酶工程 关于限制性核酸内切酶的论述

目录

摘要 (1)

关键词 (1)

Abstract (1)

Key words (1)

1、限制性核酸内切酶的定义 (2)

2、限制性核酸内切酶的起源 (3)

2、1限制与修饰现象 (4)

2、2限制酶的发现 (5)

3、限制性核酸内切酶的分类 (6)

4、限制性核酸内切酶识别的序列 (7)

4.1、限制酶识别序列的长度 (7)

4.2、限制酶识别序列的结构 (8)

4.3、限制酶切割的位置 (9)

5、限制性核酸内切酶产生的末端 (9)

5.1、限制酶产生匹配粘端（matched ends） (9)

5.2、限制酶产生平末端（Blunt end） (10)

5.3、限制酶产生非对称突出端 (10)

6、限制性核酸内切酶的应用 (10)

参考文献 (12)

致谢 (13)

摘要：限制性核酸内切酶简称限制性核酸酶。这是一类能从DNA分子中间水解磷酸二酯键,从而切断双链DNA的核酸水解酶。它们不同于一般的脱氧核糖核酸酶（DNase）,它们的切点大多很严格，要求专一的核苷酸顺序──识别顺序。长期以来，难以深入研究的DNA大分子,借此可以切割成特定的小片段来分析。限制性核酸酶的发现,为基因结构、DNA碱基顺序分析和基因工程的研究开辟了途径。

关键词：限制性核酸内切酶种类起源识别序列应用

Abstract：Short restriction endonuclease restriction nucleases.This is a class of DNA molecules from the middle of the phosphodiester bond hydrolysis, thereby cutting off the double-stranded DNA nuclease enzymes. They are different from the general deoxyribonuclease (DNase), they are mostly very strict cut-off point, requiring specific nucleotide sequence ─ ─ recognition sequence. For a long time, in-depth study of DNA molecules is difficult, to be cut into small fragments specific for analysis. The discovery of restriction nucleases for gene structure, DNA base sequence analysis and genetic engineering research opens the way.

Key words ：Restriction endonuclease Species Origin Recognition sequence Application

酶（enzyme）催化特定化学反应的蛋白质、RNA或其复合体。是生物催化剂，能通过降低反应的活化能加快反应速度，但不改变反应的平衡点。绝大多数酶的化学本质是蛋白质。具有催化效率高、专一性强、作用条件温和等特点。酶参与人体所有的生命活动：比如思考，运动，睡眠，呼吸，愤怒，喜悦或者分泌荷尔蒙等都是以酶为中心的活动结果。酶的催化作用催动着机体充满活力的生化反应，催动着生命现象不断健康的运行。同时，国内权威医学证明，酶是人体内新陈代谢的催化剂，只有酶存在，人体内才能进行各项生化反应。人体内酶越多，越完整，其生命就越健康。而都市人普遍存在着缺酶的现象。

酶早期是指in yeast 在酵母中的意思, 指由生物体内活细胞产生的一种生物催化剂。大多数由蛋白质组成（少数为RNA）。能在机体中十分温和的条件下，高效率地催化各种生物化学反应，促进生物体的新陈代谢。生命活动中的消化、吸收、呼吸、运动和生殖都是酶促反应过程。酶是细胞赖以生存的基础。细胞新陈代谢包括的所有化学反应几乎都是在酶的催化下进行的。如哺乳动物的细胞就含有几千种酶。它们或是溶解于细胞液中，或是与各种膜结构结合在一起，或是位于细胞内其他结构的特定位置上。这些酶统称胞内酶；另外，还有一些在细胞内合成后再分泌至细胞外的酶──胞外酶。酶催化化学反应的能力叫酶活力（或称酶活性）。酶活力可受多种因素的调节控制，从而使生物体能适应外界条件的变化，维持生命活动。没有酶的参与，新陈代谢只能以极其缓慢的速度进行，生命活动就根本无法维持。例如食物必须在酶的作用下降解成小分子，才能透过肠壁，被组织吸收和利用。在胃里有胃蛋白酶，在肠里有胰脏分泌的胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶等。又如食物的氧化是动物能量的来源，其氧化过程也是在一系列酶的催化下完成的。酶有成千上万种，解旋酶、DNA聚合酶、RNA聚合酶、蛋白质合成酶、反转录酶、限制性核酸内切酶、DNA 连接酶、胰蛋白酶……

