大肠杆菌表达系统的研究

大肠杆菌表达系统的研究

大肠杆菌表达系统是基因表达技术中发展最早，目前应用最广泛的经典表达系统。大肠杆菌表达系统的发展历史可追溯到二十年前，Struhl等（1976）、Vapnek等（1977）和Chang等（1978）分别将酿酒酵母DNA片段、粗糙链孢霉DNA片段和哺乳动物cDNA片段导入大肠杆菌，引起其表型的改变，证明了外源基因在大肠杆菌中可以使现有功能的活性表达。这些研究工作为大肠杆菌表达系统的发展奠定了理论基础。Guarante等（1980）在Science杂志上发表了以质粒、乳糖操纵子为基础建立起来的大肠杆菌表达系统，这一发展构成了大肠杆菌系统的雏型。随着80年代后期分子生物学技术的不断发展，大肠杆菌表达系统也不断得到发展和完善。与其它表达系统相比，大肠杆菌表达系统具有遗传背景清楚，目的基因表达水平高，培养周期短，抗污染能力强等特点。在基因表达技术中占有重要的地位，是分子生物学研究和生物技术产业化发展进程中的重要工具。

1 表达载体

大肠杆菌质粒是一类独立于染色体外自主复制的双链、闭环DNA分子，大肠杆菌质粒可分为结合转移型和非结合转移型两种，非结合转移型质粒在通常培养条件下不在宿主间转移，整合到染色体上的频率也很低，具有遗传学上的稳定性和安全性。又因其大小一般在2－50kb范围内，适合于制备和重组DNA的体外操作，因此几乎所有的大肠杆菌表达系统都选用非结合转移型质粒作为运载外源基因的载体，这些表达载体通过对天然质粒的改造获得。理想的大肠杆菌表达载体要求具有以下特征：（1）稳定的遗传复制、传代能力，在无选择压力下能存在于大肠杆菌细胞内。（2）具有显性的转化筛选标记。（3）启动子的转录是可以调控的，抑制时本底转录水平较低。（4）启动子的转录的mRNA能够在适当的位置终止，转录过程不影响表达载体的复制。（5）具备适用于外源基因插入的酶切位点。复制子、筛选标志、启动子、终止子和核糖体结合位点是构成表达载体的最基本元件。

2 各种类型表达系统的构成及特点

一个完整的大肠杆菌表达系统至少要有表达载体和宿主菌两部分构成。为了改善表达系统的性能和对各类外源基因的适应能力，表达系统有时还需要有特定功能基因的质粒或溶源化噬箘体参与。到目前为止已经成功发展了许多表达载体和相应的宿主菌。

Lac和Tac表达系统

这是最早建立并得到广泛应用的表达系统，它是以大肠杆菌lac操纵子调控机理为基础设计、构建的表达系统。Lac操纵子具有多顺反子的结构。在无诱导物的情况下，负调节因子lacI基因产物与启动子下游的操作基因紧密结合，组织转录的起始。在诱导剂IPTG存在的情况下，与阻遏蛋白结合后，导致与操纵基因的结合能力降低而解离出来，lac操纵子的转录因此被激活。用tac启动子构建的表达系统称为Tac表达系统。为了能使Lac和Tac表达系统具有严谨调控，一

种能产生过量的lacI阻遏蛋白的lacI基因的突变体lacIq被应用于表达系统（Das 1990）。但在使用高拷贝复制子构建表达载体时，仍能观察到较高水平的本底转录，还需在表达载体中插入lacIq基因以保证有较多的lacI阻遏蛋白产生。目前不少商品化的表达载体都是在Lac和Tac表达系统基础上加以改进和发展的。Lac和Tac表达系统用IPTG诱导转录，但由于IPTG本身具有一定的毒性，从安全角度而言对表达和制备用于医疗目的的重组蛋白并不适合，一些国家也规定在生产人用的重组蛋白的生产工艺中不能使用IPTG，于是人们想到用阻遏蛋白lacI的温度敏感突变株lacI（ts）应用于Lac和Tac表达系统（Hasan and Szybalski 1995，Yabuta等，1995）。这些突变体基因插入表达载体或整合到染色体后，均能使lac，tac启动子的转录受到温度严谨调控，在较低温度（30℃）时抑制，在较高温度（42℃）时开放。还有用乳糖替代IPTG诱导物（Hartsock 等，1995；Hsih等，1997）。但其效率受到多种因素的影响和制约，因此乳糖诱导的有效剂量大大高于IPTG。乳糖本身作为一种碳源可以被大肠杆菌代谢利用，较多的乳糖存在也会导致菌体生理及生长特性变化。乳糖代替IPTG作为诱导剂的研究要与发酵工艺结合起来，才能显示其良好的前景。

