眼部药物代谢动力学的研究

眼部药物代谢动力学的研究

摘要：药代动力学研究在药品研发及评价过程中具有重要作用。本文对眼用制剂的药代动力学研究的进行了探讨。本文介绍了眼的药物代谢途径及其特点，眼部药代动力学样本采集以及常见的分析方法。通过药代动力学的研究可以了解药物在体内的代谢特征，指导临床用药的给药剂量、间隔、途径等，保证药物疗效，减少毒副作用。

关键词：眼；药代动力学；分析方法

对药品研发人员、技术审评人员以及临床医师来说, 人体药代动力学研究所提供的信息是非常重要的, 有时甚至是其他研究所无法替代的。通过眼部药代动力学的研究，学者们可以获得药物在眼部代谢的浓度一时间曲线，了解药物在眼内的代谢特征，对于药物剂型设计、给药方案、治疗监测等起着重要的作用。但是眼具有特殊屏障作用, 眼用制剂的药代动力学过程不同于系统给药的过程, 那么其药代动力学的特点及一般过程如何? 其意义何在? 常用的分析方法用哪些？另外，现有眼科局部给药的突破点在于,如何通过改进药物剂型和给药方式保证病人良好的依从性和药物应用的便捷性, 安全性。因此,对眼局部的药物代谢动力学加以了解和考察,能够更好的针对不同的疾病选择不同的给药方式和药物剂型, 对于临床诊治及用药安全具有重要的指导意义。同时，眼部给药系统研究的兴起也要求有方便、准确、安全、有效的检测方法来进行说明和验证。

1 眼的药物代谢途径及其特点

1.1 药物在眼球表面的流失

在眼局部应用滴眼剂时, 由于泪液在眼表的涂布,流动和循环使药物在接触眼表时即发生了流失。泪液在眼表的更新速度仅为1μl/min,相对多量的滴眼剂可在数分钟之内随着泪液的循环快速流入鼻泪管发生排泄[1]。由此可见,滴眼剂药物的全身吸收不仅在结膜囊的局部毛细血管中进行,同时也存在于滴眼剂流入鼻腔从而进入全身的情况。因此, 大多数以局部滴眼剂方式给药的小分子量药物在数分钟内即会进入全身循环,从而导致其在眼表的生物利用度仅在5%甚至更少。全身循环中的吸收降低了药物在眼表的有效浓集, 因此,通过应用固体药物

或凝胶剂型的给药方式, 从而产生长效的药物缓慢释放作用,可以达到在对抗局部泪液循环的清除作用下提高眼表局部药物浓度和药物生物利用度的目的[2-3]。

1.2 眼表的屏障作用引起的药物流失

角膜是由具有不同生理功能和解剖性质的五层组织构成。角膜上皮作为角膜最表层的结构,其厚度约为0.1mm。在眼局部药物动力学研究中发现,角膜上皮极大地限制了泪液中药物向前房的渗透。该屏障作用依赖角膜上皮细胞的成熟和功能完备形成的,随着角膜上皮细胞的成熟,角膜上皮细胞从角巩膜缘区域逐渐向角膜中心迁移,位于角膜顶端的上皮细胞在细胞外间隙彼此形成紧密连接,从而限制药物通过细胞旁间隙的渗透作用[4]。有研究证明,亲脂性药物较亲水性药物具有更高的角膜上皮通透性[5],同时, 经角膜途径由泪液进入前房也是滴眼剂药物作用径路中的主要路线。通常来说, 结膜上皮较角膜具有更高的可渗透性, 同时其表面积数倍于角膜,即使是亲水性药物和大分子药物同样可较好地渗透结膜。目前, 通过球结膜的给药方式正在得到更多的关注,使得较大的生物有机复合物如蛋白质, 多肽类型的药物均可通过该途径发挥作用。由于临床用眼表滴眼剂多以亲脂性,小分子为主, 故经角膜径路在目前的临床应用中仍然是相对主要的。

