分子克隆技术实验讲义最终版样本

分子克隆技术实验讲义

黑龙江大学生命科学学院

3月

甜菜M14品系BvM14-glyI基因的克隆与鉴定

一?实验目的

1、熟悉和了解目的基因克隆与鉴定的过程和方法。

2、学习和掌握质粒、T载体的特点。

3、学习和掌握TA克隆的连接体系及操作要点。

4、学习和掌握X? I酶切制备T载体的过程及方法。

5、学习和掌握CaC12法制备大肠杆菌感受态细胞的原理和方法。

6、学习并掌握热激法转化技术的原理和操作步骤。

7、学习并掌握重组子鉴定和筛选的原理及蓝白筛选的原理和方法。

8、学习并掌握碱法小量制备质粒DNA的原理及操作步骤。

二.相关知识

(一)T载体的制备

PMD18-T Vector 种高效克隆PCR产物(T-A Cloning)的商业化专用载体，由pMC 18载体改建而成。在pMC 18多克隆位点处的Xbal和Sa/I 识别位点之间插入了EcoRV识别位点，用EcoRV进行酶切反应后，再左两侧的3,端添加” T”而成，能够大大提高PCR产物的连接.克隆效率。

相关知识点:(1)质粒的提取;(2)酶切;(3) PCR等。

(二)DNA的重组与连接(PCR产物的克隆)

把DNA片段从某一类型的载体无性繁殖到启一类型载体中，例如从某种质粒克隆到另一种质粒，这个过程称为亚克隆。所谓重组，就是把外源目的基因''装进"载体的过程，即DNA的重新组合。为了将目的基因重组于载体分子中，需要将载体DNA和目的基因分别进行适当处理，一般采用内切酶法将载体DNA分子切割成可与外源基因连接的线性分子，使其与相同酶切过的载体分子相互连接，彼此成为配伍末端(compatible end),以产生末端连接。现在一些生物公司也开发了针对不同插入DNA片段的专用载体，如专门用于克隆PCR产物的载体，大大方便了实验操作。

相关知识点：(1)克隆与亚克隆；(2) DNA重组;(3)内切酶;(4)粘性末端与平末端;(5)连接酶;(6)连接酶的分类及功能等。

(三)大肠杆菌感受态细胞的制备

外源基因与载体在体外连接成重组体DNA分子后，需将其导入受体细胞进行扩增和筛选，得到大量、单一的重组体分子，这就是外源基因的无性繁殖或称为克隆。受体细胞也叫宿主细胞，大肠杆菌宿主菌杲当前基因工程最常见的受体细胞。感受态细胞(competent cell)是经过一定方法处理后，具有接受外源DNA能力的大肠杆菌，只有发展了感受态的细胞才能稳定地摄取外来的DNA 分子。

相关知识点:(1)克隆;(2)宿主细胞的定义及分类;(3)感受态细胞定义及其功能;(4)转化定义及方法(DMSO、MnCh. TB aq、PEG)等。

(四)重组DNA的转化及重组子的鉴定

将外源DNA分子导入某一宿主细胞的过程称为转化。把重组DNA分子导入到细菌中产生克隆有两个目的，一是大量产生重组DNA分子，在完成连接反应后，重组DNA分子往往只有纳克级的量，不易操作和逬行下一步的分析，若把重组DNA分子导入到细菌细胞中，细菌细胞可分裂多次产生克隆, 克隆中每一个细胞都含有很多个拷贝的重组DNA分子，这样重组DNA分子的量就多了；二是对重组DNA分子进行纯化，在构建重组DNA分子的过程中很难保证体系中不污染其它的DNA分子，连接过程完成以后体系中有多种分子存在，除了需要的重组DNA分子以外，还含有没有连接上的载体分子、没有连接上的DNA片段.自身环化的DNA分子和连接上污染DNA 片段的重组DNA分子，未连接上的载体和DNA片段对实验影响不大，因为它们即使导入细菌细胞，因为不能复制，很，快就要被细菌细胞中的酶降解掉; 对克隆工作带来影响的

是后两种分子，因为它们都为环状，在细菌细胞中都能复制，因而都能产生克隆，可杲每个细胞中只能导入一个质粒DNA分子,

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每个单克隆都是由一个细胞形成的，因此在每个克隆中所有的细胞都只含有

同一种质粒。因此只要对不同的克隆进行筛选，就能够鉴定所需的重组DNA 分子。

所谓的重组子(recombinant)也叫做转化子(transformant)是指吸收了重组DNA分子的转化细胞。将重组子从其它细胞群中(如上面提到的对克隆影响较大的自身环化的DNA分子和连接上污染DNA片段)分离出来，并鉴定无性繁殖的外源基因确实为目的基因，这过程称为筛选(screening)。根据载体体系、宿主细胞的特性以及外源基因在受体细胞表示情况的不同，初步把筛选方法分为直接筛选和间接筛选，直接筛选法又可进一步分为DNA鉴定筛选法、选择性载体筛选法、分子杂交选择法；间接筛选也能够进一步分为免疫学方法、mRNA翻译检测法；本试验采用平板筛选法中的蓝白筛选法。

《南京农业大学学报》-论文撰写要求

论文撰写要求 1．题名准确、精炼、清晰，充分反映论文的基本内涵与特色。中英文题名内容应一致，英文题名通常以名词短语为主要形式，整个题名只有第1个词的首字母大写，其余均小（专有名词除外）；禁止使用非公知公用的符号、缩写词、外来语、代号和商品名。 2．作者姓名及单位中英文作者姓名顺序应一致，通信作者请用“*”标识，作者英文名为汉语拼音，姓在前，名在后，姓全大写，双名只首字母大写，如，WANG Dawei。作者单位请准确写出全称，不能简写。 3．摘要中文摘要：摘要是对正文主要内容高度浓缩的简短论文，与论文具有同等的信息量，包含“研究目的、方法、结果、结论”4个要素。句首不要简单重复文章题名中的信息。目的、方法、结论要简炼，结果的内容要具体。方法部分须有试验材料和主要设计；结果部分应突出原创性工作，着重反映出文章的创新、独到之处，只叙述新信息和发现及主要数据。缩写或代号首次出现必须加以说明。摘要不宜太短，500字左右。英文摘要：所有论文都必须有500词左右的英文摘要，包含“研究目的、方法、结果、结论”4个要素，与中文摘要对应，结果部分可以详细些。研究目的用一、两句话概括，写出论文的主要研究目的；方法、结果的内容尽可能详细，即解决问题的主要方法、过程（包括试验材料、试验设计、测定方法等），研究结果部分重点描述研究中的创新内容，尽量包括论文中的主要论点和重要的论证和数据；结论应明确。中英文摘要的数据必须与正文的数据一致。摘要模板：摘要：[目的] ×××××××××××××。[方法] ×××××××××××××。 [结果] ×××××××××××××。[结论] ××××××××××× ××。 Abstract：[Objectives]×××××××××××××.[Methods]×××××××××××××.[Results]×××××××××××××.[Conclusions]××××× ××××××××. 4．关键词尽量选用主题词，如果自由选词，选词的关键在于要精选能代表文章主要内容的词或词组；每篇论文可列出3～8个关键词；中英文关键词既要意思一致又要顺序一致。 5．中图分类号从《中国图书馆分类法》（第四版）中查找，自查。 6．引言内容包括研究意义、研究背景、提出问题即本研究与已有研究的不同之处及研究目的。

