第二章 培养基

第二章培养基

1. 培养基的种类及特点

在离体培养条件下，不同种植物的组织对营养有不同的要求，甚至同一种植物不同部分的组织对营养的要求也不相同，只有满足了它们各自的特殊要求，它们的生长才能尽如人意。为了满足培养各种组织和器官的需要，已经出现了若干种培养基，如MS培养基、改良White培养基、Miller培养基、Heller培养基、LS培养基、 ER培养基、 B5培养基SH培养基、Nitsch培养基、N6培养基等，MS培养基特点：是无机盐的浓度高，有加速愈伤组织生长的作用，能满足植物组织对矿质营养的要求。铵盐和硝酸盐含量高，比例也比较适合，也不需要添加更多的有机附加物，这是目前应用最广泛的一种培养基。但它不适合生长缓慢、对无机盐浓度要求较低的植物，尤其不适合过高易发生毒害的植物。

改良的White培养基则是一个无机盐浓度较低的培养基。它的使用也很广泛，同时它还非常适合于生根培养和胚胎培养。

B5培养基特点是含有较低的铵盐，该营养成分可能对不少培养

物的生长有抑制作用，对有些植物如双子叶植物（如豆科植物）特别是木本植物，却更适合生长。

N6培养基其KN03和(NH4)2S04含量高且不含钼。目前在国内已广泛应用于小麦、水稻及其他植物的花粉和花药培养和组织培养。

SH培养基与B5相似，不用(NH4)2S04而改用NH4H2P04，在不少单子叶和双子叶植物上使用，效果很好。马铃薯简化培养基是为适应经济

条件较差的农村农科站和中学而设计的，既经济又适用，容易取材，有利于组培技术推广和普及。

2. 培养基的成分

目前，不论液体培养还是固体培养，大多数植物组织培养中所用的培养基都是由水、无机营养物、碳源、维生素、

生长调节物质和有机附加物等几大类物质组成。

2.1 水分

生物的生命活动离不开水分。构成培养基的绝大部分组分为水分。在研究上，常用蒸馏水来配制培养基，而最为理想的水应该是纯水。在生产上，为了降低成本，有时也可以用高质量的自来水代替蒸馏水。由于自来水中除了含有大量的钙、镁、氯和其他金属离子外，还含有有机物质。因此，最好将自来水煮沸，经过冷却沉淀后再使用。

2.2 无机营养物(无机盐)

植物所必需的营养元素有16种，包括碳 (C)、氢(H)、氧(O)、氮(N)、磷(P)、钾(K)、硫(S)、钙(Ca)、和镁(Mg)、铁(Fe)、锰(Mn)、铜(Cu)、锌(Zn)、氯(C1)、硼(B)、钼(Mo)，除碳 (C)、氢(H)、氧(O)外，其余的都是无机营养元素。无机营养物包括大量元素和微量元素。植物所需元素的浓度大于0.5mmol/L的称大量元素，包括碳 (C)、氢(H)、氧(O)、氮(N)、磷(P)、钾(K)、硫(S)、钙(Ca)、和镁(Mg)。它们是植物细胞中构成核酸、蛋白质、酶系统、叶绿体以及生物膜所必不可少的元素。在植物组织培养中,各种营养元素主要从培养

基中获得，氢和氧来自于水，碳来自于在培养基中加入的适当种类与数量的糖, 氮(N)、磷(P)、钾(K)、硫(S)、钙(Ca)、镁(Mg)几种矿物元素要靠加入适宜的无机盐类来提供。其中氮常以硝态氮(NO3-)或氨态氮(NH4+)，或两者相互配合的形式存在。镁常以MgS04·7H2O的形式，既提供了镁也提供了硫。硫还有用Na2S04的形式提供，不过其中的钠(Na)对植物并不是必需的，或者说常常是不利的。磷常以NaH2P04·H2O、KH2P04或NH4H2P04的形式提供。钾常以KCl、KNO3或KH2P04形式。钙常以CaCl2·2H2O、Ca(N03)2·4H2O或其无水形式提供。