1、限制性核酸内切酶的定义

是识别DNA的特异序列，并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。是一种能将双股DNA切开的酵素。切割方法是将糖类分子与磷酸之间的键结切断，进而于两条DNA链上各产生一个切口，且不破坏核苷酸与碱基。切割形式有两种，分别是可产生具有突出单股DNA的黏状末端，以及末端平整无凸起的平滑末端。由于断开的DNA片段可由另一种称为DNA连接酶的酵素黏合，因此染色体或DNA上不同的限制片

段，得以经由剪接作用而结合在一起。

限制酶在分子生物学与遗传工程领域有广泛的应用，此类酵素最早发现于某些品系的大肠杆菌体内，这些品系能够“限制”噬菌体对其感染，因此得名。科学家认为限制酶是细菌所演化出来对抗病毒感染，并帮助将已殖入的病毒序列移除的机制。是限制修饰系统（restriction modification system）的一部分。丹尼尔·那森斯、汉弥尔顿·史密斯与沃纳·亚伯因为限制酶的发现及研究，而共同获得1978年的诺贝尔生理学或医学奖。此酵素最早的应用之一，是用来将胰岛素基因克隆到大肠杆菌，使其具备生产人类胰岛素的能力。

2.限制性核酸内切酶的起源

很多年前，当人们在对噬菌体的宿主特异性的限制-修饰现象进行研究时，首次发现了限制性内切酶。细菌可以抵御新病毒的入侵，而这种"限制"病毒生存的办法则可归功于细胞内部可摧毁外源DNA的限制性内切酶。首批被发现的限制性内切酶包括来源于大肠杆菌的EcoR I和EcoR II，以及来源于Haemophilus influenzae的Hind II和Hind III。这些酶可在特定位点切开DNA，产生可体外连接的基因片段。研究者很快发现内切酶是研究基因组成、功能及表达非常有用的工具。

当限制性内切酶的应用在上世纪七十年代流传开来的时候，以NEB为代表的许多公司开始寻找更多的限制性内切酶。除了某些病毒以外，限制性内切酶只在原核生物中被发现。人们正在从数以千计的细菌及古细菌中寻找新的限制性内切酶。而对已测序的原核基因组数据分析表明，限制性内切酶在原核生物中普遍存在--所有自由生存

的细菌和古细菌似乎都能编码限制性内切酶。

限制性内切酶的形式多样，从大小上来说，它们可以小到如Pvu II（157个氨基酸），也可以比1250个氨基酸的Cje I更大。在已纯化分类的4000种限制性内切酶中，已发现了超过250种的特异识别序列。其中有30%是在NEB发现的。对具有未知特异识别序列的限制性内切酶的研究发现工作仍在继续。人们从分析细胞提取物的生化角度研究的同时，也采用计算机分析已知的基因组数据，以期有更多的发现。尽管很多新发现的酶的识别序列与已有的重复--即同裂酶，仍然有识别新位点的酶不断被发现。

上世纪80年代，NEB开始克隆并表达限制性内切酶。克隆技术由于将限制性内切酶的表达与原有细胞环境分离开来，避免了原细胞中其它内切酶的污染，从而提高了酶的纯度。此外，克隆技术提高了限制性内切酶的产量，简化了纯化过程，使得生产成本显著降低；克隆的基因很容易进行测序分析，表达出的蛋白也能进行X射线结晶分析，这使得我们对于克隆产物更加确定。

2.1．限制与修饰现象

早在 50 年代初，有许多学者发现了限制与修饰现象，当时称作寄主控制的专一性（host controlled specificity）。 l 噬菌体表现的现象便具有代表性和普遍性，其在不同宿主中的转染频率可说明这一问题（表 2-1）。 l 在感染某一宿主后，再去感染其它宿主时会受到限制。

E.coli 菌株λ噬菌体感染率

lK lB lC

E.coli K 1 10-4 10-4

E.coli B 10-4 1 10-4

E.coli C 1 1 1

说明 K 和 B 菌株中存在一种限制系统，可排除外来的 DNA 。 10-4 的存活率是由宿主修饰系统作用的结果，此时限制系统还未起作用。而在 C 菌株不能限制来自 K 和 B 菌株的 DNA 。限制作用实际就是限制酶降解外源 DNA ，维护宿主遗传稳定的保护机制。甲基化是常见的修饰作用，可使腺嘌呤 A 成为 N6 甲基-腺膘呤，胞嘧啶 C 成为 5' 甲基胞嘧啶。通过甲基化作用达到识别自身遗传物质和外来遗传物质的目的。

2.2．限制酶的发现

在 20 世纪 60 年代，人们就注意到 DNA 在感染宿主后会被降解的现象，从而提出限制性切酶和限制酶的概念。 1968 年，首次从 E.coli K 中分离到限制酶，它有特定的识别位点但没有特定的切割位点，其中切割位点离识别位点达 1000bp 以上。

