分析验证方案及要求

分析方法验证方案及要求

目的：各项目验证方案相对同一，并达到相应要求。

适用范围：适用于起始原料、原料药和制剂的有关物质、异构体、含量、溶出度和残留溶剂的方法验证。

1.参考标准及参考文献

参考标准：USP/BP/EP/JP/CP 国标部标/进口注册标准符合说明/其他参考标准/参考文献等，并分析判断。

资料中结果和方案尽量以表格形式列出。

小数位数：所有有关物质百分含量计算过程中保留小数后3位，最终结果保留小数后2位。如果样品特别纯，最大杂质也在0.01%以下，则最终结果保留小数后3位。（四舍五入保留双）

*每个项目各自始终重点保留好已知杂质（包括起始原料和中间体）、异构体、购买对照品（包括包装说明书空瓶）、自制对照品和粗品等。

2.1优化方法

UV扫描（杂质可用DAD），确定波长、优化流动相、柱温、样品配制溶剂及浓度和进样量等。粗品估计样品浓度（限度：限度浓度的对照溶液逢高至少大于LOQ两倍以上）。模方法及方法波长不能完全确定时，可以选择双波长进行。

要求：优化流动相跟他每一个条件重复进样两针，写所有试验详细记录，注意问题讨论和结论。图谱性能报告按有关物质放大比例打印。最后资料体现几个代表性的优化过程及附图。（几个参考方法列表，你比较优劣，如方法是在USP等法定或别的基础上优化的，则需有实验和图谱证明等同性或优越性。并做1-n批的对比测试，证明结果相当）

*原料和制剂报告限度、鉴定限和控制限的算法。原料制剂中降解的未知组分超过鉴定限和控制限应该排除分析上的问题后着手从工艺、原辅料质量和贮存条件等上下功夫解决。

2.2耐用性

有专家说考察系统适应性溶液的耐用性即可。建议在专属性前优化方法时就做（破坏试验之前），以更好的了解方法本身；建议用粗品做：为兼顾到含量的系统适应性溶液的配制，可以设计系统适应性溶液为“活性成分含量的浓度+有关物质限度的浓度”。

分别考察流动相的比例变化按相对比例±5%（注意梯度计算方法）、流动相缓冲盐的浓度按摩尔浓度的±10%，流动相pH值变化±0.2、柱温变化±5°C、检测波长变化±5nm（如UV图半峰宽）比较小则±2nm）、流速相对值变化±20%（时间和分离度达不到则减小）以及采用三根柱子不同批号或不同品牌的色谱柱（最好是在精密度时做）进行测定时，仪器色谱行为的变化，每个条件下按方法的系统适用性溶液（研究时按已知杂质加样品）测试两次（有关物质耐用性：空白+系统适用性溶液2针）共6个数据；含量耐用性：除系统适用性溶液连续进样5针，计算RSD，最后总的RSD。

要求：A各杂质峰的拖尾因子与原方法相当，不得大于2.0（0.5-2.5）；各杂质峰的分离度与原方法比较，不得小于1.5，杂质峰和主峰必须大袋基线分离，各峰含量的RSD不大于2%（流速和有机相比例变化不考察），保留时间不大于5%（流速和有机相比例变化不考察）。如达不到要求，特别是分离度，则减小变化幅度，并在质量标准中做严格规定。

B结果同时关注保留时间和相对保留时间的变化，所有结果以表格形式列出，按有关物质放大比例尺打印谱图性能报告。资料中附图。

2.3

2.3.1系统适应性

试验前确定好杂质谱并得到所有杂质样品，并对样品和粗品按面积归一化或自身对照法进行过粗约测试，初步讨论各杂质限度。质量研究中的系统适用性包括的杂质不仅仅是质量标准中系统适应性溶液的杂质，包括既定研究的已知杂质。方法验证用同一批小试样品或中试样品。

空白、杂质定位溶液和样品（建议用粗品，更好的考察杂质情况）供试液：各1针，杂质单品浓度要合适，峰高1000-2000mv，以用面积归一化法计算各单品的纯度，样品纯度按面积归一化或自身对照法计算。

