大鼠Langendroff离体心脏局部缺血再灌注模型建立及功能评价
2013年12月
第23卷第12期中国比较医学杂志CHINESE JOUＲNAL OF COMPAＲATIVE MEDICINE December ，2013Vol．23No．12
［基金项目］国家自然科学基金（81273691）。
［作者简介］陈婵娟（1985－），女，在读博士生，主要研究方向：中医气血痰瘀理论在心血管疾病中的应用及中医药对心血管疾病的预防与
治疗。E-
mail ：ccjqlgcj@126．com 。［通讯作者］鲁卫星（1959－），男，主任医师，博士生导师，主要研究方向：中医气血痰瘀理论在心血管疾病中的应用及中医药防治心血管
疾病的研究。E-mail ：weixinglu918@sina．com 檵檵檵檵檵
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殝。研究报告大鼠Langendroff 离体心脏局部缺血
再灌注模型建立及功能评价
陈婵娟1，潘昡1，赵明镜2，鲁卫星
3（1.北京中医药大学，北京100029；2.北京中医药大学东直门医院，北京100007；
3.北京中医药大学第三附属医院心内科，北京100029）
【摘要】目的建立大鼠Langendorff 离体心脏局部缺血再灌注模型的方法并进行功能评价。方法将26
只Wistar 大鼠随机分成2组，对照组（control ，n =12）和模型组（model ，n =14）。两组均建立标准的Langendorff 离
体心脏灌注模型：K-H 液持续灌注（95%O 2+5%CO 2过饱和，左心室插入球囊压力管），
K-H 液持续灌注平衡20min 后对照组K-H 液持续灌注105min ；模型组同对照组平衡20min 后穿线结扎冠状动脉左前降支第一对角支下
缘部位，
造成局部停灌（缺血）30min ，而后剪断结扎线复灌（再灌注）75min 。伊文思蓝、TTC 染色观察心肌梗死、缺血面积；记录左心室压力及心率变化过程，比较各组平衡20min 、局部缺血30min 、再灌15min 、再灌30min 、再灌
75min 的血流动力学指标及灌流液中肌酸激酶（creatine kinase ，CK ）和乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase ，LDH ）漏
出量。结果对照组血供正常，模型组局部缺血、梗死明显；对照组、模型组平衡末心肌酶学及血流动力学各参数
无明显差异（P ＞0.05），模型组局部缺血、再灌注各个观测时刻心肌酶学及血流动力学参数均与对照组有显著差
异（P ＜0.05），说明模型组经历局部缺血、再灌注损伤，心肌酶漏出明显升高，心脏收缩功能、舒张功能受损，心肌
耗氧量升高。结论大鼠Langendorff 离体心脏局部缺血灌注模型稳定可靠，掌握制作要点及注意事项后，可顺利
快速地成功制备，
为心肌局部缺血再灌注损伤的研究提供更接近临床疾病状态的实验途径。【关键词】大鼠；Langendorff 离体心脏；局部缺血再灌注；模型制备与评价
【中图分类号】Ｒ33【文献标识码】A 【文章编号】1671-7856（2013）12-0021-06
doi ：10.3969．j．issn．1671.7856.2013.012.006
Establishment and assessment of a Langendorff perfused
rat heart model of ischemia-reperfusion
CHEN Chan-juan 1，PAN Xuan 1，ZHAO Ming-jing 2，LU Wei-xing 3
（1.Beijing University of Chinese Medicine ，Beijig100029，China ；
2.Dongzhimen Hospital Affiliated to Beijing University of Chinese Medicine ，Beijig100007；
3.Department of Cardiology ，the Third Affiliated Hospital of Beijing University of Chinese Medicine ，Beijing 100029）
【Abstract 】Objective
To explore and summarize a Langendorff perfused rat heart model of ischemia-reperfusion．Methods Twenty-six Wistar adult rats were divided into two groups randomly ：control group （n =12）and model group
（n =14）．Each rat underwent open-chest surgery．The hearts were removed and immediately cannulated and effectively
perfused in Langendorff apparatus．A fluid-filled latex balloon was inserted via left atrium into the left ventricle for measurement of the left ventricular function．Hearts of the control group received continuous perfusion without ischemia for 105min．Hearts of the model group received20min continuous perfusion for stabilization and then underwent30min ischemia by left anterior descending coronary artery（LAD）ligation and75min reperfusion．Then Evans blue and TTC staining were used to observe the myocardial infarction area．Compared the levels of perfusate CK and LDH，hemodynamic index，heart rates of the control and model groups at different time points：end of20min continuous perfusion，end of30 min ischemia，reperfusion15min，30min and75min．Ｒesults Hearts of the control group showed normal blood supply，while the model group showed evident local ischemia and infarction．There was no significant difference between the control and model groups in myocardial enzymes and hemodynamic indexes at the end of20min continuous perfusion（P＜0.05）．In the rest of the time，the myocardial enzymology and hemodynamic indexes in the model group had significant differences compared with that of the control group（P＜0.05），which indicated local ischemia，reperfusion injury，and increased myocardial enzyme leakage，impairment of the heart systolic and diastolic function，and increase of myocardial oxygen consumption in the hearts．Conclusions Langendorff perfused rat heart models of ischemia-reperfusion is stable and effective．After mastering the surgical skills and keeping above attentions，the model can be established successfully and quickly．This model is more close to clinic conditions，and provides a new experimental approach in research of myocardial ischemia-reperfusion injury．
【Key words】Ｒat，Langendorff perfused heart；Ischemia-reperfusion injury；Model establishment；Model assessment