1.3 血眼屏障引起的药物流失

血眼屏障保护眼免受血流中外源性化学物质的作用。该屏障包含两部分:血房水屏障和血视网膜屏障。前部血眼屏障由葡萄膜内皮细胞构成, 防止血浆白蛋白进入房水, 同时限制亲水性药物分子由血浆进入前房。在眼的炎症状态下, 该屏障的完整性可受到破坏, 药物可在前房发生浓集。后部血眼屏障由视网膜色素上皮细胞及视网膜血管壁构成。不同于视网膜毛细血管,脉络膜血管的血流量较大,血管通透性较高。药物可轻易进入脉络膜血管的外间隙,但较难通过视网膜色素上皮层及视网膜内皮细胞层。同时,脉络膜脉管系统是构成全身血流的一部分, 因此, 若没有较好的药物导向, 或未应用口服药物或静脉给药的方式,仅可使极少量的药物进入视网膜和脉络膜发挥作用。另外不同于血脑屏障的是,在血眼屏障的研究中并未发现特异性的代谢酶表达及药物转导机制, 在其解明之前更多的研究有待进行。

2 眼用制剂局部药代动力学研究的意义

药物角膜接触时间是决定药物进入前房组织 (即, 角膜、房水、睫状体等)剂量的一个重要因素。用于结膜囊或置于巩膜-结膜表面的药物剂型(如凝胶、软膏、胶体形成溶液、眼内插入剂、穹隆部装置等)很难直接通过结膜吸收使眼内靶组织达到有效的药物浓度。因此对于那些不直接与角膜接触的药物剂型, 其药物浓度必然被泪液稀释, 而后透过角膜达到前房组织。此时药物能否在靶组织达到有效浓度取决于以下因素：1.药物在泪液中的浓度；2.该药物浓度在泪液中持续的时间；3.药物通过角膜的被动转运；4.药物通过角膜的主动输入及输出；5.药物在各组织的分配系数和扩散常数；6.药物代谢和消除速率[6]。

对于固定药物来说, 上述3-6是不变的；因此对不同剂型, 药物能否在靶组织达到有效浓度, 取决于因素1和2。因此, 通过对比同一药物的上市剂型与新剂型间药物在泪液中的浓度及持续时间, 对于分析后者是否较前者延长角膜接触时间和改进药物吸收, 有明确的借鉴意义。由于泪液中药物浓度与房水中药物的有效浓度之间的关系尚无法计算, 因此泪液分析, 对确定新剂型较上市剂型的有效性改善和有效作用时间的改善并不是最权威的方法。通过在动物中进行该项研究,或通过体外试验, 以证实泪液中药物浓度与房水中药物的有效浓度之间的关系, 目前也是不可取的。通过检测泪液中药物浓度, 证明增加与角膜的接触时间仅对改善有效性和增加有效性持续时间有提示作用。

3 眼部药代动力学样本采集

不同的药物及给药系统需要采取不同的方式和时间取材，泪液可以采用毛细玻璃管、称重滤纸条或棉球法取样，眼内组织液可以通过穿刺或微渗吸法取样，其余眼组织则可以直接取样匀浆，传统的眼部药代动力学研究组织取材时需要解剖分离眼部各靶组织，操作复杂、要求精确。动物模型中药代动力学研究大多是在兔眼内进行，与其他实验动物相比，兔眼的生理解剖参数和人眼较为接近，而且对药物不同的理化性质和组分敏感，含有的色素可用于药物毒理学的研究，但药物与眼内色素结合并不意味着药物的毒性增加[7]。猴眼与人眼的解剖和生理则更加接近，而且存在黄斑结构，也经常被用于药理实验，但是某些组织病理学的过程仍然与人类有所不同，在用于评价与其相关的药物反应时应注意其影响[8]。另外，还可以使用狗、豚鼠、牛、大鼠等动物用于实验。实验时应注意并说明所选择动物的品种、年龄及体重。由于组织的特殊性和医学伦理学原因，在人眼进

行的药代动力学研究有限，人眼中可以方便提取的只有泪液，另外还可在手术中提取部分角膜、房水、玻璃体等组织用于检测。如Horcajada等[9]采用局部和全身给予抗生素利奈唑胺后，在不同时间点进行玻璃体切割手术抽取玻璃体组织的方法研究其在眼内的药代动力学行为。由于病理与生理状态下眼组织代谢的差异，上述方法不能完全获得药物在眼内真实的药代动力学结果。

