好）于载玻片上，然后用手抹匀，手一定要干净。将切片放在载玻片（光亮面朝向下），然后滴几滴冷水使切片悬于水上。接着将载玻片放在37℃上烘烤。 常见问题分析： 1.切片分离不能形成蜡带：?室温过低，蜡过硬。 2.蜡带弯曲：?蜡块口下面不平行，或蜡块不与刀刃平行所致。 3.切片厚薄不一:?切片刀或蜡块未固定紧。 4.切成片后，组织与蜡块脱离：?脱水不干净等。 5.蜡片易粘在切片上或蜡片萎缩：?室温太高或蜡太软或刀的角度 太小。 6.切片破裂：?浸蜡不足或浸蜡温度过高，或在脱水剂、透明剂中 时间过长，引起组织发脆或有杂质，材料脱钙不完全，此种无法补救。 7.蜡片上卷，切过刀口即破裂：?刀口太钝或沾有石蜡或刀的角 度过大或蜡太硬。 *：包埋时，时间长会使标本变质，过短则石蜡不能透进标本。石蜡包埋过程中，注意控制温度保持在58-60℃，石蜡不能融化。
石蜡切片步骤
石蜡切片制作 大致步骤：取材、固定、洗涤和脱水、透明、浸蜡、包埋、切片和粘片、脱蜡、染色、脱水、透明、封片等步骤。 1、取材 植物材料选择时必须尽可能不损伤植物体或所需要的部分。 取材必须新鲜，尽可能割取所需要的组织块，并随即投入固定液。 取材时刀要锐利，避免因挤压细胞使其受到损伤。 切取的材料应该小而薄，便于固定剂迅速渗入内部。一般厚度不超过2mm，大小不超过5*5mm2。 2、固定 用适当的化学药液—固定液浸渍切成小块的新鲜材料，迅速凝固或沉淀细胞和组织中的物质成分、终止细胞的一切代谢过程、防止细胞自溶或组织变化，尽可能保持其活体时的结构。 固定液的选用：FAA固定液 FAA固定液配制：福尔马林（38%甲醛）5 ml 冰醋酸 5 ml 70%酒精 90 ml 5 ml甘油（丙三醇） 固定时间根据材料块的大小及松密程度而定。 3、洗涤与脱水 固定后的组织材料需要除去留在组织内的固定液及其结晶沉淀，否则会影响以后的染色效果。多数用流水冲洗：使用含有苦味酸的固定液固定的则需要用酒精多次浸洗；如果组织经酒精或酒精混合液固定，则不必洗涤，可直接进行脱水。 酒精为常用的脱水剂，为了减少组织材料的急剧收缩，应使用从低浓度到高浓度递增的顺序进行，通常从30%或50%酒精开始，经70%、85%、95%直至纯酒精（无水乙醇），每次时间为1-数小时，如不能及时进行脱水，材料可以放在70%酒精中保存，因高浓度酒精易使组织收缩硬化。 4、透明 选用二甲苯为酒精和石蜡的浸媒液，替换出组织内的酒精。通常组织先经过纯酒精和透明剂各半的混合液浸渍1-2小时，再转入纯透明剂中浸渍。时间根据材料块大小而定。 5、浸蜡与包埋 用石蜡取代透明剂，使石蜡浸入组织而起支持作用。通常把组织材料块放在熔化的石蜡和二甲苯的等量混合液浸渍1-2小时，再先后移入2个熔化的石蜡液中浸渍3小时左右，浸蜡应在高于石蜡熔点3℃左右的温箱中进行，以利于石蜡浸入组织内。浸蜡后的组织材料块放在装有蜡液的容器中（摆好在蜡中的位置），待蜡液表层凝固即迅速放入冷水中冷却，即做成含有组织块的蜡块。容器可用光亮且厚的纸折叠成纸盒或金属包埋框盒。如果包埋的组织块数量多，应进行编号，以免差错。石蜡熔化后应在蜡箱内过滤后使用，以免因含有杂质而影响切片质量，且可能损伤切片刀。 6、切片 包埋好的蜡块用刀片修成规整的四棱台，以少许热蜡液将其底部迅速贴附于小木块上，夹在轮转式切片机的蜡块钳内，使蜡块切面与切片刀刃平行，旋紧。切片刀的锐利与否、蜡块硬度适当都直接影响切片质量，可用热水或冷水等方法适当改变蜡块硬度。通常切片厚度为 4-7微米，切出一片接一片的蜡带，用毛笔轻托轻放在纸上。 7、贴片与烤片
6树脂切片制作过程