缺血再灌注损伤广泛存在于心、脑、肾、周围血管病等多种组织器官，是临床上缺血性心血管疾病的防治、心脏介入术疗效不佳和器官移植领域亟待解决的问题［1］。抗缺血再灌注损伤药物的研究和开发正处于实验阶段，由于大鼠的冠脉走形及血液循环途径上比较接近人类、冠状动脉侧支循环少，心肌缺血及梗死出现早，模型稳定性好，故大鼠在体心肌缺血再灌注损伤模型被广泛用于该病发生发展机制的探索、可行性干预措施的研究等［2］。由于离体心脏不受神经体液的调节，影响因素比较少，可控性及可复制性较强，是心肌缺血/再灌注形态、功能及电生理学研究的重要模型［3］。以往离体心脏缺血再灌注模型大多是全心停灌造模［4］，这与临床上冠心病心肌梗死介入术后再通的疾病状态有较大差异，不能达到模拟临床疾病状态的目的。本文采用26只Wistar大鼠建立Langendorff离体心脏模型，通过结扎冠状动脉左前降支造成离体心脏局部缺血再灌注模型，提供更接近临床疾病状态的离体心脏局部缺血再灌注模型的建立和功能评价的方法
1材料和方法
1.1材料
1.1.1实验动物：雄性Wistar大鼠26只，体重（300 350）g，由北京华阜康生物科技股份有限公司提供，许可证号：SCXK（京）2009-0007。
1.1.2药品：肝素钠（江苏常州千红生化制药股份有限公司）、戊巴比妥钠（美国Biotopped公司）、余市场分析纯均购于北京化学试剂公司及国药集团化学试剂有限公司。
1.1.3设备及材料：Langendorff（澳大利亚AD Instruments Pty Ltd实验室，ML870B2Langendorff System）、恒温水浴（LETIC公司，LE13206）、电子天平（上海精科天平厂，JA1003）、PH仪（上海精密科学仪器有限公司，PHS-3B）、蠕动泵（Gilson公司，Miniplus3）、多导生理仪（美国Biopac MP150）、医用二元气（95%O2+5%CO2）、带线缝合针（上海医用缝合针厂有限公司，规格圆3/8
2.5?85/0）、自制球囊及导管。
1.2实验方法
1.2.1Krebs-Henseleit重碳酸盐缓冲液的配置：以配置1LK-H液为例［5］：氯化钠118、碳酸氢钠25、氯化钾4.7、磷酸二氢钾1.2、葡萄糖11.1、硫酸镁1.2、无水氯化钙1.25（单位：mmol/L），将前6种分析纯依次溶于常温去离子水，氯化钙单溶后缓慢倒入，充分搅拌至完全溶解。调PH至7.3 7.4生理范围，定容至1L。
1.2.2分组及Langendorff模型制备
应用随机数字表法将26只雄性Wistar大鼠随机分为两组。取大鼠，称重，按1?103U/1kg腹腔注射肝素生理盐水，30min后充分肝素化，按1mL/ kg给予3%戊巴比妥腹腔注射麻醉。动物充分麻醉后，置于动物台上并固定。开胸暴露主动脉弓，轻提主动脉与无名动脉汇合处，从主动脉弓以下剪断
主动脉，提着主动脉断端，剪下完整的心脏，迅速放入预备好的平皿（内为0?K-H液），提前将蠕动泵调为7.5mL/min，排净Langendorff管路中气体，以免空气挤入主动脉，造成空气栓塞，立刻用眼科镊夹持主动脉管壁将灌注管道插入主动脉，置于主动脉瓣及冠状动脉开口上方，0号线系线固定，逆行灌注正式开始。将右心耳剪开一个小口以便灌流液流出。建立标准的Langendorff离体心脏灌注模型后［6、7］，保持恒定状态：恒温（38?）恒流（实时测冠脉流量CF为10?0.1mL/min）、95%O2+5%CO2混合气持续对灌流液进行鼓泡式氧合，测量灌注压为60 80mmHg。待心脏复跳且搏动良好，心律齐，剪开左心耳，经左心耳破孔、二尖瓣，将自制心室内压球囊测压管送入左心室，测压导管通过压力感受装置连接多导生理记录仪，记录全程心率（heart rate，HＲ）、左心室舒张终末压（left ventricular end-diastolic pressure，LVEDP）、收缩终末压（left ventricular end-systolic pressure，LVESP）等从而计算出左心室发展压（left ventricular developed pressure，LVDP）、左室内压下降最大速率（-dp/dtmax）、左室内压上升最大速率（+dp/dtmax）等心功能指标。模型组在放球囊之前穿线包绕冠状动脉左前降支，方法如下：以左冠状静脉主干（心大静脉）为标志，位点为冠状动脉左前降支第一对角支分支以下部位，目的是避免放置球囊之后穿线刺破球囊实验失败。
平衡20min待心脏收缩舒张功能恢复，心律齐，记录下正常指标作为基线，即可开始分组实验。入组标准：心律齐，心率（HＲ）≥220次/min且左室收缩压（LVSP）≥60mmHg［8］。对照组：K-H液持续灌注105min；模型组：穿线结扎冠状动脉左前降支第一对角支分支以下部位，造成局部停灌（缺血）30 min，而后开放结扎线复灌（再灌注）75min。整个实验过程中各组均K-H液持续灌注。全程记录左心室压力及心率，测量各组平衡20min、局部缺血30 min、再灌15min、再灌30min、再灌75min的冠脉流量及灌流液中心肌酶学指标CK、LDH。
穿线结扎冠状动脉左前降支方法有垫线法和推管法，均可达到闭塞冠脉左前降支造成局部心肌缺血和复灌的效果。日常必须维持Langendorff系统的管道完整、密封、清洁和畅通。实验全程中压力感受装置应固定位置，避免改变位置造成的压力测量标准的变化；应时刻维持恒温储液罐中K-H液的量，尽量使药液提前氧合，避免断液、断气。
1.2.3统计学方法：采用SAS11.0统计软件，计量资料用均数?标准差（珋x?s）表示，组内采用单因素方差分析，组间采用独立样本t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。
2结果与分析
2.1TTC染色（n=4）与伊文思蓝与TTC双染色（n=4）
伊文思蓝（Evans blue）是血流依赖性染料，正常心肌血供好，被染为蓝色，否则无蓝色。对照组持续灌注105min、模型组局部缺血30min、再灌注75min后分别经主动脉逆向注入1%伊文思蓝2mL 行心肌染色（时间约30s），而后正常心肌被染成蓝色，而缺血和梗死心肌染色阴性，可将正常心肌与损伤心肌（包括缺血心肌和梗死心肌）区别开来，尚不能区分缺血心肌和梗死心肌，为了更进一步区分缺血心肌和梗死心肌，必须进行TTC染色［9］。2，3，5-氯化三苯基四氮唑（2，3，5-triphenyltetrazolium chloride，TTC）是脂溶性光敏感复合物，因染色后颜色较易观察且灵敏性高而被广泛用于研究离体心脏缺血/再灌注损伤中［10］。因为TTC在脱氢酶完整的组织（正常和危险心肌）内形成红色沉淀，因此存活心肌染成砖红色，梗塞心肌由于缺乏完整的脱氢酶系统，因而不染色，可区分梗死心肌与正常和缺血心肌。充分染色后迅速剪下心脏，低温生理盐水冲洗后将左心室切成厚约2mm的切片。血供正常心肌呈蓝染，缺血心肌呈砖红或苍白。将心肌置于37?10%TTC中水浴15min。正常心肌呈蓝色，缺血区未梗死心肌呈红色，梗死心肌组织为白色。切片进行数码照相，图1见封三。
对照组持续灌注105min、模型组局部缺血30 min、再灌注75min后迅速剪下心脏，低温生理盐水冲洗后将左心室切成厚约2mm的切片，置于37?10%TTC中水浴15min。正常心肌呈红色，缺血区心肌呈白色［9］。切片进行数码照相，图2见封三。
2.2心肌酶学参数
肌酸激酶（CK）和乳酸脱氢酶（LDH）是心肌细胞胞质中存在的两类酶，当细胞膜通透性增加时这些物质能透过胞质释放到冠状动脉中。血清（本实验中为灌流液）磷酸肌酸激酶（CK）、乳酸脱氢酶（LDH）的变化可作为判断心肌缺血/再灌注损伤程度及预后的重要指标［11］。组内方差分析得出：对照
组5个时刻CK无统计学差异（P=0.053＞0.05）且两两比较P＞0.05，差异无统计学意义；对照组5个时刻LDH差异有统计学意义（P=0.028＜0.05），其中平衡灌注20min与局部缺血30min、再灌注15 min、30min、75min差异比较有统计学意义（P= 0.06/0.07/0.09/0.22＜0.05），提示平衡灌注20 min时的LDH高于局部缺血30min、再灌注15 min、30min、75min等4个时刻的LDH，原因可能为摘取心脏手术造成一定的心肌损伤，这种损伤在平衡灌注过程中逐渐恢复。模型组5个时刻CK、LDH 不全相等（P=0＜0.01），其中平衡灌注20min与局部缺血30min（P=0.768/0.802＞0.05）、再灌注15 min与再灌注30min（P=0.326/0.459＞0.05）、再灌注30min与再灌注75min（P=0.211/0.175＞0.05）差异无统计学意义，其他时刻CK、LDH两两比较差异均有统计学意义。统计结果结合原始数据提示从局部缺血30min时CK、LDH开始出现上升趋势，但平衡灌注20min与局部缺血30min的差异无统计学意义；从再灌注15min往后差异有统计学意义，说明造成心肌损伤CK、LDH显著升高的主要原因不是局部缺血，而是再灌注损伤；CK、LDH值在再灌注15min出现高峰，但是再灌注15min与再灌注30min、再灌注30min与再灌注75min差异无统计学意义，说明缺血再灌注损伤持续存在，随再灌注时间减轻不明显。