整个基因克隆实验流程完整

一、组织总RNA的提取相关试剂：T rizol；氯仿；苯酚；异丙醇；75%乙醇；RNase-free水相关仪器：制冰机；液氮&研钵/生物样品研磨仪；高速离心机；移液器（1ml、200μl、100μl/50μl）；涡旋振荡仪；恒温金属浴。相关耗材：解剖工具，冰盒，离心管，离心管架，吸头（1ml，200μl/300μl），一次性手套，实验手套。实验步骤 1.取暂养草鱼，冰上放置一段时间，然后解剖，剪取肠道50~100mg，放入研钵中，加入液氮迅速研磨，然后加入1ml 预冷TRIzol试剂，充分研磨至无颗粒物存在。 2.转移到离心管中，室温放置5min，使细胞充分裂解； 3.按1ml Trizol加入200μl氯仿，盖上盖子，迅速充分摇匀15s，然后室温放置3min； 4.4℃，,12000g 离心15min；此时混合物分为三层，下层红色的苯酚氯仿层，中间层和上层无色水相；RNA存在于无色水相中； 5.小心吸取上清液，千万不要吸取中间界面，否则有DNA污染；转移至一个新的离心管，加入等体积的异丙醇，轻轻混匀； 6.室温放置10min；4℃，,12000g 离心10min； 7.弃上清，加入1ml 75%乙醇洗涤；涡旋，悬浮沉淀；4℃，,12000g 离心5min； 8.弃上清；可以再次用75%乙醇洗涤沉淀； 9.弃上清；用移液器轻轻吸取管壁或管底的残余乙醇，注意不要吸取沉淀；室温放置5min 晾干沉淀；（RNA样品不要过于干燥，否则极难溶解） 10.沉淀中加入30μl RNase-free水，轻弹管壁，使RNA溶解。 RNA质量检测相关试剂：溴酚蓝，TEB/TAE电泳缓冲液，溴乙锭（EB）相关仪器：（超微量分光光度计，移液器（2.5μl 或2μl 规格，10μl规格），电子天平，电泳仪，电泳槽，凝胶成像仪，微波炉，制冰机）相关耗材：（无菌无绒纸，吸头，离心管架，PCR管，PCR管架，锥形瓶，烧杯，一次性手套，实验手套，冰盒）（1）RNA纯度的检测：测定其OD260和OD280的值，根据其OD260/ OD280的比值，当其比值在1.9~2.1之间，说明提取的总RNA纯度比较高，没有蛋白质和基因组的污染。（2）RNA完整性的检测：取2μlRNA，与2μl溴酚蓝混匀，用1%的琼脂糖进行凝胶电泳，20min后，在凝胶成像系统中观察效果。当28S与18S条带清晰，且亮度比大约是2:1时，5S条带若隐若现，而且没有其它条带时，说明完整性不错，可以用于下游逆转录实验。

《分子生物学大(综合)实验》课程介绍(精)

《分子生物学大（综合）实验》课程介绍课程代码（学校统一编制）课程名称分子生物学大（综合）实验英文名称MolecularBiologyBigExperiment 学分：3修读期：第七学期授课对象：生物科学、生物技术课程主任：姓名、职称、学位关洪斌，副教授，博士课程简介 21世记是生命科学的世记,而分子生物学是带动生命科学的前沿科学。分子生物学是在生物大分子水平上研究细胞的结构、功能及调控的学科,在现代生物学学科发展中的重要性与不容置疑的带头作用是众所周知的。许多重大的理论和技术问题都将依赖于分子生物学的突破。随着分子生物学研究工作的不断深入,相关实验技术方法和技术日新月异的发展。为了适应分子生物学研究工作日益发展的需要,满足培养从事现代生物学研究,尤其是进行分子生物学研究的人才的需要,特设置分子生物学大（综合）实验课程。本课程的教学目标和基本要求是使学习者基本掌握分子生物学实验技术的基本原理和方法,教学内容包括TRIZOL试剂盒提取RNA、RNA质量的检测、RT-PCR和变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测cDNA。通过本实验可提高学生的动手能力和创造性思维能力,较好地掌握分子生物学实验操作和技能，为今后独立进行科研工作打下坚实基础。实践教学环节（如果有）实验内容包括TRIZOL试剂盒提取RNA、RNA质量的检测、RT-PCR和变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测cDNA。课程考核实验报告指定教材自编参考书目 1.分子生物学实验指导高等教育出版社施普林格出版社，1999 2.彭秀玲,袁汉英等.基因工程实验技术.湖南科学技术出版社,1997 3.吴乃虎.基因工程原理(上下册).科学出版社,1998 4.F.奥斯伯等著:颜子颖,王海林译.分子克隆实验指南(第二版).科学出版社,1998 5.J.萨姆布鲁克等著:金冬雁,黎孟枫等译.精编分子生物学实验指南.科学出版社,1993

