DNA双链断裂与同源重组修复机理研究进展
DNA双链断裂与同源重组修复机理研究进展
卞广兴 郭葆玉
第二军医大学药学院生化药学教研室(上海,200433)
摘要 双链断裂(doub le strand b reak s,D SB s)是细胞染色体复制过程中经常出现的DNA损伤,它的修复过程在真核生物中以同源重组(homo logy recom b inati on,HR)修复为主。正常机体中有着一系列的基因和蛋白及时修复这些损伤,这些蛋白归属于RAD52上位性集团(RAD52ep istasis group)。它们对细胞发挥功能和维持生存意义重大,近来国外研究十分活跃。
关键词 同源重组;双链断裂
1 与HR有关的基因和蛋白
在多种多样的生物体中,基因组保持完整具有极为重要的意义。它是细胞发挥功能和维持生存的必要条件。生物体基因组暴露于离子射线或者受内切酶作用,特别是在染色体自我复制过程中都会出现双链断裂。如果这些断裂未能及时修复就会引起细胞的染色体丢失或导致细胞的死亡。修复不正确也会引起基因的突变和染色体的重组。真核生物对这些断裂的修复有两种机理:非同源末端连接(non2 hom o logy end j o in ing,N H EJ)和同源重组(hom o l2 ogy recom b inati on,HR)。
同源重组是发生在DNA的同源序列之间的重组方式。真核生物非姊妹染色子体的交换,姊妹染色子体的交换,细菌及某些低等真核生物的转化,细菌的转导,接合,噬菌体的重组等都属于这一类型。有人认为,在原核生物中D SB s的修复以HR方式为主;而对于真核生物,其它的修复方式才是主要的。但近几年对酵母和哺乳动物细胞的研究发现,真核生物中的HR不仅在机理上与原核相似,而且具有同等的重要性[1]。
在HR中起重要作用的蛋白归属于R ec A家族,其中R ec A是其中的第一个成员,它是一个由R ec A基因编码的蛋白,在E.coli的HR和DNA复制中起重要作用。近几年来,研究发现了R ec A的很多同源蛋白,如T4噬菌体中的U vsX和哺乳动物细胞中的R ad51等。它们被统称为RAD52上位性集团。包括:RAD50、RAD51、RAD52、RAD54、RAD55、RAD57、RAD59、M R E11和XR S2、XRCC2等。它们的突变缺失细胞都表现出对离子射线的敏感和有丝分裂 无丝分裂缺陷,表明它们是D SB s修复的某条途径的组成部分[2]。其中的不少成员就是在研究射线照射对生物体的作用(radiati on sen si2 tive m u tati on)中发现的,其命名也沿袭了原来的名称(RAD)。从酵母到脊椎动物基因序列的高度保守性表明它们在HR中有着类似的功能。研究中,符合这两者的因子大都可归于RAD52上位性集团。这其中最重要的是RAD51、RAD52和RAD54。
RAD51在所有的细胞中都表达,可能执行链交换的功能。它的作用同R ec A相似,但又不完全相同。Sonoda等[3]把人的RAD51转入鸡B细胞系的D T40细胞发现,RAD51缺失的细胞静息在细胞周期的G2 M期,累积对细胞有毒害作用的染色体断裂并最终死亡。同时发现大多数可探测到的染色体缺失是异染色质型的缺口或断裂,同一染色体的姊妹染色单体在同样的基因座断裂。这表明很多不可修复的裂隙是复制过程中产生的双链断裂的可能原因。尽管RAD51的分布远比其它因子广泛,研究表明它并不是D SB s诱导的所有重组修复形式中应用最广的因子[4]。RAD51在D SB s诱导的同源染色体交换中是必须的,但它对于其他形式的重组,如自发重组(spon taneou s recom b inati on),却并不是必须的。不过,RAD52在已知的这些重组形式中却都是必须的。
RAD52是重组中最重要的蛋白,它在真核细胞中进化保守,原核中基因序列差别较大。R ad52在体内形成多聚体的环,既可以连接DNA链末端又可促进互补链的退火。人的R ad52具有类似的特性。细胞在缺失RAD52的情况下几乎所有形式的HR 都被阻断了[4]。但是研究发现,剔除了RAD52的脊椎动物细胞可以存活而不会象剔除了RAD51等那样严重(死亡),有人认为这可能是细胞中还有其它起类似作用的因子未被发现[5]。
RAD55和RAD57同RAD51具有某些同源
性。这些蛋白可以帮助RAD51装到单链DNA上去,如同E.coli中的R ecF、R ec O和R ecR蛋白的作用一样,哺乳动物更有几个特有的RAD51的同源物RAD51B,RAD51C,XRCC2和XRCC3[6]。这些蛋白同RAD55和RAD57蛋白一样参与DNA损伤的修复,起着重要的作用。
