第5章+细胞培养++讲义
第五章细胞培养
单细胞培养体系的建立为研究植物细胞的特征和潜能性提供了一个极好的机会。这种培养体系有助于揭示多细胞有机体中细胞之间的相互关系和相互影响。Haberlandt的开创性实验没能使游离细胞实现细胞分裂，但他1902年发表的研究论文激发了对这一个领域的进一步研究。随后，几位研究者相继报道了促使游离单细胞分裂，甚至从单细胞培养再生完整植株的研究结果，都获得了令人瞩目的成功。植物生物技术研究者对细胞培养具有浓厚的兴趣，他们认识到，通过细胞培养生产天然产物比培养完整器官或完整植株有更多的优点。利用细胞培养研究分析细胞代谢的途径，是最初吸引植物生物学家注意的另一个研究课题。人们不久便认识到，单细胞培养体系对农作物改良具有很大的应用潜力。在培养游离细胞的过程中，可以让各种化学药品和放射性物质很快地作用于细胞，又很快地停止这种作用，从而易于诱导和筛选培养细胞突变体。通过单细胞的克隆化，可以把微生物遗传学技术用于高等植物以进行农作物的改良。此外，在特定的生长周期和培养条件下，培养细胞群体中的单个细胞能稳定地表现细胞遗传和新陈代谢的变异，这种变异被称为空间异质性。这是一项非常有趣的研究，因为将在单细胞再生植株形态发生的过程中，证实细胞间染色体组型和积累次生代谢产物的能力是否存在差异。细胞系筛选技术可适用于培育高产细胞系和优良农业性状的株系。
l单细胞的分离
1.1由完整的植物器官分离单细胞
分离单细胞的最佳材料是叶组织，因为叶片中的细胞近似于一个同质细胞群体，很适合用于特定和调控的大规模细胞培养。用机械法或酶解法可以从这种完整植物体器官(如叶组织)分离出单细胞。1.1.1机械法
叶组织是分离单细胞的最好材料。Ball、Joshi和Noggle等曾先后由花生成熟叶片得到了离体单细胞。他们所用的方法是，先撕去叶表皮，使叶肉细胞暴露，然后再用小解剖刀把细胞刮下来。这些离体细胞可直接在液体培养基(成分见p92表6.2)中培养。在培养中很多游离细胞都能成活，并持续地进行分裂。以上是关于由完整的植物器官中获得的游离细胞能在人工培养基里进行分裂的最早报道。但不是所有植物叶片都能通过这种方法得到单细胞。上述人员就没能从所试验过的大多数其他植物的叶片中分离出活细胞。
现在广泛用于分离叶肉细胞的方法是先把叶片轻轻研碎，然后再通过过滤和离心把细胞净化。具体做法是：在研钵中放人10 g叶片和40 ml研磨介质(20μmol蔗糖，10μmol MgCl2，20μmol tris-HCl 缓冲液，pH值7.8)，用研杆轻轻研磨。之后，将匀浆用两层细纱布过滤，在研磨介质中以低速离心将得到的细胞净化。除了双子叶植物外，很多单子叶植物(其中可能包括禾本科植物，但尚未证明)也能通过这个方法产生完整的叶肉细胞。应用类似方法后人由马唐中分离出具有代谢活性的叶肉细胞和维管束鞘细胞，由菠菜中分离出叶肉细胞，由篱天剑、石刁柏等叶片中分离大量游离薄壁细胞，由大豆子叶分离出了活细胞。
和酶解法相比，用机械法分离细胞至少有两个明显的优点：①细胞不受酶的伤害；②不会发生质壁分离。这点对生理和生化研究来说是很理想的。一般用机械法分离的细胞能够发生分裂并形成愈伤组织。但这种机械分离细胞的方法并不普遍适用，只有在薄壁组织排列松散，细胞间接触点很少时，用机械法分离叶肉细胞才能取得成功。
1.1.2酶解法
利用果胶酶(pectase)处理植物叶片，使细胞间的中胶层发生降解，分离出具有代谢活性的细胞。Takebe等(1968)最早报道了由烟草叶片通过果胶酶处理分离叶肉细胞的方法（p98～99，附录6.2）：首先取烟草植株上充分展开的叶片进行表面消毒，无菌蒸馏水冲洗干净，用镊子撕去下表皮，用解剖刀将撕去下表皮的叶片切成4cm×4cm 的小块，放人经过过滤灭菌的酶液(含果胶酶0.5％+甘露醇0.8％+硫酸葡聚糖钾1％)中，用真空泵抽气，使酶液渗入叶肉组织内。在摇床上保温培养，每30min更换一次酶液，将第一次30min后换出的酶液弃掉，第二次30min后，酶液中主要分离出海绵薄壁细胞，第三和第四次以后主要分离出栅栏细胞。
Takebe等(1968)证明，在离析混合液中加入硫酸葡聚糖钾可作为原生质膜的稳定剂，降低酶液中核糖核酸酶的活力，保持质膜稳定性，提高游离细胞的产量。用于分离细胞的果胶酶不仅能降解中胶层，而且还能软化细胞壁。因此，用酶解法分离细胞时，必须对酶溶液给予渗透压保护，防止细胞的胀裂。如果所用的甘露醇的浓度低于0.3mol／L，烟草原生质体将会在细胞壁内崩解。酶解法分离细胞能
得到较均匀一致的海绵组织细胞或栅栏组织细胞。但在有些物种中，特别是大麦、小麦、玉米等单子叶植物中，很难通过酶解法使细胞分离，因为与双子叶植物相比，这些植物的叶肉细胞较长，并在若干地方发生收缩，细胞间可能形成一种互锁结构，阻止细胞的分离。
1.2由培养组织中分离单细胞
用于基础研究和应用研究的单细胞系统，在传统上常常是由离体培养的组织分离得到的，因为这个途径不但方便，而且广泛适用。只要把由经过表面消毒的器官上刚刚切取下来的一小块组织，置于含有适当比例的生长素和细胞分裂素的培养基上，即可建立起组织培养物。在这样一种培养基上，外植体愈伤组织化。这个过程一般是由切口开始，逐渐扩展到接种组织的整个表面。把愈伤组织由外植体上剥离，转移到成分相同的新鲜培养基上，促使愈伤组织生长，这个过程称做继代培养(subculture)。通过反复地在琼脂培养基上继代，不但可使愈伤组织不断增殖，扩大数量，而且还能提高愈伤组织的松散性，这对于在液体培养基中建立充分分散的细胞悬浮培养物是非常必要的。然而Wilson和Street(1975)观察到，当把新切取下来的橡胶树愈伤组织转移到液体培养基中并加以搅动时，愈伤组织只能破碎成小块，想由此建立高度分散的细胞悬浮液的努力全部归于失败。于是他们又把在液体培养基中生长的愈伤组织块转回到琼脂培养基上。两个月后形成了很易散碎的愈伤组织，当把这些愈伤组织再转移到液体培养基中以后，产生了很好的悬浮液。
由愈伤组织获得游离细胞的具体做法是，把未分化的和易散碎的
愈伤组织约2 g转移到装有30～50 m1液体培养基的三角瓶中，在25℃±1℃，弱光或黑暗中，将三角瓶置于摇床上不断振荡(120 r／min)。初期每10 d左右用新鲜培养液更换掉三角瓶中大约4／5的旧液，同时将飘浮在原培养液上层的细胞碎片和长弯形衰败细胞淘汰。几个周期之后，培养液由浊变清，开始出现胞质浓密的单细胞和小细胞团。此后不断进行继代培养，直至建成良好的悬浮培养物。在这里振荡至少有两种作用。首先，它可对细胞团施加一种缓和的压力，使它们破碎成小细胞团和单细胞；其次，振荡可以使细胞和小细胞团在培养基中保持均匀的分布。此外，培养基的运动还会促进培养基和容器内空气之间的气体交换。
2细胞悬浮培养
2.1细胞悬浮培养的概念及优点
悬浮培养(suspension culture)是指将游离的植物细胞按一定的细胞密度，悬浮在液体培养基中进行培养的方法。植物细胞的悬浮培养是从愈伤组织的液体培养基础上发展起来的。自20世纪50年代以来，从试管的悬浮培养发展到大容量的发酵罐培养，从不连续培养发展到半连续和连续培养。80年代以来，植物细胞培养作为生物技术的一个组成部分，正在发展成为一门新兴的科技产业体系。
悬浮细胞培养的主要优点是：能大量提供比较均匀一致的细胞，也就是同步分离的细胞；细胞增殖的速度比愈伤组织快；适宜大规模培养，成为细胞工程中独特的产业。
2.2细胞悬浮培养的类型
2.2.1分批培养
分批培养(batch culture)是指把细胞分散在一定容积的培养基中进行培养，当培养物增殖到一定量时，转接继代，建立起单细胞培养物。在培养过程中除了气体和挥发性代谢产物可以同外界环境交换外，一切都是密闭的。当培养基中的主要成分耗尽时，细胞停止分裂和生长。分批培养所用的容器一般是100～250ml三角瓶，每瓶装20～75ml培养基。为了使分批培养的细胞不断增殖，必须及时进行继代。继代的方法可以是取出培养瓶中一小部分悬浮液，转接到成分相同的新鲜培养基中(约稀释5倍)。也可以用纱布或不锈钢网进行过滤，滤液接种，这样可提高下一代培养物中单细胞的比例。培养用的液体培养基虽因物种而异，但凡适合愈伤组织生长的培养基，除去琼脂，均可作为悬浮细胞培养基。
在分批培养中，细胞数目会发生不断变化，呈现出细胞生长周期。在整个生长周期中，细胞数目增加的变化过程大致呈“S”形(图5-1)。
图5-1在分批培养中每单位容积悬浮培养液内的细胞数
与培养时间关系的示意图 (引自wilson等，1971)