植物所需元素的浓度小于0.5mmol/L的称微量元素，其需要量很少，一般大多为10-5～10-7 mmol·L-1，多了会生毒害。培养基中的微量元素主要包括铁(Fe)、锰(Mn)、铜(Cu)、锌(Zn)、氯(C1)、硼(B)和钼(Mo)等。这些元素有的对生命活动的某个过程十分有用，有的对蛋白质或酶的生物活性十分重要，有的是参与某些生物过程的调节。Fe有两个重要功能，作为酶的重要组成成分和合成叶绿素所必需，缺铁时细胞分裂停止。Mn对糖酵解中的某些酶有活化作用，是三羧酸循环中某些酶和硝酸还原酶的活化剂。B能促进糖的过膜运输，影响植物的有性生殖如花器官的发育和受精作用。B还具有抑制有毒的酚类化合物形成的作用，改善某些植物组织的培养状况，缺硼时细胞分裂停滞，愈伤组织表现出老化现象。Zn是吲哚乙酸生物合成必需的，也是谷氨酸脱氢酶、乙醇脱氢酶

等的活化剂。Cu是细胞色素氧化酶、多酚氧化酶等氧化酶的成分，可影响氧化还原过程。Mo是硝酸还原酶和钼铁蛋白的金属成分。Cl在光合作用的水光解过程中起活化剂的作用，促进氧的释放和还原NADP(辅酶Ⅱ)。为了某些植物组织培养的特殊需要有人还把钠(Na)、镍（Ni)、钴(Co)、碘(I)等也加入微量元素的行列。Na对某些盐生植物、C4植物和景天酸代谢植物是必需的。Ni对尿酸酶(urease)的结构和功能是必需的。但是有些成分的作用至今还不十分清楚，可人们仍然把它们加入培养基中，如碘(I)和钴(Co)等。铁作为一种微量元素，对植物也是必需的，但由于Fe的特殊性质，即很不稳定、易沉淀，需要在酸性条件下才能比较稳定，故在培养基配制时常常把Fe盐单独配制，且常以螯合物的形式，把FeS04和它的螯合剂乙二胺四乙酸二钠(Na2EDTA)先分别配成溶液，再相互混合使形成螯合铁，以防止沉淀和帮助被植物吸收。也可直接使用现成的NaFe·(EDTA)2。

为了使用方便，无论是大量元素还是微量元素都常常是先配制成母液(即比实际培养基中的使用浓度高的贮存液)，贮存在4℃冰箱内或在室温下短期存放。

2.3 碳源和能源

植物组织培养要人工提供碳源作为生长发育的能源。一般是添加蔗糖、葡萄糖和果糖，其中以蔗糖最常用，效果也最好。然而，在体细胞组织培养中，葡萄糖、麦芽糖、山梨醇糖也有影响；在花药培

养中，麦芽糖也有促进作用。糖类在培养基中除了作为碳源和能源外，还具有维持培养基一定渗透压的作用。

2.4 维生素类

维生素类与植物体内各种酶的形成有关。维生素类的种类很多，在植物组织培养中通常以B族维生素为主，使用浓度一般为0.1～1.0 mg·L-1，其中以维生素盐酸硫胺素(Vit.B1)、盐酸吡哆素(Vit.B6)、烟酸(Vit.B3，又称维生素PP)、泛酸钙(Vit.B5)、钴胺素(Vit.B12)、生物素(维生素H)、叶酸（维生素Ｂc）及抗坏血酸（维生素C）最常用。在各种维生素中，Vit.B1可能是必需的，而烟酸及Vit.B6对生长只有促进作用。肌醇(环己六醇)本身不促进外植体生长，但可能有助于活性物质发挥作用，提高Vit.B1的效果，从而促进外植体生长、胚状体及芽的形成；培养基中的肌醇用量为50～100mg·L-1。