RAD54基因是SN F2 S W I2的超家族成员之一。含有大多数DNA解旋酶含有的7个主要区域。无论在体内还是在体外试验中,RAD54蛋白同RAD51蛋白总是结合在一起的,提示它可能是一个蛋白复合物的组成部分。可能参与了重组过程中染色质的相互接近,但其具体作用有待进一步研究。其缺失在真核生物中表现为对放射性的敏感和同源替换的减少[7]。K lein等报道了啤酒酵母(saccha2 rom yces.cerevisiae)中发现的一个同源物。它不表现RAD54所具有的对化合物MM S的敏感性但可提高RAD54对MM S的敏感性。研究发现它只有在双倍体基因重组过程中是必要的,而且只对同源基因间交换起作用而不对染色体内基因的交换起作用[8]。
2 D SBs修复的可能机理
酵母中的基因研究表明R ad52参与了两条重组途径:①发生在DNA一致序列间的单链退火。②R ad51、R ad54、R ad55和R ad57参与的同源重组, R ad52在这其中起退火互补单链的作用;其中,在有丝分裂中出现D SB s时,R ad52帮助D SB s上重组复合物的形成,帮助R ad51的定位,从而启动同源链的交换[9]。R ad52同样与三聚体的单链结合复合物复制因子(R PA)相互作用。R ad51同其它几种重要的重组蛋白R ad54,R ad55,R ad56和R ad57相互作用完成R ad51介导的链交换[10]。这是一个线性双螺旋DNA链转到一个R ad51包被的单链环上的过程。各种体外试验均证明这些因子参与了这一过程,但是它们在体内究竟如何作用:作为一个整体的组成部分还是连续的作用还有待于进一步研究。
RAD52可以连接到D SB s上,保护它免受内切酶攻击并促进链的末端2末端相互作用。这些特性非常类似于Ku蛋白[11]的作用,据此有人提出D SB s 通过RAD52依赖性的同源重组和Ku蛋白依赖性的非同源末端连接修复的机理模型[12]。在N H EJ方式中R ad50 M re11 X rs2在Ku蛋白的作用下连接到D SB s处,由X rcc4 DNA连接酶 直接将断裂连接起来。其缺失片段无法修复。在HR中,R ad50
11 2在52的作用下连接到处,启动由RAD51介导的链交换,在RAD54、RAD55、RAD57的帮助下,同源DNA间进行链交换,修复可能的缺失并连接DNA链的断裂。
这个模型同样可以解释前面的问题,在高等生物中,Ku蛋白是大量存在的,所以R ad52- -的哺乳动物细胞都不会有严重的表形缺陷(死亡),而在低等的酵母中,Ku蛋白介导的非同源末端连接只占很少一部分,R ad52- -突变住住表现出对离子射线的高度敏感。虽然,脊椎动物在R ad52缺失时不会表现严重的重组 修复缺陷,但它对D SB s的修复的重要性是不可低估的。因为哺乳动物的基因组有着大量重复序列,内含子等非编码序列。非同源末端连接导致的基因缺失或插入有较大可能性导致功能丧失或突变。所以为了避免突变,当姊妹染色体存在时同源重组是更好的选择。这也得到了试验的证实。
D resser的研究发现非同源末端连接在Χ射线引起的D SB s修复的早期是重要的,而在姊妹染色单体相互作用的后期,同源重组更为重要[14]。R ad52剔除的小鼠表型正常可能是存在其它的功能通路代替了它的末端连接作用[15]。
在高等真核细胞中,自发的等位基因重组频率很低,只有10-8水平。所以通过体内基因打靶进行基因治疗在现阶段是不实际的,除非打靶效率将来会有着非常显著的提高。从这个模型可以看出, R ad52在哺乳动物细胞中的表达,可以促进同源打靶的频率,而且用线性DNA载体,下调Ku的表达同时提高R ad52的表达,可以使同源打靶的效率显著提高。这对基因治疗的开展有某种意义。
3 展望
近几年,关于D SB s体内修复的详细过程的研究论文不多。因为现有的研究方法有着很大的局限性,方法的匮乏给试验研究带来了困难。众所周知, D SB s的体内修复过程是不可逆的,对其中间环节及产物的研究就很困难。现有的研究方法有两种:一是对基因进行突变后研究细胞表型特征,以了解各种因子可能参与的反应途径;二是Seagall等[15]发展的翻转重复系统方法(inverted2rep eated systym)。它可以部分的恢复几种经典的重组产物。采用这一方法我们搞清了细菌的重组过程: R ec BCD途径及R ecE.F途径。但要搞清真核生物的重组过程我们还需建立能够进行完整的重组反应的体外的实验系统。并且很有可能参与这些反应的一些酶或其它的成分还有待于进一步的发现,才能使这一过程及理论更加完善和明白。虽然D SB s导
致的同源重组的研究已取得了很大成果,但也存在着亟待克服的问题。一个清晰的关于重组过程的了解将对其它几个哺乳动物生物学的重要问题产生深远的影响。如怎样对付缺乏端粒酶的肿瘤细胞的永生性;怎样提高基因治疗中重组打靶的效率等,而这些课题的研究无疑对指导实践有着十分重要的意义。
参考文献
1 L iang F et a l.P roc N atl A cad Sci U SA.,1998;95:5172 2 Bo sco G et a l.Genetics,1998;150:1037
3 Sonoda E et a l.E M BO J,1998;17:598
4 H aber JE et a l.T I BS,1999;24:271