对照组平衡灌注20min CK、LDH与模型组平衡灌注20min CK、LDH相比，差异无统计学意义（P =0.620/0.368＞0.05）。对照组局部缺血30min （假手术）CK、LDH与模型组局部缺血30min CK、LDH相比，有显著差异（P=0＜0.01）。模型组再灌注15min、30min、75min CK漏出量均显著升高，在再灌注15min达到高峰，与对照组再灌注15min、30min、75min CK漏出量相比较差异显著（P＜0.01）。模型组再灌注15min、30min、75min LDH 漏出量均显著升高，在再灌注15min达到高峰，与对照组再灌注15min、30min、75min LDH漏出量相比较差异显著（P＜0.01）见表1。这一现象与既往研究相符［11，12］，证实造模成功有效。
2.3血流动力学参数
在心功能指标方面，LVEDP、-dp/dtmax反映左心室舒张功能，LVDP、+dp/dtmax反映左心室收缩功能，HＲ反映心脏的氧消耗［13、14］。对照组与模型组平衡灌注20min LVDP、+dp/dtmax、-dp/dtmax、HＲ无差异，说明两组基线一致，有可比性。对照组5个时刻LVEDP、LVESP、LVDP、HＲ、?dp/dtmax之间差异无统计学意义（P＞0.05）。模型组平衡灌注20min LVEDP与其他时刻差异显著（P＜0.05，P＜0.01），其他4个时刻之间差异无统计学意义（P＞0.05）。模型组局部缺血30min LVESP与平衡灌注20min、再灌注15、30、75min差异显著（P=0.001/ 0.022/0.011、0.038＜0.05），平衡灌注20min、再灌注15、30、75min这4个时刻之间LVESP差异无统计学意义（P＞0.05），考虑原因为舒张末压力与心脏物理状态关系密切，局部结扎缺血时左室壁部分心肌被捆绑在一起，舒张末压力升高。模型组平衡灌注末心率与其他时刻差异显著（P＜0.01），其他4个时刻之间差异无统计学意义（P＞0.05），说明无论缺血损伤还是再灌注损伤均会造成心肌耗氧量升高。模型组平衡灌注20min的?dp/dtmax与其他时刻差异显著（P＜0.05，P＜0.01），其他4个时刻之间?dp/dtmax差异无统计学意义（P＜0.05）。
对照组与模型组局部缺血30min、再灌注15、30、75min的各项血流动力学参数均有显著差异（P ＜0.05，P＜0.01）。模型组局部缺血30min、再灌注15、30、75min的LVEDP、-dp/dtmax均降低，反映模型组左心室舒张功能下降；模型组局部缺血30 min、再灌注15、30、75min的LVDP、+dp/dtmax均降低，反映模型组左心室收缩功能下降；模型组局部缺血30min、再灌注15、30、75min HＲ升高，反映模型组心脏的氧消耗增加（表2）。
表1各组不同时刻灌流液心肌酶CK、LDH含量比较
Tab．1Comparison of the level of perfusate CK and LDH in various groups at different time points
参数Variables
组别
Groups
数量
n
平衡灌注20min
Continuous perfusion
局部缺血30min
Ischemia
再灌注Ｒeperfusion
15min30min75min
肌酸激酶C823.19?18．56 5.68?2．58 5.26?4．77 6.65?13．188.73?13.03 CK（IU/L）M1028.65?25．5216.44?4．33AB250.4?109．66AB151.88?65．57AB107.78?81.87Ab 乳酸脱氢酶C87.43?7．65 1.13?1．41B 1.21?1．52B 1.48?3．73B 2.28?4.01b LDH（IU/L）M1010.91?8．15 5.96?1．14AB99.9?59．72AB57.07?26．91AB37?30.33Ab
注：组间比较，a表示P＜0.05，A表示P＜0.01；组内比较，b表示P＜0.05，B表示P＜0.01。
Note：Comparison between the two groups：a：P＜0.05，A：P＜0.01．Comparison in the same group：b：P＜0.05，B：P＜0.01．
表2各组不同时刻血流动力学参数比较
Tab．2Comparison of the changes of hemodynamic parameters in various groups at different time points
参数Variable
组别
Groups
数量
n
平衡灌注20min
Continuous perfusion
局部缺血30min
Ischemia
再灌注Ｒeperfusion
15min30min75min
LVESP C874.90?9．1575.79?7．1174.39?3．1769.34?2．7271.40?4．10 M1082.76?9．9964.82?9．54aB59.35?6．89AB55.71?8．02AB53.14?9．11AB LVEDP C87.63?2．14 5.81?0．74 6.71?1．25 5.58?0．99 5.89?0．85 M108.58?1．4914.50?3．24AB10.65?4．30ab10.21?4．21Ab11.02?4．08Ab LVDP C867.28?11．1469.97?7．4167.68?2．9663.76?2．0465.51?3．53 M1074.18?10．1850.32?11．40AB48.71?8．40Ab45.51?8．80Ab42.11?8．94Ab HＲC8265.83?14．06280.73?25．85288.11?30．16335.30?46．77269.34?13．53 M10283.62?31．00317.59?26．10AB320.36?32．83aB320.09?35．66B319.77?34．77AB +Dp/dtmax C8732.08?112．78796.48?74．75801.24?40．08754.38?17．84805.48?57．38 M10824.29?96．52613.84?99．01Ab593.10?2．57Ab577.05?92．85Ab540.70?93．91Ab -Dp/dtmax C8670.90?135．46716.32?112．08723.86?46．85703.84?27．84729.86?29．79 M10608.62?526．27573.52?98．70aB528.72?124．18AB533.40?99．44AB498.95?96．72AB
注：左心室收缩末期压LVESP（mmHg），左心室舒张末期压LVEDP（mmHg），左心室发展压LVEDP（=LVESP-LVEDP，mmHg），心率HＲ（次/ min），左心室压力最大变化速率dp/dtmax（mmHg/s）、左心室压力最小变化速率dp/dtmin（mmHg/s）。组间比较，a表示P＜0.05，A表示P＜0.01；组内比较，b表示P＜0.05，B表示P＜0.01。
Note：Left ventricular end-diastolic pressure，LVEDP（mmHg），left ventricular end-systolic pressure，LVESP（mmHg），left ventricular developed pressure，LVDP（mmHg），maximum rate of left ventricular pressure rise，+dp/dtmax（mmHg/s），left ventricular pressure drop maximum rate，dp/ dtmax（mmHg/s）．Comparison between two groups：a：P＜0.05，A：P＜0.01．Comparison in the same groups：b：P＜0.05，B：P＜0.01．
3讨论
Langendorff离体心脏灌流由1895年德国生理学家Langendorff［15］发明，原理是采用主动脉插管逆行灌注，提供心脏营养物质，使心脏保持跳动。逆向灌注使主动脉瓣关闭，灌流液通过左右冠状动脉开口进入冠状动脉系统营养心肌后，除了少量直接进入心腔外，绝大多数通过心小、中、大静脉汇集到冠状静脉窦，最后经右心房（耳）、肺动脉和腔静脉断端排出［7］。该模型的优点是制备简单，操作方便，费用低廉；实验因素容易控制，稳定性好，重复性强［16］；无其他器官影响及神经体液调节，整体干扰因素较少，有利于单个实验因素研究［8］。应用Langendorff模型可将药物溶解于灌流液中给药，药物作用路径明确，药物剂量和浓度精确，可用于研究药物的量-效关系，适合于水溶性好、需要长期给药的心肌缺血再灌注药效学实验［17，18］。现使用Langendorff离体心脏灌流模型造成不同程度或不同等级的心肌缺血可以通过完全阻断（通过夹闭流入管道）或部分限制灌注液流速获得［19］。本实验目的是模拟冠心病局部心肌缺血、心梗介入术后心肌缺血再灌注损伤等临床疾病状态，研究局部心肌缺血再灌注损伤的药物作用途径，故选用心脏局部缺血再灌注模型，通过闭塞、开放冠脉左前降支造成局部心肌缺血和复灌。本实验证实：掌握制作要点及注意事项后，可顺利快速地成功制备，为心肌局部缺血再灌注损伤的研究提供更接近临床疾病状态的实验途径。