PL和PR表达系统

以λ噬箘体早期转录启动子PL、PR为核心构建的表达系统称为PL和PR表达系统。启动子PL、PR具有很强的启动转录能力，利用它们来构建表达载体并控制外源基因的表达在大肠杆菌表达系统发展初期就已被提出来并加以研究。这两种表达系统利用温度敏感突变体cI857的基因产物来调控PL、PR启动子的转录，它在较低温度（30℃）时以活性形式存在，在较高温度（42℃）时失活。这种表达载体在普通大肠杆菌中相当不稳定，这是因为菌体中没有cI基因产物，PL或PR启动子的高强度直接转录所导致。解决这个问题的办法之一是用溶源化λ噬箘体的大肠杆菌作为PL和PR启动子表达载体的宿主菌；办法之二是把cI857ts 基因组装在表达载体上，这样就可以有更大的宿主菌选择范围。由于PL和PR

表达系统在诱导这一环节上不加入化学诱导剂，成本又低廉，因此最初几个在大肠杆菌中制备的药用重组蛋白质都采用PL或PR表达系统（Caulcott and Rhodes 1986，Derynck等，1980）。这一表达系统也有其本身的缺陷，首先是在热刺激过程中，大肠杆菌热休克蛋白的表达也会被激活，其中一些是蛋白水解酶，有可能降解所表达的重组蛋白。其次是在大体积发酵培养菌体时，通过热平衡交换方式把培养温度从30℃提高到42℃需要较长的时间，这种缓慢的升温方式影响诱导效果，对重组蛋白的表达量有一定的影响。

T7表达系统

大肠杆菌T7噬箘体具有一套专一性非常强的转录体系，利用这一体系中的元件为基础构建的表达系统称为T7表达系统。T7噬箘体基因1编码的T7 RNA聚合酶选择性的激活T7噬箘体启动子的转录。它是一种高活性的RNA聚合酶，合成mRNA的速度比大肠杆菌RNA聚合酶快5倍，并可以转录某些不能被大肠杆菌RNA 聚合酶有效转录的序列。在细胞中存在T7 RNA聚合酶和T7噬箘体启动子的情况下，大肠杆菌宿主本身基因的转录竞争不过T7噬箘体转录体系。最终受T7噬箘体启动子控制的基因的转录能达到很高的水平。根据上述特点，从80年代中期就开始有了以T7噬箘体基因元件构建的表达载体（Studier等，1986；Tabor

等，1985），启动子选用T7噬箘体主要外壳蛋白ф10基因的启动子。pET系列载体是这类表达载体的典型代表，以后出现的载体都是在它的基础上发展起来的。 T7 RNA聚合酶的转录调控的模式决定了表达系统的调控方式。噬箘体DE3

是λ噬箘体的衍生株，用噬箘体DE3的溶源菌如BL21（DE3）、HMS174（DE3）等作为表达载体的宿主菌，调控方式为化学信号诱导性，类似于Lac表达系统。噬箘体CE6是λ噬箘体含有裂解缺陷突变和温度敏感突变的衍生株，其T7 RNA 聚合酶基因处于PL启动子控制下。噬箘体CE6转染宿主菌后可通过热脉冲诱导方式激发T7噬箘体启动子的转录。这种可在需要时才把T7 RNA聚合酶基因导入的方式可以使本底转录降到很低的水平，尤其是用于表达对大肠杆菌宿主有毒性的重组蛋白质。

T7表达系统表达目的基因的水平是目前所有表达系统中最高的，但也不可

避免相对较高的本底转录，如果目的基因产物对大肠杆菌宿主有毒性就会影响它的生长。解决这一问题的办法之一就是在表达系统中低水平表达T7溶菌酶基因（Moffatt等，1987）。因为T7溶菌酶除了作用于大肠杆菌细胞壁上的肽聚糖外，还与T7 RNA聚合酶结合抑制其转录活性。目前T7溶菌酶基因都通过共转化质粒导入表达系统，它能明显降低本底转录，但对诱导后目标基因的表达水平没有明显影响。

此外还有其他表达系统，如营养调控型、糖原调控型、pH调控型等。

目的蛋白表达的形式和在细胞中的位置

目的蛋白在大肠杆菌系统表达的形式有两种，一是在细胞内表现为不溶性的包涵体颗粒；二是在细胞内表现为可溶性的蛋白质。包涵体存在于大肠杆菌细胞质中，可溶性的蛋白质可存在于细胞质中，还可借助于本身的功能序列和大肠杆菌蛋白质的加工，运输体系，最终分泌到周质空间，或分泌到培养液中。由于包涵体颗粒的形成，加上大肠杆菌对所表达的可溶性目的蛋白加工、运输的限制条件。目前技术水平还不能使所有的目的蛋白质都能够按照人们的意愿，在大肠杆菌特定的细胞部位进行表达。但也已经建立和发展了一些行之有效的方法可供选择使用。

大肠杆菌表达系统研究的新进展

近几年来，国内外大肠杆菌表达系统研究的重点已从构建各种表达载体，建立新的表达系统转移到完善现有的表达系统，解决表达系统中还存在的缺陷等方面。这些研究工作主要包括重组蛋白质的正确折叠，构象形成和分泌，菌体表面表达技术及其应用，重组蛋白质修饰加工研究等内容。