5 Yam aguch i-i w a Y et a l.M o l Cell B i o l,1998;18:6430 6 Roger DJ et a l.N atu re,1999;401:397
7 Schw acha A et a l.Cell,1997;90:1123
8 K lein HL et a l.Genetics,1997;147:1533
9 Ben son FE et a l.N atu re,1998;391:401
10 Sung P et a l.J B i o l Chem,1997;271:18996
11 Sugiyam a T et a l.P roc N atl A cad Sci U SA,1998;95: 6049
12 E ric VD et a l.N atu re,1999;398:727
13 D resser M E et a l.Genetics,1997;147:533
14 T akata M et a l.E M BO J,1998;17:5497
15 R attry A J et a l.Genetics,1995;139:45
(2000204219 收稿)
甲基CpG结合蛋白对基因转录的调控
杜红玲综述 武淑兰 戚 豫3审阅
北京医科大学第一医院血液内科(北京,100034)
3北京医科大学第一医院中心实验室(北京,100034)
摘要 甲基CpG结合蛋白(M eCP s)有5个成员(M eCP1、M eCP2、M BD1、M BD3和M BD4),通过特异结合于甲基化CpG位点(mCpG)而抑制基因表达。目前研究较清楚的是M eCP1、M eCP2和M BD1。M eCP1可与至少12个对称的mCpG结合,M eCP2和M BD1均与单一的mCpG位点结合。M eCP1和M eCP2可干扰非甲基化敏感的转录因子Sp1与启动子区的结合,也可与组蛋白脱乙酰酶(HDA C)形成复合物,影响局部组蛋白乙酰化状态。HDA C 抑制剂T SA可解除M BD1对报告基因的抑制,提示M BD1对基因的抑制与脱乙酰化有关。
关键词 甲基CpG结合蛋白; 转录; 转录因子; 组蛋白脱乙酰酶
DNA甲基化是真核细胞基因组重要的修饰方式之一,DNA甲基化对基因表达的抑制需要特异结合于甲基化Cp G位点(m ethyl2Cp G,m Cp G)的蛋白因子参与,这些特异因子称为甲基Cp G结合蛋白(m ethyl2Cp G b inding p ro tein s,M eCP s)。哺乳动物甲基化的主要方式是形成52甲基胞嘧啶(5m C),以甲基Cp G(m Cp G)形式出现,M eCP s特异识别m Cp G,对m Cp G周围序列无特异要求,因而能广泛参与基因转录抑制。近年来,随着新的M eCP s成员的发现及对其结构的深入认识,使其在基因转录抑制中的作用成为研究热点。迄今已发现M eCP s家族包括M eCP1和M eCP2及其同源蛋白共5个成员。
1 甲基CpG结合蛋白
第一个甲基Cp G结合蛋白M eCP1于80年代末发现。近两年,对M eCP2甲基Cp G结合功能域(m ethyl2Cp G b inding dom ain,M BD)序列进行表达序列标签(exp ressed sequence tags,EST)数据库对比分析发现,在人和小鼠中存在4种同源蛋白,分别命名为M BD1～4[1]。其中M BD2已被证实是M eCP1的组分。这5种蛋白中有60～80个氨基酸残基序列的同源性高达50%～70%[2]。M BD3虽然与M BD2高度同源,但不能与甲基化DNA结合。目前发现除M BD4外,M eCP1、M eCP2和M BD1对基因表达均有抑制作用。对M BD3、M BD4研究尚少有报道。
111 M eCP1
M eCP1首先从小鼠肝脏分离纯化,它广泛存在于哺乳动物体细胞,在胚胎干细胞中M eCP1不表达。通常迅速分裂的细胞(如脾细胞、M EL、H EL、H eL a细胞)中M eCP1丰度比低分裂细胞(如成人肝、脑、肾细胞)低。用含m Cp G的双链寡核苷酸探针与核提取物反应,经凝胶阻滞实验(band sh ift as2 say)分析发现M eCP1至少与12个对称的m Cp G
染色质改构蛋白BRG1在DNA双链断裂修复中的作用及机制研究