变形梯度凝胶电泳

变性梯度凝胶电泳变性梯度凝胶电泳（denatured gradient gel electrophoresis，DGGE），是根据DNA在不同浓度的变性剂中解链行为的不同而导致电泳迁移率发生变化，从而将片段大小相同而碱基组成不同的DNA片段分开。具体而言，就是将特定的双链DNA片段在含有从低到高的线性变性剂梯度的聚丙烯酰胺凝胶中电泳，随着电泳的进行，DNA片段向高浓度变性剂方向迁移，当它到达其变性要求的最低浓度变性剂处，双链DNA形成部分解链状态，这就导致其迁移速率变慢。由于这种变性具有序列特异性，因此DGGE能将同样大小的DNA片段很理想地分开，它是一种很有用的分子标记方法。 DGGE最初是Lerman 等人于20 世纪80 年代初期发明的，起初主要用来检测DNA 片段中的点突变。Muyzer 等人在1993 年首次将其应用于微生物群落结构研究，并证实了这种技术在研究自然界微生物群落的遗传多样性和种群差异方面具有明显的优越性。此后十年间，该技术被广泛用于微生物分子生态学研究的各个领域，现已广泛应用于生物多样性调查、亲缘关系鉴定、基因突变检测等多个领域。这一技术能够提供群落中优势种类信息，并同时分析多个样品，具有可重复和操作简单等特点，适合于调查种群的时空变化。而且可通过对条带的序列分析或与特异性探针杂交分析，鉴定群落组成。DGGE通过逐渐增加的化学变性剂线性浓度梯度，可以把长度相同但只有一个碱基不同的DNA片段分离。作为一种突变检测技术，DGGE具有如下的优点：（1）突变检出率高。DGGE的突变检出率为99%以上。（2）检测片段长度可达1kb，尤其适用于100~500bp的片段。（3）非同位素性。DGGE不需同位素掺入，可避免同位素污染及对人体造成的伤害。（4）操作简便、快速。DGGE一般在24小时内即可获得结果。（5）重复性好。但是，该方法需要特殊的仪器，而且合成带GC夹的引物也比较昂贵。 DGGE的基本原理及方法： DGGE不是将分子量不同的DNA分开，而是通过聚丙烯酰胺凝胶中变性剂浓度梯度的不同，将序列不同的DNA分开。该方法的原理是根据DNA 的解链特性，不同碱基组成的DNA双螺旋发生变性所要求的变性剂浓度不同，混合双链DNA在变性剂浓度呈线性梯度增加的聚丙烯酰胺凝胶电泳时，当泳动到与DNA变性所需变性剂浓度一致的凝胶位置时，相对应的DNA发生解链变性，导致电泳迁移速率降低。由于泳动受阻DNA分子在凝胶中

常用分子克隆实验方法

常用分子克隆实验方法I 一、植物总DNA的小量提取方法1：提取吸附法。无须巯基乙醇、氯仿等有毒物质，产物无须Rnase处理。 (1)充分研磨。称取约0.2克植物组织，加入液氮充分研磨3-5min，稍后加约1ml溶液 A，继续研磨至略粘稠的组织匀浆，用大口1ml吸头将所有溶液移至1.5ml离心管中，55℃水浴30min； (2) 高速离心去杂质。10,000rpm离心5min，取约600ul上清至新1.5ml离心管； (3) 核酸吸附。往上清液中加入1倍的异丙醇，轻轻混匀，再加入总体积1/4已混匀的溶液B，静置3min; (4) 低速离心沉淀。5000rpm离心1min，轻轻倒掉上清，并用吸水纸轻吸离心管口，再用移液枪吸走大部分残余液体； (5) 75%乙醇清洗。加入1ml75%乙醇，5000rpm离心30s，轻轻倒掉上清，用吸水纸稍吸离心管口。重复该步骤一次，再5000rpm离心30s，然后用移液枪吸走管底的残液，晾干5min； (6) 核酸洗脱。加入约55ul TE（PH8.0）至管底，轻轻重悬硅土，静置3min，10,000rpm 离心1min，用小枪头轻轻吸取出50ul管底溶液，冷藏。方法2：CTAB法，此为在经典方法基础上，经过摸索改进，提高了得率，减少了污染。 (1)充分研磨。称取约0.2克植物组织，加入液氮充分研磨3-5min，稍后加约1ml CTAB 提取液，继续研磨至略粘稠的组织匀浆，用大口1ml吸头移至1.5ml离心管，65℃ 水浴30-60min。 (2) 氯仿抽提。10,000rpm离心3min，取约600ul上清。加入1倍的氯仿，轻轻混匀， 10,000rpm离心3min，取上清再抽提1遍。 (3) 核酸沉淀。加入预冷的1倍异丙醇或2倍乙醇，轻混匀，6000rpm离心3min，弃上清。 (4) 清洗沉淀。轻加入1ml 75%乙醇，再吸掉上清，重复一次，倒置于吸水纸或横放于离心管架上晾干5min。 (5) 溶解DNA。加50ul含Rnase A（约10ug/ml）的TE，常温下放置30min。取约3-5ul 电泳检测后，低温冷藏。

南方医科大学分生实验-绿色荧光蛋白(EGFP)的基因克隆

绿色荧光蛋白（EGFP）的基因克隆南方医科大学学院摘要本实验旨在学习基因克隆并检验，绿色荧光蛋白基因转化入宿主细胞后很稳定，对多数宿主的生理无影响，是常用的报道基因，便于实验。本实验通过将含有目的基因GFP的pEGFP-N1质粒和pMD18-T载体进行酶切、电泳、回收、连接、转入、筛选之后，把GFP基因成功导入到大肠杆菌DH5α(克隆菌)中，从而实现荧光蛋白基因的克隆和表达。关键词：绿色荧光蛋白克隆表达实验名称绿色荧光蛋白的基因克隆 2015- ~ 实验日期实验地点 2015- 合作者指导老师评分教师签名批改日期一、实验目的 1.学习使用限制性内切酶进行DNA酶切的原理和方法。 2.学习掌握琼脂糖凝胶电泳的基本原理和操作方法。 3.掌握PCR技术原理和PCR仪的操作方法。 4.学习PCR产物的TA克隆的基本原理和操作步骤。 5.了解和掌握大肠杆菌的制备方法的基本原理和操作要点以及DNA转化大肠杆菌的原理和方法。

6.掌握双酶切法鉴定重组DNA的基本原理和操作步骤，以及菌落PCR鉴定重组DNA的基本原理和方法。 7.掌握IPTG诱导GFP基因表达的基本原理和操作步骤二、实验原理 1.pEGFP-N1质粒 2.T载体

