药物筛选

一．高通量药物筛选在新药研发中的应用

高通量药物筛选的原理，就是药物多是通过特异地作用于体内的靶点蛋白质（受体、酶、离子通道等）而重新调整病人的生理状态，达到治疗目的。该技术是指以分子水平和细胞水平的实验方法为基础，以微板形式作为实验工具载体，以自动化操作系统执行试验过程，以灵敏快速的检测仪器采集实验结果数据，以计算机对实验数据进行分析处理，同一时间对数以千万样品检测，并以相应的数据库支持整体系运转的技术体系。高通量筛选在创新先导物的发现过程中具有高效、快速、微量等特点。

高通量药物筛选的基本模式是以单一的筛选模型对大量样品的生物活性进行评价,从中发现针对某一靶点具有活性的样品。随着人类基因组计划的完成,潜在药物靶点不断被发现,新的药物靶点不断出现,不仅为创新药物的发现提供了机遇,也对高通量筛选效率提出新的要求。

1 高通量药物筛选开发新药的基本过程

药物筛选与新药发现的基本过程由于高通量筛选获得的结果是分子水平或细胞水平的活性结果，多数情况下只能反映出样品的作用机制的信息，并不能完全证明对某种疾病具有防治作用，这是其与传统筛选方法的重要区别。传统的药理学研究一般是首先研究其客体作用进而研究作用机制。而采用高通量筛选方法则是从分子水平开始，这一过程又称作反向药理学。采用高通量筛选方法发现和开发药物一般要经过药物的初筛和复筛、深入筛选、确证筛选过程。

1.1 初筛和复筛

是在分子或细胞水平筛选样品，证明某一样品对该靶点具有药理活性（或亲和力）。初筛以后，选择具有活性的化合物，采用系列浓度，进行同一模型的复筛，阐明其对该靶点的作用特点、作用强度和量效关系，由此发现活性化合物（样品）。

1.2 深入筛选

在初筛和复筛的基础上，将得到的样品，采用与初筛不同但相关的分子、细胞模型作进一步的筛选，包括证明样品的选择性、细胞毒性，以及其他性质。经过深入筛选，为比较全面地评价活性化合物的药用价值提供更充分的实验资料。根据这些资料，并结合活性化合物的化学结构、性质特点，进行综合分析，确定在结构和作用方面具有新颖性和开发价值的化合物，作为先导化合物。同时也可以结合组织器官或整体动物模型，证明其药理作用，为样品提供更加充分的实验依据。

1.3 确证筛选

对深入筛选获得的先导化合物或优化后被选定的活性最好的化合物进行更深入广泛的研究，包括药理作用、药物代谢过程、一般毒性等多方面的筛选，以确定其开发前景。将符合要求的样品确定为药物候选化合物，进入开发研究程序，即临床前研究，为临床研究准备必要的资料。

2 高通量药物筛选技术对药物开发策略的转变

新方法和新技术的应用，必然会对现有的操作方式产生冲击，在药物发现过程中更是如此，由于大量新技术的应用，传统的筛选模式肯定不能适应新技术发挥作用。因此，为了提高成功率和筛选速度，积极应用新技术是必须的，但是，在研究的策略方面不进行调整和改变，就会制约新技术的应用和研究进程的发展，甚至会导致错误的结果。

2.1 随机筛选策略的改变

高通量药物筛选技术的应用，改变了传统的药物发现的模式。由于筛选方法是建立在分子细胞水平，由此来分析药物的治疗作用，必然存在着大量需要解决的问题。分子水平的某点变化，在疾病的病理表现中可能是微不足道的，或是要受到多种干扰。因此，用这种方法发现药物，就必须改变传统的模式，建立全新的新药发现策略建立基于高通量药物筛选技术上的药物发现新模式，需要解决的主要问题是活性的评价、筛选模型与疾病的相关性、影响筛选

模型的可能因素、药物作用系统评价方法等。对每一个建立的高通量药物筛选模型，都需要进行系统的研究，才可能以最有效的方法发现新的药物。

2.2 定向筛选

组合化学技术应用，使活性化合物的结构优化和改造产生了巨大变化，速度和效率大大提高。对于在高通量筛选过程中发现的先导化合物，进行结构优化和改造是发现高质量药物的重要措施。根据药物发现的规律，优化或改造出的新化合物越多，最终发现药物的质量越高，因此，组合化学是使这一过程得到极大的促进。

2.3 分子设计途径

计算机技术在药物发现中的应用有 2 种主要的方式：第1 种方法是通过模拟药物靶点的结构，建立立体的活性位点结构，然后根据活性位点的结构特点，设计可以与活性位点相结合的化合物分子结构，然后采用合成的方法获得化合物，进行生物活性的筛选。经过实际应用，这种方法也出现了新的方式，即计算机筛选方式。第2种方法是在已知的活性化合物或已知的有效药物化学结构基础上，参考药物作用靶点的结构特点，通过合成手段获得化合物后，进行活性筛选，这种方法的目的是获得效果更好的药物。

