单分子荧光共振能量转移技术

研究生光谱

技术与应用课程

作业

河南大学

单分子荧光共振能量转移技术

学生：郭爱宇

学号：104753120870

学院：物理与电子学院

年级专业：2012级光学工程

课程名称：光谱技术及应用

指导老师：郭立俊教授

单分子荧光共振能量转移技术

摘要：单分子荧光共振能量转移技术(single molecule fluorescence resonance energy transfer, smFRET) 通过检测单个分子内的荧光供体及受体间荧光能量转移的效率，来研究分子构象的变化。在单分子探测技术发展之前，大多数的分子实验是探测分子的综合平均效应(ensemble averages)，这一平均效应掩盖了许多特殊的信息。单分子探测可以对体系中的单个分子进行研究，得到某一分子特性的分布状况，也可研究生物分子的动力学反应。介绍了近来单分子荧光共振能量转移技术的进展。

关键词：单分子；荧光共振能量转移；荧光基团

1 引言

光谱技术是研究生物分子最常用的方法之一。在单分子光谱（single molecule spectroscopy, SMS）探测技术发展以前，大多数的实验是探测分子的综合平均效应，得到的是由大量对象组成的一个整体所表现出的平均响应和平均值，这一平均效应掩盖了许多特殊的信息。而单分子探测可对体系中的单个分子进行研究，通过与时间相关过程的探测，能实时了解生物大分子构象变化的信息。2002年美国第46届生物物理年会表明单分子仍是生物物理学目前和今后重点发展的研究领域。主要的技术手段包括生物大分子荧光光谱，单分子荧光能量转移谱、与原子力显微镜结合进行单分子水平的分子间相互作用力的测量，以及可进行单分子操作的激光光钳，高时间分辨率的单分子轨迹追踪等[1]。由此可见，单分子荧光技术具有重要的地位。

标记在生物大分子上单个荧光基团的各种特性变化能够提供有关分子间相互作用、酶活性、反应动力学、构象动力学、分子运动自由度(molecular freedom of motion)及在化学和静电环境下活性改变的信息。近年，在动态结构生物学研究领域，用单分子荧光光谱技术研究生物分子构象变化的方法主要有两种：一是通过单分子荧光偏振的各向异性（single molecule fluorescence polarization anisotropy，smFPA）研究生物分子的构象动力学(conformational dynamics)和旋转运动(rotational motions)。另一个是单分子对荧光共振能量转移(single pair

fluorescence resonance energy transfer, spFRET)，在单分子水平测量一个分子内或两个不同分子间的距离变化和相互作用。本文主要就后者做简要介绍。

2 单分子荧光共振能量转移技术（smFRET）

2.1 smFRET原理

荧光共振能量转移是指当两种不同的荧光生色团离的较近，且其中一种生色团（供体，donor）的发射谱与另一种生色团（受体，acceptor）的激发谱有相当程度的重叠时，当供体被激发时，受体会因供体激发能的转移而被激发。其直观表现就是供体产生的荧光强度较其单独存在时要低的多，而受体发射的荧光却大大增强，同时伴随它们荧光寿命的相应缩短和延长。能量转移效率与两个生色团激发谱和发射谱的重叠程度、供体与受体跃迁偶极的相对取向、供受体间的距离有密切关系，其经典公式为E=R06/(R6+ R06)，R0为能量传递达到50%的距离。选定供、受体对之后，可将R0看作恒量。能量转移的发生将改变供、受体的去偏振程度、荧光寿命、荧光强度等，测定这些参数值就可得出E。利用R0和实验测得的E就可测得供受体间的距离R。用此方法测量生色团距离的方法被称为光谱尺，可测量1.0-10.0nm之间的距离。

smFRET是在一个生物大分子或两个相互作用的分子上标记两个不同的荧光基团。同样，当供体的发射光谱与受体的吸收光谱相重叠时，发生共振能量转移。通过探测能量转移效率，就可确定两点间的距离。由于相对取向和光谱重叠积分等不确定因素，该方法不能准确确定绝对距离。但可通过监测供体-受体的相对距离变化，结合其时间变化推测生物大分子在生命活动中的构象变化。该技术不仅有非常好的静态定位能力，也能提供分子内或分子间两个荧光基团在距离和方向上的动态变化。由于每次只观察一对供、受体系统，因此能在毫秒时间尺度内观察这些变化，从而将具有不同能量转移效率的亚群分开。将这种方法扩展，可用于研究生物多聚体的组成动力学、DNA限制性内切酶酶切反应，以及DNA 发夹结构的去折叠等[2-7]。