染色质改构蛋白BRG1在DNA双链断裂修复中的作用及机制研究基因组是生物遗传信息的载体。基因组的稳定性对于生物个体以及种族的生存与延续都具有至关重要的作用。 然而生物体内的基因组DNA并不是处于一个绝对安全的环境下,细胞内的自身代谢产物以及细胞外的各种毒性因子的刺激都会造成DNA损伤。损伤的DNA 如果不能被及时修复或错误修复就会导致基因突变或缺失,进而危害生物体。 为了维持遗传信息的稳定性,真核生物的DNA通过与组蛋白结合进化出复杂紧密的染色质结构。这种致密的结构虽然可以保护整个基因组尽可能免受内外界刺激因子的影响,但同时,这种结构对于DNA的转录,复制和修复等代谢活动却是一个巨大的障碍。 因此,染色质结构的动态变化在DNA代谢中扮演着重要的角色。DNA双链断 裂(DSBs)是一种严重的致死的DNA损伤类型。 生物体为了应对体内的DNA损伤进化出复杂有序的修复机制,以此来维持机体正常的生命代谢活动。在DNA损伤修复过程中涉及许多蛋白的共同参与,其中包括细胞周期调控蛋白、骨架调节蛋白、DNA损伤修复蛋白、染色质结构调控蛋白等。 BRG1是染色质改构复合物SWI/SNF的核心催化亚基,具有ATP水解酶的活性。已有研究发现,BRG1与肿瘤发生和基因组不稳定性具有紧密联系。 然而,BRG1在DNA双链断裂修复中的作用机制仍不是很明了。本文利用化疗药物依托泊苷(etoposide),博来霉素和紫外激光照射等手段,在体外构建了DNA 双链断裂损伤修复模型。 通过SW13和U2OS细胞存活率实验,我们发现BRG1缺失会明显增加细胞对
DNA损伤药物的敏感性,同时降低受损细胞的生存能力。另外,细胞彗星电泳与免疫荧光实验共同证明了,BRG1对于DNA双链断裂的修复进程具有至关重要的作用。 接下来,我们通过染色质分离提取与染色质免疫共沉淀技术发现,BRG1能够 被募集到DNA损伤位点。真核生物中DNA双链断裂主要有两种修复途径:同源重组修复和非同源重组末端连接修复。 利用DR-GFP与EJ5-GFP报告系统,我们进一步探讨了BRG1参与DNA双链断裂修复的机制。通过流式细胞仪检测DR-GFP与EJ5-GFP报告系统的GFP阳性细胞的比例,我们发现BRG1主要参与同源重组修复途径而不是非同源重组末端连 接修复。 最后,利用免疫荧光,免疫共沉淀以及活细胞示踪观察实验,我们发现BRG1 能够与介导RAD51和RPA替换的RAD52蛋白相互作用,并且调控RAD52在损伤位点的募集,从而调节RPA与RAD51在单链DNA(ssDNA)上的置换过程,进而影响同 源链侵入过程的起始。本文研究揭示了染色质改构因子BRG1参与DNA双链断裂修复的作用机制,为阐明染色质结构与DNA代谢的关系提供了一定的证据。
聚焦DNA双链断裂(DSBs)
最近，有关DNA双链断裂（DSBs）研究成果相继发表在顶级期刊Nature杂志子刊上。首先科学家提出一种利用全基因组技术进行DNA双链断裂（DSBs）作图新方法，相关研究成果荣登Nature Method杂志。于此同时，Nature杂志另一子刊Nature Neuroscience也刊登了一项成果，讲述了引发DNA双链断裂的因素。 Nature.Med：全基因组DSB作图新方法 近日，科学家提出一种利用全基因组技术进行DNA双链断裂(DSBs)作图新方法，这种作图法以单核苷酸为基本单位，称之为BLESS(direct in situ breaks labeling, enrichment on streptavidin and next-generation sequencing)，相关研究论文于2013年3月20日在线发表在Nature Method杂志上。 此项研究由德国法兰克福歌德大学医学院生物化学研究所 II、美国得克萨斯医学科大学转化科学研究院等处研究人员共同完成。 研究人员利用人类和小鼠细胞以及不同的DNA双链断裂(DSBs)诱导因子和测序平台对BLESS法进行验证。BLESS能够识别端粒末端、SCE核酸内切酶诱导的DNA双链断裂以及复杂的DSB全基因组。作为一种原理证明，我们让人类细胞复制压以敏感性基因组为特点，确定了> 2,000非均匀分布的阿非迪霉素敏感区(ASRS)，它们中基因过多，富含微卫星重复序列。人类癌症重排区也富含ASRS，许多癌症相关的基因对复制压具有极高的敏感性。 研究人员称，这种新方法适合各种细胞核实验条件下DSBs全基因组作图，其特异性和分辨率是现在的技术无法实现的。 罗格斯大学的神经遗传学家 Karl Herrup表示，这项工作令人惊叹。DNA 损伤对神经元的伤害极其危险。它无可更换，细胞必须从这些断裂中获取某些有价值的物质。Herrup并未参与此项研究。 加州大学神经科医生 Lennart Mucke，在他研究改变阿尔茨海默氏病(AD)基因组稳定性，偶然发现这种逮捕概念：切断和修复DNA是正常大脑活动的一部分。AD特征?是淀粉样蛋白和受损的神经元DNA纠结成块。带着期望了解更多有关DNA损伤及其相关高水平的淀粉样蛋白，Mucke的团队将研究焦点放在双链DNA断裂上，这是神经科学家认为最严重的损伤形式。 此研究小组揭示了一种自然行为，如探索一种新环境，能引起野生型年轻成年小鼠DNA双链断裂(DSBs)。DNA双链断裂(DSBs)发生在多个脑区域，但在海马齿状回神经最丰富。海马齿状回神经参与学习和记忆，能在24小时内修复。感受器或光刺激下增加的神经元活动，增加了相关神经元DNA双链断裂(DSBs)，而非不相关的神经网络。 人淀粉样前体蛋白(hAPP)转基因小鼠增加了基线神经元DNA双链断裂(DSBs)，且在探索新环境后出现严重和长期的DSBs。其中hAPP可刺激AD关键方面。