混合溶液：配制杂质（限度浓度或高于限度浓度）+样品（供试液浓度）的混合溶液，进一针。

要求：A所有试验连续进行。空白溶液和空白辅料对主峰和杂质峰无干扰，如干扰则优化条件。梯度每次试验前均做空白溶液1-2针。订入质量标准的系统适应性溶液每次试验均做，进一针。

B主峰与相邻杂质峰达到基线分离，分离度最好不小于2.0（如1.5-2.0质量标准系统适应性。可能要考虑到。并且做耐用性试验可能会达不到要求，则减小变化幅度，订质量标准中提高要求），各杂质峰之间的分离度最好不小于1.5（如达不到要求则单独论述）。对照溶液主峰

的拖尾因子不得大于1.5，理论塔板数按对照溶液主峰计算。

C．图谱按有关物质比例尺打印性能报告。资料中附图。

*样品供试液主峰保留时间的±5%范围内没有含大于0.1%的杂质峰（破坏试验除外）

2.3.2破坏试验

建议按溶液做强力破坏试验，固体破坏需要时间较长，影响因素试验60°C和光照也是破坏实验的额一部分。

配制高浓度有关物质储备液（建议用粗品），按比例稀释进行酸碱加热氧化光照破坏。其中一个或几个达到破坏的目的就行，破坏强度以5-30%为宜。建

议按如下方式进行破坏试验：

酸碱破坏起始以0.1-1M的酸碱室温避光放置2h，未破坏者再在不高于90°C的水浴加热0.3-2h。

氧化破坏起始已0.1-3%的双氧水室温避光放置2h，未破坏者再在不高于90°C的水浴加热0.3-2h，或加大到10%的双氧水室温避光放置0.5-2h。

加热破坏起始在不高于90°C的水浴加热0.3-2h，未破坏者用固体在恒温干燥箱中100-200°C 或不高于熔点的温度加热0.3-2h。

光照破坏起始于4500±500LX 光照箱中放置8-24h，未破坏者再置紫外灯下照8-24h，注意对光较敏感的样品结合溶液稳定性试验对比，建议和溶液稳定性一起进行该试验。

要求：A空白溶剂、未破坏供试液、破坏供试液和破坏空白溶液各进一针，按面积归一化法计算（注意：如供试液浓度比较高明显过载时。需要降低到适当浓度）试验连续进行，如分开进行则每次增加空白和未破坏溶液。

B图谱按有关物质比例尺打印性能报告。资料中附图

C结果注意判断杂质的归属，是否为已知杂质，提出交易产生的未知杂质是否有必要进行定性研究，资料可用表格归属更能清楚说明。

D能检测出降解产物并有合适的保留，降解峰与主峰分离度合适，破坏空白峰不干扰杂质峰和主峰。

*注意质量守恒

2.4准确度即回收率（同事的已知杂质的相对保留时间）

有关物质单品时做有关物质回收率试验。

按有关物质方法配制空白、样品对照溶液，根据有关物质的定量限与质量标准中该杂质的限度：分别加确定确定浓度的已知杂质至样品供试液中配制三个浓度的回收率供试品溶液各三

份（例如某杂质的限度为0.2%，则可分别配制该杂质浓度为0.1%（大于定量限）、0.2%和0.3%的杂质溶液，分别测定其含量（按校正因子面积归一化法或者按校正因子自身对照法），将实测值与理论值比较，计算回收率，并计算9个回收率数据的相对标准差（RSD）。

进样针数：A面积归一化法：空白溶剂1针，样品供试液和9份回收率供试液各1针，B主成分自身对照法：准确称量配制溶液，空白溶剂一针，样品对照溶液3针，样品供试液和9份回收率供试液各1针；

C杂质标准品外标法：准确称量配制溶液，空白溶剂1针，杂质对照品5+1针

要求：A各浓度下杂质含量的平均回收率应在80%~120%之间，如杂质的浓度为定量限，则该浓度下杂质含量的平均回收率可放宽至70%~130%，相对标准差不做具体规定，一般10%可以达到。