2.5 氨基酸及有机附加物

在一些培养基中可加入一些氨基酸，如甘氨酸(Gly)、丝氨酸(Ser)、酪氨酸(Tyr)、谷氨酰胺(Gln)、天冬酰胺(Asn)等，它们是培养基中重要的有机氮源。最常用的是甘氨酸，它能促进离体根的生长，对植物组织培养物的生长也有良好的促进效果，通常用量为2～3 mg·L-1。另外，在某些植物或某些组织的培养中还加有水解乳蛋白(LH)、水解酪蛋白(CH)、天然的有机物如椰子汁(椰乳，10％或100～150 ml·L-1)、玉米胚乳、麦芽浸出物、西红柿汁（5％～10％）、黄瓜汁（5％～10％）、酵母浸出物（O.5％）、香蕉泥（100～200 mg·L-1）等。其作用是提供一些必要的微量营养成分、

生理活性物质和生长激素等，可能对某些植物或植物的某些代谢过程有重要作用。如培养基中加入100～200 mg·L-1的香蕉泥，具较大的pH缓冲作用，主要用于兰花的组织培养，对幼苗发育有促进作用。但由于天然有机物成分复杂且不确定，很难保证重复一致，因而在培养基的配制中更多人仍倾向于选用已知的合成有机物。

2.6 植物生长调节物质

生长调节物质是培养基中不可缺少的关键物质，其用量虽极少，但它们对外植体愈伤组织的诱导和器官分化起着重要和明显的调节作用，其中以生长素类和细胞分裂素类最为常用。

2.6.1 生长素类

它们的主要作用是诱导愈伤组织的形成、胚状体的产生以及试管苗的生根，更重要的是配合一定比例的细胞分裂素诱导腋芽及不定芽的产生。生长素类常用的是2,4－D(2，4－二氯苯氧乙酸)、NAA(萘乙酸)、IAA(吲哚乙酸)、IBA(吲哚丁酸)，它们作用的强弱顺序为：

2,4－D > NAA > IBA > IAA。

其使用的适宜浓度：IAA为10-5～10-10mol·L-1，以1～10 mg·L-1最常用；2,4－D为10-5～10-10mol·L-1；NAA的适宜浓度范围比前两者都高。2，4－D对于愈伤组织的诱导和生长非常有效。在大多数情况下，只用2,4－D就可成功地诱导外植体产生愈伤组织，假若将2，4－D等生长素类物质与一种细胞分裂素配合使用时，效果会更好。虽然2,4－D诱导细胞分裂较好，但这个化合物趋向于抑制植物的形态发生，故在诱导再分化时就很少用它(但在禾本科及某些单子叶植物

的培养中，2，4－D却对其器官分化有较好的促进效果)，一般多用NAA或IBA或IAA与一种细胞分裂素配合使用。值得一提的是，低浓度的2,4－D往往有利于胚状体的分化，IBA和NAA广泛用于生根，并能与细胞分裂素互作促进茎芽的增殖。NAA有利于单子叶植物的分化，而IBA诱导生根的效果最好。生长素一般溶于95 ％酒精或0.1mol ／L的NaOH中，以后者的溶解效果更好。

2.6.2 细胞分裂素类

常用的细胞分裂素类有：激动素(简称KT，规范的化学名称是糠基腺嘌呤)、6－苄基腺嘌呤(6－BA)、玉米素(ZT)、2－异戊烯腺嘌呤(2－iP)、吡效隆(4PU，CPPU)和噻重氮苯基脲(TDZ)。它们的主要作用是促进细胞的分裂和器官分化、延缓组织的衰老、增强蛋白质的合成、抑制顶端优势、促进侧芽的生长及显著改变其他的激素作用。在培养基中加入细胞分裂素的目的，主要是为促进细胞分裂和由愈伤组织或器官上分化不定芽。由于这类化合物有助于使腋芽由顶端优势的抑制下解放出来，因此也可用于枝条的增殖。就发挥同一生理效应的处理浓度来比较，它们作用的强弱顺序为：