初期增长慢，称延滞期(lag phase)，特点是细胞很少分裂，细胞数目不增加；中期生长快，称对数增长期(logarithmic phase)，特点是细胞分裂活跃，数目迅速增加；到了细胞增殖最快的时期，单位时间内细胞数目增长大致恒定，细胞数目达到最高峰，称为直线生长期(linear phase)；随后由于培养基中某些营养物耗尽，或是有毒代谢物的积累，细胞增长逐渐变慢进入缓慢期(retard phase)；最后生长趋于完全停止，进入静止期(stationary phase)。滞后期的长短主要取决于在继代时原种培养细胞所处的生长期和转入细胞数量的多少。当转入的细胞数量较少时，不但滞后期较长，而且在一个培养周期中细胞增殖的数量也少。如果转入的细胞密度很低，则在加入培养单细胞或小群体细胞所必需的营养物质之前，细胞将不能生长。另外，如果缩短两次继代的时间间隔，例如，每2～3 d即继代一次，则可使悬浮培养的细胞一直保持对数生长。如果使处在静止期的细胞悬浮液保存时间太长，则会引起细胞的大量死亡和解体。因此，当细胞悬浮液达到最大干重产量之后，即在刚进入静止期的时候，须尽快进行继代。在分批培养中，细胞繁殖一代所需的最短时间，即在对数生长期中细胞数目加倍所需的时间因不同植物而异，烟草为48h，蔷薇36h，菜豆24h。一般讲，这些时间都长于在整体植株上分生组织中细胞数目加倍所需的时间。
在对悬浮培养细胞进行继代时可使用吸管或注射器，但其进液口的孔径必须小到只能通过单细胞和小细胞团(2～4个细胞)，而不能通过大的细胞聚集体。继代前应先使三角瓶静置数秒，以便让大的细
胞团沉降下去，然后再由上层吸取悬浮液。如果每次继代都依这个办法操作，就有可能建立起理想的细胞悬浮培养物。
分批培养对于研究细胞的生长代谢并不是一种理想的培养方式。在分批培养中，由于细胞生长和代谢的方式以及培养基成分不断改变，没有一个稳定的生长期，相对于细胞的数目，代谢产物和酶的浓度也不能保持恒定。这些问题在某种程度上可通过连续培养加以解决。
2.2.2半连续培养
半连续培养是利用培养罐进行细胞大量培养的一种方式。在半连续培养中，当培养罐内细胞数目增殖到一定量后，倒出一半细胞悬浮液于另一个培养罐内，再分别加入新鲜培养基继续进行培养，如此这样频繁地进行再培养。半连续培养能够重复获得大量均匀一致的培养细胞供生化研究之用。
2.2.3连续培养
连续培养(continuous culture)是利用特制的培养容器进行大规模细胞培养的一种方式。连续培养的特点是：在连续培养中由于不断注入新鲜培养基，排掉旧的培养基，保证养分的充足供应，不会出现悬浮培养物发生营养亏缺的现象。连续培养可在培养期间内使细胞长久地保持在对数生长期中，细胞增殖速度快。连续培养适于大规模工厂化生产。连续培养有封闭型和开放型之分。
(1)封闭型连续培养
封闭型连续培养是指在培养过程中，排出的旧培养基由加入的新
鲜培养基进行补充，进出数量保持平衡，从而使培养系统中营养物质的含量总是超过细胞生长的需要。悬浮在排出液中的细胞经机械方法收集后再放回到培养系统中，因此在这种培养方式中，随培养时间延长，细胞密度会不断增加。
(2)开放型连续培养
在开放连续培养中，注入的新鲜培养液的容积与流出的培养液容积相等，其中细胞的密度也保持恒定，并通过调节流入和流出的速度，使培养细胞的生长速度一直保持在一个稳定状态，流出的细胞数相当于培养系统中新细胞的增加数。开放型培养又可分为两种主要方式：一是化学恒定式；二是浊度恒定式。
①浊度恒定式。在浊度恒定培养中，新鲜培养基是间断注入的，受细胞密度增长所引起的培养液浑浊度增加的控制。可以选定一种细胞密度，当超过这个细胞密度时，使细胞随着培养液一起排出，以保持细胞密度的恒定。
②化学恒定式。在化学恒定式培养中，为使细胞密度保持恒定状态，可采用两种方法。一种是以固定速度注入新鲜培养基，将培养基内的某种营养成分(如氮、磷或葡萄糖)的浓度调节成为一种生长限制浓度，从而使细胞的增殖保持稳定状态。在这种培养基中，除生长限制成分以外的其他成分的浓度都保持在细胞生长所需要的水平上，而生长限制因子被调节在一定水平上，它的任何增减都可由细胞增长速度的增减反映出来。二是控制培养液进入的速度，使细胞稀释的速度正好和细胞增殖的速度相同，因此培养液中细胞密度一直保持恒定状
态。化学恒定式的最大特点是通过限制营养物质的浓度来控制细胞的增长速度。此方法在大规模细胞培养的工业上有巨大的应用潜力。
连续培养是植物细胞培养技术中的一个重要进展，这种培养技术对于植物细胞代谢调节的研究、各个生长限制因子对细胞生长的影响以及对次生物质的大量生产等都有重要的意义。
由悬浮细胞可以再生植株，其再生植株通常有2条途径：一是由悬浮细胞直接形成体细胞胚；二是先将悬浮细胞在半固体培养基上诱导形成愈伤组织，然后再由愈伤组织分化植株。
2.3细胞悬浮培养的培养基
要获得高质量的悬浮培养物，最初使用疏松的愈伤组织十分重要。由于愈伤组织质地是遗传控制的，所以要获得细胞分散良好的悬浮培养物常常不是一件轻而易举的事情。改变培养基成分和继代培养程序有助于获得松散的培养组织，在培养基中加入2,4-D、少量水解酶(纤维素酶和果胶酶)或酵母提取物之类的物质，也可能对细胞分散有促进作用。有时，必须把小愈伤组织块或细胞团转回到琼脂固体或半固体培养基上。经过2～3次继代培养后，愈伤组织块生长发育成疏松的愈伤组织，再将其转入液体培养基中，就能产生高质量的悬浮培养物了。
从理论上讲，能形成生长快、疏松愈伤组织的培养基一般来说也同样适用于建立该物种的悬浮培养，只是琼脂当然要从中去掉。但是，在实际研究中，迅速生长的细胞悬浮液对培养基成分的需要不同于组织或愈伤组织培养。如烟草细胞悬浮培养基需要将2,4-D的浓度从
0.3mg／L提高到2mg／L，还要在愈伤组织培养基中添加额外的维生素和酪蛋白水解物(p83表6.1)。此外，旺盛生长的悬浮培养物中，无机磷酸盐迅速地被利用，以致使无机磷酸盐成为了一个限制生长的因素。因此，为了进行高等植物的细胞悬浮培养，特别设计了B5和ER两种培养基，但一般来说，这两种培养基，以及其他一些合成培养基，也只有当细胞的初始群体密度约为5×104细胞／ml或更高时才是适用的。当细胞密度较低时，在培养基中还须加入各种其他成分(见单细胞培养p92～93)，或是使用条件培养基。
此外，许多培养基几乎没有缓冲能力，pH值可能随细胞生物产量的增加而改变。需要监测和调整悬浮培养物中的pH值。
在启动低密度细胞培养时，有必要使用条件培养基。所谓条件培养基是在培养基中加入高密度的细胞进行培养，一定时间后这些细胞就会向培养基中分泌一些物质，使培养基条件化。制作条件培养基的简便方法是：把液体培养基中培养了4～6周的高密度细胞滤掉，将其培养基制成液体培养基或固体培养基来培养单细胞或低密度细胞群体，这样可明显提高单细胞培养物存活和分裂的能力。或是采用Torres(1989)设计的一种装置，其中把高密度细胞悬浮培养物(看护培养物)装在一个透析管内(图5－1)，用线悬挂在三角瓶中，瓶内装有低密度细胞培养基。看护培养物产生的代谢物扩散到低密度细胞培养基中以后，促进了低密度细胞的生长，并提高其细胞活性。这样一来，由于在低密度细胞培养基中原先不存在的必需物质被看护细胞通过生物合成活动释放到其中，于是就可满足低密度细胞群体对生长条
件的要求。
图5－2 使低密度细胞培养基条件化的装置 (引自Razdan，1993)
悬浮培养物需要持续振荡培养基，才能通气充足，促使细胞分散。利用摇床和适当的三角瓶就可以进行振荡培养。其中旋转式摇床在分批悬浮培养中是一种应用最广泛的设备。以转速30～150 r／min为宜(不要超过150 r／min)，冲程范围应在2～3 cm。转速过高或冲程过大会造成细胞的破裂。此外还有慢速转床和自旋式培养架可用。2.4悬浮培养细胞的同步化
细胞悬浮培养物中的细胞大小、形状、DNA和核酸含量变化极大。此外，单个细胞内细胞周期时间变化也非常大。为此，细胞培养物几乎完全是非同步的。这种捉摸不定的变化严重地干扰了对细胞代谢的生物化学、遗传学、生理学及其他方面的研究。因此，很有必要控制非同步生长的悬浮培养物的生长条件，达到悬浮培养物生长的高度同步化。同步化培养是大多数细胞同时通过细胞周期每一阶段(G1、S、G2和M,细胞周期指由细胞分裂结束到下一次细胞分裂结束所经历的过程，所需的时间叫细胞周期时间。可分为四个阶段：①G1期(gap1)，指从有丝分裂完成到
期DNA复制之前的间隙时间；②S期(synthesis phase)，指DNA 复制的时期；③G2期(gap2)，指DNA复制完成到有丝分裂开始之前的一段时间；④M期又称D期(mitosis or division)，细胞分裂开始到结束。)的培养方法。同步化程度以悬浮培养物中同步细胞的百分率来表示。获得悬浮培养物同步化的方法可以分成2类，即物理方法和化学方法。
2.4.1物理方法
物理方法主要是通过对细胞物理特性(细胞或小细胞团的大小)或生长环境条件(光照、温度等)的控制，实现高度同步化，其中包括按细胞团的大小进行选择（以最优质的潜在悬浮培养物中细胞团大小为标准选择细胞团，有可能获得同步化生长的细胞）的方法和低温休克法等。
2.4.2化学方法
（1）饥饿法