B 计算已知杂质的相对保留时间

C 图谱按有关物质放大比例尺打印，资料中附图

2.5线性与范围

定量方式：a)主成分自身对照法b）杂质标准品外标法

如果是a）使用样品对照品，6个浓度（LOQ-200%*限度浓度），每个浓度进3针，测定主峰面积；

如果是b）使用各个杂质标准品，同样6个浓度（LOQ-200%*限度浓度），每个浓度进3针，分别测定各杂质峰面积

以各浓度为横坐标（X），各峰面积位纵坐标（Y）,Y轴截距应在100%响应值的25%以内，响应因子的相对标准偏差应不大于10%。

2.6相对校正因子（相对响应因子、相对保留时间）

定量方式按主成分自身对照法和面积归一化法均需做相对校正因子，可以同2.4线性与范围同一试验进行，使用各个杂质标准品和本品工作对照品（样品也行），建议多做几个点如LOQ、20%限度、50%限度、80%限度。100%限度、120%限度、150%限度和200%限度（各组分浓度相同），线性按全范围进行回归，相对校正因子按较小的范围如50%-150%进行回归，计算主成分与各杂质线性方程斜率的比值即得，或按80%、100%和120%三点进行计算，比较三法的结果差异大小，取较小范围的结果。

要求：A计算相对保留时间，结合系统适应性和回收率的RRT结果，相差不能太大，RSD 应不大于2%，质量标准中RRT按平均值计算。

B 相对响应因子为相对校正因子的倒数。相对校正因子和相对响应因子保留计算后两位。

C图谱按尖峰打印，资料中附图。

2.7精密度

加已知杂质，可与有关物质回收率试验同时进行，定量方式：a)主成分自身对照法b）杂质标准品法

2.7.1重复性

按有关物质方法配制空白1针、各杂质限度浓度（从同一混合储备液中稀释）+样品供试液（测定浓度）配制6份（分别称取），主成分自身对照法:6*1和对照溶液3针；杂质标准品法：6*2针和对照溶液5+1针，由一个分析人员在尽可能相同的条件下进行测试。

要求：A 6份供试液各杂质和总杂含量的相对标准偏差不大于15%

B 图谱按有关物质放大比例尺打印。资料中附图。

2.7.2中间精密度

另一分析人员按2.6.1重复性的方法在不同品牌的仪器上试验，得到由两个分析人员使用不同的仪器测试得12个各杂质和总杂含量数据。建议做三根柱子的精密度验证，每次两份。

要求：A 12份供试液各杂质和总杂含量的相对标准偏差不大于20%

B 精密度图谱按有关物质放大比例尺打印。资料中附图。

2.8检测限和定量限【定量方式：a主成分自身对照法b杂质标准品法】

LOD/LOQ可以与同2.4线性与范围和2.5相对校正因子试验一起进行

精密称量的供试液逐级（每次1针）至各杂质峰和主峰与噪音峰信号的强度比应不得小于3和10，LOQ浓度的溶液配制6份，各一针。

要求：A所测LOQ 6份溶液各峰面积的相对标准偏差不做具体规定，一般10.0%能达到（可舍去个别比较差的数据），

B 实验记录详细的稀释过程并打印各级图谱，进样量不局限于方法规定，图谱性噪比报告打印放大比例至能看到信噪比或尽量显示整个基线，时间轴尽量长，资料中附各组分LOD/LOQ图。打印S/N的数据，不能打印的用铅笔手动画以示S/N。

*以LOQ的一倍以上计算出报告浓度和报告限（低于LOQ没有资格报告，不积分）。

2.9溶液稳定性【定量方式：a自身对照法b杂质对照品法】

可与光照试验同时进行。

按照有关物质分析方法配置供试品溶液并测定各杂质和总杂的含量（面积归一化法，也可同时计各杂质峰面积），然后将上述溶液分别密封贮存在室温（室温不稳定则进行冰箱冷藏室2-4°C）中，分别于1、2、4、6、8、12、18、24和48小时测定（各1针）。进行到12h即可，对光敏感和需要做关照对比的样品可进行到24h至48h。