2.2 smFRET的特点

单分子技术的优势使其在生物领域受到极大的青睐。例如在不均一的体系中，单分子技术能直接反映分子特性的分布状态。此外，在复杂的生物化学反应中，单分子技术能够在不同步化每一步反应的情况下研究每一步的动态化学反应[8,9]。

2.2.1 smFRET研究群体的分布状态

当单个生物分子的FRET 值确定后，可以通过FRET 值的分布作出生物分子的统计图[10]。这种方法不局限于smFRET 技术，还有其他的方法也能达到这一目的。可以假设有一个不均一的样品，包含两个不同的群体，每一个群体有不同的FRET 值。传统的整体稳态FRET 测量只能得到单一的FRET值，即整个样品的平均FRET 值，但是它不能反映出样品的不均一性。而smFRET 方法通过生物分子的统计图能很直观的检测出样品的群体分布状态，以及每一个群体的FRET 值( 图1 A)。

2.2.2 smFRET研究生物分子的动力学反应

对于生物化学反应，如果想用整体FRET 来研究动力学反应，得出反应的动力学参数，需要用各种方法来使反应同步化，使每一个分子处于反应的同一状态，然后在外加的因子下启动反应。如果反应无法同步化，整体FRET 的方法就无法对反应的动力学进行研究。但是smFRET 并不受生物化学反应同步化的限制( 图1B)。同时smFRET 还能探测到稀有的构象变化以及非富集中间产物的形成[11]。这些是很难用整体FRET 检测到的。

图1 smFRET能检测不同的构象。A, LeuT在无Na+的条件下，smFRET能检测出两个FRET的峰，而整体FRET的方法只能得到平均的FRET值(虚线)；B,smFRET能检测到单个LeuT分子构象间的转化，进而得到分子动力学参数，这些信息很难应用整体FRET的方法得到。

3 smFRET实验设计

3.1 实验设备

单分子荧光探测必须满足两个基本要求，一是在被照射的体积中只有一个分子与激光发生相互作用；二是要确保单分子的信号大于背景的干扰信号。背景信号来自于Raman散射、Rayleigh散射、溶剂中杂质、盖玻片产生的荧光和探测器的暗电流。因此，进行单分子探测要求(1) 激发容积要小，因为背景的吸

收与激发体积成正比，尽量减小激发体积可降低背景干扰，（2）高效的收集光

学系统，（3）灵敏的探测器，（4）采用针孔装置，或将溶剂中杂质预漂白以及用低荧光光学材料等方法清除背景荧光。

常用的装置是近场光学扫描显微镜(near-field scanning optical microscope NSOM)，其最小激发体积小于10-2μm3。该方法在单分子荧光的探测中发挥了很重要的作用。可监测单个生物大分子的构造变化，例如旋转和纳米水平上的距离变化。其不足是扫描时需要通过复杂的控制系统来保持适当的样品与探针之间的距离，并且其近场激发对所研究的生物体系有微扰作用，给研究带来许多限制。

共聚焦激光扫描显微镜(Confocal scanning optical microscope CSOM)[12-13]，也是常用装置之一。在其光学设计中，激光束经物镜聚集到样品上形成一个接近衍射极限的光斑，利用同一物镜收集样品反射回的光，经一个共焦小孔后被探测器接收，而非焦面的光则被小孔滤掉，从而保证了良好的光学收集效率和高信噪比。