3 高通量药物筛选技术在新药研究中存在的问题及展望

高通量筛选技术以其快速、灵敏、高特异性等特点，受到国内外药物研究机构的重视，成为了新药发现过程中的主要技术与手段。该技术作为药物筛选的一种方法，它并不是一种万能的手段，特别是在中药研究方面，其局限性也是十分明显的。首先，高通量筛选所采用的主要是分子、细胞水平的体外实验模型，因此任何模型都不可能充分反映药物的全面药理作用；其次，用于高通量筛选的模型是有限的和不断发展的，要建立反映机体全部生理机能或药物对整个机体作用的理想模型，也是不现实的。

4. 高通量筛选的基本特点

高通量筛选的基本特点表现在以下几个方面:

4.1 符合药物发现的基本规律

由于高通量筛选依赖数量庞大的样品库,实现了药物筛选的规模化,较大限度的利用了药用物质资源,提高了药物发现的机率,同时提高了发现新药的质量。

4.2 充分利用药用资源

高通量筛选采用的是细胞、分子水平的筛选模型,筛选实验是在微量筛选系统中完成的,样品用量一般在微克级，节省了样品资源,同时节省了实验材料,降低了单药筛选成本。

4.3 高度自动化操作

随着对高通量药物筛选的重视程度不断提高,用于高通量药物筛选的操作设备和检测仪器都有了长足发展,实现了计算机控制的自动化。自动化仪器的应用,减少了操作误差的发生,提高了筛选效率和结果的准确性。

4.4 多学科理论和技术的结合

在高通量筛选过程中,不仅应用了普通的药理学技术和理论,而且与药物化学、分子生物学、细胞生物学、数学、微生物学、计算机科学等多学科紧密结合。这种多学科的有机结合,在药物筛选领域产生大量新的课题和发展机会,促进了药物筛选理论和技术的发展。

在过去的近十年中,通过提高仪器制造技术、生物检测手段、计算机数据分析软件的功能等,使高通量筛选技术朝着日筛选规模越来越大,速度越来越快的方向发展。目前已经形成了可日筛选10万样次的超高通量筛选技术。但是,高通量药物筛选技术的单靶点单指标的筛选方法,已经不能适应药物发现的需要,而且也不利于对化合物活性的综合评价。在此情况下,以多指标多靶点共同作用为主要特点的高内涵药物筛选技术应运而生。

二．高内涵药物筛选技术和方法

高内涵药物筛选是指在保持细胞结构和功能完整性的前提下,同时检测被筛样品对细胞形态、生长、分化、迁移、凋亡、代谢途径及信号转导各个环节的影响,在单一实验中获取大量与基因、蛋白及其他细胞成分相关的信息,确定其生物活性和潜在毒性的过程。同时,Hcs 也是一种应用高分辨率的荧光数码影像系统,旨在获得被筛样品对细胞产生的多维立体和实时快速的生物效应信息,在细胞水平上检测多个指标的多元化、功能性筛选技术平台。

2.1 细胞毒高内涵药物筛选方法

细胞毒性检测一直是药物发现过程中的重要部分,细胞模型在高通量筛选中应用最广泛的是观察样品的细胞毒性,其中对肿瘤细胞株的毒性作用可用来筛选抗肿瘤药物。

2. 2 G蛋白偶联受体高内涵药物筛选方法

G蛋白偶联受体是最大的细胞表面受体家族,是小分子调节剂治疗干预的丰富靶点来源。研究表明用荧光生物传感器如荧光染色、蛋白标记等方法对G蛋白偶联受体活化或调节剂进行高内涵药物筛选,可平行得到GPCR自己或和它相连的第二个蛋白在细胞的位置、数目等多种信息数据,这些方法都被称为高内涵药物筛选。

2.3 其他高内涵药物筛选

高内涵药物筛选除在细胞毒、G蛋白偶联受体等方面应用较多外,尚有报道在凋亡、雌激素受体等方面的研究。

高内涵药物筛选已经成为药物发现领域中的一个重要组成部分。高内涵药物筛选方法在药物发现过程中有许多优势。其中最显著的一个优点就是降低筛选成本。为降低筛选成本,进行了多方面的尝试,包括降低筛选体积、筛选样品混合、多靶点多指标平行检测等。多指标多靶点高内涵药物筛选在一次筛选后获得样品对多个靶点的作用信息,筛选体积不必太低,检测指标的试剂互不影响,因此多指标同时评价的高内涵药物筛选不仅是先导物发现效率提高的一个新方法,而且也是未来药物筛选成本节省的方法之一。

2.4高内涵药物筛选的优势

通过与目前广泛使用的HTS技术进行比较,HCS的优势可从多方面体现。相比传统的药理学实验方法,HTS以其快速、高特异性、高灵敏度的特点在短短数年内,就受到国际药物研究机构的极大重视,成为新药发现过程中的主要技术手段。虽然其发现活性化合物的速度快,但是其检测模型均建立在单个药物作用靶分子的基础上,无法全面反映被筛样品的生物活性特征,只得到有限的数据,初筛得到的阳性结果需要进一步确认。此外,HTS是针对单个靶点筛选的极大提高,取得了纵向上的突破,而HCS不仅在筛选量上超越了HTS,而且实现了对多个靶点的同时筛选,拓展了检测范围,即取得了纵向和横向上的双重突破。