要求：A总杂和各杂质含量的绝对值在±0.1%以内，并且不得出现新的大于报告限度的杂质记为较稳定，否则质量标准做特殊规定。

B 图谱按有关物质放大比例尺打印。资料中附图。

2.10几批产品的全检的有关物质测定

三批小试全检、自制对照品标定（无法定标准品）、市售参比制剂、三批中试0天的测定。

如果用滴定的方法（非水、酸碱和氧化还原）也均做HPLC方法验证和样品检测，并阐述最终质量选用的方法的理由。

确保方法样品供试液主峰保留时间的±5%范围内没有含大于0.1%的杂质峰

资料中方案和结果尽量以表格的形式列出。

小数位数：HPLC含量及溶出度计算过程中保留小数后2位，最终结果保留小数后1位；滴定含量计算过程中保留小数后3位，最终结果保留小数后2位（四舍五入保留双）

3.1确定方法

制剂原料药的含量和有关物质方法尽量一致。但考虑到运行时间和柱子在氧量，在流动相比例、梯度变等度、溶剂和样品浓度等需要适当的改变。

要求：一般含量的主峰峰高为200~500mV即可，在满足系统适应性的前提下，C18 250*4.6*5μm的柱子主峰（5-15min）（每针运行10-20min），资料中阐述理由。

3.2耐用性

方法与有关物质相同则不做。不同或相似则做，见有关物质耐用性做法和要求。

3.3专属性

3.3.1空白及空白辅料

空白及空白辅料对主峰无干扰，各进样1针。如空白辅料有干扰，则每一个单一辅料单独进样，再优化色谱条件。空白辅料与主峰分离度小于2.0，则考虑该单一辅料订入系统适应性溶液中，主成分与各有关物质应能完全分离，分离度不得小于2.0.

要求：图谱按系统适用性尖峰打印。资料中附图。

3.3.2系统适应性

为操作方便，如含量与有关物质方法相似，则系统适应性溶液相同：“活性成分含量的浓度+有关物质限度浓度”，但要求的分离度可能不同。

一般系统适应性溶液同有关物质1针，对照品5+1针。

要求：A系统适应性溶液杂质与主峰分离度达到要求，主峰的拖尾因子不得大于2.0，理论塔板数达到要求，

B对照品5+1针校正因子的RSD大于2.0%，主峰保留时间的相对标准偏差应不大于1.0%。每次试验前均做。

C系统适应性溶液图谱按杂质尖峰比例打印性能报告，其他谱图按含量尖峰打印。资料中方法学附系统适应性溶液的图谱按尖峰打印性能报告。专属性、多批样品含量测定附图，其余方法验证按尖峰打印并不附图。

3.4准确度

单一原料药含量方法学不做回收率

验证时一般要求分别配制浓度80%、100%和120%的供试品溶液各三份，分别测定其含量，求其实测值与理论值比较，计算回收率。系统适应性溶液1针、对照品5+1针，供试液

2针。

要求：各浓度下的平均回收率应在98.0%~102.0%之间，9个回收率的相对标准偏差（RSD）应不大于2.0%。

3.5线性与范围

在80%~120%（有溶出度测定的50%~150%，缓释制剂：20%~150%）的浓度范围内配制6份浓度不同的供试液，分别测定其主峰的面积，计算相应的含量。以浓度的横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），进行线性回归分析。每个浓度3针。

要求：回归线的相关系数（R）不得小于0.999，Y轴截距应在100%响应值的2%以内，响应因子的相对标准偏差不大于2.0%。

3.6精密度

可考虑与线性范围一起做。

3.6.1重复性

配制6份相同浓度的供试品溶液，由一个分析人员使用不同的仪器与试机进行测试，所得6份供试液含量的相对标准差应不大于2.0%。

3.6.2中间精密度

配制6份相同浓度的供试液品，分别由两个分析人员使用不同的仪器与试机剂型进行

测试，所得12个含量数据的相对标准偏差应大于2.0%。“不同色谱柱”？

3.7溶液稳定性

可以考虑与含量精密度同时做。

按照含量方法配置供试液（0h 1针），然后将上述溶液分别密封贮存在室温（室温不稳定则进行冰箱冷藏室2-4°C）中，分别与1、2、4、6、8、12、18、和24h测定（各1针）。一般做到12h，如果有溶出或缓释，根据情况做到18或24h。