在这种方法中，先对细胞断绝供应一种进行细胞分裂所必需的营养成分或激素，使细胞停滞在G1期或G2期，经过一段时间的饥饿之后，当重新在培养基中加入这种限制因子时，静止细胞就会同步进入分裂。
（2）抑制法
使用DNA合成抑制剂如5－氨基尿嘧啶、羟基脲和胸腺嘧啶脱氧核苷等，也可使培养细胞同步化。当细胞受到这些化学药物的处理之后，细胞周期只能进行到G1期为止，细胞都滞留在G1期和S期的边
界上。当把这些抑制剂去掉之后，细胞即进入同步分裂。应用这种方法取得的细胞同步性只限于一个细胞周期。
2.5悬浮培养中细胞生长的测定
2.5.1细胞计数
细胞计数测量法是一种相对比较精确的测量方法，用于测定培养物的生长。由于在悬浮培养中总存在着大小不同的细胞团，因而通过由培养瓶中直接取样很难进行可靠的细胞计数，为提高细胞计数的准确性，可先用铬酸(5％～8％)或果胶酶(O.25％)对细胞和细胞团进行处理，以增加细胞的分散性。最后用血球计数板进行细胞计数。
2.5.2细胞密实体积(packed cell volume,PCV)
细胞密实体积是以每毫升培养液中细胞总体积的毫升数表示的。为了确定细胞密实体积，须将一已知体积的均匀分散的悬浮液放入一个15 ml刻度度离心管中，在2 000 g下离心5 min，即可得到细胞沉实的体积。
2.5.3细胞鲜重
把悬浮培养物倒在下面架有漏斗的已知重量的湿尼龙丝网上，用水洗去培养基，真空抽滤以除去细胞上沾着的多余水分，再称重，即可求得细胞鲜重。细胞的鲜重是以每毫升培养物细胞的重量表示的。
2.5.4细胞干重
用已知重量的干尼龙丝网依上法收集细胞，在60℃下干燥12 h，再称重。细胞的干重是以每毫升培养物或每106个细胞的重量表示的。
2.5.5细胞有丝分裂的指数
有丝分裂指数是指在一个细胞群体中，处于有丝分裂的细胞占细胞总数的百分数。指数越高，表明细胞进行分裂的速度越快，反之则越慢。有丝分裂指数只反映群体中每一个细胞用于分裂所需时间的平均值，在一个活跃分裂的悬浮培养物中，分裂指数可以反映细胞分裂的同步化程度。一个迅速生长的细胞群体其有丝分裂指数为3％～5％。
测定有丝分裂指数的方法比较简单。对于愈伤组织一般是采用孚尔根染色法，先将愈伤组织用lmol／L HCI在60℃水浴中水解后染色，然后在载玻片上按常规方法镜检，随机检查500个细胞，统计其中处于分裂期间和处于有丝分裂各个时期的细胞数目，计算出分裂指数。悬浮培养的细胞先用固定液处理，然后将固定的悬浮液滴于载玻片上，染色并做镜检，至少统计500个细胞。虽然有丝分裂指数的测定是研究细胞生长的有用技术，但它受许多因子的影响，如完成一个细胞周期所需的时间、有丝分裂持续的时间、非周期性和死细胞的百分数、细胞群体中同步化的程度等。因此单独测定有丝分裂指数还不能精确反映某一培养物的细胞分裂的同步化程度。
2.6培养细胞活力的测定
培养物的生长在很大程度上依赖于细胞的活力，可以用显微镜观察未处理的细胞或经化学试剂处理的细胞，分析细胞的活力。方法有以下几种：
2.6.1相差显微术法
在显微镜下，根据细胞质环流和正常细胞核的存在与否，即可鉴
别出细胞的死活。但在亮视野显微镜下很难观察到未染色细胞细胞的活力时，利用相差显微镜可以得到更明显的图像。
2.6.2四唑盐还原法(TTC法)
活细胞由于呼吸作用可产生还原力，可将2，3，5－氯化三苯基四氮唑(TTC)还原成红色染料，据此可测定细胞的呼吸效率，反映细胞的代谢强度。一般可在显微镜下观察视野中被染色细胞的数目，计算出活细胞的百分率。也可以将还原的TTC红色染料用乙酸乙酯提取出来，用分光光度计进行测定(520nm)，计算细胞的相对活力。2.6.3荧光素二乙酸酯法(FDA法)
用FDA法可以快速观察细胞的活力。用丙酮制备0.5％的FDA贮备液，置于0℃下保存。当进行细胞活力测定时，将FDA贮备液加入到细胞或原生质体悬浮液中，加入的数量以使最终浓度为0.01％为准。为了保持细胞或原生质的稳定性，可适当加入一种渗透压稳定剂。保温5min后，用一台带有适当的激发片和吸收片的荧光显微镜对细胞进行检查。FDA既不发荧光也不具有极性，能自由地穿越细胞膜进入细胞内部。在活细胞内FDA被酯酶分解，产生有荧光的极性物质—荧光素。由于荧光素不能自由穿越细胞膜，因而就在活细胞中积累起来，而在死细胞中不能积累。所以，在荧光显微镜下观察到产生荧光的细胞，表明是有活力的细胞；相反不产生荧光的细胞，是无活力的细胞。细胞活力以发绿色荧光的活细胞的百分数表示。
2.6.4伊凡蓝染色法
这种方法可用做FDA的互补法。当以伊凡蓝的稀薄溶液(O.025％)对细胞进行处理时，只有活力已受损伤的细胞能够摄取这种染料，而完整的活细胞不能摄取这种染料。因此，凡不染色的细胞皆为活细胞。但染色时间不宜过长，否则活细胞也会逐渐积累染料而染上色。细胞活力以未染色的活细胞数占总观察细胞数的百分数来表示。
3单细胞培养
单细胞培养就是对分离得到的单个细胞进行培养，诱导其分裂增殖，形成细胞团，再通过细胞分化形成芽、根等器官或胚状体，直至长成完整植株的技术。由于培养中细胞在遗传和生理生化上会出现变异，形成的植株也就表现出一定的差异，这种差异又反映在它们的产量、品质、抗病虫和抗逆性等方面。所以对由单细胞培养获得的单细胞无性繁殖系进行研究，在理论上和实践上都有很重要的意义。
3.1单细胞培养方法
单细胞培养方法有平板培养法、看护培养法、微室培养法和条件培养基培养法。
3.1.1平板培养法
平板培养法是将悬浮培养的细胞接种到未固化的薄层培养基中，使其与培养基充分混合，再倒人培养皿中进行培养的方法。它是最常用的单细胞培养法。具体做法是，先将含有游离细胞和细胞团的悬浮培养物过滤，弃去大的细胞团，只留下游离细胞和小细胞团。进行细胞计数。根据细胞的实际密度，或是加入液体培养基进行稀释，或是通过低速离心使细胞沉降后，除去上清液，再加入液体培养基进行调
节，以使悬浮培养液达到最终所要求的植板细胞密度的2倍。把与上述液体培养基成分相同但加人了0.6％～1％琼脂的培养基加热，使琼脂融化，然后冷却到35℃，置于恒温水浴中保持这个温度不变。将这种培养基和上述细胞悬浮培养液等量混合，迅速注人并使之铺展在培养皿中。在这个过程中要做到：当培养基凝固之后，细胞能均匀分布并固定在很薄一层(约1 mm厚)培养基中。然后用封口膜把培养皿封严。置培养皿于倒置显微镜下观察，对其中的各个单细胞，在培养皿外的相应位置上用细记号笔做上标记，以保证以后能分离出纯单细胞无性系（图5－3）。最后将培养皿置于25℃下在黑暗中培养。根据一般经验，若在培养期间频繁地在光下对培养物进行显微镜检，对细胞团的生长将会产生有害作用，因此，镜检的次数越少越好。
图5－3 Bergmann细胞平板培养法分步图解(引自Konar，1966)
用平板法培养单细胞或原生质体时，常以植板效率来表示能长出细胞团的细胞占接种细胞总数的百分数。植板效率的求算公式如下：植板效率 = 每个平板上形成的细胞团数/每个平板上接种的细胞总数×100％如果在琼脂培养基或液体培养基中，植板细胞的初始密度是1×104或1×105细胞／ml。植板后由相邻细胞形成的细胞群落常常混
在一起。由于这种现象出现得很早，不可能在此之前进行分植或稀释，因而给分离纯单细胞无性系的工作带来很大困难。若能把植板细胞密度减小，或能在完全孤立的情况下培养单个细胞，这个问题则可减轻。但是，就像在悬浮培养中一样，在正常条件下，每个物种都有一个最适的植板密度．同时也有一个临界密度。当低于这个临界密度时，细胞就不能分裂。因此，为了在低密度下进行细胞培养，或是培养完全孤立的单个细胞，必须采用一些特殊的方法。在过去几十年间，为了培养单个细胞已经设计了几种不同的方法。
3.1.2看护培养法
用同种或异种材料的愈伤组织作为看护组织来培养细胞的一种方法，该方法最初是由Muir等在1954年设计的。就是把单细胞放在一块活跃生长的愈伤组织上进行培养，在愈伤组织和培养的细胞之间有一片滤纸相隔。具体做法是：借助于一个微型移液管或微型刮刀，由细胞悬浮液中或由易散碎的愈伤组织上分离得到细胞，在接种前一天，把一块8mm×8mm的灭菌滤纸在无菌条件下放在一块早已长成的愈伤组织上，使其充分吸收组织上渗透出的培养基成分和组织块的代谢产物。愈伤组织和所要培养的细胞可以属于同一个物种，也可以是不同的物种。滤纸铺上之后，逐渐被下面的组织润湿。这时将分离出来的单细胞放到润湿滤纸表面。当这个培养的细胞长出微小的细胞团后，将它转到琼脂培养基上，以便进一步促进其生长（图5－4）。
图5－4 应用看护培养法建立单细胞无性系
A．一个置于滤纸上的单细胞，滤纸铺在一大块愈伤组织(看护组织)的顶上；B．培养的细胞分裂形成一个小细胞团；C．在由滤纸上转移到培养基上进行直接培养之后，由单细胞起源的细胞团已长成一大块愈伤组织（引自Muir等，1958)
一个直接接种在培养基上不能分裂的离体细胞，在看护愈伤组织的影响下就可能发生分裂。由此可见，看护愈伤组织不仅给单细胞提供了培养基的营养成分，而且还提供了促进细胞分裂的其他活性物质。