三、材料与方法： 1.实验材料：质粒：pEGFP-N1 T载体：pUCm-T 菌种：DH5(克隆菌) PCR引物： F——GGCATATGGTGAGCAAGGGCGA R——CGGGATCCCTTGTACAGCTCGTC Tm=56 实验试剂：即用型蓝白T载体（pMD18-T vector cloning kit）快速DNA连接试剂盒限制性内切酶：EcoR I（Fermentas） Axygen质粒提取试剂盒抗生素：氨苄青霉素(Amp)、卡那霉素(Kan) X-gal、IPTG等实验仪器：超净工作台，恒温摇床，高压灭菌锅，恒温培养箱，台式高速离心机，大容量冷冻离心机，PCR仪，紫外分光光度计，水平电泳槽，垂直电泳槽，电泳仪，凝胶成像系统，制冰机、超低温冰箱等 2.方法分离目的基因→限制酶切割目的基因与载体→连接重组体→转入受体细胞→筛选重组体、转化子四、实验具体流程 1.获取外源基因 1)碱裂解法提取质粒使用Axygen质粒提取试剂盒

分子生物学课程教学大纲

分子生物学课程教学大纲课程名称：分子生物学（Molecular Biology）课程编号：1313072215 课程类别：专业课总学时数：68 课内实验时数：18 学分：3.5 开课单位：生命科学学院生物技术教研室适用专业：生物技术适用对象：本科（四年）一、课程的性质、类型、目的和任务分子生物学为高等学校生物技术专业学生必修的一门专业基础课，是从分子水平研究生命本质为目的的一门新兴边缘学科，主要研究核酸、蛋白质等生物大分子的功能、形态结构特征及其重要性和规律性的科学，是人类从分子水平上真正揭开生物世界的奥秘，由被动地适应自然界转向主动地改造和重组自然界的基础学科。通过分子生物学的教学，应使学生了解分子生物学的发展历史以及最新研究成果；熟练掌握DNA的结构与功能、RNA在蛋白质合成中的功能、蛋白质的结构与功能、遗传密码及基因表达调控的本质；了解现代分子生物学基本研究方法，并能运用分子生物学的理论知识分析、研究和解决问题，为进一步学习有关专业课程及从事基因工程领域的研究工作奠定基础。二、本课程与其它课程的联系与分工从学科角度来讲，分子生物学涵盖面非常广，与生物学、生物化学和细胞生物学、遗传学等生命科学课程有交叉，《生物化学》是先修课程。三、教学内容及教学基本要求 [1]表示“了解”；[2]表示“理解”或“熟悉”；[3]表示“掌握”；△表示自学内容；○表示略讲内容；第一章绪论第一节引言创世说与进化论[1]；细胞学说[2]；经典的生物化学和遗传学[3]；DNA的发现[2] 第二节分子生物学简史[1] 第三节分子生物学研究的主要内容分子生物学的含义[3]；DNA重组技术、基因工程技术概念[3]；分子生物学研究的主要内容[3] 第四节展望分子生物学的一些分支学科[1]；分子生物学发展的趋势[1] 重点：分子生物学的含义和研究内容

分子克隆技术试卷

分子克隆技术一、填空题 1.PCR反应中加入矿物油的作用是___________________________。 2.分子克隆实验中外源DNA和载体片段连接之前，要对载体进行去磷酸化处理，我们在本次试验中去磷酸化使用的碱性磷酸酶是___________________________。它的目的是___________________________。 3.用α互补筛选转化子是，带有外源片段的菌落显___________________________色。 4.Southern杂交中进行与杂交的目的是___________________________。 5.凝胶糖凝胶电泳时加入loading buffer作用是___________________________和 ___________________________。 6.影响琼脂糖凝胶电泳的因素主要有___________________________、 ___________________________、___________________________、 ___________________________、___________________________。二、简答题 1.简述PCR反应体系中都有哪些成分及各成分的作用。 2.为得到质量较好的水稻RNA，抽提前应做如何准备？RNA抽提过程中、RNA的保存及以后对RNA的操作过程中应特别注意什么？ 3.简述为防止放射性同位素外照射及内照射对人体造成伤害，在操作放射性同位素时，我们可以采取哪些措施进行防护？ 4.简述影响电转化感受态细胞转化效率的因素有哪些？ 5.质粒抽提时用到的SolutionI，SolutionII，SolutionIII及异丙醇分别起什么作用？操作时应注意什么？三、分析问答题 1.描述并图示pUC19载体DNA及其在HindIII位点克隆了外源DNA片段的质粒DNA 和水稻总DNA及它们的HindIII和BamH1酶切产物在琼脂糖凝胶电泳时的带型。 2.利用质粒载体克隆外源DNA片段主要包括哪些步骤？涉及到哪些工具酶？要获得理想的结果，各步骤操作中应主要注意哪些事项？ 3.在Southern杂交实验中，同一根杂交管内的膜曝光的····（原卷此处不清晰）冲洗后，有些组X光片信号很强，有些组信号很弱，有的样品点样孔附近有较强的信号，但是有的地方信号较弱，请分析造成这种结果的可能原因。 4.下面是本次课生物技术班某组β-active基因RT-PCR（反转录前没有对总RNA进行去除DNA 的处理）试验的琼脂糖凝胶电泳图，凝胶上共点了6个样，PCR使用的模板从左至右分别是：该组提取的水稻总DNA，该组提取的水稻总RNA，该组的4个反转录产物。（原卷本题图不清晰）请问：提取的RNA的质量如何？ RT-PCR是否成功？为什么会出现这样的结果？有哪些地方需要改进？

基因克隆步骤

实验一大肠杆菌感受态细胞的制备及转化 [实验原理]（供参考，试剂盒的Solution SS成分未知）细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态。转化是指质粒DNA 或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。其原理是：在0℃下的CaCl2低渗溶液中，细菌细胞膨胀成球形。转化缓冲液中的DNA形成不易被DNA酶所降解的羟基—钙磷酸复合物，此复合物粘附于细菌细胞表面。42℃短时间热处理（热休克），可以促进细胞吸收DNA复合物。将处理后的细菌放置在非选择性培养液中保温一段时间，促使在转化过程中获得的新的表型(如Amp抗性) 得到表达。然后再涂布于含有氨苄青霉素的选择性平板上，37℃培养过夜，这样即可得到转化菌落。[仪器、材料与试剂] (一)仪器1．小型高速离心机2．恒温摇床3．恒温箱4．‐20℃冰箱5．恒温水浴器 (二)材料1．氨苄青霉素2．大肠杆菌DH5a3．pUC194．1.5mL 离心管5．枪头、枪6．试管、培养皿 (三)试剂1．快速感受态细菌制备试剂盒（申能博彩公司产品）2．LB 培养液在950mL去离子水中加入：胰蛋白胨(tryptone) 10g酵母提取物(yeast extract) 5g NaCl 10g 摇动容器直至溶质完全溶解，用Na0H调节pH至7.0，加入去离子水至总体积为1L，121℃湿热灭菌20min。 3．氨苄青霉素(Amp)，用无菌水配制成100mg／mL 溶液，置‐20℃冰箱保存。 [实验步骤]