树脂切片制作过程 一、实验仪器及试剂 1.器具 电子天平、70℃恒温箱、玻璃制刀机、半/超薄切片机、显微镜、包埋模、制刀用的玻璃条、镊子、刀片。 2.试剂 (1)固定剂：FAA (2)脱水剂：20%、40%、60%、80%、90%、95%、100%的乙醇；丙酮(3)树脂：Spurr树脂(4)染色剂：1%碱性品红二、实验步骤 1.取材和固定： 取样时所用的器具必须干净，刀、剪等必须锋利，在操作时尽量避免拉、锯、压等动作对组织细胞造成的机械损伤。一般样品块的大小约为1立方毫米，取材完成后立即放入固定液中，真空泵抽气两到三次，每次1-2min（注意不要让固定液沸出，如抽完后液体较少，可再补加固定液）。 2.脱水： 用50%、60%、70%、85%、95%、100%的乙醇分别浸渍固定的材料，每种浓度处理10～15min。 3.置换 (1)在管瓶中加入2ml无水乙醇和1ml丙酮，处理材料10min。 (2)向管瓶中追加1ml丙酮，处理材料10min。 (3)向管瓶中再追加2ml丙酮，处理材料10min。 (4)倾倒出管瓶中的无水乙醇和丙酮混合液，加入纯丙酮3次，每次10min。4.浸透 (1)在管瓶中加入1ml丙酮，向内滴入1滴Spurr树脂，1～2h。 (2)向管瓶中追加1至数滴Spurr树脂，使Spurr树脂的浓度逐渐提高，每滴加一次Spurr树脂，放置1～2h，共滴加0.3ml左右的树脂，使树脂浓度达到25%左右。 (3)用吸管吸去管瓶中0.5～0.8ml的丙酮和Spurr树脂的混合液，然后加入纯Spurr树脂0.5ml，使树脂浓度达到50%～60%左右，2～3h。 (4)用吸管吸去管瓶中的丙酮和Spurr树脂的混合液，加入0.5～0.8ml的Spurr树脂，2～3h。 (5)更换新配制的Spurr树脂1ml，过夜。(6)重复换树脂3次，每次12h。5.包埋与聚合 (1)先将恒温箱调至温度至70℃，包埋模事前烘干置干燥器中存放。 (2)在湿度小的房间里进行包埋操作。在包埋模的中放上已浸透的材料(用牙签不损伤样品地桃)，用滴管吸取新配制的Spurr树脂，并注满每个穴孔，用牙签拨样品，使样品按一定方位(有利修块、切片和观察)排列。做好记载(各穴孔中放的是什么样品)。 (3)聚合：将包埋样品的包埋模放入70℃恒温箱中聚合，8h后取出置干燥器中存放。多余的树脂可放在胶囊中或放在包埋模的穴孔中同样品一同聚合。 6.修块 用锉刀或铁砂皮磨样品块，使样品稍稍暴露，使待切部位呈方形或长方形，最后用刀片将样品块的磨面切平7.玻璃刀的制作 用玻璃制刀机先将玻璃条制成边长为25mm的正方块，然后再将每正方块制作成2把璃制刀。8.切片、贴片 (1)固定样品块和玻璃刀将样品块和玻璃刀固定在半薄切片机上，玻璃刀的避样品角约为5度，切片机装样品部位平放时，玻璃刀刀口与样品块处于同一高度。调节玻璃刀前后位置，使刀口接近样品块。 (2)荒切开动切片机，调节进刀距离和速度，让玻璃刀荒切样品块，使样品块的切面逐渐平整光滑起来。 (3)切片当样品块的切面平整光滑后便可正式切片。作为光镜观察用的半薄切片厚度一般控制在1-2μm左右。
石蜡切片详细步骤
石蜡切片 1.仪器 石蜡切片机、烘箱、显微镜、染色缸、小培养皿、镊子、毛笔、吸水纸、纱布、载玻片、盖玻片等。 2. 试剂 FAA固定液(70%酒精90ml、冰醋酸5ml、福尔马林5ml)、10%番红水溶液、0.5%固绿（用95%的酒精配制）、酒精（100%、95%、80%、70%、50%）、二甲苯、蒸馏水、甘油、中性树胶等。 3.取材 幼嫩的油菜植株叶片和茎 4.方法与步骤(参照) 1．固定： FAA固定液固定48小时以上。 2．