3.1.3微室培养法
此法最初是由Jones等(1960)设计的，是将细胞放到人工制造的一个小室中进行培养的方法。此法的优点是在培养过程中可以连续进行显微观察，把一个细胞的生长、分裂和形成细胞团的全部过程记录下来。具体方法是：先由悬浮培养物中取出一滴只含有一个单细胞的培养液，置于一张无菌载片上，在这滴培养液的四周与之隔一定距离加上一圈石蜡油，构成微室的“围墙”，在“围墙”左右两侧再各加一滴石蜡油，每滴之上置一张盖片作为微室的“支柱”，然后将第三张盖片架在两个“支柱”之间，构成微室的“屋顶”，于是那滴含有
实验3---悬浮细胞的培养
本科学生实验报告 姓名王冬梅学院＿生命科学学院＿＿＿专业＿应用生物教育＿班级＿＿08应生A班＿＿＿实验课程名称＿＿＿植物组培实验＿＿＿＿＿＿＿＿＿指导教师及职称＿龙维彪＿＿ 开课学期2010 至＿2011 学年＿下＿学期上课时间2011年3月~ 6月 云南师范大学教务处编印
实验三：胡萝卜细胞的悬浮培养 一、实验目的： 了解植物细胞悬浮培养的基本原理，通过实验掌握植物细胞悬浮培养的方法和技术。并通过实验练习和巩固无菌操作技术 二、基本原理 利用固体琼脂培养基对植物的离体组织进行培养的方法在植物遗传实验中已经得到广泛的应用。但这种方法在某些方面还存在一些缺点，比如在培养过程中，植物的愈伤组织在生长过程中的营养成分、植物组织产生的代谢物质呈现一个梯度分布，而且琼脂本身也有一些不明的物质成分可能对培养物产生影响，从而导致植物组织生长发育过程中代谢的改变而利用液体培养基则可以克服这一缺点，当植物的组织在液体培养基中生长时，我们可以通过薄层震荡培养或向培养基中通气用以改善培养基中氧气的供应。植物细胞的悬浮培养是指将植物细胞或较小的细胞团悬浮在液体培养基中进行培养，在培养过程中能够保持良好的分散状态。这些小的细胞聚合体通常来自植物的愈伤组织。 一般的操作过程是把未分化的愈伤组织转移到液体培养基中进行培养。在培养过程中不断进行旋转震荡，一般可用100～12Or/min 的速度进行。由于液体培养基的旋转和震荡，使得愈伤组织上分裂的细胞不断游离下来。在液体培养基中的培养物是混杂的，既有游离的单个细胞，也有较大的细胞团块，还有接种物的死细胞残渣。 在液体悬浮培养过程中应注意及时进行细胞继代培养，因为当培养物生长到一定时期将进入分裂的静止期。对于多数悬浮培养物来说，细胞在培养到第18～25d 时达到最大的密度，此时应进行第一次继代培养。在继代培养时，应将较大的细胞团块和接种物残渣除去。若从植物器官或组织开始建立细胞悬浮培养体系，就包括愈伤组织的诱导、继代培养、单细胞分离和悬浮培养。目前这项技术已经广泛应用于细胞的形态、生理、遗传、凋亡等研究工作，特别是为基因工程在植物细胞水平上的操作提供了理想的材料和途径。经过转化的植物细胞再经过诱导分化形成植株，即可获得携带有目标基因的个体。 三、器材 超净工作台、高压蒸汽灭菌器、恒温培养箱、恒温空气摇床、镊子、锥形瓶等。 四、操作步骤： 胡萝卜细胞的悬浮培养培养基的配制 配方：MS+RT(0.5mg/l)+2,4-D(1)+LH(100)+C(30g/l) PH:5.8 胡萝卜细胞的悬浮培养 将前面培养好的胡萝卜愈伤组织。如下：
原代细胞培养与分离
原代细胞的培养与建系 凡是来源于胚胎、组织器官及外周血，经特殊分离方法制备而来的原初培养的细胞称之为原代细胞。细胞的纯化或细胞克隆技术是细胞培养工作的基础。 原代细胞的取材 人和动物细胞的取材是原代细胞培养成功的首要条件，直接影响细胞的体外培养。 一、取材的基本要求 .1．取材要注意新鲜和保鲜 .2．应严格无菌 .3．防止机械损伤 .4．去除无用组织和避免干燥 .5．应注意组织类型、分化程度、年龄等 .6．作好记录 二、各类组织的取材技术 皮肤和粘膜的取材 内脏和实体瘤的取材 血液细胞的取材 骨髓、羊水、胸/腹水细胞取材 动物组织取材 人胚体组织取材 鸡（鸭）鸟类胚胎组织取材鸡（鸭）鸟类胚胎组织取材 皮肤和粘膜的取材 主要取自于手术过程中的皮片，方法似外科取断层皮片手术操作，但面积一般2~4平方厘
米。 内脏和实体瘤的取材 内脏除消化道外基本是无菌的，但取材时要明确和熟悉所需组织的类型和部位，实体瘤取材时要取肿瘤细胞丰富的区域，要避开破溃、坏死液化部分，以防污染，尽量去除混杂的结缔组织。 血液细胞的取材 血细胞、淋巴细胞的取材，一般多抽取静脉外周血，或从淋巴组织中（如脾、扁桃体、胸腺、淋巴结等）分离细胞，取材时应注意抗凝。 骨髓、羊水、胸/腹水细胞取材 严格无菌，注意抗凝，还要尽快分离培养，离心后，用无钙、镁PBS洗两次，再用培养液洗一次后即可培养，不宜低温存放。 动物组织取材 1、鼠胚组织取材 首先用引颈或气管窒息致死法处死孕期合适的动物，然后将其整个浸泡在含有75%酒精的烧杯中，5分钟后（注意时间不能太长，以避免酒精从口或其他通道进入体内，影响组织活力），取出动物，在消毒过的木板上可用无菌的图钉或大头针固定四肢，切开皮肤，用无菌操作法解剖取胚或用无菌止血钳挟起皮肤、用无菌眼科剪沿躯干中部环形剪开皮肤，用止血钳分别挟住两侧皮肤拉向头尾，把动物反包，暴露躯干，然后再固定，更换无菌解剖器材，采用无菌操作法解剖取出胚胎。 2、幼鼠胚肾（或肺）取材 幼鼠采用上述方法处死消毒后，腹部朝上固定在木板上，先切开游离毛皮并拉开至两侧：然后采用无菌法打开胸腔取肺，或背部朝上固定在木板上，先将背部毛皮切开游离并拉向两侧，
肿瘤细胞培养方法和培养基
肝癌细胞培养 一、培养基 1、RPMI-1640+10%胎牛血清培养基 2、DMEM+15%胎牛血清培养基 成分表
二、实验前准备工作: 操作者的皮肤、培养瓶的盖和外壁常用酒精消毒。用紫外线消毒实验室空气、工作台面和一些不能使用其他方法消毒的培养器皿。进无菌室前或做完实验后，均应开灯照射30min进行消毒。紫外线照射60min可以消灭空气中大部分细菌。 1、玻璃器皿的清洗灭菌（5％盐酸溶液、重鉻酸钾120ml、硫酸200ml、蒸馏水200ml）：（1）浸泡:新使用或重复使用的玻璃器皿须经5％盐酸溶液或自来水浸泡过夜或煮沸30min，水洗。以去除新购进玻璃器皿所带有灰尘、铅、砷等物质，并消除其弱碱性。 （2）刷洗:浸泡后用软毛刷和优质的洗洁精进行刷洗。刷洗后经行烘干。 （3）酸浸:刷洗后的玻璃制品酸浸前须适当晾干或烘干，以免造成酸浸液稀释，影响效果。将玻璃制品完全浸泡入清洁液中24h。清洁液具有极强酸蚀作用，操作过程需戴防护用具。（4）冲洗、烘干备用:浸酸后的玻璃器皿先用自来水充分冲洗，吸管需冲洗10min，器皿需每瓶灌满自来水、倒掉反复10次以上，不留任何酸浸液残迹，然后用蒸馏水漂洗2～3次，将清洗好的玻璃器皿放入烘干箱中，烘干后的玻璃器皿要求干净透明，无油烟，不能残留任何有害物质及化学药品等。 （5）包装灭菌:器材经清洗烤干或晾干后，先应严格包装，然后再行消毒灭菌处理，以防止消毒灭菌后再次遭受污染。包装材料常用包装纸、牛皮纸、硫酸纸、棉布、铝饭盒、玻璃或金属制吸管筒、纸绳等。
2、橡胶制品清洗消毒： 0.5mol/L NaOH煮沸15分钟，流水冲洗，0.5mol/L HCl煮沸15分钟，流水冲洗，自来水煮沸2次，蒸馏水煮沸20分钟，50℃烤干备用 3、塑料制品的清洗消毒（瓶盖、离心管）： 使用器皿后立即用清水清洗，浸于自来水过夜，用纱布或棉签和50℃清洗液刷洗，流水冲洗，晾干，浸于清洁液15分钟，流水冲洗（15－20遍）,蒸馏水浸洗三次，双蒸水泡24小时，晾干备用。 三、细胞复苏： 冻存细胞保存管保存在液氮中（-196℃），取出保存管后必须快速冷冻，以避免冰晶重新结晶而对细胞造成伤害，致使细胞死亡。在冻存细胞的保存管中含有对细胞有毒害的成分DMSO,故在解冻应马上将其去除。在冷冻活化前应在无菌台上将细胞培养液配好，然后将保存管从液氮中取出，放于37℃的温水中快速使细胞解冻。解冻后悬液快速移入培养液中混匀，离心去掉上清液，再加入细胞培养液。 实验人员穿上无菌实验室操作服用酒精喷于手上消毒，然后就位用酒精棉球擦拭实验台（1）取一15ml离心管用滴管在其内滴加5--9ml培养液（取8ml）。 （2）从液氮罐中取出冻存管，并迅速放入37℃水浴，不时摇动，使其急速融化，30～60s 内完成。 （3）冻存管用70％酒精擦拭消毒后，打开盖子，用吸管将细胞悬液转移入上述离心管中（用培养基把冻存管洗一遍，把粘在壁上的细胞都洗下来）。 （4）低速离心(1000r／min) 5min，去上清后再用8ml培养液再清洗离心一次。 （5）离心后倒掉上清液，在离心管中滴加3ml培养液（RPMI-1640），混匀（可用滴管轻柔吹打）。 （6）将离心管中的混合液转移到培养瓶中，并在培养瓶中滴加15滴10%小牛血清，盖上瓶盖，标好细胞种类和日期、培养人姓名等，将培养瓶平放，置于37°C培养箱中培养。