质粒DNA转染实验指导

质粒DNA转染

细胞生物学研究中，需要针对某个基因和蛋白质的功能进行特定研究，因此需要应用外源性导入的方法将这一外源基因表达，进而研究其一系列生物学功能。

转染是将外源性基因导入细胞内的一种专门技术。利用不同的载体物质携带质粒通过直接穿膜或者膜融合的方法使得外源基因进入细胞。随着基因与蛋白功能研究的深入，转染目前已成为实验室工作中经常涉及的基本方法。

本次实验采用罗氏的X-tremeGENE HP DNA非脂质体转染试剂，作为携带质粒穿膜的载体物质，具体介绍DNA转染方法。

一、细胞准备

转染前一天，取出处于对数生长期的健康细胞，吸掉原来的培养液，用无菌PBS清洗细胞。加入1毫升胰酶消化液消化细胞，显微镜下观察所有细胞完全皱缩变圆后加入终止液终止消化。采用无菌吸管轻轻吹打细胞表面，注意吹打全部培养表面，可以按照先左右吹打，后上下吹打的方式。收集细胞悬液于15毫升离心管中，每分钟800转，室温离心5min。用罗氏CASY快速细胞计数及活率分析仪进行细胞计数。弃去上清，加入培养基重悬细胞。以每孔3至5×105细胞密度接种到6孔培养板上，在无抗生素培养基中培养一天。具体数量因细胞种类不同而不同，掌握为转染时使细胞达到80％～90％的融合率。

转染前3小时，取出无抗生素培养的细胞置于倒置显微镜下观察。若融合率达80％～90％，即可进行转染实验。

请注意，如使用传统的转染试剂，细胞培养物必须去血清培养，否则会影响转染效率。但本实验所采用的X-tremeGENE HP转染试剂无需去血清

二、耗材及试剂准备

实验开始前，准备好所需的Optimem I无血清培养基，去核酸酶EP管，经高压灭菌的200微升和1毫升枪头各一盒枪头，以及罗氏X-tremeGENE HP DNA转染试剂等。

三、细胞转染

首先进行转染试剂复合物的制备。

在已标记好的EP管中分别加入100微升Optimem I无血清培养基

采用1微克质粒：100微升OptimemI稀释质粒DNA。枪头轻轻吹打混匀。

将3微升转染试剂缓缓加入上述稀释好的100微升质粒DNA中，即X-tremeGENE HP DNA 转染试剂与DNA质粒的比例是3微升比1微克。最小体积为100μl, 减少复合物体积将会显著降低转染效率. 转染试剂与DNA的最优比例，以及复合物的最适总体积，应根据细胞系、细胞密度、检测时细胞生长状况和基因表达的不同进行调整。

在15至25度条件下，静置转染试剂-DNA质粒复合物EP管，时间15-20分钟。

取出准备好的待转染细胞，做好相应标记，将转染复合物均匀滴入细胞六孔板中。轻轻摇动培养皿，使转染复合物与细胞充分接触。将培养板放于37 ℃、体积分数为5%的CO2饱和湿度培养箱中培养。

四、转染后观察

转染后24至72小时，可取出细胞观察细胞状态，以及进行其他检测转染效率的实验。

为了检测转染效率，可以采用GFP标记的质粒载体携带DNA，放置于荧光显微镜和相差显微镜下观察GFP荧光标记率，即可计算转染效率。

五、疑难问题解决：

一．低转染效率：

1、转染试剂与质粒DNA的比例不合适：

X-tremeGENE HP DNA转染试剂与DNA质粒复合物配比不合适。根据建议选用最佳配比浓度。见表格显示。

2、细胞状态不佳，过密或过稀疏：

细胞状态不佳，细胞营养不良，细胞伸展不好，细胞密度稀疏，细胞过密都影响转染效率。因此调整细胞状态，采用高质量血清，避免支原体污染，使转染前细胞达到80-90%融合的对数生长期。

3、抗生素损伤细胞：

转染培养基中含有抗生素会影响细胞转染效率。因为转染试剂相当于细胞打孔，这时培养基中存在抗生素则会进一步损伤细胞。

二．高细胞毒性：

1、转染后换液

使用传统的转染试剂，转染后4-6小时必须进行换液，否则会由于转染试剂毒性而引细胞死亡。本实验所采用的X-tremeGENE HP转染试剂由于毒性较低，无需换液。

2、质粒DNA受内毒素污染，或其他化学物质的污染：

未使用去内毒素的质粒试剂盒提取质粒，对细胞损伤很大。转染过程中会造成细胞死亡。