1970 年，美国约翰·霍布金斯大学的 H. Smith 于偶然中发现，流感嗜血杆菌（Haemophilus influenzae）能迅速降解外源的噬菌体 DNA ，其细胞提取液可降解E.coli DNA ，但不能降解自身 DNA ，从而找到 HindⅡ限制性内切酶。 HindⅡ限制性内切酶位点和切割位点如下：

5 '… GTPy ↓ PuAC … 3 '

3 '… CAPu ↑ PyTG … 5 '

从此以后，发现的限制酶越来越多，并且许多已经在实践中得到应用。 EcoRⅠ是应用最广泛的限制性内切酶，酶切位点和切割位点如下：

5' G↓AATTC 3'

3' CTTAA↑G 5'

限制性内切酶的命名遵循一定的原则，主要依据来源来定，涉及宿主的种名、菌株号或生物型。命名时，依次取宿主属名第一字母，种名头两个字母，菌株号，然后

再加上序号（罗马字）。如 HindⅢ限制性内切酶， Hin 指来源于流感嗜血杆菌， d 表示来自菌株 Rd ，Ⅲ表示序号。以前在限制性内切酶和修饰酶前加 R 或 M ，且菌株号和序号小写。但现在限制性内切酶名称中的 R 省略不写。

1986 年下半年发现 615 种限制酶和 98 种甲基化酶； 1998 年发现 10000 种细菌或古细菌中存在 3000 种酶，且酶有 200 多种特异性。到 2005 年 1 月，共发现 4342 种限制酶和甲基化酶，其中限制酶有 3681 种，包括Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型限制酶各有 59 、3612 、10 种，甲基化指导的限制酶有 3 种，商业化的限制酶有 588 种，在Ⅱ型限制酶中共有 221 种特异性。

3.限制性核酸内切酶的分类

根据酶的亚单位组成、识别序列的种类和是否需要辅助因子，限制与修饰系统至少可分为四类。表 2-2 是各种限制与修饰系统的比较。

Ⅱ型（type Ⅱ）限制与修饰系统所占的比例最大，达 93% 。Ⅱ型酶相对来说最简单，它们识别回文对称序列，在回文序列内部或附近切割 DNA ，产生带 3'- 羟基和 5'- 磷酸基团的 DNA 产物，需 Mg2+ 的存在才能发挥活性，相应的修饰酶只需SAM 。识别序列主要为 4-6bp ，或更长且呈二重对称的特殊序列，但有少数酶识别更长的序列或简并序列，切割位置因酶而异，有些是隔开的。

Ⅱs 型（type Ⅱs）限制与修饰系统，占 5% ，与Ⅱ型具有相似的辅因子要求，但识别位点是非对称，也是非间断的，长度为 4-7bp ，切割位点可能在识别位点一侧的 20bp 范围内。

Ⅱ型限制酶一般是同源二聚体（homodimer），由两个彼此按相反方向结合在一起的相同亚单位组成，每个亚单位作用在 DNA 链的两个互补位点上。修饰酶是单体，修饰作用一般由两个甲基转移酶来完成，分别作用于其中一条链，但甲基化的碱基在两条链上是不同的。

在Ⅱ型限制酶中还有一类特殊的类型，该酶只切割双链 DNA 中的一条链，造成一个切口，这类限制酶也称切口酶（nicking enzyme），如 N.Bst NBI 。

Ⅰ型（type Ⅰ）限制与修饰系统的种类很少，只占 1% ，如 EcoK 和 EcoB 。其限制酶和甲基化酶（即 R 亚基和 M 亚基）各作为一个亚基存在于酶分子中，另外还有负责识别 DNA 序列的 S 亚基，分别由 hsdR 、hsdM 和 hsdS 基因编码，属于同一操纵子（转录单位）。 EcoK 编码基因的结构为 R2M2S 。 EcoB 编码基因的结

构为 R2M4S2 。

EcoB 酶的识别位点如下，其中两条链中的 A 为甲基化位点， N 表示任意碱基。

TGA*（N）8TGCT

EcoK 酶的识别位点如下，其中两条链中的 A 为可能的甲基化位点。

AA°C（N）6GTGC

但是 EcoB 酶和 EcoK 酶的切割位点在识别位点 1000bp 以外，且无特异性。Ⅲ型（type Ⅲ）限制与修饰系统的种类更少，所占比例不到 1% ，如 EcoP1 和EcoP15 。它们的识别位点分别是 AGACC 和 CAGCAG ，切割位点则在下游 24-26bp 处。在基因操作中，一般所说的限制酶或修饰酶，除非特指，均指Ⅱ型系统中的种类。