同源重组的分子机制
同源重组的分子机制 一、断裂重接模型（breakage joining model） C．D．Darlington 1936年提出。 在同源染色体联会时，由于染色体的缠绕而产生张力，两个相对染色单体在同一位置断裂，然后彼此和另一染色单体重新连接起来从而形成重组并消除这种张力。 二、基因转换现象 Olive等广泛研究粪生粪壳菌g座位，g-决定子囊孢子灰色，g+决定子囊孢子的黑色，在g+×g-的杂交中，他们分析了20万子囊，发现0.06%是5∶3分离，0.05%是6∶2分离，0.008％是3∶1∶1∶3（或异常4∶4）分离。图示． (1)一个孢子中的两个孢子有着不同的基因型。(2)分离比例不是4∶4。(3)邻近的基因A/a都呈现正常分离。 断裂重接模型则无法解释异常现象。
1930年，德国遗传学家H．温克勒把这种不规则分离现象解释为减数分裂过程中同源染色体联会时一个基因使相对位置上基因发生相应的变化所致，因而称就基因转变。好象是由于一个基因转换为另一等位基因，所以称为基因转换（gene conversion）。 以后由于发现一个基因发生基因转变时，它两旁的基因常同时发生重组：在5∶3和6∶2分离的子囊中，大约有30%也在g座位的这边或那边发生重组；有基因转换的子囊中，基因转换和遗传重组都发生在同样两个单体的子囊比例竟高达90%。 所以认为基因转变是某种形式的染色体交换的结果。因此，基因转变的研究，实质上也是染色体交换机制的研究。 三、同源重组的Holliday模型
1964年，R. Holliday提出了重组的杂合DNA模型(hybrid DNA mode)，并作修正。图示．过程：
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SCGE法检测DNA损伤(包括DNA单链断裂和DNA交联)
SCGE法检测DNA损伤 SCGE的原理（中性电泳液，高盐和变性剂检测双链断裂；碱性检测单链，双链断裂和碱不稳定性） SCGE技术是一种在单细胞水平上检测有核细胞DNA损伤和修复的方法。该技术的原理是基于有核细胞的DNA分子量很大，DNA超螺旋结构附着在核基质中，用琼脂糖凝胶将细胞包埋在载玻片上，在细胞裂解液作用下，细胞膜、核膜及其它生物膜破坏，使细胞内的RNA、蛋白质及其它成分进入凝胶，继而扩散到裂解液中，唯独核DNA仍保持缠绕的环区(Loop)附着在剩余的核骨架上，并留在原位。如果细胞未受损伤，电泳中核DNA因其分子量大停留在核基质中，经荧光染色后呈现圆形的荧光团，无拖尾现象。 若细胞受损，在中性电泳液(pH8)中，核DNA仍保持双螺旋结构，偶有单链断裂(SSBs)并不影响DNA双螺旋大分子的连续性。只有当DNA双链断裂(DSBs)时，其断片进入凝胶中，电泳时断片向阳极迁移，形成荧光拖尾现象，形似彗星。如果在碱性电泳液(pH>13)中，先是DNA双链解螺旋且碱变性为单链，单链断裂的碎片分子量小即可进入凝胶中，在电泳时断链或碎片离开核DNA向阳极迁移，形成拖尾。细胞核DNA受损愈重，产生的断链或碱易变性断片就愈多，其断链或断片也就愈小，在电场作用下迁移的DNA量多，迁移的距离长，表现为尾长增加和尾部荧光强度增强。因此，通过测定DNA迁移部分的光密度或迁移长度就可定量测定单个细胞DNA损伤程度。 1. 仪器及试剂 冰箱，载玻片，水平电泳槽，荧光显微镜。 不含Ca2+、Mg2+的PBS (PH=7.4)；正常溶点琼脂糖（NMA）及低溶点琼脂糖（LMA）（0.6％溶于PBS）；细胞裂解液（2.5 M NaCl, 100 mM Na2EDTA, 10 mM Tris-HCl, 1%肌氨酸钠, PH=10, 用前加1％TritonX-100, 10% 二甲亚砜（DMSO））；电泳缓冲液（0.3 M NaOH, 1 mM Na2EDTA, PH=13）；0.4 M Tris-HCl（PH=7.5）；无水乙醇；20-30μg/mL 溴化乙锭（EB）。 2. 方法 1.在体外实验中,将对数期生长的细胞用0.25%胰蛋白酶消化,收集细胞备用。在体内实验中,取需测试的脏器或组织,用磷酸缓冲液( PBS,PH 7.4) 洗净后,剪至糜状滴加PBS(PH 7.4) 研磨,过300 目筛子,收集细胞,悬浮于PBS(PH 7.4) 中, 细胞密度为（1-5） x 104-6个/ mL （血细胞计数板最中央每小格0.5个细胞）,台盼蓝染色、镜检、细胞存活率90 %以上,即可进行以下操作。 2.样品处理： 1）通过尾动脉取血，肝素或枸椽酸钠抗凝，800r/min离心5min，加等体积无钙镁磷酸缓冲液，获得细胞悬液。 a.枸椽酸钠抗凝:有2Na 3C 6 H 5 O 7 。和2Na 3 C 6 H 5 ·11H2O等多种晶体。通常用前者配成 109mmol/l(32g/l)水溶液（也有用106mmol/l浓度），与血液按1：9或1：4比例使用。枸椽钠对凝血V因子有较好的保护作用。 b.肝素（heparin）每毫升血液抗凝需要持素15±2.5Iu.
