病毒血凝和血凝抑制试验--(以新城疫为例)
实践三 病毒血凝和血凝抑制试验--（以新城疫为例）
实践目的：
1．掌握血凝（HA ）和血凝抑制(HI)试验的原理 2．掌握鸡新城疫病毒血凝和血凝抑制试验的操作方法 实践原理：
某些病毒(如鸡新城疫病毒，禽流感病毒等)能够与人或动物的红细胞发生凝集，此即为红细胞凝集现象。这种红细胞凝集现象可于病毒悬液中加入特异性抗体（免疫血清）所抑制，即为红细胞凝集抑制试验。 实践内容：
1．红细胞凝集试验(HA 试验) 主要是测定病毒的红细胞凝集价，以确定红细胞凝集抑制试验所用病毒稀释倍数(抗原单位)。有试管法和微量法两种，现以常用的微量法进行说明。
鸡新城疫病毒的HA 试验现采用微量法，在V 形微量反应板上进行。 (1)首先用微量移液器向每个孔加入稀释液即灭菌生理盐水一滴(25μl)。
(2)用微量移液器取病毒抗原液25μl 加入第1孔内，吸头浸于液体中缓慢吸吹几次使病毒与稀释液混合均匀，再吸取25μl 液体小心地移至第2孔，如此连续稀释至第11孔，第11孔吸取25μl 液体弃掉；病毒稀释倍数依为1:2～1:2048，第12孔为红细胞对照。 (3)再以微量移液器每孔加％红细胞悬浮液1滴(25μl)。
(4)在振荡器上振荡混匀约l ～2分钟，再置37℃作用15分钟后观察结果。
(5)每次测定样品都应同时做红细胞对照。
表1 鸡新城疫血凝效价(HA)的测定术式(微量法)
孔号 1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
病毒稀释倍数 1:2
1:4
1:8
1:16
1:32
1:64
1:128
1:256
1:512
1:1024 1:2048 对照
生理盐水 25
l 25l μ病毒液
25l
l l l l 25l l l l l l μl 弃去 1％红细胞悬液 25μ
l
25μl
25μl
25μl
25μl
25μl
25μl
25μl
25μl
25μl
25μl
25μl
感作 置振荡器上混匀1～2分钟，放37℃静置15分钟
# 表示100％完全凝集 ++ 表示50％凝集 - 表示不凝集
未被或不完全被病毒凝集；如果孔底的红细胞铺平孔底，凝成均匀薄层，倾斜后红细胞不流动，说明红
细胞被病毒所凝集。
能使100％红细胞凝集的病毒液的最高稀释倍数，称为该病毒液的红细胞凝集效价。如上例：病毒液的HA效价为1:128，HI试验时，病毒抗原液25微升内须含4个凝集单位，则应将原病毒液作成128/4＝32倍的稀释液。
2.红细胞凝集抑制试验(HI试验) 有试管法和微量法两种，现以常用的微量法进行说明。
(1)用微量移液器每孔各加入1滴稀释液(即25μl)，从第1孔到第10孔。第1l孔加稀释液2滴(50μl)。
(2)以微量移液器取被检血清25μl，放入第1孔，，吸头浸于液体中缓慢吸吹几次使被检血清与稀释液混合均匀，再吸取25μl液体小心地移至第2孔，如此连续稀释至第10孔，最后第十孔吸取25μl液体弃掉；被检血清稀释倍数依为1:2～1:1024，第11孔为红细胞对照，第十二孔为抗原对照。
(3)每孔再加入含有四个单位的病毒液1滴(25μl)至第10孔，第1l孔为红细胞对照孔，不加病毒液；第十二孔为抗原对照，加病毒液。
(4)置振荡器上振荡l～2分钟后，放37℃静置20分钟。
(5)每孔再加入％红细胞悬浮液1滴(25μl)放振荡器上振荡l～2分钟混匀，置37℃，15分钟后判定
结果。
表2 鸡新城疫红细胞凝集抑制(H1)试验(微量法)
孔号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
被检血清稀释倍数1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:12
8
1:25
6
1:51
2
1:10
24
红细胞
对照
抗原
对照
生理盐水25
l
25μl
被检血清25
l l l l l l l l l l l
弃掉
4单位病毒液25μ
l 25μ
l
25μ
l
25μ
l
25μ
l
25μ
l
25μ
l
25μ
l
25μ
l
25μ
l
25μ
l
振荡器上振荡1～2分钟，放37℃作用20分钟
1%红细胞悬液25μ
l 25μ
l
25μ
l
25μ
l
25μ
l
25μ
l
25μ
l
25μ
l
25μ
l
25μ
l
25μ
l
25μ
l
振荡器上振荡1～2分钟，放137℃作用15分钟
结果例示-------++##-#注：- 表示不凝集、++ 表示部分凝集、# 表示完全凝集。
胞未被或不完全被病毒凝集；如果孔底的红细胞铺平孔底，凝成均匀薄层，倾斜后红细胞不流动，说明
红细胞被病毒所凝集。
能将4单位病毒物质凝集红细胞的作用完全抑制的血清最高稀释倍数，称为该血清的红细胞凝集抑制效价，用被检血清的稀释倍数或以2为底的对数(10g2)表示。如上例，该血清的红细胞凝集抑制效价为
1：128或HI效价为7(10g2)。
结果分析：
(1)一般认为鸡的免疫临界水平为1:8(成年)或1:16(雏鸡)，随地区不同而稍有差异。
(2)鸡血清HI抗体效价高于1:16时可适当推迟新城疫免疫的时间，HI抗体效价在1:16以下，须进行新城疫疫苗接疫种，在新城疫流行的地区或鸡场，鸡的免疫临界水平应稍提高。
(3)鸡群的HI抗体水平是以抽检样品的HI抗体效价(㏒2)的平均值表示的。
如果某鸡群的10份样品中，HI抗体效价(㏒2)为8的有3份样品，为7的有5份样品，为6的有2份样品，它们的平均值为：
8×3＋7×5＋6×2/3＋5＋2＝平均水平在4(10g2)以上，说明该鸡群为免疫鸡群。若在检样中HI抗体效价的最高值与最低值相差太大时，则不能用上法计算平均水平，应根据临界水平以下的样品数在全部样品中所占的百分比决定免疫与否。
(4)大型养鸡场，每次进行抽测时，抽样率一般不低于％一％，小型鸡群，抽样率应有所增加，一般认为理想的抽样率应为％。
(5)鸡群接种新城疫疫苗后，经2～3周测血清中的HI抗体效价，若提高2个滴度以上，表示鸡的免
疫应答良好，疫苗接种成功；若HI抗体效价无明显提高，表示免疫失败。
作业：
1．每三位学生做一个血凝试验，测定出新城疫病毒的血凝效价，记录试验结果。
2．根据血凝价将新城疫病毒稀释成4个单位病毒液，每三位学生做一个血凝抑制试验，检测待检血清的血凝抑制效价，记录试验结果
3．回答问题：
（1）病毒的血凝和血凝抑制试验的原理是什么？
（2）病毒血凝反应是抗原抗体反应吗，为什么？
（3）病毒血凝抑制反应是抗原抗体反应吗，为什么？