脱水： 50%酒精→70%酒精→83%酒精→95%酒精→100%酒精→100%酒精。每级2h。100%酒精中1.5h。其中70%酒精处可长期保存。 3．透明： 1/2二甲苯+1/2无水乙醇 (2h) →纯二甲苯(1.5h) →纯二甲苯(1.5h) 4．浸蜡： 将处理的材料置于1/2石蜡(固体粉末状)+1/2二甲苯中，40℃烘箱敞口过夜。 5．包埋： 先提升恒温箱的温度至60℃，换纯蜡3次，每次1-2h，用硬的电光纸、牛皮纸叠纸盒，置于45-60℃的烫板上，倒入材料，摆放好材料，把标签（正面向外置于底部），补足石蜡，倒好后轻轻的置于冷水盆中，注意底面要接触盆中凉水，待石蜡全部凝固后可取出晾干，也可在凉水盆中放置过夜。 6．切片 对包埋的材料进行修块、粘块、整修后，保证材料四周都有石蜡包围。但不可太多。切面的上、下边平行。用加热的解剖刀蘸取少许石蜡碎屑，并迅速将石蜡块四周的碎屑烫平，使石蜡块牢固地粘在台木上。检查切片机，安装切片刀、调整好刀的角度，调整石蜡块与刀口之间的角度与位置后开始切片。
7．粘片 将粘贴剂置簿玻片上，再取切片浮置粘片剂上，然后置烘片台上，使切片展开烫平，材料不现皱纹为度。最后将切片依次排好，用滤纸吸去多余水分，同时以记号笔在玻片上编号，放入温箱中烘干，温度30～40℃中过夜。 8．脱蜡 脱蜡用二甲苯，把烤好的载玻片放于盛二甲苯的染缸中：纯二甲苯(10-20min)→纯二甲苯(5-10min) 9．染色 将纯二甲苯脱蜡完全的材料，1/2 二甲苯十1/2纯酒精→100%酒精→95％酒精→85％酒精→70％酒精→50％酒精→1%番红染色(4h以上) →50％酒精→70％酒精→85％酒精→95％酒精→0.5%固绿(1min)→95％酒精→100%酒精→100％酒精(未注明时间各级均为3min) 10．胶封 滴加加拿大树胶封藏。 11.镜检，拍照
电镜切片样品制作步骤知识讲解
A 悬浮培养的细胞、细菌、血细胞、精子等； 细胞使用PBS或无血清培养基离心漂洗1~2次以去除血清，离心转速依据不同离心机、不同样品自定，总时间控制在5min内；细胞团根据预设浓度在适量2.5%戊二醛吹悬，滴加在预先置入青霉素小瓶中的托盘，4℃静置沉降2~3天，在托盘周围加入PBS，以防止样品干燥。 B贴壁培养的细胞： 在培养皿中预先加入盖玻片，使细胞贴附于盖玻片上；PBS或无需请培养基漂洗后，放置在培养板室温固定1h，4℃3 h，注意放置干燥，自行转入青霉素小瓶中，加满PBS送检。SEM标本处理必须使用玻璃容器，需明确所用盖玻片尺寸可以放入青霉素瓶。 C组织取材 样品观察表面可达8~10mm2,高度小于5mm左右； 样品表面在固定前必须清洁：使用生理盐水或PBS冲洗掉表面的灰尘以及不需要观察的蛋白、粘液等。能够明确标识标本的观察面。消化道、呼吸道、血管、生殖器官、泌尿等官腔内表面，尤其要注意先清洗再固定。 如需要观察脏器内结构，应依照不同的实验目的，决定目的脏器是否需要灌注清洗； 固定2.5%戊二醛浸没标本，室温1h，4℃固定3h以上，换PBS送检。 附：2.5%戊二醛的配制 Step 1: 0.2M磷酸缓冲液的配制： --------------------- 磷酸二氢钠（NaH2PO4.H2O） 2.6克 磷酸氢二钠(Na2HPO4.12H2O)29克 双蒸馏水加至500毫升 pH调至7.4 Step 2: 戊二醛固定液的配制： --------------------- 25% 戊二醛1ml 双蒸馏水4ml 0.2mol/L磷酸缓冲液5ml 戊二醛最终浓度 2.5% pH值7.3-7.4
病理切片的制作过程
