Ano2是钙激活氯离子通道的分子基础_藏雨轩

2014年11月第34卷第11期

基础医学与临床Basic ＆Clinical Medicine November 2014Vol．34No．11

收稿日期：2014-02-12

修回日期：2014-08-25

基金项目：国家自然科学基金（81202031）；吉林省教育厅“十二五”科学技术研究项目（2013-351）；2013年吉林省大学生创新创业训练计划（856号）；吉林医药学院大学生科研项目［吉医学科字（2012）第12号］

*

通信作者（corresponding author ）：haof863@126．com

文章编号：1001-6325（2014）11-1477-05

研究论文

Ano2是钙激活氯离子通道的分子基础

藏雨轩1

，方

芳2，朱杭飞2，向国艳1，张雲乔1，李瑷彤1

，郝

峰

1*

（吉林医药学院1.生物化学检验教研室；2.免疫学教研室，吉林吉林132013）

摘要：目的探讨Ano2是否为钙激活氯离子通道的分子基础。方法用ＲT-PCＲ技术扩增Ano2编码基因，将Ano2

连接到真核表达载体pEGFP-N3；通过脂质体介导将Ano2转染至FＲT 细胞，抗生素筛选获得稳定表达Ano2的细胞系；倒置荧光显微镜下观察Ano2在FＲT 细胞中的表达和分布，

Western blot 检测Ano2的表达；全细胞膜片钳技术研究Ano2的电生理学特性。结果成功构建pEGFP-Ano2真核表达载体；Ano2表达在FＲT 细胞膜上；Ano2电流呈Ca 2+、时间和电压依赖性，电流和电压关系呈外向整流。结论Ano2是钙激活氯离子通道的分子基础。

关键词：Ano2；FＲT 细胞；转染；钙激活氯离子通道

中图分类号：Q 424

文献标志码：A

Ano2is the molecular identity of calcium-activated chloride channels

ZANG Yu-xuan 1，FANG Fang 2，ZHU Hang-fei 2，XIANG Guo-yan 1，ZHANG Yun-qiao 1，

LI Ai-tong 1，HAO Feng 1*

（1.Dept．of Biochemistry Laboratory ；2.Dept．of Immunology ，Jilin Medical College ，Jilin 132013，China ）

Abstract ：Objective To investigate that whether Ano2is the molecular identity of calcium-activated chloride channels．Methods

The full length coding sequence of Ano2was amplified by ＲT-PCＲ，Ano2and eukaryotic ex-

pression vector pEGFP-N3were ligated ；Then recombinant plasmids were transfected into FＲT cells using liposome ，and the stable transfection FＲT cells were selected with antibiotic ；the expression and location of Ano2was ob-served by the inverted fluorescence microscope and its expression was detected by Western blot ；the electrophysio-logical properties of Ano2were researched by whole-cell patch-clamp technique．Ｒesults

pEGFP-Ano2was suc-cessfully constructed ，FＲT cell membrane expressed Ano2；the electrophysiological properties of Ano2were Ca 2+-，time-and voltage-dependent ，and an outward-rectifying I /V relationship was observed．Conclusions Ano2is the

molecular identity of calcium-activated chloride channels．

Key words ：Ano2；FＲT cells ；transfection ；calcium-activated chloride channels

钙激活氯离子通道（calcium-activated chloride channels ，CaCCs ）是一类在内皮细胞、平滑肌细胞和神经元等细胞广泛表达的阴离子通道，在跨上皮液体转运、嗅觉信号传导和平滑肌收缩等多种生理过程中扮

演重要角色

［1-2］

，同时CaCCs 也是治疗高血压、腹泻和

某些特定肿瘤等疾病潜在的药物靶点［3］

。跨膜蛋白16

家族（transmembrane protein 16）共有10个成员，目前已证实Ano1（anoctamin 1）是CaCCs 的分子基础

［4-5］

，但

基础医学与临床Basic＆Clinical Medicine2014.34（11）

对其他成员的作用还不十分清楚。本实验探讨Ano2（anoctamin2）是否是CaCCs的分子基础。

1材料与方法

1.1材料

限制性内切酶、T4连接酶和Taq酶（Takara公司）；引物合成和测序（上海生工公司）；ＲT-PCＲ试剂盒和Trizol（Invitrogen公司）；DNA凝胶回收试剂盒（Qiagen公司）；FＲT细胞（大连医科大学麻彤辉教授馈赠）；兔源增强型绿色荧光蛋白（EGFP）抗体和羊抗兔二抗（中杉金桥公司）；F-12基本培养基、4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）、氯化铯（CsCl）、N-甲基-D葡萄糖胺（NMDG）和尼氟灭酸（niflumic acid，NFA）（Sigma公司）；胎牛血清（四季青公司）。