实践三病毒血凝和血凝抑制试验--（以新城疫为例）
（一）实践目的：
1、掌握血凝及血凝抑制试验的基本方法及原理
2、掌握鸡新城疫的试验室诊断技术。
（二）实践内容与基本要求：
实践原理：某些病毒，如鸡新城疫、禽减蛋综合症等，有能凝集动物红细胞的特性，此即红细胞凝集现象。这些病毒囊膜上有糖蛋白血凝素，能与动物的红细胞表面的糖蛋白受体结合，发生红细胞凝集现象。可以利用这一特性判断被检材料中有无病毒的存在，并可以测定病毒的效价。
1、血凝试验：常多用感染鸡胚液进行，凝集价可达1:160---1:640也可采用急性病例的组织浸出液，但凝集价较低。本病毒可凝集许多动物的红细胞，但凝集性能不够稳定，故通常作血凝试验时都采用鸡的红细胞采血部位为心脏或翅静脉，取血后加抗凝剂或脱纤维，置于离心机中摇转加生理盐水洗涤三次后，将浓缩的红细胞配成1%生理盐水悬液，即可应用。操作方法见实习指导。
凡能使鸡红细胞完全凝集的病毒最高稀释倍数，称为该病毒的血凝滴度。
2、血凝抑制试验：单纯地使用血凝试验还不能作出明确的诊断，因为还有其它病原也能引起红细胞凝集，如引起慢性呼吸道病的禽败血支原体。所以需用已知的抗血清作血凝抑制试验，以鉴别病毒。也可用已知病毒来测定病鸡血清中的抗体，而得明确的诊断。但不适于急性病例，通常要在感染后的5---10天，或出现呼吸症状后的2天，血清中的抗体到一定水平，就可用试管法。
（三）主要器材与药品
器材：离心机、试管架、试管、注射器、针头号、感染鸡胚，微量移液器1套，V型、96孔板，滴头，微量振荡器，塑料采血管，
药品：病毒：鸡新城疫弱毒疫苗；%生理盐水、1%红细胞浑悬液、血清、4单位病毒。
标准阳性血清；浓缩抗原；%红细胞浑悬液；被检血清；—磷酸缓冲盐稀释液；
—磷酸缓冲盐稀释液：氯化钠（GB1266—77）170g；磷酸二氢钾（GB1274—77）13.6g；氢氧化钠
（GB629—77）3.0g；蒸馏水1000ml；高压灭菌，4保存，使用是作20倍稀释。
鸡1%红细胞悬浮液：由健康来航公鸡羽根静脉采血迅速置于装有抗凝血剂（3%柠檬酸钠溶液）的离心管中，用生理盐水洗涤3次，每次以3000r/min离心10分钟，将血浆、白细胞等充分洗去，根据沉淀的红细胞压积，用PH=7的生理盐水稀释成1%悬浮液。
被检血清：每群鸡随机采20—30份血样，分离血清。
采血法：先用三棱针刺破翅下静脉，随即用塑料管引流血液至6~8cm长。将管一端烧融封口，待凝固析出血清后以1000r/min离心5分钟，剪断塑料管，将血清倒入一块塑料板小孔中，若需较长时间保存，可在离心后将凝血块一端剪去，滴融化石蜡封口，于0o C保存。
（四）实践方法
操作方法
微量血凝试验
4.1.1 于微量血凝板的每孔中滴加磷酸缓冲盐稀释液50ul，共滴四排。
4.1.2 吸取1:5稀释抗原滴加于第一列孔，每孔50ul，然后由左至右顺序倍比稀释至第11列孔，再从第11孔各吸取50ul弃之。最后一列不加抗原作对照。
4.1.3 于每孔加入%红细胞悬液50ul。
4.1.4 置微型振荡器上振荡1分钟，或手持血凝板绕圆圈混匀。
4.1.5 放室温下（18~20oC）30~40分钟，根据血凝图象判定结果。以出现完全凝集的抗原最大稀释度为该抗原的血凝滴度。每次四排重复，以几何平均值表示结果。
4.1.6 计算出含4个血凝单位的抗原浓度，按式（B1）进行计算。
抗原应稀释倍数=血凝滴度/4……………………..(B1)
上述材料全部按顺序加完后，振荡96孔板，使红细胞与病毒充分接触，然后置于20-22℃室温中静置，自第15分钟开始观察结果，每5分钟检查一次，至60分钟结束，观察结果时注意不要摇震96孔板。
如果被检材料中有病毒的存在，就会出现红细胞的凝集现象，红细胞出现凝集反应者,凝集成片或碎片,呈伞状铺于管底,不凝集的红细胞沉积于管底,呈一小圆点,将板倾斜,可以看到沉积于底板上的红细胞沿倾斜面呈线状流动.
（五）结果观察：
1．首先观察对照孔，红细胞应无凝集。
2．观察实验孔
++++全部红细胞凝集，凝集的红细胞铺满管底，边缘不整齐，无红细胞沉积。
+++ 大部分红细胞凝集，在管底铺成薄膜状，但尚有少数红细胞不凝，在管底中心形成小红点。
++ 约有半数红细胞凝集，在管底铺成薄膜，面积较小，不凝集的红细胞在管底中心聚成小圆点。
+只有少数红细胞凝集，不凝集的红细胞在管底中心聚成小圆盘状，凝集的红细胞在此小圆盘周围。
-不凝集，红细胞沉于管底，成一致密圆盘，边缘整齐。
病毒血凝呈现的不同程度凝集强度
凝集效价：能使红细胞呈++凝集的病毒最高稀释度为凝集效价，表示含有一个单位血凝抗原。如上述第7孔为++，则该病毒悬液效价为1：128，即病毒稀释到1：128时，每50μl中含一个血凝单位的病毒。凝集孔数越高,病毒凝集效价越高.
4单位病毒：血凝试验（HA）测出病毒的HA价，配制成4单位病毒，装于疫苗瓶中冷冻备用。
病毒的血凝实验（HA）结果分析
（五）鸡新城疫微量血凝抑制试验
5.2.1 先取稀释液50ul，加入微量血凝板的第一孔，再取浓度为4个血凝单位的抗原依次加入3~12孔，每孔50ul，第二孔加浓度为8个血凝单位的抗原50ul。
5.2.2吸被检血清50ul 于第1孔(血清对照)中,挤压混匀后吸50ul 于第2孔,依次倍比稀释至12孔,最后弃去50 ul.
5.2.3置室温(18—20℃)下作用20分钟.
5.2.4滴加50ul %红细胞悬液于各孔中,振荡混合后,室温下静置30—40分钟,判定结果
5.2.5每次测定应设已知滴度的标准阳性血清对照.
结果判定
1在对照出现正确结果的情况下,以完全抑制红细胞凝集的最大稀释度为该血清的血凝抑制滴度.
2若有10%以上的鸡出现11(log2)以上的高血凝抑制滴度,说明鸡群已受新城疫强毒感染.
3若监测鸡群的免疫水平,则血凝抑制滴度在4(log2 )的鸡群保护率为50%左右;在4(log2)以下的保护率达90%--100%;在4(log2)以下的非免疫鸡群保护率约为9%,免疫过的鸡群约为43%.鸡群的血凝抑制滴度以抽检样品的血凝抑制滴度的几何平均值表示,如平均水平在4(log2 )以上,表示该鸡群为免疫鸡群.
（六）实践要点
1.配置1%红细胞悬液时不能用力摇震，以免把红细胞膜震破，造成溶血，影响实验效果。
2.在滴加材料时，注意每滴加一种材料更换一个滴头，以免病毒与红细胞混合影响实验效果。
3.稀释病毒时将材料充分混匀后再吸出滴入下一孔中。
4.适时观察结果，如果长时间放置，凝集的红细胞团会沉降下来，造成观察结果不准确。
（七）作业
1.报告血凝试验（HA）的血凝效价的判定结果。
2.病毒的血凝和血凝集抑制试验试验有何意义?