要求：主峰面积的相对标准差不大于2.0%。

不稳定则建议低温进样并注明**小时稳定完成进样，或即配即用**小时完成进样。

3.8几批产品的全检的含量测定

三批小试全检、自制对照品表达（有法定标准品）、市售参比制剂、三批中试0天的测定

4含量（非水滴定和酸碱滴定）

4.1方法的建立与确定

原理及方法。滴定曲线及滴定终点（一阶导数）附图或制图，滴定曲线突跃较大、终点明显。

4.2样品浓度与范围

在80%~120%的浓度范围内配制3个浓度9份供试液，测定其含量，相对标准偏差不大于0.2%。

4.3重复性

测定同一批供试品6份含量，相对标准偏差不大于0.2%

4.4几批产品的全检的含量测定：三批小试全检、自制对照品标定、三批中试0天的测定。

5.异构体（HPLC）

反相测定非对应异构体方法验证同有关物质。正相测定异构体方法验证做系统适应性、加热和光照实验（也可加TFA和二乙胺乙醇胺，仅了解样品的性质，不是验证需要的的）、LOD/LOQ、溶液稳定性、重复性实验。要求和可接受标准同有关物质。异构体的图谱均附图。

几批产品的全检的含量测定：三批小试全检、自制对照品标定、三批中试0天的测定**1-3批起始原料异构体检测图谱

6.残留溶媒（GC）

待测组分对照品AR以上级别，限度对照品溶液没有明显的的杂质峰。溶剂DMF/DMA/DMSOy用农药级或重蒸（去中后馏分）。

资料中方案和结果尽量以表格形式。小数位数：所有溶残百分比计算过程中保留小数后4位，最终结果保留小数后3~4位（限度要求百分比小数后3位以上的保留3位，限度要求百分比小数后4位的保留四位）（四舍五入保留双）

6.1优化方法

溶残首选顶空和DB-624毛细柱，按指导原则，不能顶空的直接进样。

顶空：对平衡时间和平衡温度有筛选和确定的过程，并注意平衡时间和平衡温度下产品是否会降解。不能避免降解则定性降解峰。

要求：优化柱子和程序升温并写所有试验详细记录，注重问题讨论和结论。图谱性能报告按照尖峰和适当比例尺打印。如方法比较难做或需要多个方法检测时资料简约说明并附图。

6.2 专属性

试验前确认并列出所用到的溶剂及其它可能用GC测定的杂质和降解产物，并对样品和粗品进行过测试，初步讨论确定好各杂质限度。

空白溶剂、各对照定位溶液和混合溶液各一针

要求：A空白溶剂对待测组分无干扰、如有干扰，每次样品测定前均做空白溶剂一针。

B 各组分峰达到基线分离，待测组分峰分离度不小于1.5，拖尾因子不得大于2.0.

C 混合溶液图谱按照尖峰或适当比例打印性能报告并附图。专属性、LOD/LOQ 和多批样品检测附图，其他不附图。

6.3准确度即回收率（回收率、线性和精密度可以一起做）

按方法配制空白、样品对照溶液和样品供试液：根据限度，分别加待测组分对照品至样品供试液中，80%、100%、120%三个浓度的回收率供试液各三份，分别测定其含量，将实测值与理论值比较，计算回收率，并计算9个回收率数据的相对标准偏差（RSD）。

进样针数：准确称量配制溶液，空白1针，对照品溶液3针，样品供试液和9份回收率供试液各1针。

要求：各浓度下的平均回收率均在80%~120%之间（一般90~110%可以达到的），相对标准偏差不应大于10%（外标法），5%（内标法）。目前自动进样及顶空的外标法也可到5%。