TDZ，4PU > ZT > 2－iP > 6－BA > KT

但在组织培养中通常使用人工合成的、性能稳定又价格适中的KT和6－BA，二者的最适浓度为10-6～lO-7 mol·L-1。

细胞分裂素一般溶于0.5或1 mol／L的HCl或稀薄的NaOH中。

此外，赤霉素(GA3)、脱落酸(ABA)和多效唑(PP333)、等生长调节物质也见用于组织培养中。一些植物需要赤霉素和脱落酸增强

生长，而在另一些植物中需要它们抑制生长。GA3是20多种赤霉素中最常用的赤霉素，GA3能促进低密度培养细胞的生长，增加愈伤组织生长，诱导矮化或发育迟缓的植物伸长生长。GA3贮存液最好现用现配，过滤灭菌后加入到培养基中。根据植物种类不同，脱落酸(ABA)在培养基中刺激或抑制愈伤组织生长。据报道，ABA有利于胚胎培养。

2.7 琼脂

琼脂（琼脂粉、琼脂条）是从海藻中提取的一种高分子碳水化合物，它的主要作用是使培养基在常温下凝固，同时不参与代谢，所以在植物组织培养中一直被作为首选固体培养基质而广泛应用。新买来的琼脂应先试其凝固能力后再决定用量。在通常的情况下，纯净度高，含杂质量少，色浅、透明的质量好的琼脂，用量一般在O.6％～1.O％。而色黄、杂质多的琼脂质量较差。当培养基pH值偏酸时，则琼脂用量要增加。此外，加热时间过长、温度过高均会影响其凝固。

2.8 其他成分

2.8.1 活性炭

活性炭加入培养基中的目的主要是利用其吸附能力，减少一些有害物质的影响，例如可以防止酚类物质污染而引起组织褐化死亡。这在兰花组织培养中效果更明显。另外，活性炭使培养基变黑，有利于某些植物生根。但活性炭对物质吸附无选择性，既吸附有害物质，也吸附有利物质，例如植物生长调节物质、培养基成分(Vit.B6、叶酸、烟酸等)。因此使用时应慎重考虑，不宜过浓，一般在O.02％～1.O％，尤以O.1％～O.5％更常用。活性炭对形态发生和器官形成有良好的效

应。在失去胚状体发生能力的胡萝卜悬浮培养细胞中加人1％～4％的活性炭，可使胚状体的发生能力得以恢复。在高压灭菌之前加入活性炭会降低培养基的pH值，使琼脂不易凝固，该点在培养基配制时应予注意。

2.8.2 硝酸银

离体培养中的植物组织会产生和散发乙烯，而乙烯在培养容器中的积累会影响培养物的生长和分化，严重时甚至会导致培养物的衰老和落叶。AgNO3中的Ag+通过竞争性地结合于细胞膜上的乙烯受体蛋白，从而可起到抑制乙烯活性的作用。因此，在培养基中加入适量的AgN03，无论是在单子叶植物，如小麦和玉米中，还是在双子叶植物，如向日葵、拟南芥以及许多芸苔属植物中，都能起到促进愈伤组织器官发生或体细胞胚胎发生的作用，并能使某些原来再生困难的物种分化出再生植株。据报道，有些培养物在含有各种不同组合的生长素／细胞分裂素的培养基上都不能形成茎芽，但当培养基中加了AgN03后，则出现了茎芽分化。此外，AgNO3对于克服试管苗玻璃化及早衰和落叶等也有明显效果。

不过，也有些研究者指出，AgNO3并非总能阻止乙烯的积累。由于低浓度AgNO3能引起细胞坏死，而这种坏死细胞所产生的乙烯的数量，可能大于同一组织中非坏死细胞由于AgNO3对乙烯生物合成的抑制作用而减少的数量(Liu等，1990)。