血凝与血凝抑制试验标准方法
血凝抑制（HI）试验操作规程 1.仪器、设备和试剂的准备 1.1仪器及设备 V型96孔血凝板、微量振荡器、低速台式离心机、含25μL的单道加样器、含25μL的 八道加样器、小圆底试管、吸管。 1.2抗原和试剂： 1.2.1相应HI抗原 1.2.2相应阳性血清 1.2.3生理盐水、阿氏液（血球保护液） 1.2.41%鸡红细胞悬液 1.2.4.1红细胞的采集从2-6月龄SPF公鸡翅静脉采集血液与等量的阿氏液混合（采集后 上下颠倒使血液和阿氏液混匀，防止凝血） 1.2.4.2红细胞的洗涤将于阿氏液混合的血液，分装于圆底试管中，以1000rpm离心5分 钟，吸弃阿氏液；加入适量生理盐水轻轻吸打将红细胞充分混合，以1500rpm离心5-10分 钟，吸弃上清液时，应注意吸弃红细胞表面的白细胞层，并应尽量吸净上清液。按上述步骤， 用生理盐水对红细胞进行洗涤三次，最后一次洗涤应1500rpm离心10分钟（确保红细胞的 压积）。 1.2.4.3吸弃上清液，将沉淀的红细胞吸取1ml，加入99ml生理盐水摇匀配制成1%的红细 胞悬液。（按照需要量配制） 1.2.4.41%红细胞悬液的标定对首次配制的红细胞悬液应进行标定，取配制好的红细胞悬 液60ml，自然沉降后，弃掉上部生理盐水50ml，混匀后装入刻度离心管中，1000rpm离心 5分钟，红细胞压积应为0.6ml 2．HI抗原工作液配制 2.1HI抗原血凝价测定 血凝试验： 1．取一块V型96孔板，按表1每孔加入生理盐水25ul，将HI抗原进行系列倍比稀 释，至11孔后吸取25ul弃去，第12孔为对照，稀释后每孔再加入25ul生理盐水，最后每 孔加入1%鸡红细胞悬液25ul，微量振荡器中速摇匀，置于室温（20—25℃），20~30分钟后 判定结果，以能使100%红细胞凝集的抗原最高稀释倍数作为判定终点。 表1病毒血凝试验 孔号：123456789101112滴度：1:21:41:81:161:321:641:1281:2561:5121:10241:2048对照 生理盐水252525252525252525252525抗原(病毒)2525252525252525252525弃去生理盐水252525252525252525252525红细胞悬液252525252525252525252525 轻轻振荡1-2min置于20~25℃静置20-25min后判定结果
血凝抑制实验报告文档3篇
血凝抑制实验报告文档3篇 Report document of hemagglutination inhibition test 编订：JinTai College
血凝抑制实验报告文档3篇 小泰温馨提示：实验报告是把实验的目的、方法、过程、结果等记录下来，经过整理，写成的书面汇报。本文档根据实验报告内容要求展开说明，具有实践指导意义，便于学习和使用，本文下载后内容可随意修改调整及打印。 本文简要目录如下：【下载该文档后使用Word打开，按住键盘Ctrl键且鼠标单击目录内容即可跳转到对应篇章】 1、篇章1：血凝抑制实验报告文档 2、篇章2：血凝抑制实验报告文档 3、篇章3：血凝抑制实验报告文档 篇章1:血凝抑制实验报告文档 禽流感血凝和血凝抑制试验可用于血清中抗体水平的监测，也可用于判断未使用疫苗群体的感染状态等。该试验是目前世界卫生组织和国际动物健康组织进行全球流感监测所普遍采用的方法，而且因其具有经济、快速、可靠、操作简便、能够处理大量的样品，并能在短时间内报告禽流感抗体水平等优点，已经成为当前基层兽医实验室禽流感疫病监测和免疫抗体检测中最为常用的方法。但因该试验受人为操作影响较大，经
常因操作不规范、不严谨等造成结果偏差大、重复性差等问题，现根据几年来的工作经验对该试验过程中应注意的事项做一探讨。 一、血凝试验操作程序 1、取96孔90°V形酶标板，用微量移液器在第一至第 五排的1~12孔每孔加25 μL PBS液。 2、吸取25 μL标准禽流感抗原加入到第一排第1孔中 充分混匀。 3、从第1孔吸取25 μL混匀后的抗原液加到第2孔中，混匀后吸取25μL加入到第3孔中，依次进行倍比稀释至第二排最后一孔即第24孔，最后弃去25 μL。第三排孔至第四排 孔同上操作。 4、依次向第一至第五排孔的每孔中加入25 μL 1%的鸡 红细胞悬液。 5、将酶标板置于微量振荡器上振荡10秒，室温（20-25℃）静置30 min观察结果（如果环境温度太高，可置4℃ 环境下）。
病毒血凝和血凝抑制试验以新城疫为例
实践三病毒血凝和血凝抑制试验--（以新城疫为例）实践目的： 1．掌握血凝（HA）和血凝抑制(HI)试验的原理 2．掌握鸡新城疫病毒血凝和血凝抑制试验的操作方法 实践原理： 某些病毒(如鸡新城疫病毒，禽流感病毒等)能够与人或动物的红细胞发生凝集，此即为 病毒稀释倍数1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128 1:256 1:512 1:1024 1:2048 对照生理盐水 病毒液 1％红细胞悬液25μl25μl25μl25μl25μl25μl25μl25μl25μl25μl25μl25μl # 表示100％完全凝集++ 表示50％凝集- 表示不凝集
表明红细胞未被或不完全被病毒凝集；如果孔底的红细胞铺平孔底，凝成均匀薄层，倾斜后红细胞不流动，说明红细胞被病毒所凝集。 能使100％红细胞凝集的病毒液的最高稀释倍数，称为该病毒液的红细胞凝集效价。如上例：病毒液的HA效价为1:128，HI试验时，病毒抗原液25微升内须含4个凝集单位，则应将原病毒液作成128/4＝32倍的稀释液。 生理盐水225μl 被检血清 4单位病毒液25μl25μl25μl25μl25μl25μl25μl25μl25μl25μl25μl 振荡器上振荡1～2分钟，放37℃作用20分钟 1%红细胞悬液25μl25μl25μl25μl25μl25μl25μl25μl25μl25μl25μl25μl 振荡器上振荡1～2分钟，放137℃作用15分钟 结果例示-------++##-#注：- 表示不凝集、++ 表示部分凝集、# 表示完全凝集。
淀，表明红细胞未被或不完全被病毒凝集；如果孔底的红细胞铺平孔底，凝成均匀薄层，倾斜后红细胞不流动，说明红细胞被病毒所凝集。 能将4单位病毒物质凝集红细胞的作用完全抑制的血清最高稀释倍数，称为该血清的红细胞凝集抑制效价，用被检血清的稀释倍数或以2为底的对数(10g2)表示。如上例，该血清的红细胞凝集抑制效价为1：128或HI效价为7(10g2)。 2．根据血凝价将新城疫病毒稀释成4个单位病毒液，每三位学生做一个血凝抑制试验，检测待检血清的血凝抑制效价，记录试验结果 3．回答问题： （1）病毒的血凝和血凝抑制试验的原理是什么？ （2）病毒血凝反应是抗原抗体反应吗，为什么？ （3）病毒血凝抑制反应是抗原抗体反应吗，为什么？
血凝抑制试验