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〔修回日期〕2013-11-06
取小鼠脑组织
丁香园上面总结的方法，排版有点乱。 其实过程与大鼠近似，我的经验是： 1. 材料准备；大剪刀、眼科剪、眼科镊、大镊子、滤纸、竹签等； 2. 步骤：处死小鼠，取头颅； 剪开皮肤，漏出颅骨； 用大尖镊子夹住两侧眼眶，用眼科剪稍剪除颅骨中线； 再用眼科镊夹住颅骨从内向外夹，从下向上逐步去除颅骨； 当全脑露出时，再用眼科镊去除脑膜和血管； 然后用竹签从嗅球处向下取出全脑，即可。 3. 注意事项：用力轻柔，否则容易弄破脑部； 用剪刀剪颅骨时，一定要贴壁向上剪，否则容易剪破脑部； 去除脑膜时，不能硬拉，否则容易弄破大脑； 取出全脑时应把头顶朝下，用竹签轻轻取出，离桌面也不要太远、高； 若留病理，建议一定要取完整无损的大脑。 做免疫组化的话，稍微麻烦一点儿，因为脑组织含水量多，要固定的好，就需要先灌注。先麻醉小鼠 剪开胸腔，找到心脏，从心尖入针，剪开右心耳 先用生理盐水灌注直到从心耳流出来的水清亮了 再改用固定液（一般是4%多聚甲醛）灌注至小鼠四肢僵硬 小鼠只需要用注射器就行了，我做的25～35g的小鼠一般用50mLNS+30mL多聚甲醛。具体步骤：常规麻醉小鼠，将其固定，用剪刀剪开胸部皮肤，暴露出皮下组织，剪开时注意钝性分离，以免误伤。然后用镊子提起剑突，用剪刀剪开胸腔，剪断两侧肋骨，暴露整个胸腔，小心误伤肺及心脏、大血管。用镊子撕开心包膜，暴露心脏，用眼科剪剪开右心耳，然后提起心尖将准备好的生理盐水注射器插入左心室，注射，注射时小心针头滑脱。生理盐水灌流至肺和肝的颜色都变成灰白色即可。然后用多聚甲醛灌流，针孔最好是同一个，多聚灌流时小鼠四肢会抽搐，待抽搐结束，小鼠僵硬即可。取下小鼠，用剪刀在颈部离断头颅，用剪刀在小鼠头颅中间皮肤剪一刀，将两边皮肤向下翻用手捏住，暴露整个颅骨，用眼科剪从脊髓端插入椎孔，沿着颅正中线剪开颅骨，注意剪刀向上翘一些，以免误伤脑组织，剪开后用弯眼科镊分离颅骨，小心分离，直至暴露整个大脑，然后用弯镊伸入颅底离断颅底神经，就可以取出整个脑子了。放多聚里固定24h后包埋切片即可。 具体操作如下： 实验操作步骤： 1) 小鼠称重，以每克小鼠0.0025ml 4%戊巴比妥钠剂量的实施腹腔麻醉。也可以用10%的水合氯醛，3-5ul/g腹腔注射麻醉。 2) 将麻醉的小鼠仰放在操作台上，去毛。 3) 解剖小鼠，暴露心脏。 4) 找到心尖部，左手用镊子提起心尖部，右手或左手将灌流针刺破心尖部进针约0.5cm（最好是用小点的针头，用止血钳固定针尖，剪开右心耳。 5) 将灌流器的导管部开口放到生理盐水中里，打开灌流器灌流，直到从右心耳流出的液体为无色，同时小鼠肝脏色淡，肠管肿胀为止，停止灌流。没有灌流器的用注射器或者吊瓶都可以。
大鼠灌注固定的方法
大、小鼠灌注固定的方法 准备物品： 1、灌注针（灌注用的针可以是临床上的静脉套管针，便于穿刺） 2、医用输液器 3、500ml输液用玻璃瓶 4、血管钳 5、剪刀 6、生理盐水 7、4%多聚甲醛（4℃）,0.1M的PB配制 大鼠深度麻醉，迅速打开胸腔，暴露心脏，此时注意用血管钳钝性分离心包及周围软组织以便充分暴露心脏。左手持镊子捏住心脏，右手持套管针从心尖部位插入，向上进针到升主动脉。取出套管针内芯，连接生理盐水，打开输液开关，快速灌注，同时用剪刀在右心耳处剪一小口，待流出的液体无色后（约60ml即可）更换为多聚甲醛。多聚甲醛灌注速度为先快后慢，快速灌注50ml后放慢速度，缓慢滴注维持即可，每只大鼠约需100ml。如果多聚甲醛灌注充分，则动物四肢和全身肌肉会不停抽动。如此灌注约需1小时时间。 充分暴露升主动脉
套管针从心尖部位插入，向上进针到升主动脉 1、暴露心脏时要小心，速度要快，但不可损伤心脏及大血管，如果出现血液凝固或大血管损伤，灌流将失败。 2、最好是剖开右心室，但是因为暴露的问题，有误剪到左心室的可能。相对来说，剪开右心耳更为方便。我们就是这样做的。 3、灌流的效果：PBS或NS灌流时，血流丰富的脏器如肝脾肾等的颜色会迅速转为灰白，此为灌流正常。另外，大鼠耳尖，口唇，四肢掌部也会变苍白。 4、PBS或NS灌流需缓慢而持续，防止血液血管内凝固。有条件的话可加点肝素。 5、先主动脉插管，再右心耳放血，这样插管容易些。先剪右心耳的话，心脏会瘪下去的。小鼠灌注固定方法： 采用水合氯醛麻醉后剪开胸腔，动作要快，经左心室插入头皮针连接的20 mL注射器（头皮针磨钝，从与身体纵轴成45°角的方向进针，针尖插入升主动脉内，可以看见，动作要轻柔），同时剪开右心耳，推入20 mL 生理盐水。推完以后迅速换4 ℃多聚甲醛20 mL，灌完以后取材基本就可以了。
Removed_大鼠急性心肌缺血模型制备详细图解
模型的背景，心肌缺血模型分全心缺血和左心室缺血两种，全心缺血主要靠注射药物（如异丙肾上腺素等），左心室缺血主要靠手术对动物的冠状动脉左降支进行紧扎实现。由于左心室缺血对临床的意义更大，所以研究心肌缺血药物时这个模型是必须的。 （1）术前12小时给动物禁食 （2）将动物注射10%水合氯醛（0.4mL/100g）麻醉后固定在手术台上 （3）用笔型静脉置留针进行气管插管，插好后可用手术刀柄靠近气管，如果见气雾，就证明成功，连接动物呼吸机，参数为：呼吸频率85；呼吸比1：1；潮气量为18ml （4）胸部被毛、酒精棉消毒，在胸部左侧3~4肋间剪开皮肤，如图1 （5）分离肌肉露出肋骨，切口位置有两块肌肉，胸浅肌和胸深肌，注意按照肌肉的纹路分离可以避免将肌肉扯烂，如图2
（6）在第三根肋骨下用止血钳将肌肉分离开，然后左手用止血钳挑住肋骨，右手持剪刀剪开第三根肋骨，如图3
（7）用止血钳将剪断的肋骨夹住掰开，放入开睑器，用止血钳剥离心包膜，如图4
（8）用止血钳将胸腺（心脏上面白的像脂肪一样的东西）夹住拉出，如图5 （9）在左心耳与肺动脉圆锥间穿6~0号线，拉紧丝线，形成心肌缺血，观察线扎紧的部位上下大约2mm范围的心肌是发白色的，如图6
（10）闭合胸腔，注意将胸腔内的空气挤出（这点非常关键，这个模型最容易失败导致大鼠死亡的就是这个地方），对肌肉和皮进行缝合，挤空气的手法如图7
（11）结扎术后6小时可进行TTC染色：将大鼠脱颈处死，打开胸腔，将心脏剪下，用生理盐水将心脏清洗干净并排出心脏内的淤血，沿冠状沟将心房切除留下心室，用刀片将心脏切成1mm厚的切片，放入0.1%的TTC磷酸盐缓冲液（pH 7.4）37℃水浴7~10分钟，取出切片用生理盐水冲洗数次，观察结果。非梗死区因脱氢酶还原TTC而呈红色，梗死区因脱氢酶流失而呈白色，将梗死区和非梗死区分离并分别称重，梗死范围以梗死心肌占缺血心肌重量的百分比表示。下图是染色的结果，图8 结扎位置，梗死的地方其实肉眼大致能看出，和其他地方相比发白，图9：
大鼠Langendroff离体心脏局部缺血再灌注模型建立及功能评价
2013年12月 第23卷第12期中国比较医学杂志CHINESE JOUＲNAL OF COMPAＲATIVE MEDICINE December ，2013Vol．23No．12 ［基金项目］国家自然科学基金（81273691）。 ［作者简介］陈婵娟（1985－），女，在读博士生，主要研究方向：中医气血痰瘀理论在心血管疾病中的应用及中医药对心血管疾病的预防与 治疗。E- mail ：ccjqlgcj@126．com 。［通讯作者］鲁卫星（1959－），男，主任医师，博士生导师，主要研究方向：中医气血痰瘀理论在心血管疾病中的应用及中医药防治心血管 疾病的研究。E-mail ：weixinglu918@sina．com 檵檵檵檵檵 檵檵檵檵檵殝殝 殝 殝。研究报告大鼠Langendroff 离体心脏局部缺血 再灌注模型建立及功能评价 陈婵娟1，潘昡1，赵明镜2，鲁卫星 3（1.北京中医药大学，北京100029；2.北京中医药大学东直门医院，北京100007； 3.北京中医药大学第三附属医院心内科，北京100029） 【摘要】目的建立大鼠Langendorff 离体心脏局部缺血再灌注模型的方法并进行功能评价。方法将26 只Wistar 大鼠随机分成2组，对照组（control ，n =12）和模型组（model ，n =14）。两组均建立标准的Langendorff 离 体心脏灌注模型：K-H 液持续灌注（95%O 2+5%CO 2过饱和，左心室插入球囊压力管）， K-H 液持续灌注平衡20min 后对照组K-H 液持续灌注105min ；模型组同对照组平衡20min 后穿线结扎冠状动脉左前降支第一对角支下 缘部位， 造成局部停灌（缺血）30min ，而后剪断结扎线复灌（再灌注）75min 。伊文思蓝、TTC 染色观察心肌梗死、缺血面积；记录左心室压力及心率变化过程，比较各组平衡20min 、局部缺血30min 、再灌15min 、再灌30min 、再灌 75min 的血流动力学指标及灌流液中肌酸激酶（creatine kinase ，CK ）和乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase ，LDH ）漏 出量。结果对照组血供正常，模型组局部缺血、梗死明显；对照组、模型组平衡末心肌酶学及血流动力学各参数 无明显差异（P ＞0.05），模型组局部缺血、再灌注各个观测时刻心肌酶学及血流动力学参数均与对照组有显著差 异（P ＜0.05），说明模型组经历局部缺血、再灌注损伤，心肌酶漏出明显升高，心脏收缩功能、舒张功能受损，心肌 耗氧量升高。