核蛋白提取法
Buffer A： HEPES (pH 7.9) 10Mm
MgCl2 1.5mM
KCl 10mM
Buffer C: HEPES pH 7.9 20mM
MgCl2 1.5mM
NaCl 420mM
EDTA 0.2mM
Glycerol 25%,v/v
用前加入0.5ul 1M的DTT，2ul 100mM的PMSF以及在每ml Buffer中加入10ul 蛋白酶抑制剂。
100 mM PMSF：174.2mg PMSF+10ml 水
步骤为：
1．用冷D-PBS洗两次细胞
2．刮除细胞入1ml D-PBS中
3．离心细胞3000rpm，5分钟
4．用400ul Buffer A重悬细胞，并上肿胀细胞10分钟，vortex10秒
5． 1000rpm离心10秒，弃上清
6． 12000rpm离心5分钟，弃上清
7．重悬细胞在50-100ul Buffer C中，置于冰上20分钟
8． 12000rpm离心5分钟，转移上清于另一EP管中
9．定蛋白，分装于-70℃保存
0.5M EDTA
1M 碳酸钠：3.277g+ 20ml H2O
Buffer A: HEPES (pH 7.9) 0.28698g
1M MgCl2 0.15ml
1M KCl 1ml
H2O to 100ml
Buffer B HEPES (pH 7.9) 0.57396g
1M MgCl2 0.15ml
NaCl 2.45448g
(10mM) EDTA 2ml
Glycerol 25ml
H2O to
脑核蛋白抽提
Brain Nuclear Extracts (2/97, AG; modified from David Frank) Lysis Procedure 1. Place small piece of frozen ctx (approx one hemisphere of E18 Ctx) in 1 ml PBS lysis buffer. 2. Homogenize with dounce homogenizer (5 strokes with A, 5 strokes with B). 3. Transfer homogenate to eppendorff tube. Spin at 4 C for 5 mins. 4. Discard supernatant, resuspend pellet (nuclei) in 1 ml Extraction Lysis Buffer. 5. Sonicate nuclei with two 15 sec bursts. 6. Spin at 4 C for 15 mins. 7. Recover supernatant and transfer to new tube. 8. Quantify protein concentration by Bradford Assay. Label tubes and freeze at -70 C. 9. To run lysate in gel, suspend required amount in 2X SDS sample buffer (50 μl) with b-mercapto-ethanol, boil, cool on ice, and load. Note: To make whole brain lysate, go directly to step 4 and start by placing tissue in 1 ml extraction buffer.
汉坦病毒@
汉坦病毒
Hantavirus
汉坦病毒属病原学
布尼亚病毒科汉坦病毒属，-ssRNA分3个节段 L RNA M RNA
包膜
S RNA
G2包膜糖蛋白
血凝
核衣壳蛋白 RNA聚合酶
G1包膜糖蛋白
受体吸附、中和抗原
细胞培养：金黄地鼠肾细胞、Vero细胞、 恒河猴肾细胞等多种细胞中缓慢增殖， 可形成包涵体
易感动物：黑线姬鼠、乳小白鼠等
黑
线
姬
小白鼠
鼠
汉坦病毒型别、动物宿主、致病性及分布
病毒型别
动物宿主
汉滩病毒
黑线姬鼠
（hantaan
virus，HTNV）
首尔病毒
褐家鼠
（Seoul virus，
SEOV）
辛诺柏病毒
草原
（Sin Nombre 鹿鼠
virus，SNV ）
所致疾病
分布地区
肾综合征出血热
（hemorrhagic fever with renal syndrome， HFRS）
朝鲜，中国 和远东地区
HFRS
中国，朝鲜
（高热、出血、肾损 和日本等
害）
汉坦病毒肺综合征
南、北美洲
（hantavirus
pulmonary syndrome，
HPS） （急性肺水肿，成
人呼吸窘迫征，青壮年多见）
HFRS的特点
9人群普遍易感，隐性感染少
9临床特征：
高热、出血、肾损害
三痛＝头痛、眼眶痛、腰痛