血凝抑制试验 1 适用范围 本标准规定了禽流感的血凝试验、血凝抑制试验。 本标准适用于禽流感抗体的检测（主要适用于血清样品）。 2 血凝试验 2.1 材料与试剂 2.1.1 器材：普通天平、分析天平、普通离心机、微型振荡器、高压灭菌器、刻度离心管、微量移液器及96孔V形微量血凝板。 2.2.2 pH7.2磷酸盐缓冲液（PBS）。 2.2.3 1%鸡红细胞悬液。 2.2.4 阿氏液。 2.2.5 血凝抗原、被检血清。 2.2 操作程序 A. 取96孔V形微量血凝板，用微量移液器在第1孔~第12孔加25 μL生理盐水，共滴2排。每排的第1孔加入抗原25 μL，用微量移液器，从第1孔~第11孔对抗原作系列倍比稀释：即将第1孔的抗原与生理盐水用移液器反复吹吸3次后，吸出25 μL移至第2孔，再反复吹吸3次后，吸出25 μL移至第3孔，以此类推，直至第11孔。从第11孔中吸出25 μL弃去，此孔抗原的最终稀释度为1:211（即11 log2）。第12孔作为对照孔。 B. 每孔中加入25 μL生理盐水，再加入1%鸡红细胞悬液25 μL。 C. 将血凝板置于微量振荡器上500 r/min振荡1~2 min。 D.在室温18~25℃下静置20~40 min，或37 ℃静置15~20 min，或4 ℃静置60 min。红细胞对照孔成明显的纽扣状沉到孔底时即可判定结果。 2.3 抗原血凝效价判定 A. 在反应时间内，对照孔的红细胞全部沉淀时，观察判读血凝结果。 对于使用V形孔微量血凝板进行的试验，将血凝板倾斜70°，观察沉淀于孔底的红细胞是否沿倾斜面向下呈线状流动（红细胞对照孔成明显的纽扣状沉到孔底），以出现全部凝集（红细胞无流动）的抗原最大稀释度为该抗原的血凝效价，该效价为1个血凝单位（HAU）。 3 血凝抑制试验 3.1 血清的处理 3.1.1 被检血清样品准备
血凝实验实验报告
影响血液凝固的因素 （一）实验目的：通过本实验来了解血液凝固的基本过程及了解影响血液凝固的一些因素。 （二）实验对象：家兔 （三）实验步骤：（略） （四）实验结果： 1、观察纤维蛋白原在凝血过程中的作用：实验中可见到静置杯内血液发生凝固。搅拌杯内血液不凝固，但在毛刷上见到红色的血凝块，经水冲洗后毛刷上缠绕有白色丝状物。 2、观察影响血凝的一些理化因素：如下表9-1所示。 表9-3 影响血凝的一些理化因素实验条件 1.加少许棉花 2.用石蜡油均匀涂试管内壁 3.放置37℃水浴 4.放置冰水水浴 5.加肝素10个单位 6.加草酸钾2mg （表9-3文字说明：略） 3、观察内源性及外源性凝血过程：如下表9-2所示 表9-2 内源性和外源性凝血过程的观察 试剂 1、富血小板血浆 2、少血小板血浆 3、生理盐水 4、羊肺悬液 5、0.025mol/l cacl2 血液凝固时间 （表9-2文字说明：略） （五）讨论： 血液凝固是指血液由流动的液体状态变为不流动的冻胶状态血液凝固过程大致分为三个 主要阶段：①凝血酶原激活物形成；②凝血酶原激活成凝血酶，③纤维蛋白原转变为纤维蛋白。在凝血酶原激活物的形成过程中分有两种不同的途径：内源性凝血途径和外源性凝血途径。内源性凝血途径是由凝血因子?启动的，参和血凝的全部凝血因子都在血浆内。凝血因子?可被各种带负电荷的物质等所激活，如血管内膜暴露的胶原纤维、玻璃、陶器等。外源性凝血途径是由存在于血管外组织中的凝血因子ⅲ所启动的，其余参和的凝血因子也在血管内。凝 血因子ⅲ在脑、肺、胎盘组织含量很丰富。 不管是内源性凝血途径或外源性凝血途径，他们最后的是使血纤维蛋白的形成而使血液 发生凝固。在观察纤维蛋白原在凝血过程中作用的实验中，由于参和凝血的全部凝血因子都在血浆中，因此其凝血过程是属于内源性凝血。由于玻璃和毛刷表面都带有负电荷，后者可激活凝血因子?，启动内源性凝血过程。凝血到最后阶段时，在凝血酶的作用下，把纤维蛋白原水解成血纤维蛋白；形成的纤维蛋白不断地交叉成网状结构，把血液中的所有血细胞网凝血时间50’’ 8’15’’ 2’15’’ 6’45’’ 不凝不凝试管1 0.2 ml 0.2 ml 0.2 ml 2’15’’ 试管2 0.2 ml 0.2 ml 0.2 ml 3’45’’ 试管3 0.2 ml 0.2 ml 0.2 ml 45’’ 罗于其中，从而使血液发生凝固。静置杯中的血液，由于发生了上述的血液凝固过程， 所形成的纤维蛋白没有被破坏，所以杯中血液凝固。而搅拌过的杯内血液，虽也发生血液凝固过程，但所形成的纤维蛋白却不断缠绕到毛刷上，当杯内血液的纤维蛋白原全部水解掉后，形成的纤维蛋白也全部缠绕在毛刷上，这时血纤维只能网罗毛刷附近的一些血细胞，在毛刷上见
血凝、血凝抑制试验
红细胞凝集试验（HA）与红细胞凝集抑制试验（HI） 一、实验用设备： 1、离心机 1台*（3000转离心红细胞） 2、冰箱 1台*（存放抗原） 3、振荡器 1台*（振荡96孔V型板） 4、抗原新城疫（ND）、减蛋（EDS）、流感（AI）抗原，从正规厂家进。 5、96孔V型板稀释血清清洗后可重复使用 6、八道移液器 1把（5-50微升稀释血清） 7、吸头和八道移液器配套使用，清洗后重复使用） 8、积液槽配制4个单位抗原及盛放生理盐水加样用 9、一次性采血管采血用 10、2毫升注射器采血用 11、红细胞非免疫鸡心脏采血或免疫鸡也可，但需离心5次后使用。 12、柠檬酸三钠配制3.8％抗凝剂用 13、重铬酸钾配制清洁液用 14、硫酸配制清洁液用 15、吸管 1毫升、10毫升 16、吸耳球和吸管配套使用 17、针头 9*13（采雏鸡）、9*25（采大鸡） 18、蒸馏水当地买。清洗96孔V型板、吸头用 19、10毫升离心管离心红细胞用（塑料制） 20、生理盐水做血清稀释液用、配制4单位抗原 二、实验前的准备： 1.抗原：从指定厂家购买稳定浓缩抗原。 2.抗凝剂的配制：用天平称量 3.8克柠檬酸三钠，溶入100ml生理盐水中，待溶解完全后即可使用。 3.1％红细胞悬液：由鸡心脏或翅静脉采血，放入加有抗凝剂的离心管内（按抗凝剂：全血＝1：2的比例），迅速混匀。在离心机中以3000转/分离心5分钟，用吸管吸去上清液和红细胞上层的白细胞薄膜，将沉淀的红细胞加生理盐水，慢慢混合均匀，再在离心机中3000转/分离心5分钟，弃去上清液，再加生理盐水混匀，如此反复离心4～5次，最后一次离心后的红细胞，弃去上清液，即为红细胞泥。放入4℃冰箱中可保存2—3天。使用时用1ml 吸管吸取0.1ml红细胞泥，然后加入9.9ml的生理盐水，此即1%红细胞悬液。现用现配。 4.被检血清：每只鸡心脏或翼下采血0.5-1ml,静置或离心，待血清析出后备用。 5.吸管清洁液的配制：使用1%的稀硫酸溶液。水10公斤，硫酸100毫升，将硫酸慢慢倒入水中，不断搅拌，操作时必须戴手套，口罩。 6.96孔V型板和微量滴头清洁液的配制：重铬酸钾79克，水1000ml，硫酸100ml，将重铬酸钾磨碎，溶解于水中，然后慢慢加入硫酸100ml，不断搅拌，切不可将重铬酸钾水溶液倒入硫酸中，以防爆炸，操作时必须戴手套，口罩。 7.血清稀释液：为灭菌的生理盐水。 三、实验过程： 原理：某些病毒（如新城疫、减蛋、流感）能够与鸡红细胞发生凝集，此即为红细胞凝集现
病毒的血凝及血凝抑制试验[医学参照]