在大肠杆菌中表达的目标基因往往会形成不溶性、无活性的包涵体，这使大肠杆菌表达系统的应用范围受到了很大限制，虽然到目前为止大肠杆菌细胞内可溶性表达问题还没有完全解决，但也取得了不少研究结果和进展。包涵体是由于在新合成的大量目标蛋白质的折叠过程中，大肠杆菌细胞内参与折叠的蛋白因子的量不能满足需要，无法形成正确的构象而产生的，因此在大肠杆菌内共表达与蛋白质折叠过程密切相关的分子伴侣，折叠酶和硫氧环蛋白基因可以使目标基因可溶性表达的比例明显上升。研究表明这种作用是具有专一性的，不同的目标蛋白需要不同类型的蛋白因子共表达。在有些情况下需要由多个蛋白因子共表达才能达到预期的目标（Machida et al.，1998；Caspers et al.,1994）。

大肠杆菌周质空间通过二硫键形成酶DsbA和DsbB二个蛋白维持适当的氧化还原态势使蛋白质的二硫键形成。已有报道发现来源于人或小鼠的蛋白质二硫键

异构酶（PDI）在大肠杆菌细胞内共表达可以二硫键的形成和正确折叠（Ostermeier等，1996；Humphreys等，1995）。对PDI在大肠杆菌中的功能研究表明，PDI对目标蛋白的二硫键形成和正确折叠的促进作用可以受到谷胱苷肽的调节。这些研究结果表明真核生物的PDI在大肠杆菌中的功能是依赖于大肠杆菌自身的氧化还原体系的。PDI具有的二硫键异构交换功能有效地弥补了DsbA

和DsbB功能上的不足，从而提高了目标蛋白正确折叠的比例。

目标蛋白在大肠杆菌中分泌表达具有许多优点，但由于大肠杆菌自身的蛋白分泌系统不够完善，分泌目标蛋白的能力与其它一些原核生物相比要微弱的多。以前的研究工作主要集中在宿主菌改造，共表达与分泌过程相关的蛋白因子和培养条件的优化上，随着基因突变技术的发展，近期不少研究工作都围绕着改造信号肽的序列和结构，提高分泌效率这一角度展开。比较成功的例子是发现了把碱性磷酸酶基因phaA信号肽的疏水区置换为多聚亮氨酸残基能明显提高分泌效率（Rusch等，1994）。表明信号肽核心部位的疏水性的增强有利于它与细胞膜的相互作用。这一结果为天然信号肽优化改造的设计提供了很好的参考依据。

随着信号转导研究的深入，膜蛋白基因在大肠杆菌中表达的技术逐渐成为研究的热点领域，到目前为止已有几十种膜蛋白在大肠杆菌中成功表达，其中大部分是受体或受体的亚基。膜蛋白表达技术的发展促进了大肠杆菌表面表达技术的建立。外源蛋白质在菌体表面表达的优点是大肠杆菌可直接用于制备疫苗，进行生物催化和作为探针筛选药物。在一定程度上能与噬箘体展示系统相媲美。因此大肠杆菌表面表达技术近年来得到了较快的发展，主要通过三条途径使目标蛋白呈现在菌体表面：（a）把外源蛋白插入外膜蛋白的膜外区；（b）把外源蛋白导入大肠杆菌鞭毛或伞毛的结构中；（c）在脂蛋白、IgA蛋白酶的N端或C端融

合外源基因。前两种方法适合表达一段长度小于100个氨基酸残基的外源序列，第三种融合表达的方法对外源基因的限制条件就比较小，其序列可在50－500

氨基酸残基长度的范围内。

由于大肠杆菌本身的蛋白质翻译后修饰加工体系相当不完善，因此不能对重组蛋白质进行修饰加工，这是大肠杆菌系统与其它表达系统相比存在的一个比较突出的缺陷。蛋白质C末端酰胺化和侧链糖基化是常见的翻译后修饰加工类型，目前C末端酰胺化一般都是在体外通过肽酰甘氨酸酰胺酶把C末端甘氨酸转换为胺基，来自有爪蟾蜍的肽酰甘氨酸酰胺酶基因已克隆并在哺乳动物细胞表达系统获得表达，把其他微生物的肽酰甘氨酸酰胺酶，真核生物糖基化过程所涉及的酶系导入大肠杆菌的设想很早就被提出，但这些工作都还在探索之中。其中需要研究的主要问题有：如何使肽酰甘氨酸酰胺酶在大肠杆菌中有较高的活力和专一性；如何通过基因工程技术改造真核生物的糖基化多酶体系使其能整合到大肠杆菌

的染色体中和对糖基化位置和糖基种类和长度进行控制等等。关于表达产物的构象、分泌、定位和修饰加工研究是今后大肠杆菌表达系统研究的重点方向。