1.7.1 修整组织 将手术切取的乳腺肿瘤切成一个平整面，各组织块不宜太大，以便固定剂穿透和组织脱水等操作，通常以10 mm×10 mm×3mm或5mm×5mm×3mm为宜。找到不同的部位切取2块，以备后用。 1.7.2 组织洗涤 组织经修整后，组织中的福尔马林等必须冲洗干净，尤其是含有重金属的物质存在。因为残留在组织中的福尔马林，有的不利于染色，有的产生沉淀或结晶影响观察，所以组织修整后应冲洗12h左右。 1.7.3 组织脱水 组织经洗涤后，组织中含有大量水分，由于水与石蜡不能互溶，所以必须将组织中的水分除去。 80%乙醇溶液：2h 95%乙醇溶液:1h 95%乙醇溶液:1h 100%乙醇溶液:30min 100%乙醇溶液:30min 1.7.4 组织透明 由于乙醇与石蜡不相溶，而二甲苯既能溶于乙醇又能溶于石蜡，所以脱水后还要经过二甲苯以过渡。当组织中全部被二甲苯占有时，光线可以透过，组织呈现出不同程度的透明状态。 二甲苯Ⅰ：30min 二甲苯Ⅱ：10min 1.7.5 组织浸蜡 浸蜡的目的是除去组织中的透明剂（如二甲苯等），使石蜡渗透到组织内部达到饱和程度以便组织包埋。浸蜡时间根据组织的透蜡时间较长，需3h左右。浸蜡应在恒温箱内进行，并保持箱内温度在55℃左右，注意温度不要过高，以免组织发脆。 石蜡Ⅰ：1h
石蜡Ⅱ：1h。 石蜡Ⅲ：1h 1.7.6 组织包埋 将经过透蜡的组织连同熔化的石蜡，一起倒入容器内，然后立即投入冷水中，使其立刻凝固成蜡块的过程。包埋时，将纸盒放在温箱旁边，用镊子夹取组织平放于纸盒底部，，再用温镊子轻轻拨动组织，从温箱中取出盛放纯石蜡的蜡杯，沿壁倒入包埋用的纸盒中，速度要慢。待石蜡凝固（约30min）后放入冰箱保鲜层内以备后用。包埋时应根据组织材料、切片厚度、气候条件等因素，选择不同熔点的石蜡，新的石蜡一般要熬顿几次，以免石蜡固定后有气泡，影响切片。用于包埋的石蜡的熔点在50~60℃之间。 1.7.7 组织切片 （1）从冰箱里拿出蜡块，进行修快 （2）将已固定和修好的石蜡块台木装在切片机的夹物台上。 （3）将切片刀固定在刀夹上，刀口向上。 （4）摇动推动螺旋，使石蜡块与刀口贴近，但不可超过刀口。 （5）调整石蜡块与刀口之间的角度与位置，刀片与石蜡切片约成15度左右。 （6）调整厚度调节器到所需的切片厚度，先调约为25um，待切平后改为5um。 （7）一切调整好后方可以开始切片。此时右手摇动转轮，让蜡块切成蜡带，左手持毛笔将蜡带提起，摇转速度不可太急，通常以40-60r/min。 （8）切成的蜡带到10-20cm长时，右手用另一支毛笔轻轻地将蜡带挑起，以免卷曲，并牵引成带，平放在蜡带盒上，靠刀面的一面较光滑，朝下，较皱的一面朝上。 （9）感觉效果较好的蜡片一小段，用单面刀片切取，再放入约43℃的水浴锅中展片，观察切片是否良好。 （10）切片工作结束后，应将切片刀取下用氯仿擦去刀上沾着的石蜡，把切片机擦拭干净妥为保存。 1.7.8 贴片
21常规石蜡切片制片规范
常规石蜡切片制片规范 1．制片过程中的每一个环节，应确保切片号和蜡块号一致，自始至终不能将号码弄错，一旦发生应重新取材，以防事故发生。 2．制片完成后，应在HE切片上及时粘贴写好本病理科病理号的标签，并认真仔细地核对。 3．认真检查制片质量。切片优良率（甲、乙级片所占的比例）≥90％，优级率（甲级片所占的比例）≥35%。不合格切片应立即重做。4．制片完成后，技术人员应将所制作的切片连同相应的申请单/记录单、取材工作单等一并移交给病理医师，双方经核对无误后，办理移交签字手续。 5．制片工作一般应在取材后2个工作内完成（需要脱钙、脱脂等特殊处理的除外）。 6．制片过程中如发生意外情况，有关技术人员和技术室负责人应及时向病理科主任汇报，并积极设法予以补救。 