1.2方法

1.2.1引物设计与合成：NCBI查询小鼠Ano2基因（NM_153589）序列，设计位于开放读码框架两端的引物，去除下游引物终止密码子后加入保护碱基和相应酶切位点EcoＲⅠ（GAATTC）和KpnⅠ（GGT ACC）。上游引物：5'-CGAATTCCGTCTGAGCCGCA TGCACTTT-3'；下游引物：5'-GCGGTACCTACATTGG TGTGCTGGGACC-3'。

1.2.2ＲT-PCＲ扩增Ano2基因：提取小鼠视网膜总ＲNA，仅转录为cDNA，以此为模板进行PCＲ反应，94?预变性5min；94?30s，55?30s，72?3.5min，30个循环；72?，10min，PCＲ产物琼脂糖凝胶电泳后，切胶回收阳性片段。

1.2.3pEGFP-Ano2的构建、转化与鉴定：EcoＲⅠ和KpnⅠ双酶切Ano2与pEGFP-N3后，16?连接过夜。将重组质粒转化入感受态DH5α，次日挑取阳性克隆，摇菌扩增，12h后提取质粒，酶切正确后测序。1.2.4稳定表达pEGFP-Ano2细胞系的建立：将长势良好的FＲT细胞铺6孔板，置于37?、5%CO2培养箱培养。待第2天细胞汇合度达80% 90%，将0.5μg质粒分別与1、1.5、2和2.5μL脂质体Li-pofectamine2000，混合进行转染，倒置荧光显微镜观察转染pEGFP-Ano2在Fisher大鼠甲状腺滤泡上皮细胞（Fisher rat thyroid，FＲT）中Ano2的表达情况，选取转染效率高的质粒和脂质体比例进行后续实验。36h后将转染的FＲT细胞消化，按照1?5?10的比例传代到3个10cm培养板中，并加入含有1000ng/mL的G418的完全培养液培养，挑取纯度和表达量均较高的克隆到96孔板继续培养，待细胞汇合度达60%后扩大培养。

1.2.5Western blot检测pEGFP-Ano2的表达：转染后36h，消化收集细胞并超声裂解，将定量的蛋白样品上样进行SDS-PAGE凝胶电泳，180mA2h电转移至NC膜，脱脂奶室温封闭2h，然后加EGFP抗体、内参β-actin抗体和羊抗兔二抗摇晃孵育，TBST 洗膜3次，ECL（A和B显色液等体积混合）化学发光试剂显影，放入凝胶成像系统中拍照，用Quality one软件分析灰度值。实验数据以均值?标准差（x?s）表示，应用SPSS13.0软件进行统计分析，组间比较采用t检验。

1.2.6全细胞膜片钳技术记录Ano2的电流：将转染pEGFP-Ano2的FＲT细胞消化置于倒置荧光显微镜载物台，电极给予负压吸引并击破细胞膜，维持GΩ高阻抗封接，形成whole-cell patch。初始钳制电压为0mV，施加从－100mV跃阶到+100mV电压（每20mV一个step），各记录750ms电流变化，750ms后电压变为－60mV，继续记录200ms，CaCCs的抑制剂NFA作为对照。配制600nmol/L Ca2+溶液和0nmol/L Ca2+溶液，配方详见参考文献［6］。

2结果

2.1重组pEGFP-Ano2真核表达载体双酶切鉴定

琼脂糖凝胶电泳结果约在4700、2700、7400、7400和4000bp处有5条清晰带，与预期结果一致（图1）

。

1.Ｒestriction enzyme of recombinant plasmid pEGFP-

Ano2by EcoＲⅠ/KpnⅠ；2.EcoＲⅠsingle enzyme；

3.KpnⅠsingle enzyme；

4.pEGFP-Ano2recombinant

eukaryotic expression plasmid；5.DL5000DNA marker

图1重组质粒电泳图

Fig1Electrophoregram of recombinant plasmid

8741

藏雨轩

Ano2是钙激活氯离子通道的分子基础

2.2

重组pEGFP-Ano2真核表达载体测序结果结果表明所构建重组质粒上连有目的基因

Ano2，经分析上游及下游酶切位点分别为EcoＲⅠ和Kpn Ⅰ，证实成功构建重组pEGFP-Ano2真核表达载体（图2）。2.3

瞬时转染条件的优化结果

0.5μg 质粒分别与1、1.5、2和2.5μL 脂质体，混合进行瞬时转染，0.5μg 质粒与2.5μL 脂质体转染效率最高（图3）。

2.4

稳定表达Ano2的FＲT 细胞

稳定转染pEGFP-Ano2的FＲT 细胞膜呈现绿色，提示FＲT 细胞成功表达pEGFP-Ano2（图4）。2.5

Western blot 检测FＲT 细胞中Ano2的表达转染pEGFP-Ano2的FＲT 细胞出现EGFP-Ano2和β-actin 两条带，片段大小正确，吸光度：EFGP-Ano2/β-actin =0.26?0.03，对照组的FＲT 细胞只出现β-actin 一条带，吸光度：EFGP-Ano2/β-actin =0.13?0.02，明显高于对照组（p ＜0.05）（图5）