据张鹏等(1997)报道，AgNO3的使用浓度一般为l～10 mg／L。使用前过滤灭菌，并须待培养基温度降到60℃以下时再加入培养基。

即便AgN03浓度适宜，也须注意不要把培养物长期保存在含AgNO3的培养基上，否则会导致再生植株畸形。Sharma等(1990)的经验是，培养物至少应在含AgNO3的培养基上培养lld方能见效，张鹏和傅爱根等(1997)则认为，AgN03处理时间的长短应取决于原基形成的时间，培养物一旦形成原基即可去掉AgN03。

2.8.3 抗生素

加入抗生素的主要目的是是防止由外植体内生菌造成的污染，减少培养物中材料的损失，尤其是快速繁殖中，常因污染而丢弃成百上千瓶的培养物，采用适当的抗生素可节约人力、物力和时间。常用的抗生素有青霉素、链霉素、土霉素、四环素、氯霉素、卡那霉素和庆大霉素金霉素、夹竹桃霉素等，用量在５～２０mg/L之间。

2.8.4 防止酚类物质污染的添加剂

植物组织在切割时会溢泌一些酚类物质，接触空气中的氧气后自动氧化或由酶类氧化为相应的醌类，产生可见的茶色、褐色以至黑色，这些物质渗出细胞外会造成自身中毒，使培养的材料生长停顿，失去分化能力，最终变褐死亡，这就是酚污染。抗酚类氧化常用的药剂有半光氨酸及盐酸盐，可用５０～２００mg/L的浓度洗涤刚切割的外植体伤口表面，或过滤灭菌后加入固体培养基的表层。其它的抗氧化剂有抗坏血酸、谷光甘肽等。

3. 培养基的选择

培养基的选择是植物组织培养中较为关键的环节。选择合适的培养基是植物组织培养成功的基础。选择合适的培养基主要从以下两个

方面考虑：一是基本培养基；二是各种激素的浓度及相对比例。

在选择一种新的植物材料进行组织培养时，为了能尽快建立起再生体系，最好选择表2－1所列培养基中的一种作为基本培养基。MS 培养基适合于大多数双子叶植物，B 5和N 6培养基适合于许多单子叶植

物，特别是N 6培养基对禾本科植物小麦、水稻等很有效，White 培养

基适于根的培养。首先试用这些培养基进行初步实验，可以少走弯路，大大减少时间、人力和物力的消耗。当通过一系列初试之后，可再根据实际情况对其中的某些成分做小范围调整。

组织培养中对培养物影响最大的是外源激素，在基本培养基确定之后，实验中要大量进行的工作是用不同种类的激素进行浓度和各种激素间相互比例的配合试验。在实验中，首先应参考已有的报道，看是否有用相同植物、相同组织或相近者做过成功或失败的试验，如果有则可直接作为参考；如果没有，则在建立激素配比中，将每一种拟使用的激素选择3～5个水平，再按随机组合的方式建立起如下的实验方案（表2－2）：

表2－2 两种激素4种浓度的组合实验

12 11 10 9 0.3mg/L 8 7 6 5 0.2mg/L 4 3 2 1 0.1mg/L 8mg/L 6mg/L 4mg/L 2mg/L 序 号 6－BA NAA

这样就设计出了16种激素配比的实验方案，即16种不同的培养基。用这16种培养基进行初试之后，你会找到1种或几种是比较好的。再在这些比较好的组合的基础上进行小范围的调整，设计出一组新的配方。如在表2－2中，您认为6号培养基较有希望，就可以在此基础上做出如表2－3的一组新的设计：