结论大鼠Langendorff 离体心脏局部缺血灌注模型稳定可靠，掌握制作要点及注意事项后，可顺利 快速地成功制备， 为心肌局部缺血再灌注损伤的研究提供更接近临床疾病状态的实验途径。【关键词】大鼠；Langendorff 离体心脏；局部缺血再灌注；模型制备与评价 【中图分类号】Ｒ33【文献标识码】A 【文章编号】1671-7856（2013）12-0021-06 doi ：10.3969．j．issn．1671.7856.2013.012.006 Establishment and assessment of a Langendorff perfused rat heart model of ischemia-reperfusion CHEN Chan-juan 1，PAN Xuan 1，ZHAO Ming-jing 2，LU Wei-xing 3 （1.Beijing University of Chinese Medicine ，Beijig100029，China ； 2.Dongzhimen Hospital Affiliated to Beijing University of Chinese Medicine ，Beijig100007； 3.Department of Cardiology ，the Third Affiliated Hospital of Beijing University of Chinese Medicine ，Beijing 100029） 【Abstract 】Objective To explore and summarize a Langendorff perfused rat heart model of ischemia-reperfusion．Methods Twenty-six Wistar adult rats were divided into two groups randomly ：control group （n =12）and model group （n =14）．Each rat underwent open-chest surgery．The hearts were removed and immediately cannulated and effectively
大鼠心肌缺血再灌注损伤动物模型的建立与评估_成玲俐
基金项目:广东省自然科学基金(06021338);广东省科技计划项目 (2007B031508003);佛山科技局(200808109) *通讯作者,Wushuhua168@https://www.360docs.net/doc/b07086465.html, 文章编号:1007-4287(2010)08-1163-03 大鼠心肌缺血再灌注损伤动物模型的建立与评估 成玲俐1,吴素华2*,李志梁1,唐 2 ,张 瑞1 (1.南海盐步医院,广东佛山528247;2.中山大学附属第一医院;3 南方医科大学珠江医院) 摘要:目的 改进和完善大鼠急性心肌缺血再灌注损伤动物模型的制备及评估。方法 健康SD 大鼠随机分为3组:假手术组(Sham 组),仅穿线,不结扎LAD;缺血组(Ischemia 组),单纯结扎LAD30min;缺血再灌注组(IR 组),结扎LAD30min,再灌注120min 。每组20只。并从造模成功率、心电图、外周血中LDH 、CK MB 的含量测定、心肌病理组织学检查等方面对改进后的模型进行评估。结果 改进后的造模成功率达到90%以上,血液动力学、心电图、外周血中LD H 、C K MB 的含量测定、心肌病理组织学检查等方式均证实改良后的动物模型成功。结论 改进后的方法能大大降低手术难度,提高模型成功率和动物成活率,准确地复制心肌缺血再灌注损伤的实验模型,简化实验操作步骤。 关键词:大鼠;心肌缺血再灌注;动物实验模型中图分类号:R541 4 文献标识码:A Im proving and Evaluating the Method of Establishing Rat Models of Acute Myocardial Eschem ia Reperfusion C HE NG Ling li ,WU Su hua,LI Zhi lian g ,et a l.(De p a rtment of Ca rdiovascula r ,Yanbu H osp ital o f Nanhai District ,Foshan 528247,China) Abstract:Objective To i mprove and evaluate the method of establishing rat models of acu te myocardial ischemiareperfusion,which had high rate of success and survive.Methods 60Sprague Dawley rats were divided into three groups at random:con trol group,Sham group and improved myocardial ischemia/reperfusi on group.The successful rate and the effectiveness of each group were observed.The hemodynamics,eletrocardiogram,Evans blue and TTC staining,myocardial enzyme spectrum and histology resul ts were used for evaluating the modified model.Results The successful rate of three groups were 90%,100%and 100%,respectively.The hemodynamics,eletrocardiogram,Evans blue and TTC staini ng ,myocardial enzyme spectru m and histology all tes tified that the models of modified method were results were successful.Conclusion The method of establish rat models of acu te myocardial ischemia reper fusion is simpleand convenient,with high successful rate and survival rate. Key words:Rats;Myocardial ischemia reperfusion;E xperimental animal models (Chin J Lab Diagn,2010,14:1163) 在动物体内阻断左冠状动脉前降支(LAD)造成急性心肌缺血,并在预定时间内恢复血供予以再灌注,是模拟人类缺血性心脏病恢复血供治疗必需的实验方法。由于大鼠在进化关系上比较接近人类,且其冠状动脉侧支循环少、心肌坏死出现早、心律失常发生率高、稳定性好,且大鼠制作模型费用低廉,从而成为制作心肌缺血再灌注损伤模型的首选,结扎大鼠LAD 形成心肌梗死是目前国内外公认的模型制备方法。但以往模型制备过程中存在诸多不便,如:手术时反复多次将心脏牵拉到胸腔外,造成动物死亡率增加,加大了实验成本,又加大了动物的创伤;阻断冠状动脉造成缺血后实现再通时,结扎线不易剪断,常导致左心耳破裂,引起心脏撕脱伤,造成大出血;文献报道冠状动脉的定位部位不一,会造成模型缺血损伤部位及损伤程度不一致等。参照不 同研究人员采用的模型制备方法[1],结合本实验室条件对该模型制作进行了改进,以提高模型制备成功率。现报告如下。1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 实验动物与分组 清洁级SD 大鼠,体重220-260g,雄性,合格证号:SC XK(粤)2008-0020。由广州中医药大学实验动物中心提供。将大鼠随机分为3组:假手术组(Sham 组),仅穿线,不结扎LAD;缺血组(Ischemia 组),单纯结扎LAD30min;缺血再灌注组(IR 组),结扎LAD30min,再灌注120min 。每组20只。 1.1.2 主要仪器和器械 动物呼吸机ALC V8(上海奥尔科特生物科技有限公司),澳大利亚产Power lab16导生理记录仪,无创缝合针(上海医菱医疗器械有限公司);黑色医用缝合线、lOml 一次性无菌注射器、各种手术器械,如止血钳、小无齿弯钳、小镊、小眼科剪等。 1163 中国实验诊断学 2010年8月 第14卷 第8期
大鼠心缺血再灌注实验设计