7．具体HE切片制作技术参见《病理组织学常规制片技术》。 附： 1．取材组织取材的方法是制作切片的一个重要程序，根据教学、科研及外检的具体要求取自人体（外科手术切除标本、活检标本、尸检标本）或动物，并确定取材的部位和方法。取材者需要掌握解剖学、组织学、病理学的基本理论知识，还要掌握实际操作技术，每个组织器官的取材都有一定的部位和方法，不能任意切取组织作为制片材料，不然，无法达到教学、科研和临床诊断的目的，具体要求如下： (1)材料新鲜：取材组织愈新鲜愈好，人体组织一般在离体后，应迅速固定，以保证原有的形态学结构。
(2)组织块的大小：所取组织块较理想的体积为 2.0cm×2.0cm×0.3cm，以使固定液能迅速而均匀地渗入组织内部，但根据制片材料和目的不同，组织块的较理想体积也不同，如制作病理外检、科研切片，其组织块可以薄取0.1～0.2cm即可，这样可以缩短固定脱水透明的时间，若制作教学切片厚取0.3 ～0.5cm，这样可以同一蜡块制作出较多的教学切片。 (3)勿挤压组织块: 切取组织块用的刀剪要锋利，切割时不可来回锉动。夹取组织时切勿过紧，以免因挤压而使组织、细胞变形。 (4)规范取材部位: 要准确地按解剖部位取材，病理标本取材按照各病变部位、性质的不同，根据要求规范化取材。 (5)选好组织块的切面:根据各器官的组织结构，决定其切面的走向。纵切或横切往往是显示组织形态结构的关键，如长管状器官以横切为好。 (6)保持材料的清洁:组织块上如有血液、污物、粘液、食物、粪便等，可用水冲洗干净后再放入固定液中。 (7)保持组织的原有形态:新鲜组织固定后，或多或少会产生收缩现象，有时甚至完全变形。为此可将组织展平，以尽可能维持原形。 2．固定 (1)小块组织固定法：这是最常用的方法，从人体取下的小块组织，须立即置入液态固定剂中进行固定，通常，标本与固定液的比例为1:4～20，但组织块不宜过大过厚，否则固定液不能迅速渗透。故取组织块的大小一般为2.0cm×2.0cm×0.3cm。 (2)注射、灌注固定法：某些组织块由于体积过大或固定液极难渗入内部，或需要对整个脏器或整个动物体进行固定。这时宜采用注射固定或灌注固定法。将固定液注入血管，经血管分支到达整个组织和全身，从而得到充分的固定。 最常用的固定液有10%甲醛固定液和95%乙醇固定液。
石蜡切片制作过程
（一）材料与用具 1．材料： 鱼皮肤、性腺、肠、肝胰脏等。 2．用具： 溶蜡箱、蜡杯、不同熔点的石蜡、酒精灯等。 （二）实验内容与步骤 1．取材及固定 取动物体上的小块组织成为组织块。组织块的大小以不超过 0.5立方厘米为宜。切去组织块时动作要轻，切忌用力牵引或挟持，以免组织内部发生变化。 组织块取下后，先用 0.85％的生理盐水漂洗以洗去血液与污渍，如果是管状组织则必须把管腔中污物洗净，可用注射器自一端向管腔中注射生理盐水数次，使其管腔冲洗干净，切忌不可用刀或其他器具刮之。 由动物身上切取的组织必须是新鲜的，材料越新鲜越好，一般不应超过死后24小时。 如果是管状器官或是其中有分泌之消化液，则死后应迅速采取，以免组织自溶或上皮剥落。 材料由动物体取下后应当迅速固定，固定的目的是尽快使固定液渗入组织内部，将组织固定，以保持其原有的结构。不同的组织应选用适当的固定液。固定液的用量与组织块体积之比一般在20：1。不应使组织块贴于容器壁上，应记录固定液的名称，材料的种类，动物品种及开始固定的时间。 2．冲洗