6.4线性与范围

6个浓度（LOQ-200%*限度浓度），每个浓度3针，测定各待测组分峰面积；

以各浓度为横坐标（X），各峰面积为纵坐标（Y），进行线性回归。

要求：回归线的相关系数（R）不得小于0.990，Y轴截距应在100%响应值的25%以内

6.5精密度

6.5.1进样精密度

对照溶液5针，各待测组分峰面积的相对标准偏差应不大于10%（外标法）；5%（内标法），目前自动进样及顶空外标法也可以达到5%。

6.5.2重复性，

按溶残测定方法配制空白溶剂1针、供试品溶液6份各1针和对照品溶液3针，所得6个溶残数据的相对标准偏差应不大于5%。

6.6检测限和定量限

LOD/LOQ可以同2.4线性与范围一起进行

精密称量的对照溶液逐级稀释（每次1针）至各杂质峰和主峰与噪音峰信号的强度比应不得小于3和10，LOQ浓度的溶液配制3份，各进一针。

要求：A所测LOQ 3份溶液杂质峰保留时间的相对标准偏差应不大于2.0%，峰面积的相对标准偏差不做具体规定，，一般10.0%能达到。（可舍去个别比较差的数据）B实验记录详细的稀释过程并打印各级图谱，进样量不局限于方法规定；图谱性噪比报告打印放大比例至能看到信噪比或尽量显示整个基线，时间轴尽可能的长，资料中附各LOD/LOQ 图。

6.7几批产品的全检的含量测定：三批小试、自制对照品和三批中试的检测图谱。

7起始原料及中控和分离中间体的方法学试验

起始原料及重要中间体的质量标准较多规定异构体和有关物质检查，检查残留溶剂较少，含量较少用色谱外标法，较多用滴定法。

异构体、残留溶媒和含量（滴定）方法验证同产品，起始原料有关物质（面积归一化或自身对照法）侧重于方法的建立和优化、系统适用性（中间体+特定杂质）、线性（面积归一化做高浓度且范围宽,，自身对照法做低浓度）、相对校正因子、溶液稳定性（0~8hr）和LOD/LOQ等方法验证，如果合成不能提供起始原料中间体及特定杂质就不做系统适用性（但方法的风险性很大）、相对校正因子。重要中间体偏向于与产品相同或相近，根据情况选择性的做一些方法学验证试验，如系统适用性（相同或相近）、LOD/LOQ相近）。

几批产品的检测：1-3批起始原料检测，三批小试、自制对照和三批中试（生产厂家）的中控和分离中间体的实验图谱。

8 自制对照品的标定（不小于99.5%）

含量用自制对照品除按质量全检外，还需含量标定。

方法1：有法定标准品（可以滴定）：HPLC+滴定

两份法定标准品10mg，5+1针，5份自制对照品，5*2针，外标法计算含量及RSD；另一个人另一台仪器同法测定。计算总的RSD。（做6份则为含量的额重复性和中间精密度，无需另做）。

如可以滴定，则两法同做，（同样两人次标定）

方法2：无法定标准品（可以滴定）：滴定

用经验证的滴定方法，两人次标定，每人次五份（可同重复性，无需另做）。扣除水分得干品含量为标定含量。

方法3：无标定标准品（不滴定）：校正因子自身对照法。

称取5份自制对照品，5*2针，计算5份样品的总杂，扣除总杂得纯度，得平均值及RSD；另一个人另一台仪器同法测定，计算总的RSD（做6份则为有关物质的重复性和中间精密度，无需另做）

扣除自制对照品全检测得的水分、残留溶剂和炽灼残渣即为含量标定结果；

含量结果=纯度-水分-溶残-炽灼残渣

注：标定后贴好详细标签（批号、水分、溶残、干品含量、标定人、重量、有效期）。

使用时做好对照品实验记录，每次使用后及时密封低温保存，使用时无需干燥和测定水分。

9杂质对照品的要求**

订入质量标准需要用校正因子计算的特定杂质对照品要求95%以上纯度并代入校正因子的计算，此校正因子最后要两人次不同的仪器测定。研究的其余已知杂质要求可以放低。

同样质量标准中用相对保留时间定位的RRT值要多次不同仪器不同柱子测得（耐用性、校正因子、系统适用性和回收率多次测得的平均值），并且在质量标准中写出保留时间“约为。。。”以供参考。质量标准中附带说明的有关物质不作此要求。

**每个项目的质量研究负责人注意：各试验目的明确，理解透彻，方案的具体设计要合理有效；也要注重项目的整体考虑和各试验统筹设计，避免做重复工作。