题目：不同药物对大鼠心缺血再灌注损伤的治疗作用 目的：观察抑制氧自由基生成药物（5-甲酰尿嘧啶）对大鼠心缺血再灌注损伤的治疗作用。 观察钙离子拮抗剂（硝苯地平）对大鼠心缺血再灌注损伤的治疗作用。 观察抗脂质过氧化制剂（维生素C或维生素E）对大鼠心缺血再灌注损伤的治疗作用。 原理：多数情况下，缺血后再灌注可使组织器官功能得到恢复，损伤的结构得到修复，患者病情好转康复；但有时缺血后再灌注．不仅不能使组织、器官功能恢复，反而加重组织、器官的功能障碍和结构损伤。这种在缺血基础上恢复血流后组织损伤反而加重，甚至发生不可逆性损伤的现象称为缺血再灌注损伤。 心缺血再灌注损伤是指心肌缺血后再灌注期间导致的心机细胞损害，其损害程度较心肌缺血本身严重，常表现为心肌细胞收缩功能减弱和心室顺应性改变，出现心律失常，心功能低下等现象。 心肌缺血再灌注损伤与氧自由基产生增多、钙超载、及白细胞的作用有关。 抑制氧自由基生成药（黄嘌呤氧化酶抑制剂——5-甲酰尿嘧啶）具有抑制氧自由基生 成的作用，减少氧自由基生成。钙离子拮抗剂（硝苯地平）可以阻断钙的慢通道，使细胞外钙的内流减少，从而降低胞浆钙离子，可起到减少MIRI的作用。抗脂质过氧化制剂（维生素C或维生素E）可以阻断脂质过氧化可1）抗白细胞粘附;（2）保护内皮功能;（3）抗血小板粘附、聚集及脱颗粒反应。有研究证实外源性维生素E可增加心肌梗死后大鼠血浆、心脏的维生素E含量，改善心功能，并减少大鼠的再灌注心律失常。 实验对象：大鼠4只，120-200g，体格健康雌雄不限。 器材和药品：手术刀，动脉夹4个，棉线，剪子，镊子2把，玻璃分针2个，注射器及针头2个，动脉插管器械，BL-420生物机能实验系统 药品：20%氨基甲酸乙酯0.5ml/g，5-甲酰尿嘧啶注射液，硝苯地平注射液，维生素C或维生素E注射液，肝素。 方法步骤：1、大鼠心再灌注损伤再灌注模型的制备 （1）取大鼠，称重，用20%氨基甲酸乙酯0.5ml/g腹腔注射麻醉，仰卧位固定。 （2）1%肝素0.2ml/100g从尾静脉注射。 （3）前胸，上腹部剪毛，沿肋缘下剪开腹前壁皮肤皮下筋膜，肌肉，纵向剪开胸前壁和横向剪开胸前壁暴露心脏。 （4）经主动脉插管 （5）找到左冠状动脉用动脉夹夹闭1分钟。打开动脉夹，血液重新供应，用BL-420实验技能系统记录，观察心律心室内压等的改变。
灌流取脑
大鼠灌注固定取脑 准备物品： 37℃的温生理盐水500ml、10%的中性甲醛或4%的多聚甲醛固定液500 ml、500 ml的输液瓶2个、输液管2副、三通1个,镊子、剪刀、止血钳各2把、灌注针(将12号注射用针头的针尖掐断磨钝圆、光滑即可)1个、麻醉剂、步骤 1)将两个输液瓶中分别装满生理盐水和固定液并将输液管安装在生理盐水瓶上并调整好,使管内没有气泡。 2)将动物麻醉,数分钟后,待动物前后肢放松,即可准备灌注。 3)将已麻醉的动物仰卧在解剖台上,固定四肢,用左手持镊子夹起腹部皮肤,右手持剪刀自腹部剪一小口,由此沿腹中线和胸骨剑突中线向上将皮肤剪至下颌,分离皮下组织,将皮肤翻向两侧,再沿腹中线和胸骨中线向上剪开胸骨,沿膈肌向两侧剪开,并用止血钳将胸骨和胸部的皮肤钳紧,将止血钳翻向外侧以充分暴露心脏。小心用镊子将心包打开,滴一些生理盐水保持湿润。 4)分离出主动脉,穿一根丝线,准备结扎灌针。 5)将左心室尖用眼科剪刀剪开一小口,将灌注针插入心室并送至主动脉内,用丝线结扎牢固,使之不能退出,打调节阀,灌注生理盐水,灌注时的灌流量约20 ml/分钟。时,剪开右心耳,使血液排出。观察肝脏逐渐变为白色为止 6)旋转三通使之对准灌注液,开始灌注固定液。固定液进大鼠血管后,逐渐出现四肢抽动,表明灌注液进入大鼠大脑,待抽动完全停止,全身组织器官变硬后即可取材。 7)取脑：枕骨大孔处用剪刀横断，小心地于枕骨大孔斜插入剪刀剪开顶骨，用止血钳掰断两边地顶骨，注意嗅球上地顶骨也要仔细去掉，用剪刀于一侧剪断视神经并探到颅底，就可以将整块的脑组织翘起。取出的脑在同样固定液中4℃再固定4-6小时。 8)保存或切片注意事项： 1、将灌注针插入主动脉内是灌注固定的关键,也是难点。首先准确找到主动脉,这是此步骤的要点。可用温生理盐水将胸腔内的血液冲洗干净,用眼科镊子轻轻夹住心外膜(夹的越少越好,以免影响取材)将心脏向左上方提起,即可看清主动脉,又可使灌注针很容易地插入主动脉内。插入时动作要慢,针尖方向不要偏向右侧,以免刺入右心房,如果感到有阻力,则将针退后、调整方向重新进针,直到进入主动脉,灌注针进入主动脉后可在心脏的上方看到其位置,灌注针进入主动脉的长度最好为3~5毫米,然后用丝线扎紧。切勿将灌注针放在左心室内,这样由于主动脉瓣的关闭,灌注液很难进入主动脉,而是沿着心室的切口流出,致使灌注失败。另外,灌注针插入成功后,一定要用剪刀剪开右心耳而不是右心室,这是灌流液的出口。剪开心尖的位置一定要掌握好,不能偏右使灌注针插入右心室。 2、配4％多聚甲醛PBS缓冲液：称取40g PFA溶于装有500ml DEPC水的玻璃容器（烧杯或烧瓶）中，持续加热磁力搅拌至60～65℃，使成乳白色悬液。用1.0mol/L的NaOH直至7.0，使呈清亮状（滴加），再加入约500ml PBS，充分混匀（在冰浴或冷水浴中），可再检测一下pH，过滤后定容至1000ml，室温或4℃保存备用。 加热至60～65℃固然融解的快，只需要15分钟左右，不过容易挥发，气味难闻，需配置的量比较大的时候是较合适的方法。如果有通风厨的可在通风厨内配置，就基本没有气味散发的问题。在通风较好的地方配置也可以，但配置的时候配溶液的人一定要注意自我防护，味道确实很刺激！。如果不着急，可先配好pbs，称好相应的多聚甲醛，37℃水浴或温箱密
成年大鼠心肌细胞培养方法的建立和形态学观察
成年大鼠心肌细胞培养方法 的建立和形态学观察 北京心肺血管疾病研究所细胞免疫室 许秀芳 李温斌3 陈宝田3 吕燕宁 赵莉敏 陈 燕 提要:为探索稳定的成年大鼠心肌细胞的分离和培养方法,应用生物酶(5g/L胰蛋白酶及1g/L胶原酶)灌注法分离成年大鼠心肌细胞,用形态学及台盼蓝染色法鉴定分离的心肌细胞,并在光镜和电镜下观察和摄像记录。结果:心肌细胞的存活率为91.7%;存活的心肌细胞静止地贴在培养板底上,细胞完整,呈杆状,长宽比约为4～6∶1。结果提示:该方法是比较理想的心肌细胞培养法。 关键词:成年大鼠心肌细胞;胰蛋白酶;胶原酶;分离技术 中图分类号:Q253;R322.1+1 自从1953年Durrows和Moscona首次成功地应用生物酶分离出鸡胚心肌细胞后[1],其分离培养技术不断发展,逐渐发展为3种分离方法:离体心脏灌注法、心肌细胞浸泡法和贴块培养法。对动物而言,离体心脏生物酶灌注法分离心肌细胞的质量及数量最佳。成年心肌细胞的分离较幼年及新生动物心肌细胞的分离更为困难,但成年心肌细胞做为一种生物学实验工具是其他心肌细胞不可替代的。国内仅有少数单位分离培养成功成年动物心肌细胞。1992年1月至1998年12月,我们建立了成年大鼠心肌细胞分离培养方法并进行了形态学观察。 1 材料和方法 1.1 材料 实验动物为成年Wistar大鼠,体质量150～200g,由本研究所实验动物室提供。 DM EM培养液、胰蛋白酶均购自美国GIBC公司;胶原酶购自美国Sigma公司;牛血清白蛋白购自美国BM公司;胎牛血清由金华生物制品公司提供;淋巴细胞分离液由中科院血液学研究所出品;安贞Ⅱ号心脏停跳液由本院体外循环组提供。 实验药物及试剂的配制:2%胎牛血清20 mL加DM EM培养液100mL,青霉素100mg/ L,链霉素100万U/L,p H7.2～7.4,过滤除菌。酶消化液:胶原酶0.1g加胰蛋白酶0.5 g、牛血清白蛋白1g,加入DM EM培养液100 mL,于使用前配制。 1.2 方法 采用离体心脏灌注法分离心肌细胞[2,3]。 Wistar大鼠腹腔注射2%戊巴比妥钠麻醉(含1∶200肝素45mg/kg),麻醉满意后胸腹部用75%乙醇消毒,“U”字形切开腹壁,快速剪断左右前腔静脉及后腔静脉,经升主动脉根部灌注4℃高钾安贞Ⅱ号心脏停跳液30mL,待心脏停跳呈灰白色后取下心脏,接在Langendorff 灌注架上,按下列步骤进行实验: 1)清洗心脏:用无Ca2+、Mg2+的D2Hank 液灌洗心脏5min即可;目的是解离桥粒和细胞间连结。由于Ca2+在心肌细胞连结上起重要作用,用无Ca2+的液体灌洗心脏能带走大量的Ca2+,心肌细胞间糖蛋白被破坏,桥粒和连结随之解离。 2)溶解细胞外基质:应用酶消化液37℃灌注,保持灌注压在4.90～7.84kPa(50～80 cmH2O)。 3)心肌细胞的释放:经一定时间(30～90 min)酶消化后,心肌细胞外基质大部分被消化,但细胞间连结如缝隙连结并没有完全断开,心脏仍保持大体形态,松弛状,机械作用才能将细胞分开。见心脏变软、呈暗红色,取下心脏,轻揉搅拌几分钟后剪下心室肌,剪成1mm3大 2000年 6月第21卷 第2期 首都医科大学学报 Journal of Capital University of Medical Sciences J un.2000 Vol.21 No.2 收稿日期:1999203209 3首都医科大学附属北京安贞医院心外科
大鼠灌注取脑
大鼠灌注取脑 用途： 1.用于常规HE染色，免疫组化分析。 2.冰冻切片可以不做脑组织固定。 3.不可用于western blot和PCR。 4.如果观察脑组织的缺血、损伤或其它病变时，不作灌注固定，而是在取出脑组织后作固定，将大大影响效果。 原理： 心脏灌流术能够快速冲净血液并在动物死亡前进行组织的前固定,避免了组织的自溶现象,是脑组织切片观察的常用方法。多聚甲醛使组织蛋白发生交联，以保持蛋白的原位和表面结构不变，从而能使其对应的抗体准确检测其表达位置和量。 必要性： 1.脑组织较软，且细胞成分不易保留，脑组织是较易软化的组织之一，血供也较为丰富，所以最好是在取脑组织前用4％多聚甲醛灌注固。 2.经前固定后，取脑操作时，可减少脑组织损伤。 3.脑内血液都在，HE染色后，可去除红细胞背景影响。 大鼠灌注取脑标准操作规程(SOP)： 流程： 1)麻醉2)开胸3)心脏左心室穿针,剪开右心耳4)生理盐水冲水5)4%多基甲醛固定6)取 脑7)保存或切片.