同源重组的分子机制.doc
同源重组的分子机制 、断裂重接模型(breakage joi ning model ) C. D. Darlington 1936 年提岀。 在同源染色体联会时，由于染色体的缠绕而产生张力，两个相对染色单体在同一位置断裂, 然后彼此和另一染色单体重新连接起来从而形成重组并消除这种张力。 、基因转换现象 Olive等广泛研究粪生粪壳菌g座位，g-决定子囊抱子灰色，g+决定子囊抱子的黑色，在+ - g X g的杂交中，他们分析了20万子囊，发现0.06%是5 : 3分离，0.05%是6 : 2分离，0.008 % 是3 ： 1 ：1 ：3 (或异常4 : 4)分离。图示.(1) 一个抱子中的两个抱子有着不同的基因型。(2)分离比例不是4 : 4。(3)邻近的基因A/a都呈现正常分离。
断裂重接模型则无法解释异常现象。
1930年，德国遗传学家H.温克勒把这种不规则分离现象解释为减数分裂过程中同源染色 体联会时一个基因使相对位置上基因发生相应的变化所致，因而称就基因转变。好象是由于一个 基因转换为另一等位基因，所以称为基因转换(gene con version ) 30%也在g座位的这边或那边发生重组；有基因转换的子囊中，基因转换 和遗传重组都发生在同样两个单体的子囊比例竟高达90%。 所以认为基因转变是某种形式的染色体交换的结果。因此，基因转变的研究，实质上也是染色体交换机制的研究。 粗糙脉俺菌中+ pdxpX pcfc ■!■杂交 抱子对 子囊型 1234 第一对+ pdxp pdj：++ +pdx ■+ 第二对+ +pds +++ 第三对+ pixp+ +”酝 ++ 4 第四对pdx ++ pcfep pd^ +pdx +、同源重组的Holliday模型 M pdx—pdxp-Dtt 哆醇pH?感 + + pdx
原核生物的同源重组
原核生物的同源重组 在生物细胞中，DNA或RNA分子间或分子内的同源序列能在自然条件下以一定的频率发生重新组合，这个过程称为同源重组（Homologous Recombination）。同源重组的频率与DNA 或RNA序列的同源程度（即序列的相似程度）、同源区域大小以及生物个体的遗传特性密切相关，一般而言，同源程度越高、同源区域越大，重组的频率就越高。同源重组是生物进化的一种重要方式，对于原核细菌、噬菌体和病毒而言，同源重组现象的发生尤为普遍。 3.1.1 原核细菌的基因转移程序 原核细菌的基因转移程序是基于物理学和生物学的原理建立起来的，将质粒或噬菌体DNA导入细菌受体细胞的方法主要有以下几种： 1．Ca2+诱导转化法 1970年，有人发现用CaCl2处理过的大肠杆菌能够吸收噬菌体DNA，此后不久，对这种程序进一步的优化实现了质粒DNA转化大肠杆菌的感受态细胞，其整个操作程序如图3-1所示。将处于对数生长期的细菌置入0℃的CaCl2低渗溶液中，使细胞膨胀，同时Ca2+协助细胞膜磷脂层形成液晶结构，使得位于外膜与内膜间隙中的部分核酸酶离开所在区域，这就构成了大肠杆菌人工诱导的感受态。此时加入DNA，Ca2+又与DNA结合形成抗脱氧核糖核酸酶（DNase）的羟基-磷酸钙复合物，并粘附在细菌细胞膜的外表面上。经短暂的42℃热脉冲处理后，细菌细胞膜的液晶结构发生剧烈扰动，随之出现许多间隙，致使通透性增加，DNA 分子便趁机进入细胞内。此外在上述转化过程中，Mg2+的存在对DNA的稳定性起很大的作用，MgCl2和CaCl2又对大肠杆菌某些菌株感受态细胞的建立具有独特的协同效应。1983年，有人除了用CaCl2和MgCl2处理细胞外，还设计了一套用二甲基亚砜（DMSO）和二巯基苏糖醇（DTT）进一步诱导细胞产生高频感受态的程序，从而大大提高了大肠杆菌的转化效率。目前，Ca2+诱导法已成功地用于大肠杆菌、葡萄球菌以及其它一些革兰氏阴性菌的转化。 2．原生质体转化法 在高渗培养基中生长至对数生长期的细菌，用含有适量溶菌酶的等渗缓冲液处理，剥除其细胞壁，形成原生质体，它丧失了一部分定位在膜上的DNase，有利于双链环状DNA分子
DNA同源重组修复的分子机制