固定后的组织块在进行脱水前必须用流水洗去固定液。组织块应用纱布包好，注名，放金属水洗网中用流水冲洗，甲醛固定液固定的组织一般水洗24小时，Bouins固定液固定的组织水洗24小时。AFA固定液则不需要水洗。 3．脱水和硬化 经过固定后的组织在水洗后要进行脱水，脱水的目的将组织内的水分用酒精或其他溶剂置换出来，使组织逐渐变硬，便于油类或其他透明及浸入，为熔化的石蜡浸渗到组织中创造条件。 常用的脱水剂是不同浓度的酒精，因为酒精与水有很大的亲和力，酒精浓度可以逐渐升高，置换出组织中的水。脱水必须充分，脱水不充分会影响透明和浸蜡。脱水过程要逐级上升，不能操之过急，跳级脱水会引起组织块强烈的收缩变形。 脱水所用的酒精浓度及过程如下： 30％—→50％—→70％—→80％—→90％—→95％—→100％(Ⅰ)—→100％(Ⅱ)组织块在各级较低浓酒精（小于70％）中脱水的时间应视组织块的大小而定，大小不超过 0.5立方厘米的组织块脱水时间为6～12小时，在高浓度酒精中（大于70％）脱水时间为3小时左右。组织块在无水酒精中需经过两次处理，以保证脱净水分。由于无水酒精有使组织变脆的缺点，故在无水酒精中脱水的时间不宜过长，一般应在15～30分钟左右。 在脱水瓶中酒精的量与组织块之比约为50：1。 简化步骤如下： 70%（一夜）——80%（1小时）——90%（30分）——95%（30分）——100%（15分）——酒精+二甲苯（15分）——二甲苯（3分）——石蜡+二甲苯（30分）——石蜡（80分） 4．透明
石蜡切片步骤
石蜡切片基本步骤 （一）取材和固定 根据实验目的选择材料。将整个虫体或虫体的内部器官（如肠道、马氏管、唾液腺等）取出后，立即投入固定液。 取材大小：0.5cm×0.5 cm×0.2或者1.0 cm×1.0 cm×0.2，厚度不宜超过3mm。 固定液：2.5%的戊二醛固定液，Bouin氏液，10%甲醛等。 固定时间：4oC固定24小时。 注意事项： 取材：1．勿使组织块受挤压切取组织块所用刀、剪要锋利，切割时不可来回切割。夹取组织时，镊子要轻，切勿挤压，以免损伤组织。取材时，组织块可稍大一点，以便在固定后，将组织块的不平整部分修去。 2.选好组织块的切面应熟悉器官组织的组成，并根据观察目的来确定纵切或横切。 3．保持材料的清洁组织块上如有血液、污物、粘液、食物等，先用生理盐水冲洗干净，再入固定液。 4．切除（清除）不需要的部分特别是组织周围的脂肪等，应尽可能清除掉，以免影响以后的程序和观察。 固定：1．材料新鲜取出组织后须立即固定。否则时间相隔过久，体积就要收缩变形或发生自溶现象。 2．抽气生物组织常有气体的存在，使材料不能沉入固定液中，抽气使得固定液有效渗入。真空泵抽气或者用空针管抽气。昆虫整体固定，固定前用解剖针刺数个小孔，以利用固定液渗透。 3．固定剂用量一般为组织体积的10~20倍。勿使组织贴于瓶底或瓶壁，以免影响固定剂的渗入。 4．避免阳光尽可能避免接触阳光以免失去固定作用。 5．加速固定轻轻摇动盛器使组织移动有利于固定液渗入，对长期固定的标本可经常更换固定液。
（二）洗涤 2.5%戊二醛固定液固定的组织：0.2M, pH7.2磷酸缓冲液漂洗三次，每次10min Bouin氏固定液固定的组织：直接入70%酒精更换数次即可脱水，注意苦味酸。 甲醛固定的组织：直接投入50%或70%酒精脱水，不经水洗。但如果在甲醛中时间过长，则仍应当用流水冲洗。 陈旧性标本和混合性固定液应及时洗涤，有利于脱水、切片和染色。否则会影响以后的染色效果。 （三）脱水与透明 漂洗后即入酒精脱水，经50%，70%，80%，90%，95%，100%酒精脱水，其中95%，100%酒精需重复两次。每级10min。 脱水后，入1/3二甲苯+2/3乙醇混合液→1/2二甲苯+1/2乙醇混合液→2/3二甲苯+1/3乙醇混合液→二甲苯→二甲苯，每次约10min，至组织透明为止。 