为了实现宽场显微观察，可通过常规荧光显微镜的上方照明孔送入激发光，但这样无法消除来自显微镜片和样本的自身荧光，会产生次级干扰。采用瞬间场激发方法可避免激发光进入探测器，这种方法是由在玻璃和水界面的激发光产生全内反射实现的，因此称为全内反射荧光显微镜(Total internal reflection fluorescence microscope TIRFM)[14-15]。为了实现全内反射，需要大的入射角，例如玻璃-水界面的入射角要大于61°。这可以通过棱镜(prism)实现，称为prism-based TIRFM；也可通过高数值孔径的物镜实现，此时称为objective-type TIRFM，见图2[16]。探测器是单分子荧光检测的关键部分，常用的探测器是超敏电感偶合相机(intensity charged coupled device, ICCD)和单光子计数模式的雪崩光二极管，将其与激光共聚焦荧光显微镜和有关电子系统相组合，可进行多种形式的单分子荧光特性研究。包括单分子荧光成像，荧光光谱，荧光寿命及FRET。为了实现FRET效率最优化，需特别注意降低cross-talk现象，即供体和受体发射光互相泄漏到彼此的探测器，尤其是供体发射光的漏射。可采用带通滤波器降低此影响。

一般而言，单分子FRET研究设备的主要组成包括：①激光光源，激发常用标记物Cy3的理想波长为532nm；②倒置显微镜，CSOM和objective type TIRM 可用60倍油浸物镜，NA=1.4, WD（工作距离）=0.15mm，prism-based TIRM可用60倍水浸物镜，NA=1.2, WD=0.25mm；③超敏数字CCD摄象机；④其它，如样本扫描平台；荧光过滤器；棱镜；石英载玻片；雪崩光电二极管；计算机等。

图3是典型的供体-受体标记的单个蛋白能量转移情形，可见供体荧光有效地转移给受体。当受体发生光漂白时，能量转移被阻断，供体自身发出荧光[17]。

图2 smFRET全反射荧光显微镜示意图。

图3 单对D-A体系标记的单个无抑制剂蛋白的能量转移过程。

3.2 荧光标记物

用于单分子荧光研究的理想荧光标记物应有下述特点：耐光，不易发生光致漂白；具有高消光系数和高量子产率；易被激发，荧光强度波动小；体积小，对标记的宿主分子影响小。对于smFRET研究用的一对荧光探针，还要求①供、受体的激发谱有较大不同，二者的发射谱也要足够分开。但供体发射谱与受体激发谱又要有一定重叠，尽量减少供体发射的荧光漏入受体发射范围，降低激光直接激发受体的作用；②供体和受体都有相当的量子发射，保证在有FRET发生时，供、受体都有明确的强度相对变化。

荧光蛋白[18-20]、有机染料[9,21]以及半导体量子点[22-23]在单分子荧光技术上均有应用。荧光蛋白具有较低的光稳定性，在单分子技术上它的应用不如有机染料广泛。有机染料由于其相对分子质量小，光稳定性强，以及多种形式的有机染料可以很容易购得( 例如Cyanine 系列的染料可以从GE Healthcare购得)，因此其应用最为广泛。其中，长期以来一直广泛应用的是Cyanine 染料系列中的Cy3 及Cy5。半导体量子点也可作为荧光的供体用于单分子荧光技术上。目前商品化的半导体量子点的直径大于20 nm，远大于有机荧光染料分子( 直径小于1 nm)。如此大的体积，使其在smFRET 中检测生物分子的构象变化上不够灵敏。另外，单官能的半导体量子点目前尚未商品化。但是Jacob Piehler 实验室[23]及Alice Y Ting 实验室[24]报道了单官能的半导体量子点的制备及在单分子荧光技术上的应用。由于其光稳定性远强于荧光蛋白及有机荧光染料，半导体量子点作为一种新型的荧光探针正越来越广泛地被采用。

标记的荧光团是否会影响宿主分子的生物活性？Taekjip[8]认为有机的荧光基团会有一定作用，但他们进行的有关RNA和DNA的研究，尚未发现标记的荧光基团能明显影响分子反应的动力学。在他们进行的靡蛋白酶抑制剂分子折叠-展开平衡分布的smFRET研究中，也未发现两个较大的荧光基团对分子的稳定性有影响。一般而言，应多选几个替代标记部位，根据实验要求选择对分子影响最小的部位。