一般来说，经过这次实验就可能选出一种适合于你的实验材料的培养基，或许不是最好的，但结果是可靠的。在此基础上可进行培养基中其他成分的变动实验，如可变动蔗糖浓度、琼脂用量、培养基的pH 或添加某些氨基酸等。但必须掌握一个原则，就是要有理有据，特别是对一些宝贵的植物培养材料，更要慎之又慎。

如果上述试验失败，那就要做一些更细致、更麻烦的实验，花费更多的时间、人力和物力，切莫根据想像来随意设计培养基，这样成功的概率极小。 那么如何来进行更为复杂的实验设计呢？

表2－3第二次激素配比实验

15 10 5 5mg/L 14 9 4 4.5mg/L 13 12 11 0.2mg/L 8 7 6 0.15mg/L 3 2 1 0.1mg/L 4mg/L 3.5mg/L 3mg/L 序 号 6－BA NAA

为了能给一个新的实验体系选出一种适合的培养基，De Fossard等(1974)介绍了一种“广谱实验法”。和上面介绍的方法相比，这个方法是比较复杂的。然而，如果利用简单的方法解决不了问题，就有必要用这个方法试验一下。在这个广谱实验法中，把培养基中的所有组分分为4大类：无机盐、生长素、细胞分裂素和有机营养物质(蔗糖、氨基酸和肌醇等)。对每一类物质再选定3个浓度，即低(L)，中(M)和高(H)(见教材p31)。4类物质各3种浓度的各种不同组合即构成了一项包括81个处理的实验。在这81个处理中最好的一个可用4个字母表示。例如，一个包含中等浓度无机盐、低浓度生长素、中等浓度细胞分裂素和高浓度有机营养物质的处理即可表示为MLMH。达到这个阶段以后，即可再试验不同类型的生长素和细胞分裂素，以找到它们的最好类型。有些实验系统对于生长素和细胞分裂素这两类生长物质的具体形式非常敏感。

4. 培养基的配制

现在配制培养基的最简单的方法是用市售培养基干粉，其中含有无机盐、维生素和氨基酸。把这种干粉溶解在蒸馏水里(要比培养基的最终容积少10％)，加上蔗糖、琼脂和其他必要的补加物，最后再加入蒸馏水使之达到最终的容积。调节pH值，高压灭菌，于是制成所需要的培养基。如果没有培养基干粉，可采用以下两种方法来配制：

一个是按照配方规定的数量分别称量出各种成分，分别使它们溶解于水，然后再将它们混合在一起。另一个是先配制一系列的浓缩贮备液(母液)，包括大量元素、微量元素、铁盐、除蔗糖之外的各种有机物质，浓度为培养基配方使用浓度的10倍、20倍、50倍、100倍、200倍、500倍，甚至1000倍。平时应贮存在2～4℃冰箱内，待配培养基时取出，按比例稀释配用。

在这两种方法中，以第二种方法较常采用。母液如何配制呢？4.1 培养基母液的配制

母液的配制有两种方法：一种是配制成单一化合物母液；另一种是配成几种不同化合物的混合母液。前一种方法适合配制多种培养基都需要的同一种母液；后一种方法在大量配制同种培养基时省时省力。配好的母液应放在试剂瓶中贮存。

现以MS培养基配制为例来说明其母液的配制。在配制MS培养基母液时，为减少工作量可以把几种药品（如培养基中的大量元素或微量元素）配在同一母液中，但应注意各种化合物的组合以及加入的先后顺序，以免发生沉淀。通常把每种试剂单独溶解后再与别的也已完全溶解的药品混合，或者待前一种化合物完全溶解后再加入后一种化合物。混合已溶解的各种矿质盐时还应注意先后顺序，力求把Ca2+与SO42-和PO43-错开，以免形成硫酸钙或磷酸钙的不溶物。同时，要慢慢地混合，边混合边搅拌。

4.1.1 大量元素母液的配制

MS培养基中的大量元素除C、H、O外，剩下的六种可由KNO3、NH4NO3、

CaCl2?2H20、MgSO4?7H2O、KH2PO4几种无机盐来供应，它们可配在同一母液中。配制的步骤为：称量→分别溶解→混合→定容→装瓶→贴标签→放入冰箱保存。

