浅谈蛋白质质谱分析报告

浅谈蛋白质质谱分析方法及应用

董义龙

(单位：学院，化学与化学工程学院，2009级化学教育本科三班,学号:）

摘要：随着科学的不断发展，运用质谱法进行蛋白质的分析日益增多，本文简要的综

述了肽和蛋白质等生物大分子质谱分析的特点，方法及蛋白质质谱分析的原理，方式

和应用，并对其发展前景着出展望。

关键词：蛋白质质谱分析原理与方法

蛋白质是生物体中含量最高，功能最重要的生物大分子，存在于所有生物细胞，约占细胞干质量的50%以上。作为生命的物质基础之一，蛋白质在催化生命体各种反应进行，调节代，抵御外来物质入侵及控制遗传信息等方面都起着至关重要的作用，因此，蛋白质也是生命科学中极为重要的研究对象。关于蛋白质的分析研究，一直是化学家及生物学家极为关注的问题，其研究的容主要包括分子量测定，氨基酸鉴定，蛋白质序列分析及立体化学分析等。随着生命科学的发展，仪器分析手段的更新，尤其是质谱分析技术的不断成熟，使这一领域的研究发展迅速。

1 蛋白质组学研究的背景和意义

1．1蛋白质组学的产生

20世纪90年代开始的人类基因组计划(}Iuman Genome Project，HGP)是人类有史以来最伟大的认识自身的世纪工程，旨在阐明人类基因组DNA3×109核苷酸序列，希望在分子水平上破译人类所有的遗传信息。经过各国科学家十几年的努力，HGP已取得了巨大的成绩。在揭示基因组精细结构的同时，也凸现了基因数量有限性和基因结构的相对稳定性，这与生命现象的复杂和多交性之间存在着巨大的反差。这种反差促使人们认识到：基因只是遗传信息的载体。要研究生命现象，阐释生命活动的规律，只了解基因组的结构是远远不够的。对于生命活动的主要体现者——蛋白质进行更全面和深入的研究是目前生命科学研究的迫切需要和重要任务。后因组时代中功能基因组(Functional Genomics)的研究采用一些新的技术，如微阵列，DNA芯片对成千上万的基因表达进行分析比较，并从基因整体水平上对基因的活动规律进行阐述。它摒弃经典分子生物学零敲碎打地研究个别基因的习惯，力求从细胞水平上解决基因组问题以建立对生命现象的整体认识。但是，生命现象的主要体现者是蛋白质，而蛋白质有其自身的特定活规律仅仅从基因的角度来研究是远远不够的l 31。因此，产生了一门在整体水平上研究细胞蛋白质的组成及其活动规律的新兴学科——蛋白质组学(Proteomics)。

1．2蛋白质组学的概念

“蛋白质组”是澳大利亚Macquarie大学的Wilkins和Williams等于1994年在意大利一次学术会议上首次提出的，最早见诸于文献是在1995年7月的(Electrophoresisj)杂志上【41指的是基因组编码的全部蛋白质。』4一义上来讲，蛋白质组(proteome)是指：“一个细胞或一个组织基因组所表达的全部蛋白质”。蛋白质组是一个动态的概念，它是对应于一个基因组的所以蛋白质构成的整体，而不是局限于一个或几个蛋白质。它不仅在同一个机体的不同组织和细胞表

达情况不同，在同一机体的不同发育阶段、直至消亡的全过程中也不断变化；机体处于不同生状态下不同，在不同外界环境下也是不同的。实际上每一种生命运动形式，都是特定蛋白质群体不同时间和空间出现并发挥功能的不同组合的结果。蛋白质组的研究是从整体水平上研究细胞或有机体蛋白质的组成及其活动规律，包括细胞所有蛋白质的分离、蛋白质表达模式的识别、蛋白质的鉴定、蛋白质翻译后修饰的分析及蛋白质组数据库的构建。这一术语一经提出，很快得到国际

生物学界的广泛关注。第～次国际性的“蛋白质组学”会议于1997年召开，同年出版了第一部蛋白质组学专著。2000年三月首次发表了一个生物体的完整蛋白质组。2001年二月和同年六月分别公布了人类基因组框架图和序列图谱，极促进了蛋白质组学的兴起，成为后基因组计划的重要组成部分。