药代动力学参数的计算是通过不同的时问点药物浓度描绘的时间-浓度曲线确定，所以时间点的确定对药代动力学的结果有着决定性的影响。由于眼组织多数情况下无法连续采集组织样本，所以只能设置不同的时间点和不同实验眼进行取样。完整的眼组织药物浓度-时间曲线应包括药物的吸收相、平衡相及消除相，采样点的设计应兼顾到此3个时相。通常需经过预先的动物实验，一般在吸收相至少2～3个采样点，峰浓度附近至少3个采样点，消除相至少3～5个采样点，一般不少于11～12个采样点，应有3～5个消除半衰期的时间或采样持续到血药浓度为血药蜂浓度的1/10～1/20，特别是对具有缓释、控释功能的长效制剂更应兼顾到消除相的检测。每个时间点至少有6只实验眼的数据，才能正确判断药物作用持续时间并为设计和优化临床给药方案提供有用的依据[10]。

微渗析法是一种利用膜透析原理，微量地对细胞间液进行流动性连续取样的技术。它已是神经递质取样分析的标准可靠方法，被广泛用于药物动力学、药物代谢、营养学、毒理学、生物化学及生理学等领域。由于微渗析取样法可多部位和多组分同时取样、连续活体取样、取样量少、取出样品杂质少、分析条件更接近体内条件、且可实现在线分析等特点也被引入眼科多种给药系统的研究[11]。

4 眼部药代动力学分析方法

传统的检测方法如色谱法和免疫学方法原则上适用于各种眼部给药方法的检测，并且灵敏度很高，但其要求精确分离取材眼部各组织并计量，对容易获得的眼部组织如泪液、角膜、房水、晶状体等适用，对于不易完整取材并精确分离的玻璃体、视网膜、脉络膜等组织药物浓度的测量有一定的局限。而且，其结果是一维的，要求在不同的时间点处死不同的动物以获得连续的药代动力学结果，需要大量的实验动物和样本，在取材过程中也容易发生药物的再分布和样品间的交叉污染，增加了因动物个体差异及人为操作带来的误差和实验费用。另外，这些方法的人体样本通常只能通过眼科手术少量、随机的取材，因此也不易于临床

应用，尤其足健康人群内开展。而影像学检查法和拉曼分光镜检法可以非侵入性地在活体下连续观察模型，实时测定药物在眼内的分布和浓度，不会对眼组织的代谢带来干扰和造成药物的再分配，所以可以方便地进行人体试验，并且在正常和病理状态下的眼组织内均可进行。而且这些非侵入、实时、连续、活体的检测方法更好的减少模型的个体差异和人为操作带来的误差，减少实验对象的数量。其缺点是结果受限于检测方法本身对眼各组织的分辨率及代谢产物对药物的干扰，影响了其对眼药代动力学评价的灵敏度和准确性。因此，在进行药代动力学检测时应充分参考给药方法、药物靶组织、药物代谢特征等因素选择合适的测定方法，或者将几种方法联用。互为补充和验证。

4.1 色谱法

色谱法是利用不同物质在不同相态的选择性分配，以流动相对固定相中的混合物进行洗脱，混合物中不同的物质会以不同的速度沿固定相移动，最终达到分离的目的，包括高效液相色谱法、气相色谱法和色谱一质谱联用法(如气相色谱．质谱联用法、液相色谱质谱联用法、液相色谱一串联质谱法等)。目前生物样品的分析一般首选色谱法，这类方法的灵敏度、特异性、准确性一般都能满足临床药代动力学研究的需要。高效液相色谱法是目前最常用的方法，可用于大多数药物的检测，大部分实验室也具备相应条件，因此应用最为广泛。眼部给药系统的研究也多采用这种方法。它可以精确、灵敏地检测出泪液、角膜及房水等组织中药物浓度。张俊杰等[12]利用高效液相色谱法测定0.2%更昔洛韦滴眼液及其原位胶化滴眼液滴眼后泪液、角膜、房水中的药物浓度，证实原位胶化滴眼液的组织浓度明显高于普通滴眼液，可以显著提高更昔洛韦的眼部生物利用度。

