简答植物组织培养

（一）、某培养基的配方是MS＋BA 1.5 mg/L＋NAA2.5 mg/L＋IBA 1.0 mg/L+ 2.5%蔗糖＋0.7％琼脂粉。MS母液的浓度分别是：大量元素50倍，微量元素100倍，铁盐20倍，有机物100倍；BA母液浓度1.0 mg/ml ，NAA母液浓度0.5mg/ml，IBA母液浓度0.2mg/ml。要配制800ml该培养基，需要吸取各种母液各多少ml？分别称取蔗糖、琼脂粉各多少克？（要求写出计算步骤） 1.BA=0.8*1.5/1=1.2ml 2.NAA=0.8*2.5/0.5=4ml

3.IBA=0.8*1/0.2=4ml

4.蔗糖=800*2.5%=20g

5.琼脂粉=800*0.7%=5.6g

（二）、如何减轻试管苗玻璃化现象？如何防止外植体的真菌污染？

1. （1）利用固体培养方法，增加琼脂浓度，降低培养基中的渗透势，造成细胞吸水阻遏。或提高培养基中蔗糖含量或加入渗透剂，减少培养基中植物材料可获得的水分，这也可以抑制玻璃化的发生。

（2）适当降低培养基中的细胞分裂素和赤霉素的浓度。或者，适当增加培养基中Ca、Mg、Mn、K、P、Fe、Cu、Zn元素含量，降低N和CL元素比例，特别是降低胺态氮的浓度，提高硝态氮量。

（3）增加自然光照。因为自然光中的紫外线能促进试管苗成熟。

（4）改善培养器皿的气体交换状态封口膜

（5）在培养基中添加其他物质。如添加马铃薯汁可降低油菜的玻璃苗的产生频率。

2.在接种前要求无菌室内做到用空气循环过滤装置使空气过滤灭菌或通过紫外线照射灭菌外，再利用超净工作台接种前，应开机15min以达到空气的充分过滤灭菌。而且接种时严格操作，如在接种前去掉橡皮筋，打开棉塞时动作要轻及去掉瓶塞后瓶子应拿成斜角，最好瓶口放在酒精火焰的前方等等

（三）、简答出一般茎段是怎样选材消毒和接种的？

选材：较幼嫩的材料，器官的生理状态和发肓年龄，外植体的大小为0.5－1.0cm

消毒：自来水较长时间冲洗+70%酒精浸泡植物种+无菌水冲洗2~3次+2%~10%NaClO （0.1%HgCl2）12min+无菌水冲洗3次。（第三章5页）

接种：①左手拿三角瓶或果酱瓶，用右手轻轻取下封口膜或盖子

②将三角瓶或果酱瓶的口靠近酒精灯火焰，瓶口稍微倾斜，这样瓶口外部在火焰上旋转灼烧数秒钟，后用镊子将外植体送入瓶中。

一．植物组织培养成功的关键是什么？

1.无毒无菌的环境

2.生长素或生长素类似物

3.通常用固体培养基(琼脂)

4.先进行植物组织或器官的脱分化

5.长出根来后要保证根呼吸所需氧气

二．植物外植体的表面消毒剂种类

1、漂白粉（1%~10%的滤液）

2、次氯酸钠溶液（0.5%~10%）

3、氯化汞（0.1%~1%）

4、酒精（70%~75%）

5、过氧化氢（3%~10%）

6、新洁尔灭等。

三．植物组织培养技术的常见难题及防治方法。1污染问题：分为细菌和真菌1）外植体的灭菌要彻底. 要获得完全无菌的接种材料2）严格遵守无菌操作规程3）加入抗生素4）无菌培养5）控制外植体的接种数量6）一旦发现已经有了污染的苗头，最好马上转接到新的培养基上

2 外植体和愈伤组织的褐化问题

①选择适宜的外植体及最佳培养基

②对于易褐变的材料注意改善培养条件，并进行连续转接，勤换新鲜培养基。

③在培养基中加入抗氧化剂，如抗坏血酸、聚乙烯吡咯烷酮和牛血清白蛋白等。

④在培养基中加入吸附剂，如：活性炭。

3 玻璃化的问题

（1）利用固体培养方法，增加琼脂浓度，降低培养基中的渗透势，造成细胞吸水阻遏。或提高培养基中蔗糖含量或加入渗透剂，减少培养基中植物材料可获得的水分，这也可以抑制玻璃化的发生。

（2）适当降低培养基中的细胞分裂素和赤霉素的浓度。或者，适当增加培养基中Ca、Mg、Mn、K、P、Fe、Cu、Zn元素含量，降低N和CL元素比例，特别是降低胺态氮的浓度，提高硝态氮量。（3）增加自然光照。因为自然光中的紫外线能促进试管苗成熟。（4）改善培养器皿的气体交换状态封口膜（5）在培养基中添加其他物质。如添加马铃薯汁可降低油菜的玻璃苗的产生频率。