1．3蛋白质组学研究的主要手段

蛋白质组研究包括对蛋白质的表达模式的研究和对蛋白质功能模式研究的两个方面。它核心实验工具是双向凝胶电泳和以质谱为代表的蛋白质鉴定技术及生物信息学。蛋白质组分析首先要求分离亚细胞结构、细胞或组织等不同生命结构层次的蛋白质，目前一般采用1975年由‘Farrell 等创立的双向聚丙烯酰胺凝胶电泳技术pJ。双向电泳图谱通过扫描仪扫描并数字化通过分析软件(如PDQUEST)可对数字化的图谱进行各种图像分析，包括分析蛋白质在图谱上的定位，分离蛋白质的计数，图谱间蛋白质差异表达的检测等。对分离出的蛋白质进行鉴定是蛋白质表达模式的又一重要容。为适应大规模蛋白质组分析，质谱已成为蛋白质鉴定的核心技术。除此之外，还有Edman降解法测N端序列，氨基酸组成分析等。由这些技术测得的完整蛋白质分子量、蛋白质的肽指纹图谱以及部分肽序列等数据，通过相应的数据库的搜寻来鉴定蛋白质。生物信息学是蛋白质组学中的一个重要的技术平台，它研究生物信息的采集、加工、分析、存储和传播等各个方面，它通过综合应用数学、计算机科学、工程科学以及生物学的技术、方法分析大量而复杂的生物学数据来揭示生物学的奥秘，是蛋白质组学中的不可或缺的一部分，其在蛋白质组学中的研究有两个重要应用：…是构建和分析双向凝胶电泳图谱，二是数据库的搜索与构建。

2质谱原理、发展及生物质谱技术

2．1质谱及质谱分析的基本原理

质谱技术具有较好的灵敏度、准确度，能准确测定蛋白质。目前质谱主要测定蛋自质一级结构包括分子量、肽链氨基酸排序及多肽或二硫键数目和位置，在对蛋白质结构分析的研究中占据了重要的地位。[1,2]质谱有进样器、离子源、质量分析器、离子检测器、控制电脑及数据分析系统等组成。传统的质谱仅用于小分子挥发物质的分析，但随着新的离子化技术的出现，如基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）和电喷雾电离质谱（ESI-MS）等，各种质谱技术的出现为蛋白质分析提供了一种新的且准确快速的途径。目前，酶解、液相色谱分离、串联质谱及计算机算法的联合应用已成为鉴定蛋白质的发展趋势。

1）质谱分析蛋白的原理：

质谱法分析蛋白的基本原理是通过电离源将蛋白质分子转化为离子，然后利用质谱分析仪的电场、磁场将具有特定质量与电荷比值（M/Z）的蛋白质离子分离开来，经过离子检测器收集分离的离子，确定离子的M/Z值，分析鉴定未知蛋白。通常结合相应的处理及其他技术，能够比较准确、快速地鉴定蛋白质。

2）基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）

简而言之，基质辅助激光解析电离飞行时间质谱是将多肽成分转换成离子信号，并依据质量/ 电荷之比（M/Z）来对该多肽进行分析，以判断该多肽源自哪一个蛋白。基质辅助激光解吸附质谱技术（MALDI）的基本原理是将分析物分散在基质分子中并形成晶体，当用激光照射晶体时，由于基质分子经辐射所吸收的能量，导致能量蓄积并迅速产热，从而使基质晶体升华，致使基质和分析物膨胀并进入气相。MALDI所产生的质谱图多为单电荷离子，因而质谱图中的离子与多肽和蛋白质的质量有一一对应关系。MALDI产生的离子常用飞行时间（TOF）检测器来检测，理论上讲，只要飞行管的长度足够，TOF检测器可检测分子的质量数是没有上限的，因此MALDI-TOF 质谱很适合对蛋白质、多肽等生物大分子的研究。

3）电喷雾电离质谱（ESI-MS）

电喷雾电离质谱（ESI-MS）是在毛细管的出口处施加一高电压，所产生的高电场使从毛细管流出的液体雾化成细小的带电液滴，随着溶剂蒸发，液滴表面的电荷强度逐渐增大，最后液滴崩解为大量带一个或多个电荷的离子，致使分析物以单电荷或多电荷离子的形式进入气相。电喷雾离子化的特点是产生高电荷离子而不是碎片离子，使质量电荷比降低到多数质量分析仪器都可以检测的围，因而大大扩展了分子量的分析围，离子的真实分子质量也可以根据质荷比及电荷数算出。