注意： 1. 一般经水洗的材料脱水可从35%开始，柔弱的材料从15%开始，若用酒精洗涤，则可直接移入50%或70%酒精中继续脱水。 2. 每级脱水时间，依照材料的大小、性质以及留在固定液中的时间长短和固定液的溶解性而定。动物组织每级10~30min。 3. 脱水应彻底，否则与二甲苯混合后混浊，必须倒回重脱水且效果不好；如需过夜，则停留在70%酒精中。 （四）透蜡 透明后，先把组织材料块放在熔化的石蜡和二甲苯的等量混合液浸渍3小时，再先后移入2个熔化的石蜡液中浸渍6小时左右，直至用石蜡完全置换了组织块中的二甲苯，浸蜡应在高于石蜡熔点3℃左右（60°C）的温箱中进行，以利石蜡浸入组织内。便于今后的包理与切片。
石蜡切片的制作
石蜡切片的制作 一：试验目的 掌握石蜡切片的制作 二：器材和试剂 实验动物、手术刀、手术剪、镊子、托盘、标本缸、石蜡切片机、恒温箱、水浴锅、温度计、烧杯、电磁炉、石蜡、包埋纸盒、毛笔、载玻片、盖玻片、中性树胶、染色架、鸡蛋清、甘油、甲醛、各级浓度的酒精(50%、70%、80%、85% 、90%、95%、100%)、二甲苯、苏木精、伊红、盐酸、蒸馏水、30%三氯化铁液。 三：试剂配制 苏木精染液：甲液：苏木精1g、无水酒精100ml;乙液：30%三氯化铁液4ml、蒸馏水 100ml、盐酸1ml。使用时将甲液、乙液等量混合。 伊红染液：伊红1g、95%酒精100ml、冰醋酸1-2滴。 1%盐酸酒精：盐酸1ml、70%酒精99ml。 福尔马林：甲醛10ml、蒸馏水90ml。 蛋白甘油1:1配制 四：实验步骤 1.取材和固定 处死实验动物，迅速取出所需的组织，清洗干净放入福尔马林中固定，12h后换福尔马林。 注意事项： （1）取材动作要迅速，不宜作太久的拖延以免组织细胞的成分、结构等发生变化。 （2）切片材料应根据需要观察的部位进行选择，尽可能不要损伤所需要的部分。 （3）材料固定完毕后，保存于严密紧塞或加盖的标本缸里，同时在容器外上标签。标签上注明固定液、材料来源、日期等。 ⑷如需清洗的材料可用生理盐水轻轻擦洗。 2.清洗 材料固定后，用清水清洗4小时 2.脱水： 50%酒精12h,在依次经70%、85%、95%、100%各级酒精溶液脱水1-2h。 注意事项： (1)脱水必须在有盖的玻璃品中进行，防止吸收空气中的水分和酒精挥发。 (2)在低浓度酒精中，每级停留不宜太长，否则易使组织变软，助长材料的解体。
电镜切片样品制作步骤
扫描电镜样品的准备 A悬浮培养的细胞、细菌、血细胞、精子等； 细胞使用PBS或无血清培养基离心漂洗1~2次以去除血清，离心转速依据不同离心机、不同样品自定，总时间控制在5min内；细胞团根据预设浓度在适量 2.5%戊二醛吹悬，滴加在预先置入青霉素小瓶中的托盘，4℃静置沉降2~3天，在托盘周围加入PBS，以防止样品干燥。 B贴壁培养的细胞： 在培养皿中预先加入盖玻片，使细胞贴附于盖玻片上；PBS或无需请培养基漂洗后，放置在培养板室温固定1h，4℃3 h，注意放置干燥，自行转入青霉素小瓶中，加满PBS送检。 SEM标本处理必须使用玻璃容器，需明确所用盖玻片尺寸可以放入青霉素瓶。 C组织取材 样品观察表面可达8~10mm2,高度小于5mm左右； 样品表面在固定前必须清洁： 使用生理盐水或PBS冲洗掉表面的灰尘以及不需要观察的蛋白、粘液等。能够明确标识标本的观察面。消化道、呼吸道、血管、生殖器官、泌尿等官腔内表面，尤其要注意先清洗再固定。 如需要观察脏器内结构，应依照不同的实验目的，决定目的脏器是否需要灌注清洗；固定 2.5%戊二醛浸没标本，室温1h，4℃固定3h以上，换PBS送检。 附： 2.5%戊二醛的配制