1．从大肠杆菌DH5a平板上挑取一个单菌落接于2mL LB培养液的试管中，37℃振荡培养过夜。 2．取50mL菌液转接到一个含有5mL LB培养液锥形瓶中，37℃振荡培养2小时。以下步骤按修改后的试剂盒说明书进行。 3．用灭菌的枪头取0.5mL的大肠杆菌培养物于1.5mL灭菌离心管中，冰上放置3分钟后，加入0.5mL预冷的Solution SS。在冰上小心地用1mL 枪头将细胞悬浮起来。注意：1mL的取液器设定在500mL。悬浮细胞要轻，防止细胞进入枪内。 4．将上述细胞分装于1.5mL离心管(离心管要在放在冰上预冷) 中，每管0.1mL。细胞可以立即使用或储存。 5．将感受态细胞迅速转移到‐20℃或更低的低温冰中。注意：在转移过程中要防止温度升高，解决的办法之一是在塑料袋里装上低温冰块，将细胞迅速转移到塑料里，将整个塑料袋放到低温冰箱内。转化：1．新鲜制备的或‐20℃下保存的100mL感受态细胞，置于冰上，完全解冰后轻轻地将细胞均匀悬浮。 2．加入5mL pUC19质粒，DNA浓度为10pg/mL，轻轻混匀。 3．冰上放置30分钟。 4．42℃水浴热激60秒。 5．冰上放置2分钟。 6．加400mL LB培养液，37℃ 250转／分振荡培养30分钟。 7．室温下4000rpm离心5分钟，用枪头吸掉400mL上清液，用剩余的培养液将细胞悬浮。

分子生物学实验教学大纲

分子生物学实验教学大纲一、说明 1、课程类别专业课 2、教学目的通过实验教学使学生了解、验证、巩固和加深所学理论知识，掌握分子生物学研究的基本实验技能，如：质粒（植物/动物）DNA的分离及纯化、植物总RNA的提取，琼脂糖凝胶电泳等技术。培养科学、严谨、实事求是的学风，提高动手能力、分析问题解决问题的能力以及创新性思维。 3、教学内容本门课教学主要以某一基因为主线，从基因的分离、纯化、克隆、及鉴定等方面入手，帮助学生掌握分子生物学基本的实验方法和技能，在此基础上对分子生物学方法的应用和意义有一个整体的把握，在可能的情况下同时提供多种实验材料让学生自行设计和准备实验，培养其独立科研能力。 4、教学方式以实验操作为主，配合原理教授、实践性教学、多媒体教学和学生实验报告、撰写论文、自学等方法进行学习。 5、考核内容及方式实验操作 30％，实验结果 30％，实验报告 30％，考勤 10％。参照以下几个方面评定成绩。（一）认真预习实验并书写实验预习报告；（二）实验态度认真，操作规范，遵守实验室管理规定；（三）按规定步骤进行实验，实验结果准确；（四）认真撰写实验报告。 6、本课程授课时间（学期），总学时数。本课程在三年级开设，总计36学时，学时分配见下表: 教学时数分配表

二、教学内容 1、教学目标（课程）通过本课程的教学使学生了解和掌握现代分子生物学研究的基本原理、方法、技术和技能，包括DNA 提取、PCR 扩增等。通过学生的独立实验设计和实践，训练学生分析问题和解决问题的能力及实际动手能力，同时培养学生的创新思维以及对生命科学探索的兴趣和爱好。 2、教学内容（分章节描述）实验一质粒DNA的提取 1．主要内容碱裂解法提取载体质粒。 2．教学要求学习和掌握碱裂解法提取质粒的方法和技术。实验二琼脂糖凝胶电泳检测DNA 1．主要内容（1）电泳基本知识介绍（2）琼脂糖凝胶的制备（3）质粒的定量。 2．教学要求掌握琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术。实验三植物总RNA的提取及检测 1．主要内容（1）RNA的提取（2）核酸的琼脂糖凝胶电泳（3）紫外分光光度法测定核酸的含量和纯度。 2．教学要求掌握植物组织中提取RNA的基本原理和实验技术方法。实验四动物总DNA的提取 1．主要内容（1）总DNA的提取（2）核酸的琼脂糖凝胶电泳（3）紫外分光光度法测定核酸的含量和纯度。 2．教学要求掌握动物组织中提取总DNA的基本原理和实验技术方法。实验五 PCR基因扩增 1．主要内容（1）PCR基本原理（2）PCR溶液体系的制备（3）PCR仪使用 2．教学要求掌握聚合酶链式反应的基本原理和实验技术方法。（二）重点和难点

分子克隆实验标准步骤

分子克隆实验标准步骤一、常规分子克隆实验流程：二、分子克隆实验标准步骤（含实验编号）： 1. PCR 扩增目的基因（编号Clone SOP-1）以本实验室常用酶KOD-Plus-Neo （TOYOBO ）为例体系（50ul ）： 10×KOD buf 5ul dNTP(2mM) 5ul Mg 2+ 3ul Primer1 1ul Primer2 1ul Template50-200ng KOD0.5ul ddH 2O up to 50ul 程序： 95℃2min 98℃10s 58℃30s 35cycle 68℃2kb/min 68℃7min 12℃∞