2-3天换一次培养基。 四、细胞传代： 当观察到培养瓶中细胞铺满度为90%时（细胞生长处于对数期时），解冻复活成功后的细胞要进行分离培养，否则细胞会因生存空间不足或密度过大，营养障碍，影响细胞生长。细胞由原培养瓶内分离稀释后传到新的培养瓶中培养的过程称之为传代培养。传代细胞细胞株的最大利处在于提供了大量持久的实验材料，便于实验。 （1）试验台的消毒工作准备好，弃去旧培养液，用PBS液（不含钙，镁离子）洗1-2次，以免剩余培养液影响胰蛋白酶活性。（细胞贴壁生长）。 （2）向瓶内加入1ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mEDTA），置于37℃孵箱或室温（25℃温度）下进行消化，1--3min后把培养瓶放在倒置显微镜下进行观察，当发现胞质回缩、细胞间隙增大后，应立即中止消化（将培养瓶翻转过来，以保证细胞没有脱壁）。 备注：若细胞没有脱壁，生长良好，则直接倒掉消化液，加培养液8ml，离心收集细胞；若发现很多细胞已解离已脱壁（即解离过度），则直接加培养液进行离心收集细胞。 （4）倒出消化液，向瓶内用滴管加入培养液少量（约2ml），轻轻转动培养瓶，把残留胰蛋白液消化液冲掉，然后再加3ml培养液+15滴小牛血清。 （5）使用吸管，吸取瓶内培养液，按顺序反复轻轻吹打瓶壁细胞，使之从瓶壁脱离形成细胞悬液。吹打时动作要轻柔，以防用力过猛损伤细胞。 （6）将准备好的细胞悬液转入离心管中，离心(1000r／min) 5min。 （7）将离心后离心管中液体倒掉，在离心管中加入3ml培养液，并反复吹打细胞，制成细胞悬液。
原代细胞培养实验(药理)
一.细胞培养的基本原理 细胞培养是用酶消化法将组织碎块分离成单个细胞，用培养基制成细胞悬液，在体外适宜条件下，使细胞生长繁殖，并保留其一定的结构和功能特性。细胞培养与组织培养、器官培养主要不同点在于原始培养的对象不同。细胞培养使用的是单个细胞悬液，组织培养使用的是组织块(0.5～1立方毫米)或薄片(厚0.2毫米)，而器官培养使用的是器官原基或器官的一部分或整个器官。在组织培养中，细胞自组织块周围移出并生长，细胞在生长过程中总有移动(运动)或其它变动，这样就使被培养的组织难以长期维持其原有的结构和功能。培养时间越长，发生变化的可能性越大，结果常使单一类型的细胞保存下来，最终成了细胞培养。在细胞培养中，细胞生命活动和体内细胞一样，仍然是相互依存的，呈现一定的组织特异性，所以组织培养和细胞培养实际上无严格区别。 细胞培养技术是生命科学中常用的研究手段，该方法能排除神经体液因素的影响及肝、肾解毒功能的干扰，观察某些因素或药物对培养细胞的直接作用。通过实验可获得某一类型细胞的纯培养。如心肌组织中心肌细胞约占50%，非心肌细胞占50%;而经纯化分离的心肌细胞悬液中，心肌细胞可达95%以上，这样，心肌细胞原代培养实验基本不受其它细胞的干扰。在细胞培养实验中能直接观察到培养细胞生命活动的动态过程;用定时显微摄影记录可发现一些肉眼观察不到的生命现象;还可利用电镜手段、同位素标记、放免法和免疫组化法等来研究细胞形态结构及细胞内化学物质的分布。此外，还能节约研究费用。如在某些研究中，用100只动物做实验所获得结论与用100张盖玻片或几十个培养瓶而获得结论具有相同的统计学意义，而细胞培养较之大批量的动物饲养花费要小。 但细胞培养方法也存在不足之处：培养细胞失去体内细胞的制约和整体的调节作用，细胞形态和功能会发生一定程度的改变。培养方法、实验试剂对细胞形态和功能有一定的影响，如胰蛋白酶可破坏细胞表面受体、酶、抗原等。长期体外培养的细胞，由于反复传代、冻存和操作等因素的影响，可能发生染色体非整倍体改变，呈永生化或癌变的特征。 二.细胞培养的基本设备与用品 (1)细胞培养的基本设备 细胞培养的基本设备有：CO2培养箱，倒置显微镜，净化台，压力蒸汽消毒器，自动双重纯水蒸馏器，液氮罐，冰箱，电热干燥箱，电热恒温培养箱，电动吸引器，抽气泵等。 (2)常用的实验用品 1.玻璃器皿 细胞培养所用的玻璃器皿应由透明度好、无毒的中性硬质玻璃制成。常用的有以下几种：国产螺旋口培养瓶[有12.5毫升，25毫升，100毫升等规格，国外培养瓶常以底面积(平方厘米)表示];培养皿(直径有3.5厘米，6厘米，9厘米，10厘米等规格);离心管(5毫升，10毫升);注射器(1毫升，5毫升等);用生理盐水瓶代替的贮存瓶(100毫升，250毫升，500 毫升);青霉素瓶(5毫升);西力辛瓶(10毫升);其它还有尖吸管和移液管，载玻片(厚度0.8～1.2毫米)，盖玻片(厚度0.12毫米)，贮存尖吸筒用的玻璃筒或金属筒，漏斗，烧杯，量筒，贮蒸馏水瓶，冷冻管(1.5毫升，2毫升)等。
原代细胞培养和传代培养的方法及其注意事项
初代培养 原理 将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用EDTA）或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖，这一过程称原代培养。 仪器、材料及试剂 仪器：培养箱（调整至37℃），培养瓶、青霉素瓶、小玻璃漏斗、平皿、吸管、移液管、纱布、手术器械、血球计数板、离心机、水浴箱（37℃） 材料：动物组织块 试剂：1640培养基（含20%小牛血清），0.25%胰酶，Hank′s液，碘酒 初代消化培养法 1. 准备：取各种已消毒的培养用品置于净化台面，紫外线消毒20分钟。开始工作前先洗手、75%酒精擦拭手至肘部。 2. 布局：点燃酒精灯，安装吸管帽。 3. 处理组织：把组织块置于烧杯中，用Hanks液漂洗2~3次，去除血污；如怀疑组织可能污染，可先置于含有青链霉素的混合液中30~60分钟。 4. 剪切：用眼科剪把组织切成2~3毫米大小的块，以便于消化。加入比组织块总量多30~50倍的胰蛋白酶液，然后一并倒入三角烧瓶中，结扎瓶口或塞以胶塞。 5. 消化：或用恒温水浴，或置于37℃温箱消化均可，消化中每隔20分钟应摇动一次，如用电磁恒温搅拌器消化更好。消化时间依组织块的大小和组织的硬度而定。 6. 分离：在消化过程中见消化液发混浊时，可用吸管吸出少许消化液在镜下观察，如组织已分散成细胞团或单个细胞，立即终止消化，随即通过适宜不锈钢筛，滤掉尚未充分消化开的组织块。低速 （500~1000转/分）离心消化液5分钟，吸出上清，加入适量含有血清的培养液。 7. 计数：用计数板计数，如细胞悬液细胞密度过大，再补加培养液调整后，分装入培养瓶中。对大多数细胞来说，pH要求在7.2~7.4范围，培养液呈微红色，如颜色偏黄，说明液体变酸，可用NaHCO3调整。 8. 培养：置于36.5℃温箱培养，如用CO2温箱培养，瓶口需用纱布棉塞或螺旋帽堵塞，纱布塞易生霉菌，每次换液时需要换新塞。 初代组织块培养法 1. 剪切：把组织小块置于小烧杯或青霉素小瓶中，用Hanks液漂洗二三次以去掉表面血污，吸静Hanks液，用眼科剪反复剪切1mm3块为止。 2. 摆布：用弯头吸管吸取若干小块，置于培养瓶中，用吸管弯头把组织小块摆布在培养瓶底部，小块相互距离以0.5cm为宜，每一25ml培养瓶底可摆布20~30块。 3. 轻轻翻转培养瓶，另瓶底向上，注意翻瓶时勿另组织小块流动，塞好瓶塞，置36.5℃温箱培养2小时左右（勿超过4小时），使小块微干涸。 4. 培养：从微箱中取出培养瓶，开塞，46度斜持培养瓶，箱瓶底脚部轻轻注入培养液少许，然后缓缓再把培养瓶翻转过来，让培养液慢慢覆盖附于瓶地上的组织小块。置温箱中静止培养。待细胞从组织块游出数量增多后。再补加培养液。
实验报告-细胞原代培养实验
细胞生物学实验报告 实验三细胞原代培养 1引言 1.1 实验目的 1. 理解细胞原代培养原理。 2. 了解细胞原代培养的应用。 3. 独立进行鼠胚和鸡胚细胞原代培养操作。 4. 巩固无菌操作技术。 1.2 实验原理 细胞原代培养：原代培养组织直接从机体获取后，通过组织块长出单层细胞或者用酶消化或机械方法将组织分散成单个细胞开始培养，严格意义上的原代培养指在首次传代前的培养，但通常把第一代至第十代以内的培养细胞统称为原代细胞培养。 2实验仪器、试剂及操作步骤 2.1 实验仪器 超净工作台、倒置相差显微镜、CO2培养箱、酒精灯、酒精棉球、酒精喷壶、试管架、滴管筒 （头）、废液缸、手术小直剪刀、眼科直镊子、眼科弯镊子、玻璃平皿、培养瓶等 2.2 实验试剂 DMEM培养基、D-Hanks缓冲液、血清、抗生素、胰蛋白酶消化液等 2.3 实验材料 动物：9至12日龄的鸡胚、15日龄的鼠胚 2.4 实验步骤 A.鸡胚成纤维细胞的原代培养 1.实验室和超净工作台消毒，紫外照射20Min左右。 2.穿好实验服，进无菌室前穿鞋套、洗手。 3.关闭紫外灯，开日光灯和开风机，超净工作台台面应整洁，用75%酒精擦双手消毒，擦拭台面。 4.在D-Hanks缓冲液中按1：100的比例加入双抗。 5.取9-12日龄鸡胚，用照蛋器照检，画出气室边界和胎位。将鸡胚置于鸡卵架上，用酒精棉球擦拭蛋 壳。 6.用镊子在鸡蛋气室位置敲一道划痕，然后用镊子小心去除气室部位的蛋壳。 7.换用洁净的无菌镊子揭开膜，取出鸡胚至灭菌的培养皿中，用D-Hanks缓冲液冲洗鸡胚。 8.用眼科剪去除鸡胚的头部、四肢以及内脏，然后用D-Hanks缓冲液充分洗涤躯干。 9.将躯干置于小平皿盖中，用D-Hanks缓冲液至少洗涤3次，充分弃除红细胞。 10.用无菌眼科小剪刀将鸡胚躯干剪成1mm3的碎块。在胚胎组织块中加入1mL的胎牛血清，用滴管吸取组 织块接种到培养瓶内。在培养瓶中放置10-15个组织块。 11.在培养瓶的另一侧面加入完全培养基，注意不要冲到组织块。将接种组织块的培养瓶面朝上在