四．活性炭、蔗糖在组织培养中的作用。

1.促进芽的增殖、茎和苗的生长。在茎尖培养和茎段培养时，为防止褐变和有害物质的积累，常在培养基中加入适量活性炭。

2.用于生根培养基。活性炭最广泛的应用是用于培养物的生根。一般认为活性炭创造的黑暗环境有利于根的诱导和根系的生长。

3.用于胚培养，促进成苗。活性炭抗褐化效果比柠檬酸、聚乙烯吡咯烷酮效果都好。

4.用于花药培养。花药培养的主要目的是诱导花粉发育成单倍体，可以快速地获得纯系，缩短育种周期。

五．病毒在植物体内的运转方式。

从细胞到细胞的短距离运转，经过细胞间的胞间连丝向邻近细胞中扩散，速度很慢。烟草普通花叶病毒运转速度为6-13μm/h。长距离运转，通过寄主植物韧皮部的输导组织随着营养输送进行转移,速度很快。一旦病毒进入韧皮部，运转速度突然增快。例如：水稻条纹叶枯病毒运转速度为25cm/h。

六．花药和花粉培养与单倍体的关系。

培养花粉粒的单倍体植株，并使单倍体加倍，作为育种材料的来源。花粉植株经染色体加倍而来的二倍体，在遗传上是纯合的，其自交后代不再分离，缩短育种周期。

七．悬浮培养的材料必须达到的要求。

一般条件下，以幼胚诱导的愈伤组织为最佳（质量好，分化能力强）。用颗粒细小，疏松易碎，外观湿润，鲜艳的白色或黄色的愈伤组织，比较疏松易碎，经过几次筛选，继代全稳定后，可以用于诱导悬浮细胞系。

八．植物组织培养技术的主要用途。

植物组织培养技术是近代生物科学发展起来的一门新技术，是生物技术(即生物工程）的主要组成部分，是在超净的组培室中进行快繁脱毒即工厂化的裁培室中进行规模生产。自从问世以来，对农业、林业、蔬菜、果树、花卉以及药用植物新品种培育，品种脱毒，提纯复壮，快速无性繁殖，扩大种苗生产均产生了划时代影响。

1）在植物育种中的应用

2）在植物脱毒和离体快繁中的应用

3）在次生代谢产物生产中的应用

4）在植物种质资源保存和交换中的应用

5）在遗传、生理、生化、病理等研究中的应用

九．原生质体的融合方式和纯化步骤

融合方式：自发融合：在溶解细胞壁过程中，有些原生质体能彼此融合形成同核体。诱导融合：用物理或化学的方法来诱导原生质体的融合。步骤：两个或多个原生质体的质膜彼此靠近，局部区域质膜紧密粘连，彼此融合，融合完成，形成球形的异核体或同核体。

纯化：●沉淀物重新悬浮于清洗培养基中，在50g离心3-5min后再悬浮，如此反复洗涤2-3次。

●为了纯化出有活力的原生质体，将沉淀悬浮于少量清洗培养基，置于含有蔗糖溶液（21%）的上部，在100g下离心5-10min后，在蔗糖溶液和原生质体悬浮培养基的界面上会出现一个纯净的原生质体带，将此带吸收后，再反复洗涤2次，最后用原生质体培养基洗一次。

10、植物离体保存的主要步骤

一、常温保存：在常温（20±5）℃下，通过改变培养基中某些培养物质的浓度，改变培养的环境条件，可达到保存目的。在保存材料上覆盖一层矿物油如石蜡、硅酮油或液态石油。降低培养环境的氧分压。

二、常低温和低温保存：常低温（15-0℃）和低温（0- -50 ℃）保存，还可辅以改变培养基成分和培养条件，以减缓材料的生长速度减缓继代时间，故又称为最小生长法。

根据植物对温度的耐受力确定其抑制生长的保存温度。在低温保存时还可以结合低压来取得更好的效果主要通过降低培养物周围的大气压，也可以通过在正常的气压下加入惰性气体而降低氧分压。低气压和低氧压都可抑制植物的生长，但不会导致培养物表现型上的差异。

三、超低温保存：

快速冷冻法：适用于培养物细胞体能小，胞质浓、含水量低、液泡化程度低的材料。将植物材料从0℃或其他预处理温度直接投入液氮罐中，降温速度为1000℃/min以上。这种快速降温可使细胞内的水在迅速越过-140℃这一冰晶形成的危险温度期后，细胞内的水形成“玻璃化”状态，不会对细胞产生破坏作用。

慢速冷冻法：适用于含有大液泡的成熟细胞，这种细胞含水量高，在慢速降温过程中，可以使细胞内的水有充足的时间不断地渗到细胞外结冰而避免在细胞内结冰。

将植物材料以0.1—10℃/min的降温速度从0℃降到-100℃左右，而后立即浸入液氮罐中或以同样的速度连续降温至-196℃。

脱水干燥法：将培养材料的含水量降到一定程度，在进入液氮罐中，这样可使植物免遭冻死。无菌气流中干燥、硅胶干燥、21—29℃烘箱内真空干燥法等方法将含水量降到27-40%。