注意：CaCl2? 2H20最后加入

4.1.2微量元素母液的配制

MS培养基中的微量元素可由MnSO4?4H2O、ZnSO4?7H2O、H3BO3、KI、Na2MoO4?2H2O、CuSO4?5H2O、CoCl2?6H2O几种无机盐来供应，它们也可配在同一母液中。配制步骤为：称量→分别溶解→混合→定容→装瓶→贴标签→放入冰箱保存。（不要求顺序）

4.1.3 铁盐母液的配制

铁盐母液宜单独配制，它是由硫酸亚铁(FeSO4·7H20)和乙二胺四乙酸二钠(Na2－EDTA)配制而成。配制步骤为：称量→分别溶解→混合→煮沸→调pH值至5.8→冷却→定容→装瓶→贴标签→放

入冰箱保存。

4.1.4 维生素、肌醇和氨基酸母液的配制

MS培养基中所需的维生素、肌醇和氨基酸母液应分别单独配制。配制步骤为：称量→溶解→定容→装瓶→贴标签→放入冰箱保存。

4.1.5 植物生长调节物质母液的配制

对于植物生长调节物质，配制成母液时，通常用mg·ml-1或 ppm （parts per million，即百万分的浓度，指一百万份重量的溶液中，所含溶质的份数）较为方便，一般配制成0.5mg·ml-1的母液，

这样的浓度便于计算也可避免冷藏时形成结晶。由于多数生长调节物质不溶于水，因此配法各不相同：IAA、IBA和GA3可先用少量95％酒精溶解，加水定溶，摇匀后贮于试剂瓶中，帖上标签后存放在冰箱中；NAA可溶于热水或少量95％酒精中，再加水定容至一定体积；2,4－D不溶于水，可用1 mol·L－１的NaOH溶解后，再加水定容；KT 和6－BA应先溶于少量1 mol·L－１的HCl中，再加水定容；玉米素先溶于少量95％酒精中再加水定容至一定浓度。目前植物生长调节物质浓度的表示法有两种：一种是ppm (或每升mg数)；另一种是

μmol·L－１。

配制好的各种母液应分别贴上标签，写明母液名称、配制倍数、日期，置于2～4℃的冰箱中保存。尤其对生长调节物质与有机类物质要求较严。贮存时间不宜过长，如发现有霉菌和沉淀结晶产生，就不能再使用。

4.2培养基的配制程序

4.2.1 药品及用具的准备

（１）MS培养基母液的准备

配制培养基时先将事先配制贮存的母液按顺序放好，并检查这些母液是否已变色或产生沉淀或产生结晶，已失效的就不要取用。包括大量元素、微量元素、铁盐、甘氨酸、盐酸硫胺素、盐酸吡哆素、烟酸、肌醇。

（２）用具、用品的准备

将洁净的各种用具如果酱瓶、量筒、烧杯、吸管、玻璃棒、医

用口杯、精密pH试纸、封口膜、橡皮筋、电炉等准备好放在指定的位置。再将蒸馏水、琼脂、蔗糖、生长调节物质、1mol·L-1NaOH、1mol·L-1HCl准备好。

4.2.2 MS培养基配制步骤

（１）根据需要配制的培养基的量称好所需的琼脂（0.７～0.８％），放入医用口杯中，加入适量的蒸馏水（估计加入母液后不超过配制总量）置于电炉上加热溶解，边加热边用玻棒搅动。

（２）待琼脂完全溶解后，加入规定用量的母液（可事先取好放于一烧杯中），再加入规定用量的蔗糖，继续加温并不断搅拌，待琼脂煮透后端离火源，根据培养基配方及培养基体积加入所需要的生长调节物质，最后定容至所需体积。