?综述? 作者单位:300192 天津,中国医学科学院放射医学研究所 DNA 同源重组修复的分子机制 王勇 樊飞跃 电离辐射直接造成生物靶分子细胞DNA 的损伤,DNA 的损伤类型很多,其中以DNA 双链断裂(double strand break , DS B )最为严重。DNA DS B 的修复较其他类型的DNA 损伤更 加困难,不修复则可能导致染色体断裂和细胞死亡,而修复不当则可能导致染色体缺失、重排、转位和倒置等,从而易于形成肿瘤等疾病[1]。DNA 损伤的不完全修复可导致基因组不稳定,机体细胞为了对抗损伤,发展出多个修复系统来保证基因组的完整性,同源重组修复(hom olog ous recombination repair ,HRR )是DNA DS B 损伤修复的主要方式,对于保持哺乳 动物细胞的基因组完整性十分重要[2]。重组即遗传物质的重排,同源重组是指发生在同源DNA 序列间的重组,主要是利用DNA 序列间的同源性来识别,而负责配对和重组的蛋白质因子并无碱基序列特异性。 本文综述了国外近来对HRR 分子机制的研究进展,包括引发HRR 的DNA 损伤机制;HRR 的基本修复过程和多条修复通路;HRR 关键分子重要功能的实现机制;HRR 与细胞周期调控等其他事件的相互关系;辐射和HRR 及其与肿瘤之间的关系。 11DNA 损伤的感受识别:HRR 参与的蛋白质有RAD51,RAD51b ,c ,d ,RAD52,RAD54,BRC A1,BRC A2,XRCC2,XRCC3 和MRN 复合物等,另外还需大量起始和损伤应激感受分子,包括AT M ,ATR 和DNA 2PK cs [3]。 细胞在受到电离辐射照射后,一系列重组或修复蛋白及复合物重新定位形成核焦点,以应答DNA 损伤。这些蛋白有γ2H2AX ,AT M ,RAD51,BRC A1,BRC A2,NBS1,RPA 和 MRN ,它们相互作用,完成DNA 损伤信号的接受功能并转导 信号给其他蛋白质,介导并协调包括周期检控点、凋亡、修复的损伤应答。在电离辐射引起的DS B 损伤应答中AT M 是最有可能的感受分子,它属于三磷酸肌醇激酶样激酶(PIKK )家族成员(如AT M 、ATR 、DNA 2PK ),都具有磷酸化谷氨酰氨酸残基后的丝或苏氨酸残基的激酶活性。AT M 以二或多聚体非活化形式储存于未受损伤的细胞,DNA 损伤后AT M 通过自我磷酸化,解离二聚体释放出AT M 对其他分子磷酸化的结构域。活化的AT M 可磷酸化组蛋白H2AX 的139位丝氨酸残基,M DC1ΠNF BD1的俩末端BRCT 结构域,BRC A1的1189, 1542和1524位丝氨酸残基 [4] 。在磷酸化M DC1ΠNF BD1促进 下,DNA 损伤后1～3min ,最先定位于DS B 2Mbp 左右区域内的蛋白之一H2AX 就被磷酸化为γ2H2AX ,磷酸化组蛋白可使染色体的部分结构改变,释放出损伤位点的DNA ,并以其为 装配中心继续募集MRN 、BRC A1等其他因子形成大型复合物来监控基因组的损伤[5]。 21HRR 的起始:在AT M 介导的H2AX 磷酸化波之后,活 化的AT M 与DS B DNA 结合,进而磷酸化结合至γ2H2AX 核焦点的53BP1、NBS1,随后RAD502MRE11复合物由MRE11结合到NBS1,完成定位于DS Bs MRN 复合物的装配,同时BRC A1也结合至损伤位点的53BP1。很可能由具有内切酶和外切酶活性的MRN 复合物发挥5′23′外切酶活性切割DNA 断裂末端,同时MRN 也参与从DS B 到下游DNA 应答蛋白的信号转导。由于NBS1只是3′25′而不是5′23′外切酶活性,故需其他核酸酶的协助切割DNA 来提供DNA 配对和链交换所必需的 3′ssDNA 突出。MRE11定位于细胞核内,Mn 2+ 为辅因子,亚基 参与构成RAD50复合物,有单链内切酶活性和双链特异性 3′25′外切酶活性。RAD50有ATPase 活性的头部球状结构域, 使得DNA 结合具有ATP 依赖性,而其高度柔性的分子卷曲尾部,就像是从核心蛋白向外伸出的长臂,可以较大倍率的易化两DS B 末端互寻,进而桥接两个断裂末端[6]。之后由人复制蛋白A (RPA )与突出末端结合以保护并去除其二级结构。RPA 是由14、32和70kDa 3亚基组成稳定的异质三聚体,与ssDNA 结合,是DNA 复制、重组和修复的必需蛋白。 31链侵入和修复性合成:E .coli 的RecA 的真核细胞同 源物RAD51代替RPA 在ssDNA 区域形成核蛋白纤维,催化同源序列的寻找、链配对和链交换。这是一个需要同源序列的RAD51依赖性链侵入机制。