。

图2重组质粒测序图

Fig 2

The sequencing results of recombinant

plasmid

A.0.5μg?1μL ；

B.0.5μg?1.5μL ；

C.0.5μg?2μL ；

D.0.5μg?2.5μL

图3不同比例的质粒与脂质体瞬时转染至FＲT 细胞Fig 3

The different ratios of plasmid and lipofectamine in FＲT cells （?200）

9

741

基础医学与临床Basic ＆Clinical Medicine 2014.34（11

）

A.bright field ；

B.dark field

图4稳定表达pEGFP-Ano2的FＲT 细胞Fig 4FＲT cells stably expressing pEGFP-Ano2（?400

）

1.Ano2was transfected into FＲT cells ；

2.Ano2was not transfected into FＲT cells

图5Ano2在FＲT 细胞中的表达

Fig 5The expression of Ano2in FＲT cells

2.6全细胞膜片钳技术结果在600nmol /L Ca

2+

存在的情况下，

电流随电压和时间的增加而增大，并记录到尾电流（图6A ）。此时在稳定表达Ano2的FＲT 细胞上施加不同电压，

加入CaCCs 的抑制剂NFA ，Ano2被NFA 抑制，电流明显减小（图6B ）。对A 和B 进行分析表明电流和

电压关系呈外向整流特性（图6C ）。0nmol /L Ca

2+

存在的情况下，未记录到电流变化。未转染Ano2的FＲT 细胞未记录到电流变化（图6D ）。

3

讨论

CaCCs 是一类表达在哺乳动物细胞膜上的阴离

子通道，因其被胞质中的Ca 2+

激活，同时转运细胞中最多的Cl －而得名为CaCCs ［1］

，

早在上世纪80年代初于非洲爪蟾卵母细胞上首次记录到经典的CaCCs 电流，相继证实平滑肌、心肌细胞、神经细胞、

上皮细胞和内皮细胞均有CaCCs 表达［2-3］

。TMEM16其家族共有10个成员，从A K ［4］

，这个家

族拓扑结构相似，

目前已证实Ano1是CaCCs 的分子基础

［5］

。

本实验以Ano2为研究对象，

从小鼠视网膜提取Ano2，并建立稳定表达pEGFP-Ano2的FＲT 细胞模型。FＲT 细胞具有生长速度较快及贴壁能力强的优点

［3］

，常常作为高通量筛选模型的工具细胞。

EGFP 是优化的绿色荧光蛋白的突变型蛋白，作为报告基因敏感度高，荧光显微镜下可实时观察目的基因在活细胞内的动态表达

［7］

，构建C 末端融合有

EGFP 的Ano2真核表达载体，EGFP 示踪显示

Ano2

图6电压变化引起的钙激活氯离子通道电流

Fig 6

Calcium-activated chloride currents induced by voltage change

841

藏雨轩Ano2是钙激活氯离子通道的分子基础

在FＲT细胞中的表达与定位。EGFP表达于FＲT细胞的胞质，而将pEGFP-Ano2稳定转染至FＲT细胞，细胞膜呈绿色荧光，证实Ano2表达于细胞膜上。膜片钳技术可以直接观察和分辨离子通道电流并且反映离子通道的电生理特性［8］。FＲT细胞膜上的Ano2在600nmol/L Ca2+存在时，电流呈Ca2+、时间和电压依赖性，得到的I/V曲线呈外向整流，与经典的CaCCs电流一致，且被CaCCs的抑制剂NFA抑制，证实Ano2是CaCCs的分子基础。

总之，本实验证实Ano2是CaCCs的分子基础。本实验所构建的pEGFP-Ano2真核表达载体和稳定表达pEGFP-Ano2的FＲT细胞系为深入研究Ano2在细胞增殖、迁移和凋亡等生理功能中的作用，寻找Ano2参与离子转运的关键氨基酸及研究不同浓度和不同类型二价阳离子对CaCCs的影响等奠定良好基础。

参考文献：

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［6］Hao Feng，Hou Yiju，Zhao Chen，et al．Expression clone of TMEM16A as a calcium-activated chloride channels in CHO cells［J］．Advanced MaterialsＲesearch，2013，709：832-835．

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［8］Kornreich BG．The patch clamp technique：principles and technical considerations［J］．J Vet Cardiol，2007，9：25-37．

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