三红＝面部、颈部、胸部潮红
95期临床表现：
发热期、低血压休克期、少尿期、
多尿期、恢复期 9病死率：~15% 9免疫性：持久
病毒性出血热病的“3H”：
hyperpyrexia
hemorrhage
hypotention
5
凯基核蛋白和胞浆蛋白提取试剂盒
凯基核蛋白和胞浆蛋白提取试剂盒 Cat Number：For Research Use Only Store at -20℃for one year Expire date： 一、试剂盒说明 本试剂盒用于从哺乳动物组织和培养细胞中提取核蛋白和/或胞浆蛋白，提取制备过程简便。制备的核蛋白和胞浆蛋白能保持天然活性，并且纯度较高。提取的蛋白可用于进一步的转录因子活性分析、凝胶阻滞实验(gel shift assay)、免疫共沉淀、Western Blotting、酶活性测定等后续蛋白质研究。 二、试剂盒组份 三、操作步骤 Ⅰ 实体组织蛋白的提取 1、组织样本，将组织剪切成小块，加入适量的冰冷PBS均浆后，静置5 min ， 弃沉淀，小心吸取上清转移至另一离心管中； 2、上清4℃离心500×g，3 min，弃上清，估计细胞压积PCV（离心后的 紧实细胞体积）； 3、每20μL细胞压积中，加入200μL预冷的Buffer A【使用前每mL Buffer A加入1μL DTT，5μL 100mM PMSF，5μL蛋白酶抑制剂】，最大转速涡旋剧烈振荡15s，放置冰上10～15min； 4、加入11μL冷Buffer B，最大转速涡旋剧烈振荡5s，放置冰上1min； 5、再次最大转速涡旋剧烈振荡5s后，4℃离心，16000×g,5min； 6、尽快将上清转入另一预冷的洁净微量离心管，置于冰上，即得胞浆蛋白； 7、在离心沉淀物（细胞核）中加入100μL预冷的Buffer C (使用前每mL Buffer C加入1μL DTT，5μL 100mM PMSF，5μL蛋白酶抑制剂)，最大转速涡旋剧烈振荡15s，放置冰上40min，每间隔10 min涡旋剧烈振荡 15 seconds； 8、4℃离心，16000×g,,10min，尽快将上清转入一预冷的洁净微量离心管， 即得核蛋白； 9、上述提取的胞浆蛋白和核蛋白进行蛋白定量（Braford法或BCA法）， 分装并保存于-80℃，避免反复冻融。 Ⅱ 培养细胞蛋白提取
蛋白-细胞核蛋白提取方法
提取细胞核蛋白的步骤： 1.向培养细胞的平皿中加入少量（保证在1.5ml TUBE内能放下）冷PBS(或1*D-Hanks) 2.，用细胞刮刀尽可能多的刮下细胞，收集到1.5ml的离心管中。 在预冷的离心机中，４度，1000rcf，1－3分钟，沉降细胞。 为尽可能多的获得细胞，可将一次离心后的上清再重复刮细胞一次； 2. 将细胞重悬于cell lysis buffer中（加入体积106细胞/200uL，体积估计方法还是没确 定,should be sufficient; 一般就是一个10cm平皿加1ml cell lysis buffer）,添加蛋白酶抑 制剂；先破细胞膜，得到细胞核（没有用B DOUNCE）； 冰上放置（不震荡，可偶尔用枪轻吹）30分钟至1小时（此时核膜没有破，有核染色为证），充分裂解； cell lysis buffer： 5mM PIPES pH 8.0 85mM KCL, 0.5% NP40, 1% protein inhibitor; 3. ４度，1000rcf，20分钟，上清为胞质蛋白（蛋白浓度比较低，如需要检测，建议先 浓缩一下），沉淀为细胞核； 此时可以将沉淀冻存于－70℃； 4. 将沉淀重悬于100-200 ul nucleai lysis buffer（体积视目的蛋白表达丰度而定，一般 50-100ul）中，添加蛋白酶抑制剂，冰上放置30分钟至1小时（每5分钟震荡一次），充分裂解；可以观察到沉淀慢慢消失，溶液变澄清； nucleai lysis buffer：成分同SDS lysis buffer； 50mM Tris-Cl pH 8.1, 10mM EDTA, 1% SDS, 1% protein inhibitor; 5. 四度，最大转速离心，10分钟以上（尽可能沉淀完全），上清即为细胞核蛋白； （此文档部分内容来源于网络，如有侵权请告知删除，文档可自行编辑修改内容， 供参考，感谢您的配合和支持） 编辑版word
真核细胞裂解和总蛋白提取试验的标准操作规程