常规细胞培养方法
常规细胞培养方法（原代培养和传代培养）初代培养 原理 将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用EDTA）或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖，这一过程称原代培养。 仪器、材料及试剂 仪器：培养箱（调整至37℃），培养瓶、青霉素瓶、小玻璃漏斗、平皿、吸管、移液管、纱布、手术器械、血球计数板、离心机、水浴箱（37℃） 材料：动物组织块 试剂：1640培养基（含20%小牛血清），0.25%胰酶，Hank′s 液，碘酒 初代消化培养法
1.准备：取各种已消毒的培养用品置于净化台面，紫外线消毒20分钟。开始工作前先洗手、75%酒精擦拭手至肘部。 2.布局：点燃酒精灯，安装吸管帽。 3.处理组织：把组织块置于烧杯中，用Hanks液漂洗2~3次，去除血污；如怀疑组织可能污染，可先置于含有青链霉素的混合液中3 0~60分钟。 4.剪切：用眼科剪把组织切成2~3毫米大小的块，以便于消化。加入比组织块总量多30~50倍的胰蛋白酶液，然后一并倒入三角烧瓶中，结扎瓶口或塞以胶塞。 5.消化：或用恒温水浴，或置于37℃温箱消化均可，消化中每隔20分钟应摇动一次，如用电磁恒温搅拌器消化更好。消化时间依组织块的大小和组织的硬度而定。 6.分离：在消化过程中见消化液发混浊时，可用吸管吸出少许消化液在镜下观察，如组织已分散成细胞团或单个细胞，立即终止消化，随即通过适宜不锈钢筛，滤掉尚未充分消化开的组织块。低速（500 ~1000转/分）离心消化液5分钟，吸出上清，加入适量含有血清的培养液。
7.计数：用计数板计数，如细胞悬液细胞密度过大，再补加培养液调整后，分装入培养瓶中。对大多数细胞来说，pH要求在7.2~7. 4范围，培养液呈微红色，如颜色偏黄，说明液体变酸，可用NaHC O3调整。 8.培养：置于36.5℃温箱培养，如用CO2温箱培养，瓶口需用纱布棉塞或螺旋帽堵塞，纱布塞易生霉菌，每次换液时需要换新塞。 初代组织块培养法 1.剪切：把组织小块置于小烧杯或青霉素小瓶中，用Hanks液漂洗二三次以去掉表面血污，吸静Hanks液，用眼科剪反复剪切1mm 3块为止。 2.摆布：用弯头吸管吸取若干小块，置于培养瓶中，用吸管弯头把组织小块摆布在培养瓶底部，小块相互距离以0.5cm为宜，每一2 5ml培养瓶底可摆布20~30块。 3.轻轻翻转培养瓶，另瓶底向上，注意翻瓶时勿另组织小块流动，塞好瓶塞，置36.5℃温箱培养2小时左右（勿超过4小时），使小块微干涸。 4.培养：从微箱中取出培养瓶，开塞，46度斜持培养瓶，箱瓶底脚部轻轻注入培养液少许，然后缓缓再把培养瓶翻转过来，让培养液
细胞悬浮培养
细胞悬浮培养 摘要： 悬浮培养是非贴壁依赖性细胞的一种培养方式，是一种十分有用的实验体系，在液体状态下便于细胞和营养物质的充分接触和交流，细胞状态可以相对保持一致，因此有利于在细胞水平上进行各种遗传操作和生理生化活动的研究，同时为植物细胞的大规模培养提供前期技术基础。但该技术目前在国内尚未得到广泛应用，生物制品生产仍主要采用病毒产率低、生产成本高、劳动强度大的转瓶细胞培养方式。随着现代生物技术发展，利用细胞悬浮培养技术进行生物制品生产是生物制药行业发展的必然趋势。 关键词：单个细胞细胞悬浮培养愈伤组织同步化
1．细胞悬浮培养的定义 定义1：细胞悬浮培养（cell suspension culture）是指将单个游离细胞或小细胞团在液体培养基中进行培养增殖的技术[1]。 应用学科：细胞生物学（一级学科）；细胞培养与细胞工程（二级学科） 定义2：在流动的液体培养基中培养非贴壁的悬浮细胞或小细胞团的细胞或组织的培养方法。细胞附着在微运载体上的培养也是一种悬浮培养。 应用学科：生物化学与分子生物学（一级学科）；方法与技术（二级学科）2．单细胞制备的方法 2.1 机械法 早期用机械法分离叶组织单细胞。Ball和joshi（1965）、joshi和noggle（1967），以及joshi和Ball（1968）曾先后用小解剖刀从花生成熟叶片中刮离体细胞，这些离体细胞可直接在液体培养基中培养，很多游离细胞都能成活，并持续地进行分裂。随后，人们用机械法相继从菠菜、大豆和石刁柏等多种植物中分离得到叶肉细胞，并能够分裂和形成愈伤组织。Rossini（1972）指出，只有在薄壁组织排列松散、细胞间接触点很少时，用机械法分离叶肉细胞才能取得成功[2]。 2.2 酶解法 酶解法分离单细胞主要是利用果胶酶将细胞之间的中胶层解离，获得分散的细胞。人们最早用果胶酶处理烟草叶片，分离到大量有代谢活性的叶肉细胞，将这种方法用到了18种其它草木植物上也获得成功。由于果胶酶不仅能降解细胞之间的中胶层，而且还能软化细胞壁，因此在用酶解法分离细胞的时候必须对细胞给予渗透压保护，即在酶液中加入一定浓度的渗透压稳定剂。 酶解法一般利用叶片作为分离细胞的材料，但此法不能分离单子叶作物如小麦、大麦和玉米的叶肉细胞[3]。 2.3 愈伤组织诱导法 以愈伤组织作为细胞悬浮培养的细胞来源，首先必须诱导出适宜的愈伤组织。用于建立悬浮系的愈伤组织必须有较好的松散行，使之在悬浮培养的起始阶段细胞容易打散。同时，愈伤组织还必须具备较强的增殖和再生能力。诱导符合这些要求的愈伤组织，首先，必须选择适宜的植物外植体材料。其次，培养基的附加成分对建立疏松易散的愈伤组织具有较大的影响。
细胞培养操作步骤
培养基的配置：基础培养基500ml+胎牛血清50ml+双抗5ml 冻存液的配置：DMSO18ml+胎牛血清2ml。 依次比例酌量配置。 超净工作台常规配置 移液器1套（2.5μl、20μl、200μl、1ml），酒精灯1盏，液器1台，斜架1台，酒精喷壶1个，酒精棉球缸1个，污缸1个， 常规耗材：培养瓶（50㎝2），定量移液管（5ml、10ml），枪头（1ml、200μl、10μl），培养皿，6/24/48/96孔板，医用脱脂棉球，保种管 所需试剂：gibco高糖培养基，胎牛血清，双抗，DMSO，胰酶，苯扎溴氨，75%酒精…… 实验前准备： 所需的各项高压后的耗材放于超净工作台内，用酒精喷壶喷洒实验台面，并关闭工作台打开紫外灯照射30min后开始实验操作。 首次传代前细胞的复苏，首先用一大烧杯盛满37℃的温水放于液氮罐旁边，待细胞株取出后留上端1/3于37℃水面上尽最大速摇动管使其在2min内迅速融化。若种管顶部含有冻存的细胞液在摇动期间用力甩动使其降于管底后再摇动。这一过程可在超净工作台外操作。 实验步骤 一、原代细胞的培养 1.紫外消毒30min后关闭紫外灯，开启超净台正常工作状态，用酒精消毒操作 者的双手。 2.将所需的培养基确保瓶身干净后放于工作台面内，点燃酒精灯，将培养基瓶 口用酒精棉球擦拭后，再将瓶口对准在酒精灯上消毒2-3次，旋开瓶盖后再次分别消毒瓶口和瓶盖，分别放于酒精灯的两侧。特别是将培养基瓶放于斜架上，瓶口对准酒精灯，且放在距离酒精灯最近的位置，瓶盖置于酒精灯的另一侧。 3.取1个高压后的新培养瓶，瓶口在酒精灯上消毒2-3次，旋开后分别再次消 毒瓶口和瓶盖2-3次分别放于酒精灯两侧，把保种管在超净台外用酒精棉球擦拭下2/3后拿进超净台内在酒精灯上消毒保种管口2-3次放于台面左手边，取1ml移液器快速移动在酒精灯上消毒1-2次，然后再装上枪头吸取保种管内的细胞液，悬空移入培养瓶内。 4.拿出1支高压后的5ml定量移液管，在酒精灯上灼烧尾部后装于电动移液器 上，再次放于酒精灯上灼烧整个定量移液管管身2-3次，悬空进入培养基瓶内吸取4ml培养基再悬空移入培养瓶内，将培养瓶瓶口和瓶盖在酒精灯上消毒2-3次后拧紧平放，在瓶身做好实验标记。 5.将培养基瓶口和瓶盖消毒2-3次后拧紧，熄灭酒精灯，整理实验台面，取出 实验试剂及污缸等，关闭超净工作台。 6.将培养瓶放于28℃,5%CO2的培养箱内培养，旋开瓶口少许。注意整个培养箱 底托盘内一定要放高压后的水，且定期更换确保无菌。 在CO2培养箱内培养10-12h，瓶盖拧紧后拿出培养箱，置于荧光倒置显微镜下观察细胞贴壁情况，及细胞形态。最后更换培养液。 二、培养液的更换