电喷雾质谱的优势就是它可以方便地与多种分离技术联合使用，如液-质联用（LC-MS）是将液相色谱与质谱联合而达到检测大分子物质的目的。

4）快原子轰击质谱技术

快原子轰击质谱技术（FABMS）是一种软电离技术，是用快速惰性原子射击存在于底物中的样品，使样品离子溅出进入分析器，这种软电离技术适于极性强、热不稳定的化合物的分析，特加适用于多肽和蛋白质等的分析研究。

FABMS只能提供有关离子的精确质量，从而可以确定样品的元素组成和分子式。而FABMSMS 串联技术的应用可以提供样品较为详细的分子结构信息。

3质谱分析蛋白的方法

用于质谱分析蛋白质的方法主要有三种：肽质量指纹图谱法（PMF）、串联质谱法（CID）和梯形肽片段测序法（ladderpeptide sequencing）。

3.1肽质量指纹图谱（PMF）

肽质量指纹图谱（PMF）即用特异性的酶解或化学水解的方法将蛋白质切成小的片段，然后用质谱检测各产物肽的相对分子质量，将所得的蛋白酶解肽段质量数在相应的数据库中检索，寻找相似肽指纹谱，从而绘制“肽图”。由此可见，分子质量的精确度是PMF的关键指标所在，但蛋白质的翻译后修饰可能使PMF的质量数与理论值不符，故这就需要与序列信息适当结合。

3.2串联质谱法（CID）

串联质谱法（CID）是利用待测分子在电离及飞行过程中产生的亚稳定离子，通过分析相邻同组类型峰的质量差，识别相应的氨基酸残基。串联质谱的肽序列图需要读出部分氨基酸序列与前后的离子质量和肽段母质量相结合，这种鉴定方法称为肽序列标签（PST）。

3.3梯形肽片段测序法（ladder peptide sequencing）

梯形肽片段测序法（ladder peptide sequencing），与Edman法有相似之处，是用化学探针或酶解使蛋白或肽从N端或C端逐一降解下氨基酸残基，产生包含仅异于1个氨基酸残基质量的系列肽，名为ladder，经质谱检测，由相邻肽峰的质量差而得知相应氨基酸残基。其中的问题是由于酶解速度不一，易受干扰。

4 蛋白质质谱分析法的研究进展

自约翰·芬恩和田中耕一发明了确认生物大分子结构的分析方法及其质谱分析法以来，随着生命科学及生物技术的迅速发展，生物质谱目前已成为有机质谱中最活跃、最富生命力的前沿研究领域之一。它的发展强有力地推动了人类基因组计划及其后基因组计划的提前完成和有力实施，已成为研究生物大分子特别是蛋白质研究的主要支撑技术之一。质谱分析用于蛋白质等生物活性分子的研究具有如下优点：灵敏度高，能为亚微克级试样提供信息；能最有效地与色谱联用；适用于复杂体系中痕量物质的鉴定或结构测定；同时具有准确性、易操作性、快速性及很好的普适性。

4.1 质谱分析方法与蛋白质分析的联系

蛋白质是一条或多条肽链以特殊方式组合的生物大分子，其复杂结构主要包括一级、二级、三级或四级结构。目前蛋白质测定主要是指针对蛋白质一级结构包括分子量、肽链氨基酸（二级结构）及多肽或二硫键数目和位置（三级结构）作出量效关系确定。近年来，涌现出较为成功地用于生物大分子质谱分析的软电离技术，其主要有：（1）电喷雾电离质谱（Electrosprayioni-sation， ESI- MS）；（2）基质辅助激光解析电离质谱（Matrixas- sistedlaserdesorption/ionization， MALDI）；（3）快原子轰击质谱；（4）离子喷雾电离质谱；（5）大气压电离质谱。在这些软电离技术中，以前3种研究得最多，应用得也最广泛。现代研究结果发现，越来越多的小肽与蛋白质一样具有生物功能，建立具有特殊、高效的生物功能肽的肽库是现在的研究热点之一。现有的肽和蛋白质测序方法包括N末端序列测定的化学方法Edman法、C末端酶解方法、C末端化学降解法等，这些方法都存在一些缺陷，如测序速度较慢、样品用量较大、对样品纯度要求很高、对于修饰氨基酸残基往往会错误识别而对N末端保护的肽链则无法测序。C末端化学降解测序法则由于无法找到异硫氰酸苯酯（PITC）这样理想的化学探针，其发展仍面临着很大的困难。由于蛋白降解为多肽技术的提升以及质谱测定的飞速发展，使得质谱广泛应用于蛋白质的分析和测定。近年来随着ESI- MS及MALDI等质谱软电离技术的发展与完善，检测限下降到fmol级别，可测定分子量围则高达100 kDa，使蛋白质分子测定成为可能。目前基质辅助激光解析电离/飞行时间质谱法（MALDI- TOF/MS）已成为测定生物大分子尤其是蛋白质、多肽分子量和一级结构的有效工具，也是当今生命科学领域中重大课题——蛋白质组研究所必不可缺的关键技术之一。目前蛋白质组研究为蛋白质提供了一级结构（序列）谱库，能为解析FAST（超高速）谱图提供极大的帮助，并为确证分析结果提供可靠的依据。