真核细胞裂解和总蛋白提取试验的标准操作规程（编号：032） 1、目的及适用范围 该SOP用来规范真核细胞裂解以及细胞中总蛋白提取的操作。 2、主要仪器 细胞刮刀、冰盒、冷冻台式高速离心机、垂直混匀仪、微量移液器 3、试剂及配制方法 3.1 PBS（pH7.4）：NaCl 8g、KCl 0.2g、Na2HPO4·12H2O 3.58g、 KH2PO4 0.24g，定容至1L。3.2细胞裂解液：1% NP40、150mM NaCl、20mM Hepes pH7.5、10% glycerol、mM EDTA；使用时在每40mL细胞裂解液中加入1片蛋白酶抑制剂cocktail，保存于-20℃。 4、相关器皿的预处理 所有相关容器和器具均需要预冷 5、操作步骤 5.1 吸出要收获的细胞的培养基。 5.2 用PBS洗细胞2次，以完全除去培养基，置于冰上。 5.3 加入合适体积的细胞裂解液（具体加入的量可参照问题向导2），用细胞刮刀将细胞刮下后用移液器将细胞裂解液收集至离心管中。 5.4 将离心管置于冰上10min。 5.5 将离心管放入垂直混匀仪，于4℃中快速垂直混匀30min，以使细胞充分裂解。 5.6 30min后，将离心管拿出，于4℃下12000rpm离心15min。 5.7 吸取上清于新的离心管中，上清即为收获的细胞总蛋白；弃去沉淀，沉淀为细胞核和未破碎的 细胞。 6、问题向导 6.1如果要收取的蛋白为核内蛋白，可以在细胞裂解液里加入0.1%-0.5% 的Triton-100，以裂解核膜，释放核蛋白。 6.2加入的细胞裂解液的量根据收获细胞的培养皿规格以及想要获得的目的蛋白的浓度来决定，正常情况下的比例为： 100mm 皿：1.0mL-1.2mL 63
胞浆蛋白—核蛋白抽提试剂盒说明书
胞浆蛋白—核蛋白抽提试剂盒 产品编号产品名称包装 SINP001 胞浆－核蛋白抽提试剂盒50× 产品简介：细胞核和细胞浆目前成为研究细胞组分的两个热点，获得高浓度的细胞核蛋白和细胞浆蛋白成为得到好的研究结果的重要实验过程。本试剂盒主要原理是在低渗透压条 件下，使细胞充分膨胀，然后破坏细胞膜，释放出细胞浆蛋白，离心得到细胞核沉 淀。最后通过高盐的细胞核蛋白抽提试剂抽提得到细胞核蛋白。本试剂盒是本公司 非放射性EMSA试剂盒（cat; SIDET001, SIDET003, SIDET004,）实验成功的重要部 分，经BCA测定24cm2贴壁细胞(或50ml规格培养瓶养的悬浮细胞)抽提物，核蛋白 浓度约为 2.5ug/ul或更高。抽提得到的蛋白可以用于Western，EMSA， footprinting，报告基因检测以及酶活力测定等后续操作。本试剂盒可足够您进行 50次抽提操作！ 包装清单： 试剂包装总量 5X Buffer A 1瓶35ml/瓶 2X Buffer B1支 1.5ml/支 Solution I（溶液I）1支 1.75ml/支 Solution II（溶液II）1支 1.75ml/支 Solution III（溶液III）1支 1.5ml/支 PMSF Solution 1支0.85ml/支 User Manual (说明书) 1份1份/Kit 保存温度： 4℃保存。 Ⅰ.准备抽提试剂：按照下列方法制备胞浆－核蛋白抽提液： 1.制备3ml胞浆蛋白裂解液I ： 试剂体积 5X Buffer A0.6ml Solution I（溶液I）30ul Solution II（溶液II）30ul PMSF Solution 15ul dd-H2O 2.325ml 总体积 3.0ml 注：PMSF Solution须在抽提试剂加入到样品中前2-3分钟内加入。
简单实用的核蛋白提取方法
Subject: Nuclear(核) Protein Extraction Materials: Tissue(liver, spleen, testis, etc), CHB, CRB, PBS, 10% NP40 Centrifuge, Eppendorf tube, Micropipette, tip Methods ①Sacrifice the mice by cervical dislocation. ②Pick the organ and put it into the vials(CryoTube) . ③Add 700 ?of PBS and Homogenization. ④Centrifuge (4000rpm, 5 min, RT) ⑤Aspirate supernatant, resuspend the tissue pellet in (5×volume of pellet) CHB. ⑥Incubate it on ice for 10min. ⑦Centrifuge (4000rpm, 10 min, RT) ⑧Aspirate supernatant. ⑨Resuspend tissue pellet in (3×volume of pellet) CHB-NP40.(10%NP40 : 1?/100?) ⑩Vortexing and pumping(30 times) ?Centrifuge (4000rpm, 10 min, 4℃) ?Remove the supernatant into a EP-tube and then put it into a -20℃freezer. (Cytoplasm ) ?Resuspend the pellet : Add 200?of CRB + 12?of 5M NaCl by gently pipetting. ?Incubate it on ice for 30 min. ?Centrifuge (12000rpm, 10 min, 4℃)