具体过程： 大鼠经深度麻醉后，固定于自制的手术木板上,置于解剖盘中,开胸暴露并游离出心脏,经左心室插入灌流针并固定, 切开右心耳,先灌注冰冻无菌生理盐水(4℃)XmL，直到肝和肺脏颜色转白及右心房流出液澄清,后再灌注冰冻(4℃)4%多聚甲醛XmL,断头取脑,多聚甲醛浸泡固定24小时。 Tips： 1.多聚甲醛的配置： 一般方法为：4％多聚甲醛PBS缓冲液配法：称取40g PFA溶于装有500mlDEPC水的玻璃容器（烧杯或烧瓶）中，持续加热磁力搅拌至60～65℃，使成乳白色悬液。用1.0mol/L 的NaOH值至7.4，使呈清亮状（滴加），再加入约500ml PBS，充分混匀（在冰浴或冷水浴中），可再检测一下pH，过滤后定容至1000ml，室温或4℃保存备用。 简便方法：先配好PBS，称好相应的多聚甲醛，37℃水浴或温箱密封放置2天，就能全溶。若是很急，55℃水浴一天，期间不时震荡。注意，4%的多聚甲醛需临用前配制,配制后需过滤去除小的杂质,避免心脏灌流时造成栓塞影响灌流效果。 2.制作灌注装置，用两瓶塑料包装的输液瓶装灌注液。同时配好输液器备用。 3.10％水合氯醛按4mL/100g的剂量腹腔注射麻醉动物。 4.沿两侧肋弓剪开皮肤，打开腹腔，用一血管钳夹持剑突并向上提拉，用弯剪在膈肌与胸骨柄相连处剪一小口，造成人工气胸，然后向两侧顺延，剪断膈肌及肋骨，夹持剑突的血管钳将剑突连带胸廓上翻固定，充分暴露心脏，直视下穿刺针左心室心尖处，用血管钳固定。 5.快速滴注生理盐水(室温)，同时剪开右心耳。约注入100~150mL，至流出液体血色较浅基本澄清，停止灌注。肝脏、眼珠、爪子迅速变白是排出血液的有效观察指标。
线栓法大鼠脑缺血再灌注模型制备方法-图文并茂
线栓法大鼠脑缺血再灌注模型制备方法 Pipilulu 目录： 第一部分线栓模型制备理论及经验 1插线法局灶性脑缺血模型简介 2大鼠颈部及颅内动脉解剖及常用插线位置 3大鼠大脑中动脉阻断实验的总结和心得（zhuqing0506战友） 4 也谈大鼠MCAO模型的实验体会（bladeflyer战友） 5 我的做MCAO模型的一些体会（intelligentwang战友） 6 线栓法大鼠脑缺血再灌注模型（MCAO）制备技巧（ysf2k战友）第二部分线拴模型制作过程（雨后天晴战友） 第三部分灌注取脑（pipilulu战友） 第四部分 TTC染色（pipilulu战友）
前 言 相信不少神经内科的研究生都作过或将要作大鼠线栓模型，都有一个从查文 献了解方法到跟师兄、师姐学习再到自己体会摸索直至熟练的过程，在模型制作 的过程中可能的经历了从模型不成功的郁闷到熟练后成功的喜悦（我们是有这样 的感觉）。为了缩短各位将要作或刚开始作MCAO 模型的战友的摸索过程，提高模型制作的成功率，我们愿意将自己的经验与大家分享，相信各位战友看过后将对制作大鼠线栓模型有更深的认识，并以其为乐趣，同时欢迎各位熟练的战友与我们交流经验。 第一部分线栓模型制备理论及经验 ⒈插线法局灶性脑缺血模型简介 八十年代Koizumi和Longa创用了不开颅的大鼠MCA可逆性脑梗塞模型，此后，应用插线法制备大鼠局灶性脑缺血再灌注模型的方法不断改进和完善，已渐趋成熟，目前该法已逐渐取代开颅法而成为最流行的方法。该模型先阻断颈外动脉（ECA）及其分支，且阻断翼腭动脉（PPA），以切断颅外来源的侧副循环血流。从ECA插入尼龙线，经颈内动脉（ICA）到大脑前动脉（ACA），机械性阻断大脑中动脉（MCA）发出处的血供来建立大脑中动脉缺血模型。此模型可在无麻醉状态下拔出尼龙线，恢复血流，实现再灌注。 1994年Huang等[55]首次将线栓技术应用于小鼠局部永久性脑缺血模型。1997年Hara 等[56]将线栓技术改进后应用于小鼠局部暂时性脑缺血模型。此后不断有学者借助于显微技术和多功能生理监测手段建立小鼠局部线栓脑缺血模型[57,58]。国内蒋晓帆等[59]，王芙蓉等[60]也对该方法进行了研究。 线栓法具有不开颅、效果肯定、可准确控制缺血及再灌注时间的优点，用于研究神经元对缺血的敏感性、耐受性，药物疗效观察以及再灌注损害和治疗时间窗较为理想，同时也具有对全身影响小、动物存活时间长的特点，适于慢性脑损伤的研究。控制好易变因素，可避免实验结果的不稳定性。但线栓造模也并非完美无缺，存在着下列不足：①线栓造模过程是非直视下的手术，血流是否完全阻断不能即刻得知。②动物品系、体重、批次会影响结果。动物饲养条件好的单位所繁育的动物，可以使影响程度降低。③操作者的科研训练影响结果。严格的训练和足够例数的实践可以复制出稳定的结果。④血管破裂出血。操作不小心极易刺破血管或拔线栓时引起出血。轻柔、精细的操作可以减少血管破裂的发生。
大鼠线栓(MCAO)模型+灌注取脑+TTC染色
第一部分 线栓模型制作 1、实验器材（从左到右）： 第一行：干棉球、酒精棉球、10％水合氯醛＋注射器、碘伏＋棉签 第二行：三种不同粗细的鱼线（鱼线最好在2.0、2.5mm处各用记号笔作好标记，便于观察进入距离）、弯盘内为手术器材 第三行：记号笔、自制拉钩（皮筋+曲别针＋大头针） 2、麻醉： 可用饮料瓶自制捕鼠器（适用于不敢手抓大鼠的），用于打麻药，根据大鼠的重量选择不同粗细的饮料瓶（太粗了大鼠可在瓶中回头）。 效果图
3、麻倒后绑在手术台上。 4、剪去颈前的鼠毛，碘伏消毒。 5、沿经部正中切开皮肤。 说明：切开皮肤前最好将结扎动脉的线事先剪好（后面会用到）。
6、钝性分离皮下组织。 如图：大鼠腹侧可见事先剪好的结扎线。 7、分离到气管前肌后，沿右侧胸锁乳突肌腱向下分离，见到颈动脉鞘后可上拉钩。
8、分离动脉鞘。 如图：分离好后见光滑的颈总动脉。 9、分离出颈总、颈外、颈内动脉，结扎颈总、颈外动脉，注意中间那根线不要系紧，用来插鱼线时防止出血的。
10、夹闭颈内动脉，用眼科剪将颈总动脉剪一小口。 11、插入鱼线，鱼线进入颈内动脉后按图中注释方法插（成功率在90%以上）。 说明： （1）这一步鱼线选择是关键，根据大鼠重量（作的多了后根据动脉粗细就可选择了）选鱼线。我们的经验是：250g以
下的选0.26mm的线，250-300g的选0.26mm蘸腊的或0.28的都可以。 （2）如果遇到鱼线怎么也查不进去的情况，可让大鼠休息一会，换细点的鱼线再试，这种情况不一定都是进到翼腭动脉了，我曾解剖过4例这种情况的大鼠，有三例都是在如颅的地方卡住了，可惜我们手里没有0.24mm的鱼线。 （3）通过实践，我们认为结扎或夹闭翼腭动脉没有必要，按我们的方法，熟练的话，从切开到缝合完毕也就是15分钟，算上准备工作（如麻醉、消毒等）半小时也可以搞定了，这样一上午两人作10只大鼠不成问题。 （4）我们体会最好用蘸腊的鱼线作模型，好处是进线深度控制的好，不容易出现蛛网膜下腔出血。我们曾试过0.26mm 的鱼线（不带腊）在250g以下的大鼠进入深度足有2.5cm 12、成功后结扎中间那根线，可见第一个标记距动脉分叉约2mm。 13、缝合。
大鼠灌注固定取脑
大鼠灌注固定取脑 具体方法： 1. 配4％多聚甲醛PBS缓冲液。配法：称取40g PFA溶于装有900ml PB或PBS的玻璃容器（烧杯或烧瓶）中，持续加热磁力搅拌至60～65℃，搅拌子速度从低到高，慢慢增加，至充分溶解。定容至1000ml，边搅拌边滴加1.0mol/L的NaOH直至7.0，过滤后室温或4℃保存备用。 2.制作灌注装置，一瓶生理盐水，一瓶灌入多聚甲醛，悬挂，输液器链接，远端结一个三通后到一个输液器粗针头端。 3.经心脏行灌注固定：麻醉，充分显露心脏（插针）和肝脏（判断），尽可能多暴露心脏，利于操作。首先快速滴入生理盐水或PBS，用止血钳（选把好的很关键）预夹住心尖少部，持针从心尖略偏左下进，插入有突破感即停（小鼠室壁厚约1mm），大头针或止血钳固定，若正确进入，右房充盈，剪破右房，此时液体较快下滴（调整针头朝向），红色血液从右房流出，快速冲尽全身血液（否则影响免疫反应），时间约4－5min，约40ml/只小鼠，80ml/只大鼠（取水冲洗切口，防血液凝固）。流出液变白即可，盐水过多细胞死亡多。正确的标志：右房充盈（但不是迅速充盈），肝脏逐渐变白，口鼻干燥。再注入4%多聚甲醛灌注30min 左右，多聚甲醛要偏快，100ml/只小鼠，200ml/只大鼠。大鼠不建议用灌注机（先排空管中空气，再行灌注。）它的灌流速度达不到。灌注正确标准：换多聚甲醛后身体反应，尤其尾巴竖起、四肢伸直变硬。PBS或NS灌流时，血流丰富的脏器如肝脾肾等的颜色会迅速转为灰白，此为灌流正常；另外，大鼠耳尖，口唇，四肢掌部也会变苍白。 4.取脑：枕骨大孔处用剪刀横断，小心地于枕骨大孔斜插入剪刀剪开顶骨，用止血钳掰断两边的顶骨，注意嗅球上地顶骨也要仔细去掉，用剪刀于一侧剪断视神经并探到颅底，就可以将整块的脑组织翘起。