3.3 样品的制备及单分子的检测

现在有多种商品化的荧光染料，使得生物分子的标记大大简单化，如对于核酸分子的标记，含有亚磷酰胺基团的染料能很容易地在核酸合成的过程中标记核酸分子；也可以用氨基反应性的染料标记核酸合成过程中产生的氨基，然后通过分子筛、高效液相色谱或凝胶电泳将染料标记的核酸分子与游离的染料及无染料标记的核酸分子分开。由于赖氨酸在蛋白质表面的富集性，通常使用氨基反应性的染料对蛋白质或抗体进行标记。对于大多数蛋白，由于表面含有多个赖氨酸，此方法对于位点特异性的标记并不可行，此时可以选择半胱氨酸。半胱氨酸在蛋白质表面并不常见，可以使用巯基反应性的染料对蛋白进行位点特异性地标记。

如果要较长时间使用smFRET 技术观察生物分子的构象变化，生物分子需要表面固定化。不恰当的固定方式会影响分子的性质。链霉亲和素(streptavidin) 和生物素(biotin) 具有很强的亲和性，通常利用它们之间的相互作用来特异性地固定样品[25]。例如生物素化的牛血清白蛋白可吸附在玻璃或石英的表面，然后通过多价的链霉亲和素来结合并固定生物素化的荧光标记的核酸分子。对于蛋白质的固定，通常使用钝化剂( 如聚乙二醇) 来抑制蛋白质非特异性地结合到玻璃或石英的表面。对于His-Tag 蛋白的固定，可以采用螯合的Ni2+或Cu2+，但是有些情况下需要在His-Tag 和蛋白质之间加一段链接以保证固定后的蛋白具有合适的取向[11]。

smFRET研究中的另一个问题是光致漂白作用。可以采用周期性的阻断激光，来延长观察时间。鉴于单态氧的存在是荧光漂白的主要原因，除去溶液中的氧可延长某些基团的荧光寿命，例如Cy5的寿命可增加30倍。但对其他一些荧光基团，祛除氧只有很小的作用，甚至有相反作用。此外，密封样品舱，与环境空气隔绝也很重要。

3.4 数据处理

为了保证所选择的信号来自真正的荧光分子而不是来自背景信号，在对smFRET 信号筛选时，通常需要设定多个参数[11]。如分子具有单个光褪色步骤，信噪比大于8:1，供体的荧光闪烁少，供体对受体的皮尔逊相关系数小于0.5，同时荧光分子的寿命长于15 时帧，并且分子的FRET 值大于0.15。

标记分子的FRET 值随时间变化，通常被解释成荧光供体和受体间的距离的变化及标记分子构象的变化。这是基于在数据采集的时间刻度范围内，荧光基团能自由旋转( 荧光基团的取向因子K2=2/3)及荧光的量子产率在数据收集过程中稳定。

用实验的方法测量荧光基团的取向因子K2比较困难，因此通常不用FRET 值来测定绝对距离，而是用smFRET 来反映分子动态的变化即相对距离的变化。FRET 的变化可能来自分子构象的变化，也可能是由于荧光基团与标记分子间的相互作用。通常可以用以下两个对照实验来排除构象变化外的其他因素导致的FRET 的变化[8,9]。首先，用整体平均的方法测量荧光的各向异性。如果荧光的各向异性值很低，表明荧光基团与标记的分子间的作用较弱，荧光基团的旋转比较自由。此方法不能排除荧光基团与标记分子间短暂的相互作用，该相互作用可以通过测量固定化的单个荧光分子的各向异性来排除。另外一种对照实验是通过改变实验的生物学参数来确定观察到的FRET 的变化的生物学来源，如在蛋白质的构象变化试验中，如果FRET 的变化与蛋白的底物相关，与功能相关的单位点突变也影响FRET 的变化，这说明所观察到的FRET 的变化具有生物学意义[11]。