Step 1: 0.2M磷酸缓冲液的配制：--------------------- 磷酸二氢钠（NaH2PO 4.H2O） 2.6xx 磷酸氢二钠(Na2HPO 4.12H2O)29xx 双蒸馏水加至500毫升pH调至 7.4 Step 2: 戊二醛固定液的配制： --------------------- 25%戊二醛1ml 双蒸馏水4ml 0.2mol/L磷酸缓冲液5ml 戊二醛最终浓度 2.5% pH值 7.3-
小鼠部分组织的石蜡切片制作
小鼠部分组织的石蜡切片制作 一、实验原理：利用脱水剂除去组织中的水分，再用透明剂二甲苯可以去除脱水剂酒精，而二甲苯可以溶解石蜡并将其导入到已脱水的组织细胞中，然后用熔化的石蜡对组织进行包 埋，冷却后即可将柔软的组织包埋在石蜡中，使其具有一定硬度，且不改变其大小和形状。用旋转切片机可将其切为极薄的薄片，经染色、脱水、装片后在显微镜下可以清晰地观察其 组织结构。 二、材料与用具 1 ?材料：小鼠肝脏、脾脏等。 2 ?用具：溶蜡箱、蜡杯、不同熔点的石蜡、酒精灯等。 三、实验内容与步骤 1 .取材及固定 取小鼠，采用拉颈处死或麻醉处死法将其杀死，取其脾脏和肝脏，切为边长约为0.5cm的组 织块。用先用0.85%的生理盐水漂洗以洗去血液与污渍，如果是管状组织则必须把管腔中污 物洗净，可用注射器自一端向管腔中注射生理盐水数次，使其管腔冲洗干净，切忌不可用刀 或其他器具刮之。 由动物身上切取的组织必须是新鲜的，材料越新鲜越好，一般不应超过死后24 hr。如果是 管状器官或是其中有分泌之消化液，则死后应迅速采取，以免组织自溶或上皮剥落。 取下的材料马上进行固定，采用FAA固定液，固定液的用量与组织块体积之比一般在20:1 , 固定时间2 hr以上，超过24hr时可继续浸泡或转入70%酒精中保存。不应使组织块贴于容器壁上，应记录固定液的名称，材料的种类，动物品种及开始固定的时间。 2 .冲洗 固定后的组织块在进行脱水前用70%酒精洗去固定液。 3 .脱水和硬化 经过固定后的组织在水洗后要进行脱水，脱水的目的将组织内的水分用酒精或其他溶剂置换 出来，使组织逐渐变硬，便于油类或其他透明及浸入，为熔化的石蜡浸渗到组织中创造条件。 常用的脱水剂是不同浓度的酒精，因为酒精与水有很大的亲和力，酒精浓度可以逐渐升高，置换出组织中的水。脱水必须充分，脱水不充分会影响透明和浸蜡。脱水过程要逐级上升，不能操之过急，跳级脱水会引起组织块强烈的收缩变形。 脱水所用的酒精浓度及过程如下： 30%> 5C%> 7%> 80%> 9%> 95%> 10（% （I ）> 10（% （n ） 组织块在各级较低浓酒精（小于70% ）中脱水的时间应视组织块的大小而定，大小不超过 0.5立方厘米的组织块脱水时间为6?12 hr，在高浓度酒精中（大于70%）脱水时间为3 hr 左右。组织块在无水酒精中需经过两次处理，以保证脱净水分。由于无水酒精有使组织变脆 的缺点，故在无水酒精中脱水的时间不宜过长，一般应在15?30 min左右。在脱水瓶中酒 精的量与组织块之比约为50:1。 简化步骤如下： 70% （一夜）——80% （1 hr）——90% （30 分）——95% （30 分）——100% （15 分）——酒精+二甲苯（15分）——二甲苯（3分）——石蜡+二甲苯（30分）——石蜡（80分） 4 .透明 透明是石蜡切片法切片前必经的一步。其目的在于用矿物油或植物油等透明剂置换出无水酒 精，以便于熔化的石蜡浸渗到组织间隙中，故透明剂必须是能分别与石蜡和酒精相溶的。经