生工 细胞核蛋白提取试剂盒
细胞核蛋白质提取试剂盒 Nucleoprotein Extraction Kit 产品编号：C500009 包装规格：50 Assays 产品简介 本试剂盒提供独特的组份，采用特殊的非离子型去污剂，以及焦磷酸钠等数种蛋白磷酸酶和蛋白酶抑制试剂，能够在非变性和低渗的条件下裂解细胞，经过洗涤去除大部分胞质蛋白和膜蛋白，释放的细胞核能够保持完整，再用Lysis Buffer 对 细胞核蛋白质进行抽提的同时可以保持核蛋白质的活性，因此该产品可合适用于SDS-PAGE 电泳、Western Blot 、免疫共沉 淀、EMSA 、Pull Down 和转录调控等后续蛋白质或分子生物学相关实验的研究，每次可以从107 个培养细胞或200 mg 动物 组织提取核蛋白质，本试剂盒可以使用50次。 产品特点 1. 提取的核蛋白质可以最大限度的保持蛋白质的活性，可以用于EMSA ，转录因子分析的实验。 2. 可以从50x107 个培养细胞或50x200 mg 动物组织提取核蛋白。 3. 整个实验过程只需要45分钟左右。 4. 在提取的过程中，最大限度的减少了膜和胞质蛋白对核蛋白的污染。 5. 不需要超速度离心，可以同时处理多个样品。 运输和保存条件 常温下运输，在收到后，将磷酸酶抑制剂，PMSF 和DTT 在-20℃的环境中保存，其余2-8℃保存，保质期一年。 产品组成 成分 C500009 Lysis Buffer 10 mL Hypotonic Buffer 50 mL 磷酸酶抑制剂 300 μL PMSF 600 μL DTT 60 μL 操作步骤 A 实体组织蛋白的提取 1. 在每1mL 冷Hypotonic Buffer 加入5 μL 磷酸酶抑制剂，10 μL PMSF 和1 μL DTT 混匀。冰上保存数分钟待用。 2. 将100-200mg 固体组织置于培养皿中，手术剪将小块充分剪碎，尽量去除脂肪组织和结缔组织等非目的组织，用PBS 洗涤两次，离心，取沉淀后加入0.6 mL 冷Hypotonic Buffer 混匀， 4℃下玻璃匀浆器上下手动匀浆30-50 次。或超声破碎细胞，每次30 sec ，3～4 次，每次间隔1 min ，置于冰上冷却。均质匀浆或超声破碎细胞后应镜检，细胞破碎率不小于90％，同时没有明显的组织小块。 3. 转移到1.5 mL 预冷的离心管，手指弹管壁使沉淀悬起，冰浴10 min ，震荡10 秒钟，混匀。 4. 在4℃，800g (3000 rpm)离心5 min ，立即弃上清，再加0.4 mL 冷Hypotonic Buffer 震荡洗涤沉淀 30sec ，再 4℃，2500 g (5000 rpm) 离心5 min ，弃掉上清。 s a n g o n b i o t e c h
核蛋白提取试剂盒使用说明
核蛋白提取试剂盒使用说明 货号：R0050 规格：50T/100T 产品内容： 试剂盒组成50T100T 浆蛋白抽提试剂25ml50ml 核蛋白抽提试剂5ml10ml PMSF300ul1ml 保存：核/浆蛋白抽提试剂4℃保存，PMSF于-20℃保存。 产品简介： 核蛋白提取试剂盒提供了一种简单、方便的从培养细胞或新鲜组织中抽提核蛋白的方法。整个过程只需约60分钟就可以将核蛋白和浆蛋白从细胞中分离出来。得到的蛋白可以用于Western blot等实验。本试剂盒通过浆蛋白抽提试剂使细胞膨胀破裂，释放出胞浆蛋白，再通过离心得到细胞核。然后通过核蛋白抽提试剂抽提得到细胞核蛋白。本试剂盒可以抽提50/100个样品（每个样品约2×106个Hela细胞，40mg）。 操作方法： 裂解蛋白的所有步骤都需在冰上或4℃进行。 一、对于体外培养细胞： 1．根据用量取适当的浆蛋白抽提试剂和核蛋白抽提试剂加入PMSF，使
PMSF的最终浓度为1mM。PMSF需现用现加，若目标蛋白含有丰富的半胱氨酸，可以在两种蛋白抽提液中加入DTT至终浓度0.5mM。 2．对于贴壁细胞，去除培养液，用PBS洗一遍，用细胞刮刀收集细胞，或用EDTA消化后吹打下细胞（最好不用胰酶硝化，以免胰酶消化目的蛋白）。500g离心2～3分钟收集细胞，吸尽上清留下沉淀备用。 3．对于悬浮细胞：用PBS洗一遍，500g离心2～3分钟收集细胞，吸尽上清，留下细胞沉淀备用。 4．每20ul细胞沉淀加入200ul浆蛋白抽提试剂（2×106个细胞沉淀约20ul或40mg）。 5．用移液器吹打或高速涡旋15秒（可适当延长），必须使细胞沉淀完全分散开成单细胞悬液。细胞沉淀分散不完全会导致蛋白产量降低。 6．冰浴10分钟。 7．最高转速剧烈涡旋10秒，4℃12000～16000g离心10分钟。 8．上清即为抽提得到的细胞浆蛋白，立即吸取上清至预冷的样品管中备用，进行后续的PAGE、Western等实验，但蛋白浓度较低，可根据需要进行相应浓缩。 9．沉淀即为细胞核，要完全吸尽残余的上清（避免细胞浆蛋白的污染），加入50-100ul核蛋白抽提试剂。 10．用移液器吹打或高速涡旋15秒（可适当延长）至沉淀完全分散，冰浴10分钟。 11．最高转速剧烈涡旋10秒，4℃12000～16000g离心10分钟。