（３）调节培养基的酸碱性至pH5.8

由于培养基的pH值直接影响到培养物对离子的吸收，因而过酸或过碱都对植物材料的生长有很大影响；此外，琼脂培养基的pH值还影响到凝固情况。所以，当培养基配制好后应立即进行pH值的调整。最好用酸度计测试，既快又准，如无条件也可用精密pH试纸，但最好用一两种试纸同时测定，免得一种pH试纸偏差太大而明显影响外植体的生长。培养基若偏酸时用lmol·L-1NaOH来调节，偏碱则可用lmol·L-1 HCl来调节。一般来说，当pH值高于6.0时，培养基将会变硬；pH值低于5.O时，琼脂不能很好地凝固。

（４）培养基的分装

配制好的培养基要趁热分装，分装时容器口小者可采用漏斗分

注，口大者直接加注。试管、三角瓶等培养容器加注量占其容积的

1/4～1/3为宜，果酱瓶每瓶20～30ml，太多既浪费培养基，又减少了培养材料的生长空间；太少又会因营养不良影响生长。当用试管制备琼脂固化培养基时，最好把试管斜置，将培养基制成斜面，为外植体的生长提供一个较大的面积，又便于观察生长效果。培养基分装完后，用封口膜封严瓶口，并用橡皮筋扎紧。

（５）培养基的灭菌

由于未经灭菌处理的培养基既可能带有各种杂菌，同时又是各种杂菌良好的生长繁殖场所，因此培养基分装后应立即置于高压蒸气灭菌锅内进行灭菌。消毒灭菌时，压力表读数约为1.06kg·cm-2或O.106 MPa，121℃时保持15～30 min左右即可。为了保证灭菌彻底，在蒸气灭菌锅增压前应先将灭菌锅内的冷空气放尽。排净冷空气的办法可选用下列办法之一：可以事前打开灭菌锅放气阀，煮沸等大量热蒸气排出后再关闭；也可采用先关闭放气阀，待压力升到O.35kg·cm-2或O.037 MPa，108℃时打开放气阀排出空气，再关闭放气阀。培养基消毒灭菌时间不宜过长，也不可超过灭菌锅规定的压力范围；否则，培养基中的蔗糖、有机物质，特别是维生素类物质就会分解，导致培养基变质、变色，甚至难以凝固。当灭菌完成后，应切断电源或热源，待灭菌锅内气压接近“0”时，方可打开放气阀，拧开灭菌锅盖取出培养基。切勿为急于取出培养基而打开放气阀放气，否则锅内气压下降太快会引起减压沸腾，导致灭菌锅内各容器中的培养基溢出，造成浪费或污染，甚至烫伤工作人员。

对于吲哚乙酸、玉米素及某些维生素等遇热不稳定的生物活性物质，不能进行高压蒸气灭菌，而必须采用过滤方法灭菌。当高压灭菌后的琼脂培养基温度下降到大约40～50℃(感觉不烫手)时，可把已经过滤灭菌的溶液加入。

高压灭菌后的培养基凝固后，宜将培养基放到培养室中预培养2～3d，若没有杂菌污染才可放心使用。暂时不用的培养基应。放置于10℃下保存，而含有生长调节物质的培养基在4～5℃低温下保存更佳。含吲哚乙酸或赤霉素的培养基应在配制灭菌后l周内用完，其他培养基应该在消毒后2周内用完，至多不超过1个月，以免培养基干燥变质。

配制好的培养基若不能及时灭菌，最好放入冰箱或冰柜中，在24h 内完成灭菌工作。

课堂讨论选题：

植物生长发育的必需元素有几种？必需元素的条件是什么？其在植物体内的生理作用主要有哪几方面？

课外作业选题：

1、常用培养基分为哪几类？各类的主要特点是什么？

2、培养基的成分有哪些？各有什么作用？

3、试述培养基选择的方法。

4、简述培养基配制的基本过程。