4.2 免疫学方法

免疫分析检测的原理是利用待测物质(抗原或抗体)与其相对应物质(抗体或抗原)之间专一的免疫亲和力作用，以不同标志物测定待测物质的多寡，而达到检测目的。常用于眼科的有放射免疫分析法、酶免疫分析法。放射免疫分析法是利用放射性同位素标记的体外微量分析方法。优点是灵敏、特异、简便易行、用样量小，缺点是有时会出现交叉反应、假阳性反应，组织样品处理不够迅速，有放射性副损伤、污染环境等[13]。酶免疫分析法是以酶作为标记物的免疫测定方法。一般将抗原或抗体吸附于固相载体进行免疫酶反应，底物显色后用分光光度法进

行检测。其优点是避免对人体的放射性伤害、环境的污染，产生的信号用普通的紫外分光光度计就可测定，不需昂贵的仪器设备，灵敏度和特异性高、重复性好，可批量测定。但是它不能同时测定代谢物，具有抗原决定簇的代谢片段可能会增加实验结果误差，且会受到内源性物质的干扰[14]。

4.3 影像学方法

随着影像学的发展，更多的影像学技术被用于药代动力学的研究中，如X 线计算机断层扫描、电子顺磁共振光谱法、分子成像、正电子发射断层扫描术、单光子发射计算机断层扫描术及磁共振等瞪矧。眼科也紧随各种研究手段的进展，寻找无创的、连续的、更加接近生理状态下的检测方法，随着二维、三维及四维磁共振的应用，以及分子生物学、计算机处理技术的发展，眼科利用磁共振技术(magnetic resonance imaging，IMR)检检测药物浓度，成为一种新兴的眼部药代动力学检测方法。如Kim等[15]利用MRl测定钆喷酸葡胺(gadolinium diethylenetriamine pentaaceficacid，Gd_ DTPA)聚合物种植体在兔眼玻璃体内的释放过程，将即时测得的与校准样品的MRI数据的强度值作比较转化为药物的浓度值。这种实时、无创的检测方法是眼部药代动力学检测的理想手段，对眼组织的干扰最小，是检测结果最接近眼药代动力学数学模型理论值的方法之一。但是，由于现有技术的限制，MRI本身的空间和时间分辨率会影响所得数据的精确性，对药物测定的灵敏度相对色谱技术要低，且研究的药物需要造影剂做标记，另外，对于同样携带标志物的原药及其代谢产物，MRI技术也不容易分辨。

4.4拉曼分光镜

拉曼分光镜从20世纪70年代开始广泛应用于眼科，也是一种非接触、非侵入地检测眼内药物浓度的方法，其原理是不同的分子有特征性的振动频率，而拉曼分光镜恰可检测到这种特异性的振动。例如La Via等[16]利用拉曼光谱仪聚焦于含有两性霉素B的实验兔眼前房，收集药物的特征性光谱，由于药物光谱峰值的高度和药物的浓度呈线性相关，由此可计算出不同时间眼内的药物浓度。其优点是可实时、灵活、非侵入性的在活体内检测眼内药物浓度，更适用于眼内植入物或者生物降解材料的长期观察，并且随着设备和软件的更新和进步，低浓度的化学药物也可被精确测定。其缺点是测定时可有不同振动峰重叠和拉曼散射强度容易受光学系统参数等因素的影响，而且并不是每一种药物都有特征性拉曼光

谱，在操作时激光的能量、聚焦平面以及暴露时间需严格限制在可接受的安全范围内以避免眼组织损伤。另外，使用共聚焦显微镜、扫描电镜等方法也可以观察药物代谢，尤其对微粒体包埋的药物，其他可以直观地观察药物在眼部组织的分布，但均不能进行定量的分析[17]。