灌注成功则脑变白，无红色血管。 5. 最后在同样固定液中4℃固定12小时（包新民做的是一周），沉糖切片。 有几点体会：①． 4％多聚甲醛的配制：加热至60～65℃固然融解的快，不过容易挥发，气味难闻，不是好的选者。在此强烈推荐：先配好PBS，称好相应的多聚甲醛，37℃水浴或温箱密封放置2天，就能全溶。②．灌注时夹上腹主动脉只灌注上肢及头脑，固定的好又快，又省多聚甲醛。多聚甲醛用100ml以下即可。③．灌注时注意排空输液管中的气泡不然容易气栓，影响灌注效果。一定要看到大鼠较剧烈抽搐，不然证明灌注不好。 个人体会：1、多聚甲醛加热溶解很快，只需要15分钟左右，需配置的量比较大的时候是较合适的方法。如果有通风厨的可在通风厨内配置。在通风较好的地方配置也可以，但配置的时候配溶液的人一定要注意自我防护，味道确实很刺激！2、开胸时不要伤到心脏。3、心脏穿刺最好用留置针，软，不宜穿通室间隔,见血即退针芯。插针部位是心尖部，方向向中线（先主动脉插管，再右心耳放血，这样插管容易些。先剪右心耳的话，心脏会瘪下去的）。 4、生理盐水冲血管,到右心耳流出无色液体。 5、多基甲醛固定成功的表现是刚开始灌注时老鼠剧烈抽动；成功后老鼠后肢绷直，尾部竖起成一直线；所灌注的脑组织白而硬。5、根据你实验设计，,需要切片的部位，有重点的取，常见的体表标志是前囟和外耳道。 6、去颅骨后脑表面有一层硬脑膜，要去掉。 7、后固定：灌流后的脑组织置于4％PFA置4度冰箱内进行后固定，时间>2h，过夜最好。 恒流泵的方法 在心尖搏动明显的部位，朝向主动脉插入灌流针即从心尖插入灌流针，通过左心室直至主动脉；打开腹腔，结扎腹主动脉；剪开右心耳，插人聚乙烯管，用以液体回流。打开恒流泵以10 ml/min的速度开始从心脏灌注温生理盐水，以清除血液，并开始计时，直至回流管流出晶莹明亮的液体，记录时间和生理盐水的使用量。然后用4 % 多聚甲醛以5ml/min的速度灌流15min，并分别在第5 min、第10 min、第15min夹闭前腔静脉，暂停灌流1 min，
适用于Langendorff离体心脏灌流大鼠心肌梗死动物模型的建立
2007年1月 第17卷 第1期 中国比较医学杂志 CHINESE JOURNA L OF COMPARATIVE ME DICINE January,2007 V ol.17 N o.1 研究报告 适用于Langendorff离体心脏灌流大鼠心肌梗死 动物模型的建立 汪进益,范慧敏,刘中民 (同济大学附属东方医院心胸外科,上海 200120) 【摘要】 目的 建立适用于Langendor ff离体心脏灌流大鼠心肌梗死的动物模型,为评价干细胞移植对急性心肌梗死后的心功能变化提供基础。方法 选用S prague-Dawley(S D)大鼠16只,结扎其左冠状动脉前降支中远1Π3处,在结扎前后通过MPA多导生理记录仪连续描记心电图;4周后再次开胸进行Langendor ff离体心脏灌流测定左室心功能和心肌组织病理学检查;另选仅开关胸后存活的10只S D大鼠作为对照组。结果 造模成功率为62150% (10Π16);心电图动态监测在冠脉结扎后出现ST-T抬高的融合波,30min后可见病理性Q波;4周后Langendor ff离体心脏灌流装置系统检测显示左室收缩压峰值(LVSP)、左室内压等容相最大上升及下降速率(+dpΠdtmax,-dpΠdtmax)等指标较对照组降低,左室舒张末压峰值(LVE DP)则反之;病理组织切片可见结扎区域心肌纤维排列紊乱、坏死心肌被纤维组织取代。结论 通过结扎左冠脉前降支的方法,4周后能够形成稳定的适用于Langendor ff离体心脏灌流的心肌梗死动物模型,该模型能应用于干细胞移植对心脏功能影响的研究。 【关键词】 Langendor ff灌流;离体心脏;心肌梗死;大鼠;模型,动物 【中图分类号】Q95-33 【文献标识码】A 【文章编号】167127856(2007)0120022204 Establishment of Langendorff Perfusion of the Isolated H eart after Acute Myocardial I nfarction Model in R ats W ANGJin-yi,FAN Hui-min,LI U Zhong-min (Department of Cardiovascular and Thoracic Surgery of East H ospital A ffiliated T ongji University,Shanghai200120,China)【Abstract】 Objective T o create a standard rat m odel of Langendor ff per fusion of the is olated heart after acute my ocardial in farction(AMI)by silk suture ligation for the research of stem cell.Method 16adult S prague-Dawley(S D)rats in m odel group were established by ligating the middle-distal1Π3segment of left anterior discending artery with8～0sutures to shut the blood supply of my ocardium.E lectrocardiogram(ECG)were per formed both before the ligating and after the ligated by MPA system.The cardiac function were observed by langendor ff per fusion of the is olated heart methods and histogram study with HE stain was carried out4weeks late to see whether there were any tisse necrosis and its extension.10adult S D rats without ligating coronary artery in control group.R esults The rate of establishing m odel success fully was62150%(10Π16).A fter ligation of left anterior discending artery,ECG displayed ST elevated continuously immediately and pathologic Q wave after ligating30min.Pathologic section suggested my ofibers chaotically arranged,necro-my ocardium were superseded by fibrous tissue.Meanwhile,The cardiac function indicated by these parametes of LVSP,LVE DP and±dpΠdtmax descend markedly after ligating4weeks late.Conclusion S ilk surure ligating is a g oog method in creating a standard rat m odel of Langendor ff per fusion of the heart in4weeks after AMI,and the animal m odel w ould be conducive to the basic study on the treatment of stem cell for AMI. 【K ey w ords】 Langendor ff per fusion;Is olated heart;My ocardial in farction;Rats;M odels,animals [基金项目]国家自然科学基金资助项目(30471719)。 [作者简介]汪进益(1974-),男,博士,研究方向:离子通道与外科疾病、顽固性心衰的外科治疗及分子心脏病学。 [通讯作者]刘中民。E-mail:zhongm in-liu@https://www.360docs.net/doc/b07086465.html,