5 蛋白质质谱分析的应用

有研究表明，用MALDI- TOF质谱分析蛋白质最早一例是于1988年提出用紫外激光以烟酸为基质在TOF上测出质量数高达60 kDa的蛋白质，精确度开始只有0.5％，后改进到0.1％～0.2％。质谱技术主要用于检测双向凝胶电泳或“双向”高效柱层析分离所得的蛋白质及酶解所得的多肽的质量，也可用于蛋白质高级结构及蛋白质间相互作用等方面的研究，3条肽段的精确质量数便可鉴定蛋白质。MALDI- TOF/MS以及ESI- MS可以清楚地解析蛋白质多肽的一级结构。近年来，FABMS- MS发展突飞猛进，推动了蛋白质多肽二级结构的测定，其数据采集方面的自动化程度、检测的敏感性及效率都大大提高。其主要是通过MS- MS的方式将2个以上质谱仪器进行联合运用，采用前质谱选择特定肽段，破坏后进行后续质谱的分析，可以有效实现二级质谱对蛋白质的分析。大规模数据库和一些分析软件（如SEQUEST）的应用使得FABMS- MS可以进行更大规模的测序工作，如采用2D电泳及MS技术对整个酵母细胞裂解产物进行分析，已经鉴定出1 484种蛋白质，包括完整的膜蛋白和低丰度的蛋白质；分析肝细胞癌患者血清蛋白质组成分，并利用质谱鉴定磷酸化蛋白及采用质谱技术研究许旺细胞源神经营养蛋白（SDNP）的分子结构等。科学工作者通过多种方式收集蛋白质的结构信息将其绘制成为肽质量指纹图谱，可以有效地分析蛋白性质，为医学、生命科学提供信息支持。如目前通过分离手段以及质谱联合手段发现的组织蛋白酶B、热急蛋白27、mRNA连接蛋白P62等对癌症治疗起到了非常重要作用。广泛地采用多种分离手段联合质谱对生物大分子进行全面的精确的分析取得了突出成效。如采用双向凝胶电泳- 质谱测定技术、液质联用（HPLC- MS）、气质联用（GC- MS）、ESI-MS测量法、FABMS- MS方法进行蛋白质分析；如采用HPLC-MS/MS对卵巢癌患者血液中的肿瘤标志蛋白质CA125进行测定具有治疗学价值。另外继人类基因组学（HGP）之后，目前又一个重大世界课题即蛋白质组学（Proteomictechniques）得到了人们广泛的关注，蛋白质组学广泛地应用于医学和生命科学领域。我国目前开展了“人类肝脏蛋白质组学及毒理学研究”，其中测定蛋白质主要手段中以质谱居于首位，其次为凝胶图像分析、蛋白质和多肽的N端、C端测序及氨基酸组成分析等，由此可看出质谱分析在蛋白质组学的定量以及结构和指纹鉴定中有着了无可取代的地位。在蛋白质的质谱分析中，质谱的准确性对测定结果有很大影响，因此质谱测序现在仍很难被应用

于未知蛋白的序列测定。肽和蛋白的质谱序列测定方法具有快速、用量少、易操作等优点，这些都非常适合于现在科学研究的需要。笔者相信，随着各种衍生化方法和酶解方法的不断改进，蛋白双向电