4.限制性核酸内切酶识别的序列

4.1．限制酶识别序列的长度

限制酶识别序列的长度一般为 4-8 个碱基，最常见的为 6 个碱基（表2-3）。当识别序列为 4 个和 6 个碱基时，它们可识别的序列在完全随机的情况下，平均每256 个和 4096 个碱基中会出现一个识别位点（4^4=256，4^6=4096）。以下是几个有代表性的种类，箭头指切割位置。

4 个碱基识别位点：Sau3AⅠ↓GATC

5 个碱基识别位点：EcoRⅡ↓CCWGG

NciⅠ CC↓SGG

6 个碱基识别位点：EcoRⅠ G↓AATTC

HindⅢ A↓AGCTT

7 个碱基识别位点：BbvCⅠ CC↓TCAGC

PpuMⅠ RG↓GWCCY

8 个碱基识别位点：NotⅠ GC↓GGCCGC

SfiⅠ GGCCNNNN↓NGGCC

以上序列中部分字母代表的碱基如下。

R=A 或 G Y=C 或 T M=A 或 C

K=G 或 T S=C 或 G W=A 或 T

H=A 或 C 或 T B=C 或 G 或 T V=A 或 C 或 G

D=A 或 G 或 T N=A 或 C 或 G 或 T

4.2．限制酶识别序列的结构

限制酶识别的序列大多数为回文对称结构，切割位点在 DNA 两条链相对称的位置。 EcoRⅠ和 HindⅢ的识别序列和切割位置如下。

EcoRⅠ G↓AATTC HindⅢ A↓AGCTT

CTTAA↑G TTCGA↑A

有一些限制酶的识别序列不是对称的，如 AccBSⅠ[CCGCTC（-3/-3）] 和 BssS Ⅰ[CTCGTG（-5/-1）]。识别序列后面括号内的数字表示在两条链上的切割位置。

AccBSⅠ CCG↓CTC BssSⅠ C↓TCGTG

GGC↑GAG GAGCA↑C

有一些限制酶可识别多种序列，如 AccⅠ识别的序列是 GT↓MKAC ，也就是说可识别 4 种序列，其中两种是对称的，另两种是非对称的。 HindⅡ识别的序列是 GTY ↓RAC 。

有一些限制酶识别的序列呈间断对称，对称序列之间含有若干个任意碱基。如AlwNⅠ和 DdeⅠ，它们的识别序列如下。

AlwNⅠ CAGNNNC↓TG DdeⅠ C↓TNAG

GT↑CNNNGAC GANT↑C

4.3．限制酶切割的位置

限制酶对 DNA 的切割位置大多数在内部，但也有在外部的。在外部的，又有两端、两侧和单侧之别。切点在两端的有 Sau3AⅠ（↓GATC）、NlaⅢ（CATG↓）和 EcoR Ⅱ（↓CCWGG）等；在两侧的有 BcgⅠ[（10/12）CGA（N）6TGC（12/10）]和 TspR Ⅰ（CASTGNN↓）， BcgⅠ酶的切割特性与其它酶不同，它们在识别位点的两端各切开一个断点，而不是只产生一个断点。切点在识别位点外侧的还有 BbvⅠ[GCAGC （8/12）] 和 BspMⅠ[ACCTGC（4/8）] 等。

BcgⅠ↓10（N）CGA（N）6TGC（N）12↓ TspRⅠ NNCAC（G）TGNN↓

↑12（N）CGA（N）6ACG（N）10↑↑NNGTG（C）ACNN

5.限制性核酸内切酶产生的末端

5.1．限制酶产生匹配粘端（matched ends）

识别位点为回文对称结构的序列经限制酶切割后，产生的末端为匹配粘端，亦即粘性末端（cohesive end），这样形成的两个末端是相同的，也是互补的。若在对称

轴 5' 侧切割底物， DNA 双链交错断开产生 5' 突出粘性末端，如 EcoRⅠ；若在3'-侧切割，则产生 3' 突出粘性末端，如 KpnⅠ。

NNG↓AATTCNN EcoRⅠ NNG AATTCNN

NNCTTAA↑GNN NNCTTAA GNN

5.2．限制酶产生平末端（Blunt end）

在回文对称轴上同时切割 DNA 的两条链，则产生平末端，如 HaeⅢ（GG↓CC）和 EcoRV（GAT↓ATC）。产生平末端的 DNA 可任意连接，但连接效率较粘性末端低。