核蛋白提取试剂盒说明书
核蛋白提取试剂盒说明书 货号：R0050 规格：50T/100T 产品内容： 试剂盒组成50T100T 浆蛋白抽提试剂25ml50ml 核蛋白抽提试剂5ml10ml PMSF（100mM）300μl1ml 保存：核/浆蛋白抽提试剂4℃保存，PMSF于-20℃保存。 产品简介： 本试剂盒提供了一种简单、方便的从培养细胞或新鲜组织中抽提核蛋白的方法。整个过程只需约60分钟就可以将核蛋白和浆蛋白从细胞中分离出来。得到的蛋白可以用于Western blot等实验。本试剂盒通过浆蛋白抽提试剂使细胞膨胀破裂，释放出胞浆蛋白，再通过离心得到细胞核。然后通过核蛋白抽提试剂抽提得到细胞核蛋白。本试剂盒可以抽提50/100个样品（每个样品约2×106个Hela细胞或40mg组织）。 操作方法： 裂解蛋白的所有步骤都需在冰上或4℃进行。 一、对于体外培养细胞： 1．根据用量取适当的浆蛋白抽提试剂和核蛋白抽提试剂加入PMSF，使PMSF的最终浓度为1mM。PMSF需现用现加，若目标蛋白含有丰富的半胱氨酸，可以在两种蛋白抽提液中加入DTT至终浓度0.5mM。 2．对于贴壁细胞，去除培养液，用PBS洗一遍，用细胞刮刀收集细胞，或用EDTA消化后吹打下细胞（最好不用胰酶硝化，以免胰酶消化目的蛋白）。500g离心2～3分钟收集细胞，吸尽上清留下沉淀备用。3．对于悬浮细胞：用PBS洗一遍，500g离心2～3分钟收集细胞，吸尽上清，留下细胞沉淀备用。4．每20μl细胞沉淀加入200μl浆蛋白抽提试剂（2×106个细胞沉淀的体积约20μl或40mg）。 5．用移液器吹打或高速涡旋15秒（可适当延长），必须使细胞沉淀完全分散开成单细胞悬液。细胞沉淀分散不完全会导致蛋白产量降低。
细胞核质蛋白分离
介绍 核蛋白抽提试剂可以从哺乳动物培养的细胞或组织中逐步分离和制备细胞质和细胞核提取物。不变性的活性蛋白在不到两小时内纯化。在细胞颗粒中加入前两种试剂会导致细胞膜破裂和细胞质内容的释放。用离心法从细胞质提取液中提取完整细胞核后，用第三试剂从细胞核中提取蛋白质。用这种产品提取的核和细胞质组分提取物一般污染率不到10%，这对于大多数涉及核提取物的实验来说是足够的纯度 核抽提物比起全细胞裂解物通常更适合于进行基因调控研究。全细胞裂解液中的细胞成分对核蛋白的相互作用和稳定性有不利影响，核蛋白更集中于核提取物，而非全细胞裂解物。核提取物/试剂与多种下游应用兼容（包括Western blotting，BCA蛋白定量分析（产品编号23225），凝胶移位（产品编号20148），报告基因和酶活性的测定） 重要产品信息 ●此试剂盒适用于新鲜（未冷冻）的细胞或组织样品。使用蛋白酶抑制剂维持提取物的完 整性和功能。使用前，将蛋白酶抑制剂加入CRE I和NER浓缩物中以减少试剂稀释（浓缩蛋白酶抑制剂eg.100x）。不需要添加蛋白酶抑制剂到CER II。 ●如果在随后应用中需要大量的核提取物或出现问题，透析前用核提取物清除多余的盐。 试剂盒中的洗涤剂是不可透析的，但它主要是在细胞质中。使用Thermo Scientific?Slide-A-Lyzer?小型透析装置进行透析。另外，无回收蛋白或条块分割的不利影响下，NER 用于提取液的体积可以减小2倍可以得到更集中的核提取物。 ●在4°C条件下执行所有离心步骤，保持细胞样本和提取物在冰上。 额外所需材料 ●蛋白酶抑制剂 ●磷酸盐缓冲盐水(PBS) 细胞培养制备 ●贴壁细胞，用胰蛋白酶-EDTA消化，然后在500g离心5分钟。对于悬浮细胞，通过离 心在500G 5分钟收获。 ●用PBS重悬细胞颗粒冲洗细胞 ●1-10×106细胞转移至1.5ml离心管，并在500G 离心2-3分钟 ●使用吸管小心地去除和丢弃上清液，使细胞颗粒尽可能干燥。 ●在细胞中加入冷的CRE I（表1）。使用表1所示的试剂体积进行细胞质和核蛋白提取 不同细胞体积对应的试剂体积 红细胞压积(μL) CER I (μL) CER II (μL) NER (μL) 10 100 5.5 50 20 200 11 100 50 500 27.5 250 100 1000 55 500 *Hela细胞2×106细胞相当于20μL红细胞体积.