泳的应用以及质谱技术的不断完善，质谱将会成为多肽和蛋白质分析最有威力的工具之一。但也要清醒地认识到，质谱的灵敏度虽然高，但仍然难解决细胞组织痕量调控蛋白游离显示的问题，此外质谱的发展导致质谱仪价格非常昂贵。所以，需要积极地解决质谱自身发展的关键技术，才能使质谱在蛋白质分析中的作用更加的优化和凸显。化技术的出现，如介质辅助的激光解析/离子化、电喷雾离子化，各种新的质谱技术开始用于生物大分子的分析。其原理是：首先实现蛋白降解成多肽，通过电离源将蛋白质分子转化为气相离子，然后利用质谱分析仪的电场、磁场将具有特定质量与电荷比值（m/z值）的多肽离子分离开来，经过离子检测器收集分离的离子，确定离子的m/z值，分析鉴定未知蛋白质。在这种背景下，质谱由于很高的灵敏度、准确性、易操作性、快速性及很好的普适性而备受科学家的广泛注意。

5.1傅立叶变换-离子回旋共振质谱法在蛋白质分析中的应用

传统上, 蛋白质的鉴定是从头测序,多数是自动的逐步的化学降解(Edman 降解)蛋白质,然后分离多肽片段。这些局部顺序依靠重叠的片段拼装组合出整个蛋白质的顺序,但是更多的用于探针从基因库分离出编码该蛋白的基因。随着序列数据库的增大,很明显,即使相对较短或不完善的序列(缺口,模糊的残基)对蛋白质的鉴定都是很有用的。当意识到质谱能比较理想的产生期望的数据时, 用从蛋白质或多肽提取的信息和序列数据库相关联的方法, 而不是从头测序进行蛋白质鉴定的观念已经逐渐地深入心

5.2准确质量测定对蛋白质结构分析的应用价值

氨基酸顺序测定的第一步就是蛋白质分子量的确定,这能为测定蛋白质分子中多肽链的数目和用质谱方法测定各个肽段的氨基酸顺序提供最基础的数据。质量准确性的提高不仅能提高数据库搜索的速度, 还能大大提高鉴定的可信度。用丰度为99%的13C标记物培养基培养细菌, 使磷脂中的12C被13C所取代,一旦C原子数已知,有 n个碳原子质量数就会增加 n,比较分别用ESI? FT?ICRMS 和(CID) FT?ICRMS测得的天然和 99%丰度的13C 标记物培养基中磷脂的谱图, 准确质量测定使其元素组成为唯一的可能。Demirev 等组合使用完整蛋白质的准确质量测定和蛋白组数据库, 显著提高了鉴定微生物的特异性。He 等最近组合使用了高的磁场(9.4 T ),大的Penning阱的直径(101.6mm )及低的离子浓度, 用 L2ESI?FT?ICRMS 检测两种肽时质量分辨能力很高,这有可能成为蛋白组学研究的新突破点。ESI?FT?ICRMS 的准确质量测定还能可信的证实不确定的离子组成。

5.3蛋白质分子中氨基酸序列的测定

蛋白质一级结构测定的一个最灵敏和最普遍的方式就是先用二维聚乙酰胺凝胶电泳分离蛋白质混合物, 以胰蛋白酶消解, 质量分析(分辨和分离一个特别的肽段)并最终用质谱方法产生一个至少是部分的氨基酸一级结构。肽质量图谱(Peptidemassmapping)是蛋白质一级结构测定一种最常用的手段。肽质量图谱是基于序列特异性蛋白酶水解蛋白质衍生出来的肽的一个基团的准确质量的测定, 是蛋白质鉴定的一个高效的方法。不同氨基酸序列的蛋白质用序列特异性的蛋白酶水解后将会产生一系列该蛋白独特的质量指纹。因此,如果用选择好的质量数(观察到的肽质量指纹)在一个包含有该特异蛋白的序列数据库中搜索, 该蛋白就能依赖这个数据库正确的鉴定了。采用纳流量液相色谱与傅立叶变换2离子回旋共振质谱联用, 提供了一系列的胰蛋白酶消解后的母离子和子离子的质量, 质量的准确性达到了 10-6数量级,从而进一步确证了人肝的三种二乙酰基还原酶。另外采用 n2ESI?FT?ICRMS在pmol 数量级的灵敏度上获得了蛋白质消解物的准确的质量指纹图谱,缩小了数据库的搜索围并降低了搜索的噪声,测得了该种乙醛氧化酶的序列。应用ESI?FT?ICRMS 和红外多光子解离 ( IR multiphoton dissociation,IRMPD )