更重要的是,HCS获取信息是以细胞为单位,而不像HTS是以微板孔为单位,这就意味着研究者可以从细胞群体中的各种反应获取信息,而不是像以前那样信息仅仅来源于一个微板孔中的所有细胞的平均反应。Hcs这种获取多个终点,包括单个和细胞群体的定量数据的能力全面加深了研究者对筛选中得到信息的理解,这为过去劳动强度和难度均很大的细胞功能和作用机制研究提供了新颖的视角。

通过同步应用报告基因、荧光标记、酶学反应和细胞可视化等HCS常规检测技术,研究人员可以在新药研究的早期阶段获得活性化合物对细胞产生的多重效应的详细数据,包括细胞毒性、代谢调节和对其他靶点的非特异性作用等,从而显著提高发现先导化合物的速率,减少开发后期的失败率。虽然HCS作为一种在新药研发中应用的全新研究手段才仅仅几年,但是国外业界人士一致评价HCS是新药研发的具有重要意义的组成部分,如果说高通量自动化DNA测序技术对顺利完成人类基因组计划的贡献是革命性的,那么HCS在当今药物发现中将起到同样的关键作用。

三.高内涵高通量筛选

高内涵药物筛选由于检测水平为细胞水平,测试仪器多采用荧光显微镜,因此筛选通量一直不是太高,数据处理繁琐。有研究者尝试提高高内涵药物筛选通量即建立高内涵高通量筛选方法，细胞水平多核受体拮抗剂检测、分离的细胞数、高内涵高通量筛选是高内涵药物筛选中可用于高通量筛选的方法和技术。但由于通量提高与检测设备的改进密切相关,目前高内涵高通量筛选尚处于研究阶段。

几种常见药物筛选的新技术

药物筛选的发展和新技术的出现与应用密切相关，通过偶然性的传统筛选方法来发现新药，已经出现了较大的局限性。细胞生物学、分子生物学和基因组学等学科的发展，出现的一系列药物筛选新技术和新方法，越来越广泛地应用于新药研发的各个阶段。本文对当前药物筛选中较常用的双杂交技术、基因工程技术、高通量筛选和生物信息学从概念、原理、优点、缺点和应用领域等方面作以简单的阐述。

1 双杂交技术

酵母双杂交的基本原理是基于对真核生物调控转录起始过程的认识，其起始位点特异转录激活因子通常具有两个彼此可分割开的结构域，即DNA特异结合域与转录激活结构域。一个完整的激活特定基因表达的激活因子必须同时含有这两个结构域，否则无法完成激活功能。

酵母双杂交技术主要包括: ①选择合适酵母作为筛选未知蛋白的受体菌；②诱饵蛋白表达质粒的构建和鉴定；③诱饵蛋白自身转录活性分析；④猎物蛋白cDNA 文库的构建⑤酵母双杂交筛选与阳性克隆鉴定。作为活细胞内检测蛋白质相互作用最有力的分析方法,

在疾病发病机制、药物作用靶点研究和新药筛选方面显示出极大的应用潜力。当前双杂交技术已经成功地应用于抗肿瘤、抗病毒等药物的研究开发中。

2 基因工程技术

基因工程技术也称为重组DNA技术，它是一项复杂的高新技术，是将基因工程技术方法（如重组受体、转基因动物、基因探针等）应用于药物筛选中，在发现和研制新药过程中有非常重要的作用。

2.1 重组受体与药物筛选2.2 转基因动物模型与药物筛选2.3 基因探针2.4 基因芯片技术与药物筛选

3 高通量筛选

高通量筛选它是在传统的筛选技术基础上, 应用先进的分子生物学、细胞生物学、计算机、自动化控制等寻找新药的一种高新技术，以药物作用靶点为主要对象的细胞和分子水平的筛选模型，根据样品和靶点结合的表现，判断化合物生物活性的技术方法，具有微量、快速、灵敏、准确、高效，在短时间内可以测试大量化合物活性等特点。目前，该技术已经成为主动药物筛选的主要技术手段。

4 生物信息学与药物筛选

生物信息学可以帮助研究者有目的地了解研制药物的信息，建立自主信息系统，选定目标，针对病因及发病机制开发药物；可以设计正常与疾病状态下生化代谢途径的计算机模型，并在此模型上确定最佳治疗点，获得理想的药理作用目标；更有利于新药的理性设计、从已有药源（天然药物等）筛选未被发现或利用的新活性物质等。同时，可在很短的时间内对上万种待筛选样品进行筛选，使药物筛选速度加快，并对基因变化进行跟踪检测，使那些

在传统药物筛选方式下难以察觉的副作用也会立即表现出来，提高了新药的安全性。

总之，细胞生物学、分子生物学、基因组学、物理化学和组合化学等学科的新技术和新方法的应用将有力地促进药物筛选的发展，加快药物研制的进程，必将在药物学中取得举世瞩目的成就。