5.3．限制酶产生非对称突出端

许多限制酶切割 DNA 产生非对称突出端。当识别序列为非对称序列时，切割的 DNA 产物的末端是不同的，如 BbvCⅠ，它的识别切割位点如下。

CC↓TCAGC

GGAGT↑CG

有些限制酶识别简并序列，其识别的序列中有几种是非对称的。如 AccⅠ，它的识别切割位点如下，其中 GTAGAC 和 GTCTAC 为非对称。

GT↓AT/CGAC

CATA/GC↑TG

有些限制酶识别间隔序列，间隔区域的序列是任意的，如 DraⅢ和 EarⅠ

6.限制性核酸内切酶的应用

用于DNA基因组物理图谱的组建；基因的定位和基因分离；DNA分子碱基序列分

析；比较相关的DNA分子和遗传工程。限制性核酸内切酶是由细菌产生的，其生理意义是提高自身的防御能力.限制酶一般不切割自身的DNA分子，只切割外源DNA。

限制作用实际就是限制酶降解外源DNA ，维护宿主遗传稳定的保护机制。甲基化是常见的修饰作用，可使腺嘌呤A和胞嘧啶C甲基化而受到保护。通过甲基化作用达到识别自身遗传物质和外来遗传物质的目的。所以，能产生防御病毒侵染的限制酶的细菌，其自身的基因组中可能有该酶识别的序列，只是该识别序列或酶切位点被甲基化了。但并不是说一旦甲基化了，所有限制酶都不能切割。大多数限制酶对DNA甲基化敏感，因此当限制酶目标序列与甲基化位点重叠时，对酶切的影响有3种可能，即不影响、部分影响、完全阻止。对甲基化DNA的切割能力是限制酶内在和不可预测的特性，因此，为有效的切割DNA，必须同时考虑DNA甲基化和限制酶对该类型甲基化的敏感性。另外，现在很多商业限制酶专门用于切割甲基化DNA。

参考文献

[1] 李广军,高文. 问:酶的定义是什么?[J]. 生物学通报. 1997(06)

[2] 梁祖霞. 遗传工程师的“手术刀”——限制性内切酶[J]. 生命的化学. 1982(03)

[3] 杜革命. 限制性核酸内切酶的研究进展[J]. 中学生物教学. 2007(09)

[4] 梁红. 限制性核酸内切酶及其在遗传学上的应用[J]. 生物学通报. 1984(06)

[5] 柯为. 几种限制性核酸内切酶[J]. 遗传工程. 1983(01)

[6] 陈维辛,孙欣. 限制性内切酶及其应用[J]. 生化药物杂志. 1989(01)

[7] 唐任天. DNA限制性内切酶[J]. 广东蚕丝通讯. 1983(04)

[8] 皮新春,邹国林. 限制性核酸内切酶与DNA相互作用研究进展[J]. 氨基酸和生物资源. 1997(02)

[9] 邹国林. Ⅱ型限制性核酸内切酶的性质[J]. 生物学通报. 1985(10)

[10] 吴举宏. 基因工程中工具酶的有关问题解答[J]. 中学生物教学 2011年03期

[11] 孙庆兴. 限制性核酸内切酶拓展[J]. 中学生物学 2008年01期

[12] 吴举宏. 基因概念的发展[J]. 中学生物教学 2000年01期

[13] 吴玉厚,张永忠,朱奇,周国利,杨洪双. 基因芯片技术与生命科学的发展[J]. 生物学教学 2006年09期

[14] 吴举宏. “现代生物科技专题”模块若干问题探讨[J]. 中学生物教学. 2009(11)

[15] 潘泽民. DNA甲基化在基因表达调控中的作用[J]. 国外医学.临床生物化学与检验学分册. 2001(06)

致谢：

从开始写作至论文最终定稿，总共花费了我一个月以来所有的业余时间，虽说在繁忙的工作之余要完成这样一篇论文的确不是一件很轻松的事情，但我内心深处却满含深深的感激之情。感谢陈丽丽老师，是你们让您能够静静地坐下来，在知识的海洋里吸取更多的营养，从而能够为自己进一步的加油充电。通过论文的撰写，使我能够等系统、全面的学习有关财务管理新型的、先进的前沿理论知识，并得以借鉴众多专家学者的宝贵经验，这对于我今后的工作和我为之服务的企业，无疑是不可多得的宝贵财富。由于本理论水平比较有限，论文中的有些观点的归纳和阐述难免有疏漏和不足的地方，欢迎老师指正。