病毒的血凝及血凝抑制试验 有些病毒具有凝集某种(些)动物红细胞的能力，称为病毒的血凝，利用这种特性 设计的试验称血球凝集(HA)试验，以此来推测被检材料中有无病毒存在，是非特异性的，但病毒的凝集红细胞的能力可被相应的特异性抗体所抑制，即血球凝集抑制(HI) 试验，具有特异性。通过HA-HI试验，可用已知血清来鉴定未知病毒，也可用已知病 毒来检查被检血清中的相应抗体和滴定抗体的含量。 [目的要求] 掌握病毒HA和HI试验的原理和基本操作方法，了解其实用价值。 [材料与试剂] 1. 96孔“U”形或“V”形微量反应板，50μL定量移液器，滴头，微型振荡器。 2. 生理盐水，0.5% 鸡红细胞悬液。 3. 新城疫病毒液（尿囊液或冻干疫苗液），新城疫阳性血清，被检鸡血清。 [实验内容及操作方法] （一）血球凝集(HA)试验 1. 在96孔微量反应板上进行，自左至右各孔加50μL生理盐水。 2. 于左侧第1孔加50μL病毒液（尿囊液或冻干疫苗液），混合均匀后，吸50μL 至第2孔，依次倍比稀释至第11孔，吸弃50μL；第12孔为红细胞对照。 3. 自右至左依次向各孔加入0.5% 鸡红细胞悬液50μL，在振荡器上振荡，室温 下静置后观察结果（表4-1）。 表 4-1 病毒血凝试验的操作方法（单位：μL） 弃50
4. 结果判定：从静置后10 min开始观察结果，待对照孔红细胞已沉淀即可进行结果观察。红细胞全部凝集，沉于孔底，平铺呈网状，即为100% 凝集（++++），不凝集者（-）红细胞沉于孔底呈点状。 以100% 凝集的病毒最大稀释度为该病毒血凝价，即为一个凝集单位。从表4-1看出，该新城疫病毒液的血凝价为1:128，则l:128为1个血凝单位，1:64、l:32分别为2、4个血凝单位，或将128/4=32，即1:32稀释的病毒液为4个血凝单位。 (二) 血球凝集抑制(HI)试验 1. 根据HA试验结果，确定病毒的血凝价，配制出4个血凝单位的病毒液。 2. 在96孔微量反应板上进行，用固定病毒稀释血清的方法，自第1孔至第11孔各加50μL生理盐水。 3. 第１孔加被检鸡血清50μL，吹吸混合均匀，吸50μL至第2孔，依此倍比稀释至第10孔，吸弃50μL，稀释度分别为：1:２、1:4、1:8 ……；第12孔加新城疫阳性血清50μL，作为血清对照。 4. 自第1孔至12孔各加50μL 4个血凝单位的新城疫病毒液，其中第11孔为4单位新城疫病毒液对照，振荡混合均匀，置室温中作用10min 。 5. 自第l孔至12孔各加0.5% 鸡红细胞悬液50μL，振荡混合均匀，室温下静置后观察结果（表4-2）。 表4-2 病毒血凝抑制试验的操作方法（单位：μL） 6. 结果判定：待病毒对照孔（第11孔）出现红细胞100%凝集（++++），而血清
血凝血凝抑制试验说明书
鸡新城疫血凝与血凝抑制实验 鸡新城疫血凝（HA）及血凝抑制(H1)试验 基本原理： 许多病毒表面具血凝素，具有凝集某些动物或人红细胞的特性，称为血凝现象，可用于鉴定病毒。血凝现象可以被特异性抗体所抑制，称为血凝抑制现象，利用这种特性可进行血清学试验，称为血凝抑制试验。器材及试剂: 待检病毒:鸡新城疫病毒鸡胚尿囊液； 待检血清：抗鸡新城疫病病毒阳性血清； 生理盐水/PBS、1%鸡红细胞、96孔V形微量血凝板、加样器等。 实验步骤 PBS的配制： 1%鸡红细胞的配制： （一）血凝试验（HA）取96孔板，按以下步骤操作： 1、第一排1-12孔各加生理盐水50ul，第二排1-12孔加生理盐水50ul为红细胞对照； 2、吸50ul病毒液于第一排第1孔，混匀后取50ul至第2孔，依次稀释至第12孔，弃去50ul，各孔经倍比稀释后稀释度依次为2-1~2-12 。 3、第一排1-12孔及第二排1-12孔各加1%鸡红细胞50ul，微型震荡器震荡2min混匀。 4、室温静置10-30分，观察结果（见下表）。 5、结果判定：红细胞对照组红细胞完全沉降，以试验排中能使等量红细胞发生完全凝集的病毒最高稀释倍数，作为病毒的血凝价，即HI效价，用2n表示。 （二）四单位检测： （三）血凝抑制试验（HI） 取一96孔板，按以下步骤操作： 1、4个单位抗原的制备：按HA试验测出的病毒血凝价除以4即为4个单位血凝素的稀释度。 2、待检血清的稀释：第一、二、三排1-12孔各加生理盐水50ul，于第一排第1孔中加入50ul待检血清，反复吹吸3-5次混匀后，取50ul至第2孔混匀，吸取50ul至第3孔，依次稀释至第12孔，弃去50ul，经倍比稀释，血清的稀释倍数为21~212 。 3、第一、二排1-12孔各加4个单位血凝素50ul，微量震荡器震荡2min混匀； 4、室温静置20min； 5、第一、二、三排1-12孔各加1%鸡红细胞50ul，微量震荡器震荡2min混匀混匀。
血凝和血凝抑制试验
血凝和血凝抑制试验 一些病毒或病毒的血凝素能选择性地使某种或某几种动物的红细胞发生凝集，这种凝集红细胞的现象称为血凝(Hemagglutination，HA)。正粘病毒和副粘病毒是最主要的红细胞凝集性病毒；其他病毒包括披膜病毒、细小病毒、某些肠道病毒和腺病毒等也有凝集红细胞的作用，但常要求比较严格的反应条件，例如一定的pH范围等。各种病毒的血凝素性质不尽相同。某些病毒可在很广的pH条件下呈现血凝作用，某些病毒则只在很窄的pH范围内才能凝集红细胞。某些病毒的血凝作用具有温度依赖性，也就是只在一定温度范围内才出现血凝现象；但另一些病毒却可在4℃、室温和37℃呈现同样的血凝作用。病毒凝集的红细胞种类，也随病毒种类而不同，例如某些病毒主要对人和禽的红细胞呈现凝集作用，另一些病毒则可凝集豚鼠或大鼠等的红细胞。 当病毒的悬液中先加入特异性抗体，且这种抗体的量足以封闭病毒颗粒或其血凝素时，则红细胞表面的受体就不能与病毒颗粒或其血凝素直接接触，这时红细胞的凝集现象就被抑制，称为红细胞凝集抑制(HemagglutinationInhibition，HI)，也称为血凝抑制反应。血凝的原理因病毒而有所不同，如痘病毒对鸡红细胞发生凝集作用并非是病毒的本身，而是痘病毒的产物类脂蛋白的作用。而流感病毒的血凝作用是病毒囊膜上的血凝素与红细胞表面的受体糖蛋白相互吸附而发生的。病毒的血凝现象大致可以分为可逆转型、不可逆转性、凝集条件严格型三类。 血凝和血凝抑制试验有常量法和微量法两种，目前国内外广泛使用的都是微量法，各要素用量均为25ul，微量法省时、省料、高效。以下简要介绍本次试验的主要内容，详细内容参见各国标。 各实验室所采用的HA和HI试验程序不同，下面的例子是应用V型微量板进行的试验，两种方法反应总体积都为75ul，本试验所用试剂为如下： 1.生理盐水：用蒸馏水或去离子水配制成0.85％NaCl溶液，高 压灭菌备用。 2.红细胞悬液：采鸡血液，加于倍量的红细胞保存液-阿氏液中，置4℃普通冰箱保存，可用一个月。使用前，取红细胞悬液1份，用5～10倍量的生理盐水洗涤3次，直至上清无色透明。取沉淀红细胞，加生理盐水制备成1％红细胞悬液。
血凝抑制试验
影响禽流感血凝抑制试验因素的分析 及解决方法 摘要：在试验过程中，存在很多的因素会直接影响禽流感血凝抑制试验，从而导致试验结果不正确等现象出现， 禽流感病毒能够与鸡红细胞发生凝集现象，这种红细胞凝集现象可被特异性免疫血清所抑制，即红细胞凝集抑制实验（HI）。基层工作中常用于新城疫、禽流感等免疫抗体的检测，辅助诊断病毒性疾病等，此方法操作简便、快速、准确、实用，但在实践中也常常由于某些因素的影响，从而使试验结果不精确，有时甚至无法判定结果。 1血凝试验原理和方法 血凝(直接血凝)反应(HA)：利用病毒或病毒的血凝素，能选择性凝集动物红细胞及病毒浓度与红细胞凝集程度呈正相关的特性，采集敏感的动物红细胞配制成1%红细胞悬液与待测定的病毒液在微量血凝板上进行红细胞凝集实验，根据红细胞的凝集程度间接测定病毒中的病毒浓度。方法是用鸡红细胞与标准抗原作用，检测出标准抗原血凝单位,为血凝抑制试验作准备。 2影响血凝试验的主要因素 2.1被检血清腐败变性 被检血清腐败变性严重影响免疫抗体检测。因此，血样采集后要及时分离血清，分离后及时测定或放臵在4℃冰箱内保存，要力求新鲜，如暂时不测定可冷冻保存。血清使用前要充分摇匀。 2.2不同来源、不同浓度的红细胞 不同来源、不同浓度的红细胞会使结果差异很大，所以红细胞来源一定要相同。一般需要3只或3只以上公鸡来提供红细胞，将3只以上公鸡红细胞混合在一起。也可由1只公鸡来提供红细胞，但必须经多次试验证明是可行的。有抗体鸡提供的红细胞需要更多次数洗涤。但要注意有时不同的公鸡提供的红细胞对禽流感H5亚型抗体测定，效价差异很大。不同浓度的红细胞对抗体测定也有影响。 2.3病毒悬液和红细胞悬液在使用前没有摇匀 病毒悬液和红细胞悬液如没有摇匀，加入时浓度高低不一，会人为造成误差。因此抗原和红细胞使用前一定要摇匀，保证每一孔中加入的浓度准确一致。