细胞原代培养细胞生物学实验报告
细胞生物学实验报告 细胞原代培养 姓名： 学号： 班级： 专业： 同组成员： 一、实验原理
细胞培养是生物学和医学研究中最常用的手段之一，可分为原代培养和传代培养两种。原代培养是直接从生物体获取组织或器官的一部分进行培养。由于培养的细胞刚刚从活体组织分离出来，故更接近于生物体内的生活状态。这一方法可为研究生物体细胞的生长、代谢、繁殖提供有力的手段。同时也为以后传代培养创造条件。 原代培养的方法： 1、组织块法在平皿中用弯头剪把组织尽量剪碎，每个组织块小于1mm3大小。用Hanks 液洗涤2—3次，自然沉淀。用吸管吸去上清液。将组织块贴于培养瓶进行培养。 2、酶消化法将1mm3大小的组织块放入1个三角瓶内加入10—30ml的%的胰蛋白酶。370C磁棒搅拌消化20－30分钟。然后终止消化。用几层无菌纱布过滤。取过滤液，离心800rpm 5—10分钟收集细胞。弃上清，加入带有双抗的培养基，放入培养瓶培养。 取材注意事项： 取材要注意新鲜和保鲜。取材应严格无菌。取材和原代细胞制作时，要用锋利的器械，如手术刀或剃须刀片切碎组织，尽可能减少对细胞的机械损伤。要仔细去除所取材料上的血液（血块）、脂肪、坏死组织及结缔组织，切碎组织时应避免组织干燥，可在含少量培养液的器皿中进行。取材应注意组织类型、分化程度、年龄等，一般来讲，胚胎组织较成熟个体组织容易培养，分化低的较分化高的组织容易生长，肿瘤组织较正常组织容易培养。 二、实验目的 1、理解细胞原代培养原理 2、熟悉细胞原代培养方法与过程 3、了解细胞原代培养的应用 4、独立进行细胞原代培养操作 三、实验材料 手术小直剪刀、眼科直镊子、眼科弯镊子、玻璃平皿、培养瓶、试管、移液管、巴斯德吸管、废液缸、75%酒精棉球、酒精灯。 动物：9-12日龄的鸡胚蛋 四、实验步骤
组织细胞培养技术课程教学大纲
《组织细胞培养技术》课程教学大纲 课程编码：26990214 课程名称：组织细胞培养技术 英文名称：Cell and tissue culture technology 开课学期：第二学期 授课对象：统招硕士 开课院系：基础医学院 开课教研室：病理学与法医学教研室 学时：40 （其中理论学时：20 实验学时：20 ） 学分：0.5 课程类型：公共选修课（公共必修课/选修课/专业课） 选用教材：自编教材《组织细胞培养技术》 主要参考书：⑴鄂征主编. 组织培养和分子细胞学技术.北京：北京出版社，1994。⑵施新猷主编.实验动物学. 北京：人民军医出版社，2000。 大纲编写人员：张宏颖副教授 一、课程目的与任务 组织细胞培养技术是研究组织和细胞的技术方法，被培养的组织和细胞也是实验研究的对象。本课程是医学临床与基础专业硕士研究生的公共选修课程之一，在医学各专业高级人才培养中具有重要地位。本课程系统介绍了组织和细胞培养技术有关的概念、基本原理、操作程序和关键技术，及其在医学研究和临床实践中的应用，该领域的研究历史和最新发展动态；转基因动物技术的概念、研究进展、技术方法、建立方法、应用及前景展望。旨在提升医学专业硕士研究生的知识结构，掌握现代生物技术中的基本实验技能，培养学生开拓创新的能力，适应未来学科发展对人才的需求。 二、教学基本要求 本课程系统地论述了组织细胞培养技术的理论和方法，简要介绍了转基因动物技术及应用。要求学生全面系统地掌握组织细胞培养的操作过程，了解各种操作的基本原理；有判定细胞生长好坏和是否发生污染的能力；熟悉体外培养细胞的生存条件、细胞的生物学性状和与此有关的基本理论知识，了解国内外细胞培养的最新动态和研究进展，了解转基因动物技术的概念、研究进展、技术方法、建立方法、应用，并能自行根据需要设计实验，运用所学技术解决科研中的实际问题，提高学生综合分析问题，系统利用专业知识的综合素质。 三、各章节内容及学时分配 第一章组织培养技术的基本理论知识（4.5学时） 目的与要求 1、掌握组织培养基本概念；了解对组织培养的评价；熟悉对组织培养工作者的要求和工作方法。 2、了解体内外细胞的差异与分化；掌握培养细胞形态分类及培养细胞的大体形态；熟悉组织培养 细胞的生长和增殖过程。 3、熟悉培养细胞生存环境和条件。
悬浮细胞的传代培养
悬浮细胞的传代培养 关键词：细胞菌株标准物质中心北京标准物网 1)训练目的 熟练掌握悬浮细胞的传代培养法。 2）买验原理 体外培养的原代细胞或细胞株要在体外持续地培养就必须传代，以便获得稳定的细胞株或得到大量的同种细胞，维持细胞种的延续。放平细胞瓶，当发现悬浮细胞长到瓶壁85％～90％时，从容器中取出细胞，以1：2或1：3以上的比率转移到另外的容器中进行培养，即为悬浮细胞的传代培养。 3)实验材料 CO2培养箱、倒置显微镜、超净工作台、培养瓶、试管、移液管、巴斯德吸管、废液缸、75％酒精棉球、酒精灯、悬浮细胞株、完全培养基(RPMLl640或DMEM)。 4)操作步骤 A.热培养用液：把已经配制好的培养液瓶子放人37℃水浴锅内预热。
B.用75％酒精棉球擦拭经过紫外线照射的超净工作台和双手。 C.正确摆放使用的器械：保证足够的操作空间，不仅便于操作而且可减少污染。 D.点燃酒精灯：注意火焰不能太小。 E.超净工作台内拆除已消毒空培养瓶的外包装。 F.取出预热好的培养用液：取出已经预热好的培养用液，用酒精棉球擦拭好后放人超净工作台内。 G.从培养箱内取出悬浮细胞：注意取出细胞时要旋紧瓶盖，用75％酒精棉球擦拭显微镜的台面，再在镜下观察细胞。 H.静置：超净工作台内将需传代的培养瓶直立静置半小时左右，待大部分细胞都沉降到细胞瓶底，轻轻吸出1／2～2／3的旧培养基。 I.分瓶：加入新鲜培养液，按1：2或1：3的比例分装到2或3个培养瓶中，再逐瓶加入新鲜培养基。 若想节约时间，并且离心对细胞影响也不大，可采用离心的方式取代静止分离。将培养瓶中的悬浮细胞从培养箱中取出，超净工作台内将所有含细胞的培养液转入离心管，1000r／min。离心5 min，弃上清。加入定量新鲜培养基重悬后以1：2或1：3的比例分装到2或3个培养瓶中培养。
细胞培养的一般过程
细胞培养的一般过程 一、准备工作 准备工作对开展细胞培养异常重要，工作量也较大，应给予足够的重视，推备工作中某一环节的疏忽可导致实验失败或无法进行。准备工作的内容包括器皿的清洗、干燥与消毒，培养基与其他试剂的配制、分装及灭菌，无菌室或超净台的清洁与消毒，培养箱及其他仪器的检查与调试，具体内容可参阅有关文献。 二、取材 在无菌环境下从机体取出某种组织细胞（视实验目的而定），经过一定的处理（如消化分散细胞、分离等）后接入培养器血中，这一过程称为取材。如是细胞株的扩大培养则无取材这一过程。机体取出的组织细胞的首次培养称为原代培养。理论上讲各种动物和人体内的所有组织都可以用于培养，实际上幼体组织（尤其是胚胎组织）比成年个体的组织容易培养，分化程度低的组织比分化高的容易培养，肿瘤组织比正常组织容易培养。取材后应立即处理，尽快培养，因故不能马上培养时，可将组织块切成黄豆般大的小块，置4℃的培养液中保存。取组织时应严格保持无菌，同时也要避免接触其他的有害物质。取病理组织和皮肤及消化道上皮细胞时容易带菌，为减少污染可用抗菌素处理。由组织并分离分散细胞的方法可参阅有关文献。 三、培养 将取得的组织细胞接入培养瓶或培养板中的过程称为培养。如系组织块培养，则直接将组织块接入培养器皿底部，几个小时后组织块可贴牢在底部，再加入培养基。如系细胞培养，一般应在接入培养器皿之前进行细胞计数，按要求以一定的量（以每毫升细胞数表示）接入培养器皿并直接加入培养基。细胞进入培养器皿后，立即放入培养箱中，使细胞尽早进入生长状态。正在培养中的细胞应每隔一定时间观察一次，观察的内容包括细胞是否生长良好，形态是否正常，有无污染，培养基的PH是否太酸或太碱（由酚红指示剂指示），此外对培养温度和CO2浓度也要定时检查。 一般原代培养进入培养后有一段潜伏期（数小时到数十天不等），在潜伏期细胞一般不分裂，但可贴壁和游走。过了潜伏期后细胞进入旺盛的分裂生长期。细胞长满瓶底后要进行传代培养，将一瓶中的细胞消化悬浮后分至两到三瓶继续培养。每传代一次称为“一代”。二倍体细胞一般只能传几十代，而转化细胞系或细胞株则可无限地传代下去。转化细胞可能具有恶性性质，也可能仅有不死性（Immortality）而无恶性。培养正在生长中的细胞是进行各种生物医学实验的良好材料。 四、冻存及复苏 为了保存细胞，特别是不易获得的突变型细胞或细胞株，要将细胞冻存。冻存的温度一般用液氮的温度—－196℃，将细胞收集至冻存管中加入含保护剂（一般为二甲亚砜或甘油）的培养基，以一定的冷却速度冻存，最终保存于液氮中。在极低的温度下，细胞保存的时间几乎是无限的。 复苏一般采用快融方法，即从液氮中取出冻存管后，立即放入37℃水中，使之在一分钟内迅速融解。然后将细胞转入培养器皿中进行培养。 冻存过程中保护剂的选用、细胞密度、降温速度及复苏时温度、融化速度等都对细胞活力有影响。 培养细胞的细胞生物学 一、体内、外细胞的差异和分化 1、差异：细胞离体后，失去了神经体液的调节和细胞间的相互影响，生活在缺乏动态平衡的相对稳定环境中，日久天长，易发生如下变化：分化现象减弱；形态功能趋于单一化或生存一定时间后衰退死亡；或发生转化获得不死性，变成可无限生长的连续细胞系或恶性细胞