RAD51催化重组中的分子间稳定的联会配对包括:RAD51核蛋白纤维同源双螺旋DNA DS B 被加工的单链末端链侵入成为同源dsDNA ,核蛋白纤维 的ssDNA 和侵入DNA 双螺旋同源链之间的Wats on 2Crick 氢键作用导致随后的双螺旋非互补链的置换,最后形成含有异源双螺旋DNA 的D 环结构重组中间体。随着链交换的深入,重组中间体分岔结构向两边迁移的同时,以侵入中的DS B 加工后的3′末端作为引物,侵入双螺旋的互补链作为模板,进行修复性DNA 合成[7]。 RPA 参与链侵入,通过稳定ssDNA 和被置换来促进RAD51结合ssDNA 。RAD51属于RecA RAD51亚家族,可能定 位于核内,广泛参与普遍的DNA 损伤应答通路,结合单或双链DNA ,可显示DNA 依赖的ATPase 活性,Mg 2+和K +是辅因子[8]。RAD51同系物中RAD51D 的地位特殊,一旦缺失,人和大鼠细胞将不能增殖,小鼠在出生前就会死亡[9]。 参与DS B 的HRR 的RAD52以环状七聚体钳住DNA 链,募集RAD51结合到RPA 覆盖的ssDNA ,结合两者并协助 RAD51形成DNA 交换中间体,可将ssDNA 暴露于蛋白质表
DNA同源重组机制的确立
287 doi:10.3969/j.issn.0253-9608.2015.04.007 DNA同源重组机制的确立 向义和? 清华大学物理系，北京 100084 摘要 介绍了DNA同源重组机制确立的过程。其主要内容包括基因连锁和重组现象的发现，交叉假设的提出，断裂重接假设和复制选择假设的出现，同源重组的三个模型(Holliday模型、单链断裂模型和双链断裂模型)的确立。关键词 连锁基因；同源重组；交叉假设；Holliday模型；单链断裂模型；双链断裂模型 DNA 重组(recombination)是指发生在DNA 分子内部或DNA 分子之间核苷酸序列的交换、重排和转移现象，是已有遗传物质的重新组合过程。同源重组(homologous recombination)是在两个DNA 分子的同源序列之间直接进行交换的一种重组形式。进行交换的同源序列可能是完全相同的，也可能是非常相近的。同源生物体通过重组可以产生新的基因或等位基因的组合，还可以提高种群内遗传物质的多样性，而人们可使用同源重组进行遗传作图。 本文介绍了DNA 同源重组机制确立的过程。20世纪初发现了基因连锁和重组现象，在探讨重组现象出现的原因时又提出了交叉假设，形成了交换概念。20世纪30年代中期在探讨基因交换的机制时，出现了染色体交换的两种假设：断裂重接假设和复制选择假设。1953年DNA 双螺旋结构发现后，科学家开始在分子水平上探讨同源重组的机制。20世纪60—80年代，科学家分别提出了DNA 同源重组的三种模型：Holliday 模型，单链断裂模型和双链断裂模型。 1 基因连锁和重组现象的发现 1.1 连锁现象的发现 1905年，英国生物学家贝特森(Bateson W., 1851—1926)和庞尼特(Punnet R. C.)研究香豌豆两对性状的遗传。他们选择的一对性状是花的颜色，有紫色和红色两种；另一对是花粉粒的形状，有长形和圆形两种。将紫花长花粉粒和红花圆花粉粒的植株作亲本进行杂交，结果F 1代都是紫花长花粉粒，可见紫花对红花是显性，长花粉粒对圆花粉粒是显性。将F 1代自交得到的F 2代有紫长、紫圆、红长、红圆4种表型。这4种表型的比率不符合孟德尔的两对遗传因子的分离比9∶3∶3∶1，其中紫长和红圆的表型的比率远远超出9/16和1/16，而相应的紫圆和红长的表型却大大少于3/16(表1)。[1] 表1 香豌豆紫长×红圆杂交试验 F 2紫长紫圆红长红圆总数实得数 4 831390393 1 338 6 952预计数 3 910.5 1 303.5 1 303.5 434.5 6 952 将实验数据与由孟德尔自由组合定律所预期结果相比较，F 2代中性状的亲本组合类型远远多于重组组合的类型。这等于说，两对基因在杂交子代中的组合并不是随机的，在F 1杂种形成配子时，原来属于同一亲本的两个基因更倾向于进入同一配子中，有更多保持亲本原来组合的倾向，而且这种倾向与显隐性无关。这是在自由组合定律方面第一次出现的显著的例外，无疑，这 ?通信作者，E-mail ：xiangyhts@https://www.360docs.net/doc/b69394845.html,