血凝抑制实验报告_1
( 实验报告) 姓名：____________________ 单位：____________________ 日期：____________________ 编号：YB-BH-004573 血凝抑制实验报告Hemagglutination inhibition test report
血凝抑制实验报告 血凝抑制实验报告一 禽流感血凝和血凝抑制试验可用于血清中抗体水平的监测，也可用于判断未使用疫苗群体的感染状态等。该试验是目前世界卫生组织和国际动物健康组织进行全球流感监测所普遍采用的方法，而且因其具有经济、快速、可靠、操作简便、能够处理大量的样品，并能在短时间内报告禽流感抗体水平等优点，已经成为当前基层兽医实验室禽流感疫病监测和免疫抗体检测中最为常用的方法。但因该试验受人为操作影响较大，经常因操作不规范、不严谨等造成结果偏差大、重复性差等问题，现根据几年来的工作经验对该试验过程中应注意的事项做一探讨。 一、血凝试验操作程序 1、取96孔90°V形酶标板，用微量移液器在第一至第五排的1~12孔每孔加25 μL PBS液。 2、吸取25 μL标准禽流感抗原加入到第一排第1孔中充分混匀。 3、从第1孔吸取25 μL混匀后的抗原液加到第2孔中，混匀后吸取25μL 加入到第3孔中，依次进行倍比稀释至第二排最后一孔即第24孔，最后弃去25 μL。第三排孔至第四排孔同上操作。 4、依次向第一至第五排孔的每孔中加入25 μL 1%的鸡红细胞悬液。
5、将酶标板置于微量振荡器上振荡10秒，室温（20-25℃）静置30 min 观察结果（如果环境温度太高，可置4℃环境下）。 6、结果判定：将板作45°倾斜，观察红细胞是否呈泪滴状流淌。以完全凝集（不流淌）的抗原或病毒最高稀释倍数为1个血凝单位（HAU） 二、血凝抑制试验操作程序 1、根据血凝试验结果配制4HAU抗原。（即1HAU抗原除以4） 2、取96孔V形酶标板，用移液器在第1~12孔各加入25 μL PBS。 3、在第1孔加入25 μL被检血清，充分混匀后移出25 μL加至第2孔，依次类推，倍比稀释至第12孔，弃去25 μL。 4、按以上步骤加入阳性血清和阴性血清（各做两份），作对照孔。 5、在第1~12孔各加入25 μL 4单位抗原，置于微量振荡器上轻轻混匀，室温20-25℃下静置30 min。 6、每孔加入25 μL 1%的鸡红细胞悬液。置于微量振荡器上轻轻混匀，室温（20-25℃）静置40 min后观察结果，若环境温度过高，可于4℃条件下进行，红细胞将呈明显的纽扣状沉到孔底。 7、结果判定：只有阴性对照孔血清滴度不大于2 log2，阳性对照孔误差不超过1个滴度，试验结果才有效。将酶标板作45°倾斜，以完全抑制红细胞凝集的最大稀释倍数判为该血清的血凝抑制滴度。当被检血清效价大于等于4log2，判为禽流感抗体阳性。 三、试验过程中的注意事项 1样品的保存及试验前处理 1.1 采集的血液样品应及时分离血清，最好分装至离心管中，标记清楚，离
病毒血凝和血凝抑制试验--(以新城疫为例)
实践三 病毒血凝和血凝抑制试验--（以新城疫为例） 实践目的： 1．掌握血凝（HA ）和血凝抑制(HI)试验的原理 2．掌握鸡新城疫病毒血凝和血凝抑制试验的操作方法 实践原理： 某些病毒(如鸡新城疫病毒，禽流感病毒等)能够与人或动物的红细胞发生凝集，此即为红细胞凝集现象。这种红细胞凝集现象可于病毒悬液中加入特异性抗体（免疫血清）所抑制，即为红细胞凝集抑制试验。 实践内容： 1．红细胞凝集试验(HA 试验) 主要是测定病毒的红细胞凝集价，以确定红细胞凝集抑制试验所用病毒稀释倍数(抗原单位)。有试管法和微量法两种，现以常用的微量法进行说明。 鸡新城疫病毒的HA 试验现采用微量法，在V 形微量反应板上进行。 (1)首先用微量移液器向每个孔加入稀释液即灭菌生理盐水一滴(25μl)。 (2)用微量移液器取病毒抗原液25μl 加入第1孔内，吸头浸于液体中缓慢吸吹几次使病毒与稀释液混合均匀，再吸取25μl 液体小心地移至第2孔，如此连续稀释至第11孔，第11孔吸取25μl 液体弃掉；病毒稀释倍数依为1:2～1:2048，第12孔为红细胞对照。 (3)再以微量移液器每孔加％红细胞悬浮液1滴(25μl)。 (4)在振荡器上振荡混匀约l ～2分钟，再置37℃作用15分钟后观察结果。 (5)每次测定样品都应同时做红细胞对照。 表1 鸡新城疫血凝效价(HA)的测定术式(微量法) 孔号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 病毒稀释倍数 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128 1:256 1:512 1:1024 1:2048 对照 生理盐水 25 l 25l μ病毒液 25l l l l l 25l l l l l l μl 弃去 1％红细胞悬液 25μ l 25μl 25μl 25μl 25μl 25μl 25μl 25μl 25μl 25μl 25μl 25μl 感作 置振荡器上混匀1～2分钟，放37℃静置15分钟 # 表示100％完全凝集 ++ 表示50％凝集 - 表示不凝集
血凝血凝抑制试验总结
1、如果是马上要做实验，先把实验所需的抗原、标准阳性血清、阴性血清、待检血清取出 回温，如果待检血清已冷藏，可取出放入37℃恒温培养箱中回温，待血清析出后取出（时间大约看具体情况而定）。 2、试验准备阶段： a准备好清洗干净的血清离心管（要有刻度装血液）。 b采血：注射器内先加入一半体积的阿氏液（防止血液凝集，当所需红细胞较多时，加入注射器量程一半的阿氏液，当所需红细胞较少时，加入1.5 ml～2 ml的阿氏液）。 c 1%红细胞悬液的制备 采集至少3只SPF（无特定病原体）公鸡或无禽流感和新城疫等抗体的健康公鸡的血液与等体积的阿氏液混合，用PH 7.2、0.01 mol/L PBS液洗涤3次，每次去掉上层的清液后加入少量PBS用注射器反复抽吸使之混匀，再加至所要刻度，放入离心。每次均以1000 r/min离心10 min，洗涤后用PBS配成体积分数为1%的红细胞悬液，4℃保存备用（实际PBS液用1%的生理盐水代替）。 d所需1%红细胞悬液的体积≥4 HAU+1 ml（本例中为30 ml+1 ml=31 ml），否则配置的1%红细胞悬液不够用（理论计算为30.1 ml，取31 ml以防万一）。 