核蛋白提取protocol
Cytoplasmic and Nuclear Protein Extraction Materials: Reagents: Low Salt Buffer-For 10mL 200μL of 1M HEPES pH 7.9 2.5mL of glycerol 15μL of 1M MgCl2 200μL of 1M KCl 8μL of 250mM EDTA 100μL of 100mM DTT郃DD FRESH! 50μL of 100mM PMSF郃DD FRESH! 6.927mL of dH2O High Salt Buffer-For 10mL 200μL of 1M HEPES pH 7.9 2.5mL of glycerol 15μL of 1M MgCl2 2.67mL of 3M KCl 8μL of 250mM EDTA
100μL of NP-40 100μL of 100mM DTT郃DD FRESH! 50μL of 100mM PMSF郃DD FRESH! 4.357mL of dH2O Sucrose Buffer w/o NP-40-For 10mL 3.2mL of 1M Sucrose 300μL of 0.1M CaCl2 20μL of 1M MgAc 4μL of 250mM EDTA 100μL of 100mM DTT郃DD FRESH! 50μL of 100mM PMSF郃DD FRESH! 6.326mL of dH2O Sucrose Buffer w/ NP-40-For 1mL 1mL of Sucrose Buffer w/o NP-40 5μL of NP-40 Procedure: PERFORM ALL STEPS ON ICE! 1. Collect cells from 1 confluent T75 (scraping or trypsinizing, doesn抰matter). 2. Wash cells once with ice-cold PBS and repellet. 3. Resuspend cells in 1mL ice-cold PBS and transfer to an eppendorf tube. 4. Pellet cells at 200xg for 5 minutes. 5. Resuspend cells in 200mL Sucrose buffer with NP-40 by gently pipetting with a 1000mL tip, and incubate on ice for 5 minutes to lyse. 6. Pellet nuclei by centrifugation at 1500xg for 5 minutes and transfer the supernatant (cytoplasmic fraction) to a new tube. (NOTE: It抯best to leave the last 50mL at the bottom of the tube out of your cytoplasmic fraction, this reduces the likelihood of contaminating the cytoplasmic fraction with nuclear protein.) 7. Gently resuspend the nuclei in 1mL Sucrose buffer without NP-40. 8. Pellet the nuclei at 1500xg for 5 minutes. Discard supernatant. This and the above step removes leftover cytoplasmic contaminants using a sucrose cushion. 9. Gently resuspend nuclei in 50mL LOW salt buffer (nuclei should be semi-granular, and intact). 10. Add 0.2X volume HIGH salt buffer and gently flick tube. 11. Continue adding 0.2X HIGH salt buffer and gently flicking until 1X volume has been added OR the nuclei begin to shrink and viscosity increases (it generally takes me about 0.4X volume with HeLa cells). 12. Incubate tubes on the rotary platform in the cold room for 20 minutes 13. Centrifuge at 13000xg for 15 minutes. 14. Retain supernatant (nuclear fraction). QC Controls: β-Tubulin and PARP Western Blots on both nuclear and cytosolic samples NOTE: This method is low-salt, so it does not disrupt cytoskeletal interactions, which means you WILL pellet most if not all of any cytoskeletal proteins. This includes nuclear cytoskeletal proteins.