可对一种糖激酶进行分子量和肽的一级结构的精确测定。

6 高效液相色谱电喷雾质谱法用于茶多糖蛋白的纯度和相对分子质量的测定

1）凝胶法：分别将已知的蓝色葡聚糖、葡聚糖 - 系列标准品（-. ， -. ， -. ）溶解于蒸馏水中，质量浓度为 G E 6。上 9#0’4#$ A 凝胶柱，以 1D* E 6 F’7* 洗脱，流速 16 E 13(，自动收集仪每 13( 收集管洗出液，并逐管检测（于(1 检测多糖的蒽酮.硫酸衍生物），分别得到柱外体积（死体积）（用蓝色葡聚糖测得）和标样洗脱体积 #（用 -. 测得）、#（用 -. 测得）、#（用 -. 测得）。以 # E 为纵坐标，*DG &为横坐标作图，得 &标准曲线方程：# E ,? *DG &然后以相同的条件将样品上柱，得到 -A7，代入公式（中，求其 &。

2）5/67.89:.;9 法：干燥气体流速6 E 13(，干燥气体温度 J，雾化器压力K/’（ C3），毛细管电压 =，质谱扫描围。

7 液相色谱一质谱法比较分析正常人与胃癌患者的胃组织蛋白质

7.1样品的制备

样品为胃癌患者的胃组织，其中包含该患者正常的胃组织及癌症组织(术后病理学诊断为胃癌，病理分型均为低分化腺癌)。取材癌组织侵及胃壁全层，取癌组织中央坚硬部位(要求全层)，手术中无菌清理后，置于一80℃低温冰箱中保存待检。将正常胃组织与胃癌组织分别置于表面皿中并在冰上剪碎，用含0．0596吐温一20的pH 7．4的0．01moL／L磷酸盐缓冲溶液(PBS)反复清洗直至清洗液为无色以去除残余的血液，以含1 mmol／L蛋白酶抑制剂的8 mol／L尿素溶液为蛋白质提取液进行冰上匀浆，然后在功率为85 W时，工作10 S，停止10 S，循环超声5次条件下提取蛋白质。提取液于4℃、16 000 r／min下离心30 min，取蛋白质溶液上清液，采用考马斯亮蓝(BRADFORD)法测定蛋白质浓度。蛋白质提取液经反相液相色谱分离，收集差异馏分并旋转蒸发浓缩至干，然后重新溶解于50 mmol／L三羟甲基氨基甲烷(Tris)一HCI(pH 8．3)中，按m(提取蛋白质)：m(胰蛋白酶)=50：1的比例加入胰蛋白酶，其中提取蛋白质质量由考马斯亮蓝法测定得到。于37℃摇床上反应24 h，然后加1“L甲酸进行酸化终止反应，置于一20℃冰箱中保存备用。

7.2 RP-LC分离蛋白质提取液的条件

预柱：自填装的C8反相硅胶柱(40 mm×0．5mm，XBP填料，5 ttm，孔径20 nm，博纳司)；分析柱：反相有机聚合物色谱柱(250 mm×4．6 mm，5仙m，纳微公司)。流动相A为含有0．1％三氟乙酸(TFA)的水溶液，流动相B为含有0．196 TFA的乙腈溶液，流速为0．5 mL／min；梯度洗脱程序：O一10 min，296 B一10％B；10—20 min，10％B一35％B；20—55 min，35％B 一50％B；55—80 min，50％B一80％B，保持20 min。上样量：80斗g正常部分和癌症部分提取蛋白质。检测波长为214 nm。7.3 LC-MS／MS鉴定蛋白质提取物中差异蛋白质的条件LC条件：色谱柱为实验室自填充的C18反相微柱(5 cm x300 ttm，5灿m，孔径为20 rim，博纳公司的填料)。流动相A为含2％乙腈和0．1％甲酸的水溶液，流动相B为含2％水和0．1％甲酸的乙腈溶液，流速5 ttL／min；梯度洗脱程序：0—8min，O％B一10％B；8—20 min，10％B一40％B；20．1 min，80％B，保持10 min。

质谱条件：采集时间30 min；扫描围m／z 400—2 000；喷雾电压2．0 kV；加热毛细管温度150℃；归一化碰撞能量设置为35％；在一级质谱扫描中选取信号最强的2个母离子进行串联质谱分析，其中动态排除重复2次，每次180 s，重复容忍时间30 8。

7.3 蛋白质检索

采用BioWorks软件通过Sequest算法检索数据库，数据库为安装Bioworks软件时自带的数据库。搜索结果按照如下参数筛选：当单电荷肽段的相似度指标五。值≥1．9；双电荷肽段的墨。。