e阿氏液（Alsevers）制备 葡萄糖 2.05 g 柠檬酸钠0.80 g 柠檬酸0.055g 氯化钠0.42 g 加蒸馏水至100 ml，散热溶解后调PH值至6.1, 69 kPa高压灭菌15 min，4℃保存备用。 3、血凝试验 目的：检测试验所用的标准抗原的血凝滴度，如检测结果血凝滴度为210 = 1024，表示标准抗原稀释1024倍仍能与红细胞发生凝集反应。 注意： 一瓶新的未使用的抗原（禽流感或新城疫为粉状），需要加入（用注射器）2ml的稀释液（0.9%生理盐水，一般瓶身上有标注加入的体积2ml） a反应板要同时做三排（每排12孔），原因：根据三排的多数结果来确定血凝滴度。例如：三个结果为：210、29、29，则本次试验标准抗原血凝滴度为29。 b加入1%的红细胞悬液后放到微量震荡器上震荡混合1min，室温20℃～25℃下静置40 min，放4℃静置60 min。当PBS对照孔红细胞呈明显纽扣状沉到孔底时判定结果。 4、4 HAU抗原 例如：标准抗原血凝滴度为210 = 1024，则4 HAU抗原=（1：210）/4 = 1：256，稀释时，将1 ml的抗原加入到255 ml的PBS中即为4 HAU。 5、计算配置4 HAU所需稀释液体积V和标准抗原体积X 假设：待检血清100份每排12个孔（实际只需要11孔，但多计算一些，以防不够）每孔加入25 ul 4 HAU抗原体积= 25 ul×12×100 = 30000 ul = 30 ml 设标准抗原体积为X 则有： 1 ：256 = X ：30000 标准抗原体积X = 3000 / 256 = 117.1875 ul =0.117 ml 稀释液体积V = 30 - 0.117 = 29.883 ml 但实际量取时稀释液体积直接用30ml计算，因为0.117 ml数量很小，可以忽略不计。 6、血凝抑制试验 a红细胞在使用过程中应经常摇匀。
鸡新城疫血凝(HA)及血凝抑制(H1)试验
鸡新城疫血凝（HA）及血凝抑制(H1)试验 （一）目的意义： 1.掌握血凝试验（HA）与血凝抑制试验（HAI）的基本方法； 2.了解HA与HI在新城疫病毒及其它病毒诊断和鉴定中的应用。 (二)基本原理： 许多病毒表面具血凝素，具有凝集某些动物或人红细胞的特性，称为血凝现象，可用于鉴定病毒。 血凝现象可以被特异性抗体所抑制，称为血凝抑制现象，利用这种特性可进行血清学试验，称为血凝抑制试验。 （三）器材及试剂: 待检病毒:鸡新城疫病毒鸡胚尿囊液； 待检血清：抗鸡新城疫病病毒阳性血清； 生理盐水、1%鸡红细胞、96孔V形微量血凝板、加样器等。 （四）实验步骤： 一、血凝试验（HA）取96孔板，按以下步骤操作： 1、第一排1-12孔各加生理盐水50ul，第二排1-12孔加生理盐水50ul 为红细胞对照； 2、吸50ul病毒液于第一排第1孔，混匀后取50ul至第2孔，依次稀释至第12孔，弃去50ul，各孔经倍比稀释后稀释度依次为2-1~2-12 。 3、第一排1-12孔及第二排1-12孔各加1%鸡红细胞50ul，微型震荡器震荡2min混匀。 4、室温静置10-30分，观察结果（见下表）。
5、结果判定：红细胞对照组红细胞完全沉降，以试验排中能使等量红细胞发生完全凝集的病毒最高稀释倍数，作为病毒的血凝价，即HI效价，用2n表示。 二、血凝抑制试验（HI） 取一96孔板，按以下步骤操作： 1、4个单位抗原的制备：按HA试验测出的病毒血凝价除以4即为4 个单位血凝素的稀释 度。 2、待检血清的稀释：第一、二、三排1-12孔各加生理盐水50ul，于第一排第1孔中加入 50ul待检血清，反复吹吸3-5次混匀后，取50ul至第2孔混匀，吸取50ul至第3孔，依次 稀释至第12孔，弃去50ul，经倍比稀释，血清的稀释倍数为21~212 。 3、第一、二排1-12孔各加4个单位血凝素50ul，微量震荡器震荡2min 混匀；
血凝和血凝抑制试验操作要领
血凝（HA）和血凝抑制（HI）试验是目前我国各地对新城疫、禽流感等疾病进行流行病学调查、疫病诊断、防疫监测、免疫程序制定等工作的主要依据，各大型养殖场、兽医门市、畜牧局、兽药疫苗生产厂家均可以进行操作。该试验方法具有经济、快速、可靠、操作简便和对抗体水平进行量化的优点，能够处理大量的样品，并能在短时间内报告禽类血样的抗体滴度水平。但是实验用材料不标准、操作不规范等因素也会影响到试验结果的准确性，导致试验的失败。笔者就血凝-血凝抑制试验中关键步骤介绍如下，供同行参考。 1原理说明 某些病毒具有凝聚某些动物红细胞的能力，称为病毒的血凝，利用这种特性设计的试验称为血球凝集试验，以此来推测被检材料中有无病毒存在，是非特异性的，但是病毒的血凝可为相应的特异性抗体所抑制，即血球凝集抑制实验，具有特异性，通过HA-HI实验，可用已知的血清来鉴定未知的病毒。 2试验前准备 2.196孔V型微量反应板选用规则标准的96孔V型微量反应板，V型孔底需光滑明亮，对底部磨损严重的反应板要及时淘汰。使用前先用酒精棉擦拭干净，再用蒸镏水反复冲洗多次，在温箱中烘干备用；使用后及时将反应板用自来水反复冲洗(以孔底不留沉积的红血球为准)，再将沾有洗涤剂溶液的棉拭刷洗凹孔及板面，然后再用自来水反复冲净每个凹孔及板面，待反应板干燥后，放到2％～3％浓度的盐酸中浸泡24h以上。 2.2待检血清用于分离血清的血液必须是新鲜无污染的，采集血样后置于硅化管或一次性塑料离心管内，水平放置，保证血样与空气最大限度的接触，先置于37℃环境下半小时，再置于4℃环境下数小时，8000～10000r/min离心3~5min，将析出的血清移入清洁的包装内备用。4℃的冰箱中冷藏可保存5d，长时间保存可冷冻存放，冷冻后会出现蛋白质局部浓缩、分布不均的现象，在检测前应充分混匀。 2.31%红细胞最好选用健康、未经过疫苗免疫的成年SPF公鸡，如若没有SPF公鸡也可以使用低抗体鸡提供的红细胞但需要更多次的洗涤(5遍以上)，建议用3只以上鸡的血液混合制备红细胞悬液。采血时先将注射器内吸入 3.8％～4％枸橼酸钠(1份抗凝液可抗凝4份血液)，或阿氏液(抗凝剂和血液等体积)再采血。采完后将抗凝剂和血液轻轻摇匀，再注入大离心管内加生理盐水洗涤，洗涤按2500r/min～3000 r/min离心3次～5次，每次离心后去掉上清液和白细胞层，保留红细胞层。洗涤完毕，用生理盐水稀释成0.5％～1％红细胞悬液。配好的红细胞悬液要做血细胞沉淀检查：取96孔V板一块，滴一滴红细胞悬液到任意孔内，室温静置 血凝和血凝抑制试验操作要领 王延树1张芳2 （1，瑞普（保定）生物技术有限公司河北保定071001；2，保定市畜牧水产局河北保定071051） 摘要：血凝（HA）和血凝抑制（HI）试验是目前我国各地对新城疫、禽流感等疾病进行流行病学调查、 防疫监测等工作的主要依据，具有经济、快速、可靠等多种优点，但在实际操作中有很多问题致使实验结 果不准确，本文就该实验的操作要领做简单汇总，为指导实验操作提供参考依据。 关键词：血凝血抑，注意事项 2009年8月China Animal Health中国动物保健75
血凝抑制实验报告