2.PCR产物的琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶的制备（编号Clone SOP-2）琼脂糖溶液的制备：称取琼脂糖，置于三角瓶中，按1%-1.5%的浓度加入相应体积的TBE或TAE缓液，将该三角瓶置于微波炉加热至琼脂糖溶解。胶板的制备：①取有机玻璃内槽，洗净、晾干；②将有机玻璃内槽置于一水平位置模具上，安好挡板，放好梳子。在距离底板上放置梳子，以便加入琼脂糖后可以形成完好的加样孔。 ③将温热琼脂糖溶液倒入胶膜中，使胶液缓慢地展开，直到在整个有机玻璃板表面形成均匀的胶层。④室温下静置30min左右，待凝固完全后，轻轻拔出梳子，在胶板上即形成相互隔开的上样孔。制好胶后将铺胶的有机玻璃内槽放在含有0.5～1×TAE（Tris-乙酸）或TBE（Tris-硼酸）工作液的电泳槽中使用，没过胶面1mm以上。 3.试剂盒回收DNA片段（编号Clone SOP-3）以本实验室常用DNA凝胶回收试剂盒（天根）为例使用前请先在漂洗液PW中加入无水乙醇，加入体积请参照瓶上的标签。 ①柱平衡步骤：向吸附柱CA2中（吸附柱放入收集管中）加入500μl平衡液BL， 12,000rpm(~13,400×g)离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。（请使用当天处理过的柱子） ②将单一的目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下（尽量切除多余部分）放入干净的离心管中，称取重量。 ③向胶块中加入等倍体积溶液PN（如果凝胶重为0.1g，其体积可视为100μl，则加入100μlPN 溶液），60℃水浴放置，其间不断温和地上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解。如果还有未溶的胶块，可继续放置几分钟或再补加一些溶胶液，直至胶块完全溶解(若胶块的体积过大，可事先将胶块切成碎块)。注意：对于回收<300bp的小片段可在加入PN完全溶胶后再加入1/2胶块体积的异丙醇以提高回收率；胶块完全溶解后最好将溶液温度降至室温再上柱，因为吸附柱在室温时结合DNA 的能力较强。 ④将上一步所得溶液加入一个吸附柱CA2中（吸附柱放入收集管中），室温放置2min， 12,000rpm(~13,400×g)离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放入收集管中。 ⑤向吸附柱CA2中加入600μl漂洗液PW（使用前请先检查是否已加入无水乙醇）， 12,000rpm(~13,400×g)离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放入收集管中。 ⑥重复操作步骤⑤。 ⑦将吸附柱CA2放回收集管中，12,000rpm(~13,400×g)离心2min，尽量除尽漂洗液。将吸附柱CA2置于室温放置数分钟，彻底地晾干，以防止残留的漂洗液影响下一步的实验。 ⑧将吸附柱CA2放到一个干净离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加适量洗脱缓冲液EB或 ddH2O，室温放置2min。12,000rpm(~13,400×g)离心2min收集DNA溶液。 4.酶切反应（编号Clone SOP-4）以本实验室常用酶FastDigest restriction enzymes（Thermo）为例双酶切体系（若是单酶切则只用加一种酶）： 10×FastDigest? buffer or 10×FastDigest? Green buffer 5ul FastDigest restriction enzyme 1 0.5-1ul FastDigest restriction enzyme 2 0.5-1ul DNAN ddH2Oupto50ul 酶切体系混合均匀后置于37℃条件下反应，反应时间应大于30min，若是载体（2-3ug）至少酶切2小时。 5.酶切产物的回收（编号Clone SOP-5）以本实验室常用Axygen?AxyPrep?PCRClean-UpKit（Axygen）为例 ①在PCR、酶切、酶标、或测序反应液中，加入3个体积的BufferPCR-A（若BufferPCR-A

植物基因克隆实验指导

植物基因克隆实验规则一、植物基因克隆实验课的目标根据基因克隆实验操作的整体性和连贯性特点, 将该实验设计为综合性实验课程，实验内容设计上完全抛弃了原来分散的、孤立的单纯学习某一实验技术的缺陷, 将单个实验综合为系统的、连贯的系列型大实验，注重科研成果在教学中的应用，我们从以往的科研项目中选取了部分研究内容用于学生的综合性实验教学，这是基于教学实验与实际科学研究实验之间的新的实验教学模式。整套实验围绕洋甘菊倍半萜生物合成途径中关键酶基因HMGR的克隆这一研究课题进行操作, 设计的实验内容具有极强的连续性和综合性，让学生在独立实践操作中学习基因克隆的基本研究方法和体会科学研究的严密逻辑和培养科研理念。我们将实验内容设置为8个部分, 实验内容前后衔接紧密, 环环相扣, 不可分割, 前一个实验的结果是下一个实验的材料。该课程使学生获得了整个类似科研实践过程的训练和体验, 学习了从事科研工作的基本功, 对完成自己的毕业论文及将来从事生命科学研究奠定了科研基础。二、实验的进行程序和要求 1、预习学生在课前应认真预习实验指导以及教材有关章节，必须对该次实验的目的要求、实验内容、基本原理和操作方法有一定的了解。 2、讲解教师对该实验内容的安排及注意事项进行讲解，让学生有充分的时间按实验指导的要求进行独立操作与观察。 3、独立操作与观察除个别实验分组进行外，一般由学生个人独立进行操作和观察。在实验中要按实验指导认真操作，仔细观察，作好记录。有关基本技能的训练，要按操作程序反复练习，以达到一定的熟练程度。

4、演示每次的实验都备有演示内容，其目的是帮助学生了解某些实验中的难点，扩大在实验课有限时间内获得更多感性知识的机会。 5、作业实验报告参照硕士毕业论文的格式写，必须强调科学性，实事求是地记录、分析、综合。在实验结束时呈交。 6、小结每次实验结束后，由师生共同小结本次实验的主要收获及今后应注意的问题。三、实验规则和注意事项 1、每次上课前，必须认真阅读实验指导，明确本次实验的目的要求、实验原理和注意事项，熟悉实验内容、方法和步骤。 2、上实验课时必须携带实验指导、记录本及文具等。进入实验室要按规定座位入座。 3、实验时要遵守纪律，听从教师指导，保持肃静。有问题时举手提问，严禁彼此谈笑喧或随意走动，也不得私自进行其他活动。 4、实验时要遵守实验操作规程，严格按照教师的安排和实验指导的要求进行。操作观察要认真仔细，边做、边看、边想，认真做好实验记录。 5、要爱护仪器和器材设备，注意节约实验材料、药品和水电。如有损坏器材应立即报告并主动登记、说明情况。 6、实验结束后，应清理实验台面，认真清理好仪器、药品及其他用品，放回原处，放好凳子，方可离开实验室。值日生要负责清扫地面，收拾实验用品，处理垃圾，关好水、电、门窗后再离开。