玻璃化法：用高浓度的复合玻璃化保护剂使样品脱水减轻机械损伤和溶液效应，应用价值高。包埋脱水法：将样品用高浓度的蔗糖进行预处理，包埋到海藻酸胶中，避免了二甲亚砜和甘油的毒性。

11、防止外植体的真菌污染

在接种前要求无菌室内做到用空气循环过滤装置使空气过滤灭菌或通过紫外线照射灭菌外，再利用超净工作台接种前，应开机15min以达到空气的充分过滤灭菌。而且接种时严格操作，如在接种前去掉橡皮筋，打开棉塞时动作要轻及去掉瓶塞后瓶子应拿成斜角，最好瓶口放在酒精火焰的前方等等。

12、培养基的配制基本方法

（1）首先在烧杯内放一定量的蒸馏水，以免加入药液时溅出。

（2）再按母液顺序，根据不同母液的不同倍数取规定的量。

（3）加完后一并倒入已溶化的琼脂中，再放入蔗糖，定容至所需体积，继续加温并不断搅拌，待琼脂煮透后端离火源，根据培养基配方及培养基体积加入所需要的生长调节物质。（4）当培养基配制好后应立即进行PH值的调整。最好用酸度计。如无条件也可用精密PH 试纸，pH值可用1mol·L-1KOH（或NaOH）溶液和2mol ·L-1HCI调整。

（5）配制好的培养基要趁热分装，分装时可采用烧杯漏斗直接分注。一般以占试管或三角瓶等培养容器的1/4—1/3为宜。

（6）由于未经灭菌处理的培养基既可能带有各种杂菌，同时又是各种杂菌良好的生长繁殖场所，因此培养基分装后应立即置于灭菌锅内进行灭菌

（7）高压灭菌后的培养基凝固后，宜将培养基放倒培养室中预培养2—3天若没有杂菌污染

才可放心使用。

13、植物脱毒程序、途径和鉴定方法。

程序：利用植物组织培养技术，脱除植物细胞中浸染的病毒，生产健康的繁殖材料。

途径：植物茎尖培养脱毒法

提高脱毒效果：热处理脱毒法和茎尖脱毒法相结合。

化学处理脱毒法和茎尖脱毒法相结合。

鉴定方法：1 直接鉴定法

直接观察植株茎叶有无某种病毒引起的可见症状

2 生物鉴定法（敏感植物鉴定法）

有些植物对病毒极为敏感，一旦感染病毒就会在其叶片乃至全株上表现特有的病斑，把这种植物称为病毒敏感植物或指示植物。

3 抗血清鉴定法

当动物被病毒感染或人工注射异体蛋白质时，一种特异性丙种球蛋白称为免疫球蛋白体在特殊细胞内形成，进入血液存在于血清和体液内。

这种含有特异性“抗体”的血清称为“抗血清”。

4 电子显微镜鉴定法

用电镜直接观察经脱毒培养的叶片，检查是否有病毒质粒的存在，还可以测量病毒颗粒的大小、形状和结构。

5 分子检测法

将待测样品的总RNA与cDNA合成的试剂盒进行反应，合成cDNA，然后利用病毒DNA 特有的序列设计引物进行PCR反应，即可知道在寄主中是否有病毒基因的存在及表达。

茎段消毒方法和过程。

自来水较长时间冲洗+70%酒精浸泡植物种+无菌水冲洗2~3次+2%~10%NaClO （0.1%HgCl2）12min+无菌水冲洗3次

六、论述题

为什么茎尖培养可获得无特定病毒植株？怎样获得无特定病毒的试管苗？获得的无病毒苗用一种方法鉴定其真的无特定病毒的植株？

1）．感染病毒植株的体内病毒的分布并不均匀，病毒的数量随植株部位及年龄而异，越靠近茎顶端区域的病毒的感染深度越低，生长点则几乎不含或含病毒很少。

2）．1.了解植物携带何种病毒，病毒在体内的分布位置2. 母体植株的选择和预处理3. 茎尖的剥离4. 脱毒效果检测

3）．取培养植株的叶片置于研钵中，加入少量的水和等量的0.1mol/L磷酸缓冲液（pH 7.0），磨成匀奖，将其涂抹在指示植株叶片上，在指示植物的叶片撒上金刚砂，通过轻轻摩擦使汁浸入叶片表皮细胞而又不损伤叶片。5分钟后用清水清洗叶面。将指示植株放于防蚜虫网罩的温室内。然后视其病斑的有无，来判断是否脱除了病毒。

请阐述马铃薯脱毒和快繁的程序。为什么试管苗在经过热处理和茎尖培养等方法脱毒后，还需要进行病毒的鉴定?

选择优良母株幼苗，茎尖的２～３cm小段，冲洗1h左右

表面消毒，（表面消毒剂、无菌水），在双筒解剖镜下剥去幼叶，露出圆滑的生长点，注射器针头或解剖针，切取带有1～2个叶原基的生长点，接种于培养基中培养。病毒在植物体内分布是不均一的，热处理并不能杀死病毒，只能钝化病毒的活性，使病毒在植物体内增殖缓慢（停止），而失去侵染能力，所以还需要病毒鉴定。