4 smFRET应用

smFRET研究分子内和分子间的构象变化非常有用。分子内的研究包括大分子的起伏（fluctuation）和稳定、蛋白质分子内部特定点位之间的距离，折叠和去折叠及催化作用时酶结构改变等。分子间的研究包括受体与配体结合、酶与底物的结合和分离及马达蛋白的运动等。图4（上）[26]所示的是用smFRET测量分子内的构象变化示意图。D和A分别是供体和受体，I D和I A分别是供体和受体荧光的强度，t是时间。图4(下)表示用smFRET研究分子间的结合和分离。从图中可见供体和受体的荧光强度正好成相反的变化。自从1996年首次报道测量单个供体和受体间能量转移以来，已用该方法研究了葡萄球菌酶催化作用时酶与底物的相互作用，在人工脂膜上配体与受体的结合和定位，钙离子结合蛋白与钙结合时的构象变化，盐浓度对卷曲状原肌球蛋白解离的影响等。

图4 spFRET研究分子内(上) 和分子间（下）构象变化的示意图。

局部环境的变化会引起荧光基团发射特性的改变，也可在单分子水平进行检测。实际上，由于它们的荧光发射特性对电荷、PH和离子浓度非常敏感，因此可做为非常理想的指示剂。将其与酶或离子通道结合，封闭活性部位或通道口时就能通过其反映生物分子的结构变化和功能。图5（上）表示离子通道用荧光指示计I标记，其强度I的变化反应了局部离子浓度的变化。如果在离子通道上再标记上供体和受体对（图5下），则smFRET就能反应通道蛋白质构象动力学的变化，同时指示计能检测离子流的变化情况[26]。通道病(channelopathies)是目前生物物理领域研究的重要问题之一。电测量与荧光技术的结合已揭示了离子通道的作用模型。通道与Alzheimer病的发生也有密切关系。

图5 spFRET用于研究离子通道变化的示意图。

smFRET还可用于测量单个酶的催化作用。用供体和受体标记核酸酶后，可通过测量分子内的构象变化监测其催化活性。当底物浓度高时，能得到供、受体发射荧光强度的反相变化和呈明显周期性的时间轨迹。用这种方法能得到单个酶分子的催化速率等信息。在分子间的smFRET催化实验中，在酶上标记一个供体，底物上标记一个或多个受体。发生催化反应时也能得到供、受体荧光发射强度的反相变化曲线，如果受体空间距离相等，就能得到准确的时间周期变化，见图6A和B[26]。这种测量还能提供底物或产品结合与分离速率的信息。

图6 核酸酶与DNA相互作用时分子内（A）和分子间(B)的smFRET。

借助于单分子操纵技术，如原子力显微镜和光镊和磁镊等，可研究单个DNA 分子的过度延伸和超螺旋，单分子马达反应时的力和位移以及蛋白质的去折叠。图7示意的是用光镊与smFRET结合研究DNA的展开变化[26]。2000年有学者报道了用该技术研究A431癌活细胞上表皮生长因子受体(EGFR)的信号传递过程。用供、受体标记单个EGFR分子，能通过FRET记录其发生二聚反应（dimerization reaction）的连续视频图象，（图8）[27]。这证明smFRET可用于研究活细胞膜蛋白的二聚、寡聚、结合与分离和构象动力学。未来smFRET有可能用于胞液，甚至细胞核的研究，包括有丝分裂期间单个马达蛋白、转录时RNA聚合酶和翻译时核糖体的运动性和结构变化。

图7 用smFRET研究DNA的机械牵拉。

图8 活细胞上的spFRET。a是膜上EGFR分子标记供受体的示意图，b是供受体荧光强度变化的视频图象和记录曲线。

5 结语与展望

应用全内反射荧光显微镜进行单分子或smFRET的研究，在生物领域取得了巨大的进展，使人们对有些生物过程有了更深入的了解。活细胞水平单分子的研究能使人们深入理解细胞膜上膜蛋白的动态变化，膜蛋白与其他蛋白间的相互作用，以及膜蛋白的生物调控等问题。未来随着探针的改进及数据分析的改进，该领域会有突飞猛进的发展。

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