拟南芥AtMYB61基因的克隆及表达载体构建

拟南芥AtMYB61基因的克隆及表达载体构建王云，任永兵，杨硕，韩宇，陶杨，曹树青 (合肥工业大学生物与食品工程学院，安徽合肥230009) 摘要：文章以拟南芥幼苗提取的总RNA为模板，利用RT-PCR技术扩增获得AtMYB61基因的全长cDNA片段，再克隆到pUCm-T载体上，菌落PCR、酶切鉴定和cDNA测序结果表明成功克隆了拟南芥AtMYB61基因。从AtMYB61一pUCm-T载体上，用BstEII和BglII全双酶切切下目的基因片段，将此基因片段连接到植物表达载体pCAMBIA2301中。菌落PCR和酶切鉴定结果表明成功构建了植物表达载体pCAMBIA2301一AtMYB61。利用电转化法将重组表达载体导人根癌农杆菌中，获得了携带AtMYB61基因的根癌农杆菌株，为转基因改良植物抗逆性和进一步研究A ￡MyB61基因的抗逆分子机理奠定了基础。关键词：拟南芥；AtMYB61基因；表达载体 Cloning of Arabidopsis thaliana AtMYB61 gene and the expression vector construction W ANG Yun， REN Yong-bing， YANG Shuo， HAN Yu， TAO Yang， CAO Shu-qing (School of Biotechnology and Food Engineering，Hefei University of Technology，Hefei 230009，China) Abstract：Tota1 RNA was extracted from Arabidopsis thaliana seedlings and used as the template to amplify the full length of eDNA of AtMYB6 1 gene by RT_PCR technology，and the gene fragment was subsequently cloned into plant pUCm-T vector．The results of bacterial colony PCR，enzyme analysis and eDNA sequencing confirmed that the Arabidopsis thaliana AtM YB6 1 gene was successfully cloned．AtMYB61 gene was cut completely from AtMYB61一pUCm-T vector by BstE 1]and BglⅡ，and the gene fragment was cloned into plant expression vector pCAMBIA2301．The results of bacterial colony PCR and enzyme analysis showed the Successfu1 construction of plant expression vector pCAM— BIA2301一AtM YB61．In addition，the recombinant expression vector was carried into Agrobacterium tumefaciens by electrotransformation，and the strain of Agrobacterium tumefaciens carrying AtM YB6 1 gene was obtained．The study provides a basis for improving the resistance of transgenic plants and further exploring the molecular mechanism of AtM YB6 1 gene． Key words：Arabidopsis thaliana；AtMYB6 1 gene；expression vector 0 引言随着一些抗逆基因的鉴定和抗逆机理不断深入研究，将外源抗逆基因导人植物的基因工程技术，在提高植物抗逆性方面具有更广泛的应用前景。但植物的抗逆应答是一系列相关基因连续表达调控的极其复杂的调控网络。在整个调控网络中，转录因子能调控多个相关基因的表达，所以增强转录因子的调控是提高植物抗逆性更有效的方法Ⅲ。MYB转录因子是拟南芥中最大的基因家族。该基因家族主要在植物的生长发育方面发挥重要作用，如植物次级代谢、信号传导、器官形成等方面[3]。另外，也有一部分参与了逆境胁迫介导的细胞应答[4 ]。大量研究证实，一些MYB转录因子的过量表达可以显著增加植物对逆境的耐受性L7 ]。 MYB61转录因子具有DNA结合结构域和转录调节结构域，其功能相当广泛，参与重金属、低磷和干旱等胁迫的信号调节，植物重金属胁迫与氧化胁迫是相关的【9]。AtMYB61基因在植物中过量表达，有利于进一步研究A MyB61基因的抗逆分子机理。因此，本文利用RT-PCR 克隆AtMYB61基因，并构建了pCAMBIA2301一At—MYB61植物表达载体，为转基因改良植物抗逆性和进一步研究AtMYB61基因的抗逆分子机理奠定了基础。 1 材料与方法

感受态细胞转化操作步骤12.8

感受态细胞转化（一）实验准备： 1.Amp母液：称取氨苄青霉素100mg溶于1ml dd H2O中。0.22μm滤器过滤除菌，用EP管分装后储存于-20℃冰箱. 2.X-Gal溶液（2%，m/v）称取20mg X-Gal溶于1ml二甲基甲酰胺（DMF）中。用玻璃试管或聚丙烯管分装后储存于-20℃冰箱,装有X-Gal溶液的试管须用铝箔包裹以防因光照而被破坏.（无须过滤） 3.IPTG（20%,m/v,0.8mol/L）称取IPTG2g溶于8ml dd H2O中。用蒸馏水定容至10mL。0.22μm 滤器过滤除菌，用EP管分装成1mL一小份后储存于-20℃冰箱. （二）操作步骤“ 质粒pBS SK(-)的转化 1.取感受态细胞置于冰浴中，待感受态细胞融化后，分别在100μl 感受态细胞悬液中加入下列DNA质粒或水，轻轻摇匀后冰上放置30分钟。感受态细胞+pBS SK(-)质粒2μl (含量不超过50ng,体积不超过10μl) 感受态细胞+无菌水2μl （阴性对照） 2. 热击：42℃水浴中热击90秒（注：精确计算时间，过长将对细胞造成伤害）,热击后立即置于冰上冷2-5分钟（禁止摇动）。

3. 复苏：向每管中加入400μl LB液体培养基(注：不含Amp),混匀后37℃轻摇培养1~1.5小时,使细菌恢复正常生长状态,并表达质粒编码的抗生素抗性基因(Ampr )。涂布平板筛选转化质粒方法一（《分子克隆实验指南》标准方法） 1.将溶化的顶层琼脂分装于17*100mm试管，将试管置于45℃的加热块槽内备用。（90mm培养板用3mL顶层琼脂；150mm培养板用7mL顶层琼脂）2．从加热块取出一支试管，快速加入活菌含量不多于3000（90培养基）或10000（150培养基）的细菌悬液0.1mL。盖紧试管盖颠倒数次。以使细菌在琼脂中混匀。 3.按下表加入： 4. 快速将溶化的顶层琼脂倾入含有适当抗生素的凝固琼脂板的中部，旋转培养板使琼脂散匀。 .注：含Amp的LB固体培养基倒板 (1)配制：100mlLB培养基加入1.5g琼脂粉 (2)抗生素的加入：高压灭菌后，应使培养基降温至50℃，方可加入Amp，按每100ml培养基加10mg/ml Amp溶液1ml，使其终浓度为