植物细胞悬浮培养技术
植物细胞悬浮培养技术 一、基本原理 利用固体琼脂培养基对植物的离体组织进行培养的方法在某些方面还存在一些缺点，比如在培养过程中，植物的愈伤组织在生长过程中的营养成分、植物组织产生的代谢物质呈现一个梯度分布，而且琼脂本身也有一些不明的物质成分可能对培养物产生影响，从而导致植物组织生长发育过程中代谢的改变而利用液体培养基则可以克服这一缺点，当植物的组织在液体培养基中生长时，我们可以通过薄层震荡培养或向培养基中通气用以改善培养基中氧气的供应。植物细胞的悬浮培养是指将植物细胞或较小的细胞团悬浮在液体培养基中进行培养，在培养过程中能够保持良好的分散状态。这些小的细胞聚合体通常来自植物的愈伤组织。 一般的操作过程是把未分化的愈伤组织转移到液体培养基中进行培养。在培养过程中不断进行旋转震荡，一般可用100～12Or/min 的速度进行。由于液体培养基的旋转和震荡，使得愈伤组织上分裂的细胞不断游离下来。在液体培养基中的培养物是混杂的，既有游离的单个细胞，也有较大的细胞团块，还有接种物的死细胞残渣。 在液体悬浮培养过程中应注意及时进行细胞继代培养，因为当培养物生长到一定时期将进入分裂的静止期。对于多数悬浮培养物来说，细胞在培养到第18～25d 时达到最大的密度，此时应进行第一次继代培养。在继代培养时，应将较大的细胞团块和接种物残渣除去。若从植物器官或组织开始建立细胞悬浮培养体系，就包括愈伤组织的诱导、继代培养、单细胞分离和悬浮培养。目前这项技术已经广泛应用于细胞的形态、生理、遗传、凋亡等研究工作，特别是为基因工程在植物细胞水平上的操作提供了理想的材料和途径。经过转化的植物细胞再经过诱导分化形成植株，即可获得携带有目标基因的个体。 二、器材 超净工作台、高压蒸汽灭菌器、恒温培养箱、磁力搅拌器、恒温空气摇床、镊子、锥形瓶、水稻种子 三、操作步骤 1．配制培养基 按照培养基配方取各种药品，最后用蒸馏水定容到所需体积。所配制的培养基经高压蒸汽灭菌后备用，固体琼脂培养基分装在250mL 的锥形瓶内，每瓶约分装30mL。 2．水稻种子的消毒 （1）将种子置于无菌的培养皿内，以体积分数95％的酒精消毒1～2min。 （2）取出后用无菌水冲洗2～3 遍。 （3）将种子放入25.0g/L 的次氯酸钠溶液中轻轻摇动后，浸泡60min 。 （4）取出后用无菌水冲洗，将次氯酸钠溶液充分洗净。 3. 接种 在超净工作台内，将灭菌后的水稻种子接到诱导愈伤组织的固体培养基上，每个培养瓶接5～10 粒种子。接种完毕后用封口膜将培养瓶封好，放在26℃的恒温培养箱中进行黑暗培养。 4．悬浮培养的开始： 当得到愈伤组织后，将其转人到AA 液体培养基中。注意愈伤组织块应小于3mm . 若组织块较大可用无菌解剖刀将其分割成小块。液体培养基分装在250mL 的锥形瓶内．接种完毕后将瓶口用封口膜封好，把培养瓶放到恒温摇床上进行震荡培养。调整摇床的旋转速度，使之为120r/min。培养温度为26℃，在黑暗中培养。 5．悬浮培养物的保持 进行悬浮培养后要不断进行观察，由于培养物的继代培养与培养瓶内培养物的密度及细胞
《细胞实验》02 原代细胞培养和传代培养的方法
原代细胞培养和传代培养的方法 原代培养 原理 将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用EDTA）或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖，这一过程称原代培养。 仪器、材料及试剂 仪器：培养箱（调整至37℃），培养瓶、青霉素瓶、小玻璃漏斗、平皿、吸管、移液管、纱布、手术器械、血球计数板、离心机、水浴箱（37℃） 材料：动物组织块 试剂：1640培养基（含20%小牛血清），0.25%胰酶，Hank′s液，碘酒 初代消化培养法 1. 准备：取各种已消毒的培养用品置于净化台面，紫外线消毒20分钟。开始工作前先洗手、75%酒精擦拭手至肘部。 2. 布局：点燃酒精灯，安装吸管帽。 3. 处理组织：把组织块置于烧杯中，用Hanks液漂洗2~3次，去除血污；如怀疑组织可能污染，可先置于含有青链霉素的混合液中30~60分钟。 4. 剪切：用眼科剪把组织切成2~3毫米大小的块，以便于消化。加入比组织块总量多30~50倍的胰蛋白酶液，然后一并倒入三角烧瓶中，结扎瓶口或塞以胶塞。 5. 消化：或用恒温水浴，或置于37℃温箱消化均可，消化中每隔20分钟应摇动一次，如用电磁恒温搅拌器消化更好。消化时间依组织块的大小和组织的硬度而定。 6. 分离：在消化过程中见消化液发混浊时，可用吸管吸出少许消化液在镜下观察，如组织
已分散成细胞团或单个细胞，立即终止消化，随即通过适宜不锈钢筛，滤掉尚未充分消化开的组织块。低速（500~1000转/分）离心消化液5分钟，吸出上清，加入适量含有血清的培养液。 7. 计数：用计数板计数，如细胞悬液细胞密度过大，再补加培养液调整后，分装入培养瓶中。对大多数细胞来说，pH要求在7.2~7.4范围，培养液呈微红色，如颜色偏黄，说明液体变酸，可用NaHCO3调整。 8. 培养：置于36.5℃温箱培养，如用CO2温箱培养，瓶口需用纱布棉塞或螺旋帽堵塞，纱布塞易生霉菌，每次换液时需要换新塞。 初代组织块培养法 1. 剪切：把组织小块置于小烧杯或青霉素小瓶中，用Hanks液漂洗二三次以去掉表面血污，吸静Hanks液，用眼科剪反复剪切1mm3块为止。 2. 摆布：用弯头吸管吸取若干小块，置于培养瓶中，用吸管弯头把组织小块摆布在培养瓶底部，小块相互距离以0.5cm为宜，每一25ml培养瓶底可摆布20~30块。 3. 轻轻翻转培养瓶，另瓶底向上，注意翻瓶时勿另组织小块流动，塞好瓶塞，置36.5℃温箱培养2小时左右（勿超过4小时），使小块微干涸。 4. 培养：从微箱中取出培养瓶，开塞，46度斜持培养瓶，箱瓶底脚部轻轻注入培养液少许，然后缓缓再把培养瓶翻转过来，让培养液慢慢覆盖附于瓶地上的组织小块。置温箱中静止培养。待细胞从组织块游出数量增多后。再补加培养液。 传代培养法 原理 细胞在培养瓶长成致密单层后，已基本上饱和，为使细胞能继续生长，同时 也将细胞数量扩大，就必须进行传代（再培养）。传代培养也是一种将细胞种保存下去
组织细胞培养
组织细胞培养概述 组织细胞培养一般泛指所有的体外培养，包括组织培养、细胞培养和器官培养。其中，组织培养（Tissue Culture）指从活体内取出组织，模拟体内生理环境，在体外无菌、适当温度和一定培养条件下，使之生存和生长，并维持其结构和功能的方法。细胞培养（Cell Culture）则是指离散细胞的培养，这些细胞通过酶学的、机械的或化学方法从来源组织中获得，培养物是单个细胞或细胞群。器官培养（Organ Culture）是指以器官的原基、器官的一部分或整个器官为培养物，应用与组织培养相似的条件，使培养物保持着体内组织部分或全部组织学特征，在体外生存、生长并保持一定的功能。组织培养与细胞培养并无严格区别，组织培养可出现细胞单一化现象，即趋向变成单一类型细胞，最终也变成了细胞培养。细胞在培养过程中的生命活动是互相依存的，呈现着一定的“组织”特性。 （一）体外培养方式的分类 体外培养可分为原代培养和传代培养。原代培养，又称初代培养（Primary Culture），即对从生物体内取出的细胞、组织和器官进行实效培养的过程，这样的细胞称为原代细胞，通常只能培养10-50代左右即退化死亡。传代培养（Passage Culture），是指无论是否稀释，将细胞从一个培养瓶转移或移植到另一个培养瓶。原代培养物经首次传代成功后即为细胞系（Cell Line）。如细胞系的生存期有限，则称之为有限细胞系（Finite Cell Line），而已获无限繁殖能力能够持续生存的细胞系，称连续细胞系或无限细胞系（Infinite Cell Line）。由某一细胞系分离出来的、在性状上与原细胞系不同的细胞系，称该细胞的亚系（Subline）。 （二）体外培养细胞的分型 根据离体细胞在培养皿中生长时是否贴壁，可将体外培养细胞分为贴壁型和悬浮型两类。 1.贴壁型细胞：培养细胞需贴附在支持物上生长，大多数细胞属于此型，也称锚着依赖性细胞（anchorage-dependent cells）。细胞贴壁后，分化现象常变的不显著，易失去原有组织特征，形态上表现单一化。主要包括①上皮细胞