核蛋白提取
核蛋白提取 实验准备： 1 4℃离心机 2 根据标本数计算所需I，II，I II，IV 总体积，取出液体，并加入蛋 白酶抑制剂，（III 由加蛋白酶抑制剂I 与加蛋白酶抑制剂II 混合物）实验操作： 1 收集细胞。10ml 对照细胞（1-2*105/ml ）培养48h 后，15ml 离心管收集，300g （1370 rpm ）* 5min 。弃上清，加1ml 1*PBS 轻轻涡旋混匀后转移至 1.5ml EP 管。 2 4℃，300g * 5min ，弃上清。 3重悬细胞于120 μl缓冲液I。 4重悬细胞于120 μl缓冲液II，4℃轻微旋转混匀，15min 。 5 4℃ 2500 rpm * 1min 。 6 转移上清（胞浆蛋白）至新管。 7 在沉淀中缓慢加120 μl 缓冲液III，轻微颠倒混匀，离心：4℃，2500 rpm * 1min 。 8 弃上清，加130 μl 缓冲液IV（+蛋白酶抑制剂），4℃旋转混匀1h 。 9 离心4℃，13000g * 10 min 。 10 转移上清（核蛋白）至一新管，定量。 核提取缓冲液I（15ml ） 25mM HEPES 375 μl HEPES 5mM KCl 75 μl1M KCl
0.5mM MgCl2 7.5 μl1M MgCl2 DDH2O 14.54 ml 核提取缓冲液II（15ml ） 25mM HEPES 375 μl HEPES 5mM KCl 75 μl1M KCl 0.5mM MgCl2 7.5 μl1M MgCl2 1% NP-40 150 μl N P-40 DDH2O 14.39 ml 核提取缓冲液III（15ml ） 25mM HEPES 250 μl HEPES 10% Sucrose 1g Sucrose 350mM NaCl 700 μl5M NaCl 0.01% NP40 1 μl NP-40 DDH2O 9.1 ml 5M NaCl ：14.61g/50 ml H2O 注： 1 在提取浆蛋白后，吸去上清时，如第一次用100 μl枪洗不干净，再离心，然后用10μl 枪吸尽液体。再用III 液洗一遍，如前步骤吸尽液体，再加IV 液，这样的去除浆蛋白污染效果较好些。 2 胞浆蛋白混胞核蛋白原因：因为药物高浓度时，胞核会破裂，所以 会在高浓度处理组中胞浆蛋白混有胞核蛋白较严重； 3 胞核蛋白对照组有时会提不到原因：可能是因为没有药物处理，所
细胞核蛋白提取方法
Preparation of nuclear extracts from tissue a. Dissect and mince 10-15 g of tissue. Adjust the volume of minced tissue to 30 ml with ice-cold tissue homogenization buffer. Homogenize in a tight-fitting Dounce homogenizer until >80-90% of the cells are broken as determined by microscopy. b. To monitor lysis, mix 10 μl of the cell suspension with an equal volume of 0.4% Trypan Blue dye and examine the solution under a microscope equipped with a 20x objective. Lysed cells take up the dye and stain blue, whereas intact cells exclude dye and remain translucent. Continue to homogenize the tissue until >80-90% of the cells are broken. c. Dilute the homogenate to 85 ml with ice-cold tissue homogenization buffer. Layer 27-ml aliquots over 10-ml cushions of ice-cold tissue homogenization buffer in ultraclear or polyallomer swinging-bucket centrifuge tubes. Centrifuge the tubes at 103,900g (24,000 rpm in a Beckman SW28 rotor) for 40 minutes at 4°C. d. Decant the supernatant and allow the tubes to drain in an inverted position for 1-2 minutes. Place the tubes on ic e. (Optional) Use a razor blade to cut off the top two thirds of the tube and place the bottom one third containing the nuclei on ice. e. Resuspend the pellet of nuclei in 2 ml of ice-cold tissue resuspension buffer. Accurately measure the volume of the resuspended nuclei and add ice-cold 5 M NaCl to a final concentration of 300 mM. Mix the suspension gently. Incubate the suspension for 30 minutes on ice. f. Recover the nuclei by centrifugation at 103,900g (24,000 rpm in a Beckman SW28 rotor) for 20 minutes at 4°C. Carefully transfer the supernatant to a fresh tube. Divide the supernatant into aliquots of 100-200 μl. Reserve an aliquot for protein concentration determination. Snap-freeze the remainder of the aliquots in liquid nitrogen, and store them in liquid nitrogen. g. Determine the protein concentration of the supernatant by the Bradford method.