实验室常用生化试剂配方

实验室常用生化试剂配方 1.常用抗生素配制以及使用说明（参考链霉菌室操作手册2019版）抗生素英文名称及缩写抗性基因贮藏液浓度(mg/ml) 100 25(无水乙醇配) 50 25 50 50 25(DMSO配) 100 50 35 25(0.15M NaOH配) 50(DMSO配) 50 50 MM 使用终浓度（μg/ml）链霉菌 2CM YEME 大肠杆菌 LA或LB 氨苄青霉素氯霉素潮霉素卡那霉素壮观霉素链霉素硫链丝菌素红霉素阿泊拉霉素紫霉素萘锭酮酸 TMP Ampicillin, Amp bla Chloramphenicol, Cml Hygromycin, Hyg Kanamycin, Km Spectinomycin, Spc Streptomycin, Str Thiostrepton, Thio Erythomycin, Ery Apramycin, Am Viomycin,Vio Nalidixic acid Trimethoprim cat hyg aac/aph aadA str tsr ermE aac(3)IV vph －* 10 10 2 5 10 5 100 10 －－ 25 25 20 25 10 － 50 －－－－－－ 2.5 － 5 50-100 25 － 25 50 25 25 20 10-30

注意事项： (1) –表示无记录或不能使用，贮存液除特别说明外均用无菌水配制，配制过程请确保抗生素粉末充分溶解混匀后再分装；（2）Km 和Am有交叉抗性，同时具有这两种抗性基因时应适当提高抗生素的量，并设置阴性对照；（3）Hyg、Vio易见光分解，配制好后应用锡箔纸包好,使用过程中建议避光操作。有些抗生素需要在低盐的环境（如DNA培养基）下筛选效率较高，如Hyg, Km, Vio （4）用无菌水配制的抗生素需在超净工作台内用0.22 μm一次性过滤器过滤除菌并分装；氯霉素、TMP、硫链丝菌素可以在超净工作台外配制分装，无需过滤除菌，但需确保配制贮存液所用溶剂（无水乙醇、DMSO）未遭受污染，建议配制氯霉素时使用新的无水乙醇，不要使用抽提质粒或总DNA时用的无水乙醇，以防止污染；DMSO，即二甲亚砜，易挥发，有剧毒；（5）长期不用的抗生素请置于-20℃保存，抗生素粉末按照使用说明一般置于4℃保存，经常使用时可以暂置于4℃保存；（6）抗生素的实际使用浓度请结合实验经验进行适当调整； (7)配制抗生素时应尽量一次性称取抗生素粉末，配制过程中建议穿工作服，戴一次性橡胶手套及口罩，及时清理称量配制抗生素时使用的台面及器具，以避免抗生素及溶剂对自身的损伤及对工作环境的污染。注意事项： (1)表中所列酶均可以用无菌水配制，也可以用相应的缓冲液配制，缓冲液配制方法参考《分子克隆实验指南（第3版）》：蛋白酶 K缓冲液：50 mM Tris（pH 8.0），1.5 mM 乙酸钙； RNase A缓冲液：TE （pH 7.6）：10 mM Tris-HCl，1 mM EDTA；溶菌酶缓冲液：10 mM Tris-HCl（pH 8.0）； (2) RNase A配制好后沸水浴处理5 min，取出贮存RNase A后首次使用时也需沸水浴处理5 min后再使用；（3）制备原生质体时使用的溶菌酶配制时需过滤除菌，其他情况一般无需过滤除菌；（4）所有酶均应在-20℃保存，使用过程中避免反复冻融，配制过程中尽量避免外界污染。（1）IPTG用无菌水配制，0.22μm一次性滤膜过滤除菌，分装保存于-20℃；

整个基因克隆实验流程(完整)

整个基因克隆实验流程(完整) -标准化文件发布号：（9456-EUATWK-MWUB-WUNN-INNUL-DDQTY-KII

一、组织总RNA的提取相关试剂：T rizol；氯仿；苯酚；异丙醇；75%乙醇；RNase-free水相关仪器：制冰机；液氮&研钵/生物样品研磨仪；高速离心机；移液器（1ml、200μl、100μl/50μl）；涡旋振荡仪；恒温金属浴。相关耗材：解剖工具，冰盒，离心管，离心管架，吸头（1ml，200μl/300μl），一次性手套，实验手套。实验步骤 1.取暂养草鱼，冰上放置一段时间，然后解剖，剪取肠道50~100mg，放入研钵中，加入液氮迅速研磨，然后加入1ml 预冷TRIzol试剂，充分研磨至无颗粒物存在。 2.转移到离心管中，室温放置5min，使细胞充分裂解； 3.按1ml Trizol加入200μl氯仿，盖上盖子，迅速充分摇匀15s，然后室温放置 3min； 4.4℃，,12000g 离心15min；此时混合物分为三层，下层红色的苯酚氯仿层，中间层和上层无色水相； RNA存在于无色水相中； 5.小心吸取上清液，千万不要吸取中间界面，否则有DNA污染；转移至一个新的离心管，加入等体积的异丙醇，轻轻混匀； 6.室温放置10min；4℃，,12000g 离心10min； 7.弃上清，加入1ml 75%乙醇洗涤；涡旋，悬浮沉淀；4℃，,12000g 离心 5min； 8.弃上清；可以再次用75%乙醇洗涤沉淀； 9.弃上清；用移液器轻轻吸取管壁或管底的残余乙醇，注意不要吸取沉淀；室温放置5min晾干沉淀；（RNA样品不要过于干燥，否则极难溶解） 10.沉淀中加入30μl RNase-free水，轻弹管壁，使RNA溶解。 RNA质量检测相关试剂：溴酚蓝， TEB/TAE电泳缓冲液，溴乙锭（EB）相关仪器：（超微量分光光度计，移液器（2.5μl 或2μl 规格，10μl规格），电子天平，电泳仪，电泳槽，凝胶成像仪，微波炉，制冰机）相关耗材：（无菌无绒纸，吸头，离心管架，PCR管，PCR管架，锥形瓶，烧杯，一次性手套，实验手套，冰盒）（1）RNA纯度的检测：测定其OD260和OD280的值，根据其OD260/ OD280的比值，当其比值在1.9~2.1之间，说明提取的总RNA纯度比较高，没有蛋白质和基因组的污染。（2）RNA完整性的检测：取2μlRNA，与2μl溴酚蓝混匀，用1%的琼脂糖进行凝胶电泳，20min后，在凝胶成像系统中观察效果。当28S与18S条带清晰，