血凝抑制实验报告 【导语】实验报告是把实验的目的、方法、过程、结果等记录下来，经过整理，写成的书面汇报。以下是文库小编整理的血凝抑制实验报告，供大家借鉴！ 【篇一】血凝抑制实验报告 禽流感血凝和血凝抑制试验可用于血清中抗体水平的监测，也可用于判断未使用疫苗群体的感染状态等。该试验是目前世界卫生组织和国际动物健康组织进行全球流感监测所普遍采用的方法，而且因其具有经济、快速、可靠、操作简便、能够处理大量的样品，并能在短时间内报告禽流感抗体水平等优点，已经成为当前基层兽医实验室禽流感疫病监测和免疫抗体检测中最为常用的方法。但因该试验受人为操作影响较大，经常因操作不规范、不严谨等造成结果偏差大、重复性差等问题，现根据几年来的工作经验对该试验过程中应注意的事项做一探讨。 一、血凝试验操作程序 1、取96孔90°V形酶标板，用微量移液器在第一至第五排的1~12孔每孔加25μLPBS液。 2、吸取25μL标准禽流感抗原加入到第一排第1孔中充分混匀。 3、从第1孔吸取25μL混匀后的抗原液加到第2孔中，混匀后吸取25μL 加入到第3孔中，依次进行倍比稀释至第二排最后一孔即第24孔，最后弃去25μL。第三排孔至第四排孔同上操作。 4、依次向第一至第五排孔的每孔中加入25μL1%的鸡红细胞悬液。 5、将酶标板置于微量振荡器上振荡10秒，室温（20-25℃）静置30min 观察结果（如果环境温度太高，可置4℃环境下）。 6、结果判定：将板作45°倾斜，观察红细胞是否呈泪滴状流淌。以完全凝集（不流淌）的抗原或病毒稀释倍数为1个血凝单位（HAU） 二、血凝抑制试验操作程序 1、根据血凝试验结果配制4HAU抗原。（即1HAU抗原除以4） 2、取96孔V形酶标板，用移液器在第1~12孔各加入25μLPBS。 3、在第1孔加入25μL被检血清，充分混匀后移出25μL加至第2孔，依次类推，倍比稀释至第12孔，弃去25μL。 4、按以上步骤加入阳性血清和阴性血清（各做两份），作对照孔。 5、在第1~12孔各加入25μL4单位抗原，置于微量振荡器上轻轻混匀，室温20-25℃下静置30min。 6、每孔加入25μL1%的鸡红细胞悬液。置于微量振荡器上轻轻混匀，室温（20-25℃）静置40min后观察结果，若环境温度过高，可于4℃条件下进行，红细胞将呈明显的纽扣状沉到孔底。 7、结果判定：只有阴性对照孔血清滴度不大于2log2，阳性对照孔误差不超过1个滴度，试验结果才有效。将酶标板作45°倾斜，以完全抑制红细胞凝集的稀释倍数判为该血清的血凝抑制滴度。当被检血清效价大于等于4log2，判为禽流感抗体阳性。 三、试验过程中的注意事项
血凝抑制实验报告三篇
血凝抑制实验报告三篇 ——WORD文档，下载后可编辑修改—— 禽流感血凝和血凝抑制试验可用于血清中抗体水平的监测，也可用于判断未使用疫苗群体的感染状态等。该试验是目前世界卫生组织和国际动物健康组织进行全球流感监测所普遍采用的方法，而且因其具有经济、快速、可靠、操作简便、能够处理大量的样品，并能在短时间内报告禽流感抗体水平等优点，已经成为当前基层兽医实验室禽流感疫病监测和免疫抗体检测中最为常用的方法。但因该试验受人为操作影响较大，经常因操作不规范、不严谨等造成结果偏差大、重复性差等问题，现根据几年来的工作经验对该试验过程中应注意的事项做一探讨。 一、血凝试验操作程序 1、取96孔90°V形酶标板，用微量移液器在第一至第五排的1~12孔每孔加25 μL PBS液。 2、吸取25 μL标准禽流感抗原加入到第一排第1孔中充分混匀。 3、从第1孔吸取25 μL混匀后的抗原液加到第2孔中，混匀后吸取25μL加入到第3孔中，依次进行倍比稀释至第二排最后一孔即第24孔，最后弃去25 μL。第三排孔至第四排孔同上操作。 4、依次向第一至第五排孔的每孔中加入25 μL 1%的鸡红细胞悬液。 5、将酶标板置于微量振荡器上振荡10秒，室温（20-25℃）静置30 min观察结果（如果环境温度太高，可置4℃环境下）。
6、结果判定：将板作45°倾斜，观察红细胞是否呈泪滴状流淌。以完全凝集（不流淌）的抗原或病毒最高稀释倍数为1个血凝单位（HAU） 二、血凝抑制试验操作程序 1、根据血凝试验结果配制4HAU抗原。（即1HAU抗原除以4） 2、取96孔V形酶标板，用移液器在第1~12孔各加入25 μL PBS。 3、在第1孔加入25 μL被检血清，充分混匀后移出25 μL加至第2孔，依次类推，倍比稀释至第12孔，弃去25 μL。 4、按以上步骤加入阳性血清和阴性血清（各做两份），作对照孔。 5、在第1~12孔各加入25 μL 4单位抗原，置于微量振荡器上轻轻混匀，室温20-25℃下静置30 min。 6、每孔加入25 μL 1%的鸡红细胞悬液。置于微量振荡器上轻轻混匀，室温（20-25℃）静置40 min后观察结果，若环境温度过高，可于4℃条件下进行，红细胞将呈明显的纽扣状沉到孔底。 7、结果判定：只有阴性对照孔血清滴度不大于2 log2，阳性对照孔误差不超过1个滴度，试验结果才有效。将酶标板作45°倾斜，以完全抑制红细胞凝集的最大稀释倍数判为该血清的血凝抑制滴度。当被检血清效价大于等于4log2，判为禽流感抗体阳性。 三、试验过程中的注意事项 1样品的保存及试验前处理 1.1 采集的血液样品应及时分离血清，最好分装至离心管中，标记清楚，离心后吸出血清，对应编号冷藏送检，并禁止运输过程中剧
血凝抑制实验报告
血凝抑制实验报告 【篇一】血凝抑制实验报告 禽流感血凝和血凝抑制试验可用于血清中抗体水平的监测，也可用于判断未使用疫苗群体的感染状态等。该试验是目前世界卫生组织和国际动物健康组织进行全球流感监测所普遍采用的方法，而且因其具有经济、快速、可靠、操作简便、能够处理大量的样品，并能在短时间内报告禽流感抗体水平等优点，已经成为当前基层兽医实验室禽流感疫病监测和免疫抗体检测中最为常用的方法。但因该试验受人为操作影响较大，经常因操作不规范、不严谨等造成结果偏差大、重复性差等问题，现根据几年来的工作经验对该试验过程中应注意的事项做一探讨。 一、血凝试验操作程序 1、取96孔90°V形酶标板，用微量移液器在第一至第五排的1~12孔每孔加25μLPBS液。 2、吸取25μL标准禽流感抗原加入到第一排第1孔中充分混匀。 3、从第1孔吸取25μL混匀后的抗原液加到第2孔中，混匀后吸取25μL加入到第3孔中，依次进行倍比稀释至第二排最后一孔即第24孔，最后弃去25μL。第三排孔至第四排孔同上操作。 4、依次向第一至第五排孔的每孔中加入25μL1%的鸡红细胞悬液。 5、将酶标板置于微量振荡器上振荡10秒，室温
（20-25℃）静置30min观察结果（如果环境温度太高，可置4℃环境下）。 6、结果判定：将板作45°倾斜，观察红细胞是否呈泪滴状流淌。以完全凝集（不流淌）的抗原或病毒稀释倍数为1个血凝单位（HAU） 二、血凝抑制试验操作程序 1、根据血凝试验结果配制4HAU抗原。（即1HAU抗原除以4） 2、取96孔V形酶标板，用移液器在第1~12孔各加入25μLPBS。 3、在第1孔加入25μL被检血清，充分混匀后移出25μL加至第2孔，依次类推，倍比稀释至第12孔，弃去25μL。 4、按以上步骤加入阳性血清和阴性血清（各做两份），作对照孔。 5、在第1~12孔各加入25μL4单位抗原，置于微量振荡器上轻轻混匀，室温20-25℃下静置30min。 6、每孔加入25μL1%的鸡红细胞悬液。置于微量振荡器上轻轻混匀，室温（20-25℃）静置40min后观察结果，若环境温度过高，可于4℃条件下进行，红细胞将呈明显的纽扣状沉到孔底。 7、结果判定：只有阴性对照孔血清滴度不大于2log2，阳性对照孔误差不超过1个滴度，试验结果才有效。将酶标板作45°倾斜，以完全抑制红细胞凝集的稀释倍数判为该血