细胞和动物组织核蛋白的提取方法
细胞和动物组织核蛋白的提取方法 产品组成 310001 310002 规格 50 assays 100 assays Buffer A (Cytoplasmic Extraction Reagent) 10ml 20ml Buffer B (Nuclear Extraction Reagent) 10ml 20ml 蛋白酶抑制剂混合物 250ul 500ul 使用方法： A．细胞蛋白提取 1. 取5-10×106个细胞，在4℃，500×g条件下离心2-3分钟，小心吸取培养基，尽可能吸干，收集细胞。 2. 用冷PBS洗涤细胞两次，每次洗涤后尽可能吸干上清。 3. 每20ul细胞压积中加入200μl冷的Buffer A，2ul蛋白酶抑制剂混合物，高速涡旋振荡15秒，置冰上10分钟。 4. 再次高速涡旋振荡5秒，然后在4℃，16000×g条件下离心5分钟。 5. 快速将上清吸入另一预冷的干净离心管，即可得到胞浆蛋白，请置于冰上或-80℃冰箱保存备用。 6. 在沉淀中加入200μl冷的Buffer B，2ul蛋白酶抑制剂混合物，高速涡旋振荡15秒。 7. 置冰上40分钟，每隔10分钟高速涡旋振荡15秒。 8. 在4℃，16000×g条件下离心10分钟。
9. 快速将上清吸入另一预冷的干净离心管，即可得到核蛋白。B．组织蛋白提取 1. 取适量组织样本剪碎，加冷PBS，用组织匀浆器匀浆至无明显肉眼可见固体（或用液氮研磨），冰上静置5分钟，小心将上清吸入另一预冷的干净离心管。 2. 在4℃，500×g条件下离心2-3分钟，弃上清。 3. 按照细胞蛋白的提取方法的第3步骤往下操作即可。 上述蛋白提取物请分装后于-80℃冰箱保存备用。 注意事项： 1. 实验过程中的所有BestBio-贝博生物试剂须预冷；所有器具须放-20℃冰箱预冷。 2. 整个过程须保持样品处于低温状态。 储存条件： -20℃保存。 有效期： 一年。 DXY网友qingraner问：本人核浆分离做了最少两个月了吧，似乎没有什么进展，我想请问高人指点一下。我很想知道我的配方有什么问题，或者是我的操作有什么需要注意的地方。十分感谢！还有，我检测的方法是用Ikb-α（标细
Thermo Scientific NE-PER核蛋白-胞浆蛋白抽提试剂盒
描述 Thermo Scientific NE-PER核蛋白-胞浆蛋白抽提试剂盒提供了高效的细胞裂解和抽提方法，可在两个小时之内完成胞浆蛋白与核蛋白的分离操作。 NE-PER核蛋白-胞浆蛋白抽提试剂盒的特性： ? 快速—在两个小时之内获得胞核与胞浆内的可溶性蛋白组分 ? 可靠—NE-PER试剂盒已经被950篇以上的发表文献引用 ? 通用–适用于培养细胞或组织（仅适用于新鲜样本）的核蛋白抽提 ? 可扩展—两种规格试剂盒，满足从细胞和组织中抽提样本的应用需求 ? 方便—操作简单，无需超速梯度离心 ? 兼容性好—获得样本适合于多种下游应用，包括免疫印迹、凝胶迁移分析、蛋白分析、报告基因分析以及酶活性分析 NE-PER试剂盒为用户提供了高效的核蛋白抽提方法，用户只需拥有台式微量离心机、离心管和移液器，进行简单的分步式细胞裂解及核蛋白与胞浆蛋白离心分离即可。NE-PER试剂盒能够高效地将胞浆蛋白与核蛋白溶解和分离为不同组分，交叉污染以及基因组DNA/mRNA 的干扰均降到了最低。一旦经过脱盐或稀释，分离后的蛋白即可用于免疫分析和蛋白相互作用实验，如迁移率分析(EMSA)、免疫共沉淀(Co-IP)和拉下实验。 分离胞核和制备核蛋白抽提物的方法很多，但大多数制备核蛋白抽提物的制备方法都很耗时，并需要机械匀浆、冻融循环、反复离心或透析，而这些都可能影响核蛋白的完整性。NE-PER 核蛋白-胞浆蛋白抽提试剂盒使用了基于试剂的分离方案，能够分步裂解细胞并从胞浆中分离出完整的细胞核，然后再从基因组DNA与mRNA中抽提核蛋白。这一温和的过程可在两小时之内完成，且使用培养细胞时仅需标准的桌台式离心机即可。此外，用户还可以从细胞培养物或组织样本中分离得到具有活性的核蛋白与胞浆蛋白。 本试剂盒能够从两百万个细胞中提出200至500μg胞浆蛋白和100至200μg的核蛋白（浓度为1mg/mL）。一般情况下，胞浆蛋白与核蛋白之间的交叉污染在10%左右。本方法分离得到的主要是细胞核中的可溶蛋白，而非与染色质结合的蛋白或核膜整联蛋白。可通过调整核抽提试剂（NER）的体积来改变胞核抽提物的蛋白浓度，而不会对抽提效率造成显著影响。从细胞中专一地抽提核蛋白是许多基因调控研究的关键，然而现有的许多分离细胞核、制备核蛋白抽提物的方法都十分耗时，且需要进行机械匀浆、冻融循环、重复离心或透析等操作，对许多脆弱的核蛋白的完整性造成影响。NE-PER试剂盒能够克服这些问题，通过EMSA及其他分析技术为用户提供高质量的浓缩核蛋白抽提物。