5 展望

综上所述,目前许多眼部药物动力学实验都是直接通过体内或体外实验的方式,采取局部或全身用药, 观察药物在眼部的浓集情况。这些实验常的进行,提供了眼部药物动力学的基础研究信息。另外，还有眼部药物动力学的研究则包括了与药物理化性质有关的渗透性实验。这些实验主要在基础科研部门进行,其研究则围绕着药物通过角膜,结膜及巩膜组织的被动弥散作用。随着越来越多的相关实验研究的开展, 眼部的药物代谢动力学及药物的安全应用得到越来越多的重视, 通过相应的实验诊断技术及新剂型的不断开发,我们对眼部的给药系统的认知将更加完善,从而更好地应用于临床疾病的诊治。

参考文献

[1] A. Urtti, L. Salminen. Minimizing systemic absorption of topically administered ophthalmic drugs[ J]. Surv. Ophthalmol, 1993, 37: 435-457.

[2] Ripalgaudana, J. Jwala. Recent Perspectives in Ocular DrugDelivery [J]. Pharmaceutical Research, 2009, 26: 1197-1126.

[3] Keransvr, Williams RL. Drugdelivery systemsfor theeye [J]. Expert RevMedDevices, 2009, 6(3): 277-90.

[4] M. Hornof, E. Toropainen, A. Urtti. Cell culturemodelsof theocular barriers[J]. Eur. J. Pharm. Biopharm, 2005, 60: 207-225.

[5] H. S. Huang, R. D. Schoenwand, J. L. Lach. Corneal penetration behavior of beta-blockers[J]. J. Pharm. Sci, 1983, 72: 1272-1279.

[6] NelsonWL, Fraunfelder FT, Sills JM, et al. Adverse respiratory and cardiovascular eventsattributed to timololophthalmicsolution, 1978-1985[ J]. AmJOphthalmol, 1986; 102: 606-611.

[7] Short BG．Safety evaluation of ocular drug delivery formulations:techniques and practical considerations．Toxicol Pathol，2008，36：49-62．

[8] Sinha DP，Cartwright ME，Johnson RC．Incidental moilollucle cell infiltrate in the uveaof cynomolgnsmonkeys．Toxicol Pathol，2006，34：148-151．

[9] Horcajada JP，Atienza R，Sarasa M，et a1．Pharmacokinetics of linezolid in human non-inflamed vitreous after systemic administration．J Antimierob Chemother．2009,63：550-552．

[10] 陈租基．重视眼部给药系统的研究．中华眼科杂志，2006，42：292-295．

[11] Janoria KG，Boddu SH，Wang Z，et a1．Vitreal pharmaeokinelics of biotinylated ganciclovir：

role of sodium-dependent multivitamin transporter expressed ogl retina．J Ocul Pharmacol Ther，2009，25：39-49．

[12] 张俊杰，高长凤，王丽娅．更昔洛韦原位胶化滴眼液兔眼部药物动力学及生物利用度研究．中华眼科杂志，2006，42：637-641．

[13] FujitaE，TeramuraY，MitsugiK，et a1．Absorption，distribution，andexcretion of14C-labeled taerolimus(FK506)after a single or repeated ocular instillation in rabbits．J Oeul Pharmacol Ther，2008，24：333-343．

[14] Krohne TU，Etern，Holz FG，et a1．Intraocular pharmacokinetics ofbevacizumabafter a single intravitreal injection in humans．Am J Ophthalm01．2008，146：508-512．

[15] Kim H，Lizak MJ，Tansey G，et a1．Study of ocular transport of drugs released from an intravitreal implant using magnetic resonance imaging．Ann Biomed Eng，2005，33：150—164．[16] La Via wV，Idmb JL，Pelletier MJ，et a1．Measurementof amphotericin B concentration bv resonant Raman spectroscopy．A novel technique that may be useful for non-invasive monitoring. Med Myc01．2006，44：169．174．

[17] Bourges JL，Gautier SE，Delie F，et a1．Ocular drug delivery targeting the retina and retinal pigment epithelium using polylaetide nanopartieles．Invest Ophthalmol Vis Sci，2003，44：3562-3569．