测铜绿假单胞菌的试验研究

荧光定量PCR快速检测铜绿假单胞菌的试验研究

陈娟邓中平

（中山大学达安基因诊断中心，广州 510665）

【摘要】目的应用荧光定量PCR技术实现铜绿假单胞菌的快速鉴定。方法利用所报道的铜绿假单胞菌外毒素A基因设计引物和探针，并对该方法进行特异度、灵敏度、稳定度等方面的考察。结果用该

方法检测到铜绿假单胞菌的近源种未发生非特异性扩增，最低检出量达103个细菌/ml。结论用该荧光定

量PCR检测试剂盒检测铜绿假单胞菌不仅特异度好、灵敏度高，且快速简便。

【关键词】铜绿假单胞菌；荧光定量；PCR

A study of detecting Pseudomonas aeruginosa by Real-time PCR CHEN Juan，DENG Zhongping. DaAn Gene Diagnostic Center，guangzhou 510665，China

【Abstract】 Objective Using real-time PCR technique to identify P.aeruginosa rapidly. Methods Primers for specific PCR amplification were designed based on the published sequence of the exotoxin A gene of P.aeruginosa , besides its specificity、sensitivity and stability was examined. Results Using this method to detect P.aeruginosa and other Bacteriaes of Pseudomonas, only P.aeruginosa can be detected, and as little as 103 copy/ml of P.aeruginosa DNA can be amplified . Conclusion PCR amplification targeting at the exotoxin A gene of P.aeruginosa is a rapid、specific、sensitive and relatively simple method for the identification of P.aeruginosa.

【Key words】P.aeruginosa；Real-time；PCR

铜绿假单胞菌又称绿脓杆菌，属于假单胞菌属，在自然界中广泛分布，空气、水、土壤中均有存在，是一种重要的条件致病菌，常引起人皮肤化脓感染，特别是烧伤、烫伤、眼部疾病患者被感染后，常使病情恶化，并可引起败血症[1]。临床上还可引起呼吸道感染、心内膜炎、尿路感染、中枢神经系统感染、骨关节感染、眼科、耳、乳突及鼻窦感染、消化道感染等。国家质量监督检验检疫总局、卫生部等部门有明确规定，在食品、化妆品、外用药品以及絮用纤维制品等物品中不得检出铜绿假单胞菌；由于铜绿假单胞菌分布甚广、适应性强、且容易产生抗药性，因此是院内常见的感染源之一。传统的检测方法主要依靠铜绿假单胞菌的生物学特征，通过分离培养结合生化检定等方法进行检测，不仅操作繁琐、耗时长，且容易延误诊断。

实时荧光定量PCR技术是近年来发展起来的一种快速、准确、定量的基因检测技术，已经被广泛应用于临床肝炎、结核等疾病的诊断检测中，不仅可以用于检测是否有病原体感染，而且还可以对用药效果进行有效监测。本研究采用TaqMan探针实时荧光定量PCR技术，以铜绿假单胞菌外毒素A（ETA）基因作为检测靶基因研究检测铜绿假单胞菌的荧光定量PCR试剂盒，以实现快速检测临床样本、化妆品及环境样本中的铜绿假单胞菌，且能对样品中所含有的铜绿假单胞菌进行定量。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌 株本研究所用的菌株绿脓杆菌是购自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的标准菌株。

1.1.2 培养液营养肉汤培养液，普通琼脂培养平板。

1.1.3 试 剂 DNA提取液、定量PCR buffer、Taq 酶、dNTP均由中山大学达安基因股份有限公司提供。

1.1.4 引物探针的设计铜绿假单胞菌有多种产物有致病性，其内毒素则在发病上无重要意义。铜绿假单胞菌分泌的ETA是最重要的致病、致死性物质，进入敏感细胞后被活化而发挥毒性作用，使哺乳动物的蛋白合成受阻并引起组织坏死，造成局部或全身疾病过程[2]。而ETA基因仅在铜绿假单胞菌基因组中存在[3]。所以本研究根据已报道的ETA基因序列设计了引物探针4套。引物探针由中山大学达安基因股份有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 铜绿假单胞菌的复苏从中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心购买的菌株为干粉，铜绿假单胞菌处于休眠状态，须进行复苏和增菌培养。复苏操作按照所购菌株的说明书进行。

1.2.2 增菌培养取50 μl已复苏的铜绿假单胞菌培养物加入10 ml的营养肉汤培养液中37℃振荡培养过夜。

1.2.3 定量菌液浓度用比浊法定量所培养的铜绿假单胞菌的菌液浓度。首先用麦氏比色管试剂盒制作OD550值——每ml菌液里的细菌个数的标准曲线，再测定所培养菌液的OD550值，将OD550值代入标准曲线，得到所培养菌液的浓度，单位为个细菌/ml。把菌液稀释成1×101个细菌/ml 、1×102个细菌/ml 、1×103个细菌/ml、1×104个细菌/ml、1×105个细菌/ml、1×106个细菌/ml、1×107个细菌/ml几个梯度。

1.2.4 菌液DNA的提取用1.5 mlEP管取每个梯度菌液各1 ml，然后12 000 r/min离心5 min，去上清，保留50 μl菌液，再加入50 μlDNA提取液，100℃恒10 min，最后12 000 r/min 离心5 min，留上清置于-20℃备用。

1.2.5 主要实验

1.2.5.1 引物探针的筛选本研究根据ETA基因设计了引物探针4套，先用铜绿假单胞菌和几个非铜绿假单胞菌的菌株DNA对引物探针进行初步筛选。取这4套引物探针用相同的配方各配1套40 μl的反应体系，分别加入5 μl的铜绿假单胞菌和非铜绿假单胞菌的DNA，进行荧光定量PCR扩增。反应条件为：93℃预变性2 min，93℃变性45 s，55℃退火延伸1 min，10个循环不收集荧光，93℃变性30 s，55℃退火延伸45 s，30个循环在退火延伸时收集荧光。根据对这几个菌株DNA扩增的特异性和荧光曲线的形状是否光滑是否成典型的“S”进行筛选，最后确定了1套引物探针。

1.2.5.2特异性实验特异性实验是保证试剂盒特异性的关键。实验的样本有非近源种奇异变形杆菌、粪链球菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌和近源种荧光假单胞菌、菊苣假单胞菌、恶臭假单胞菌，以上都为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心所购买的标准株。用以上的样本和绿脓杆菌的DNA加入反应体系进行荧光定量PCR扩增，反应条件与1.2.5.1同，结果如图1。反应体系只对绿脓杆菌DNA进行了扩增，扩增曲线成典型的“S”型。

Fig.1 Specific identification of P.aeruginosa by real-time PCR

图1 铜绿假单胞菌特异性实验的荧光定量PCR结果图

1.2.5.3 灵敏度实验灵敏度实验是保证试剂盒最低检出量的实验。将稀释成1×101个细菌/ml 、1×102个细菌/ml 、1×103个细菌/ml、1×104个细菌/ml、1×105个细菌/ml、1×106个细菌/ml、1×107个细菌/ml几个梯度的铜绿假单胞菌菌液按照1.2.4的方法提取DNA，各取5 μl做为模板，进行荧光定量PCR扩增，反应条件与1.2.5.1同。结果如图2。

Fig.2 Sensitivity result of P.aeruginosa by real-time PCR

图2 铜绿假单胞菌灵敏度实验的荧光定量PCR结果图

1.2.5.4标准曲线的制作将1×103个/ml、1×104个细菌/ml、1×105个细菌/ml、1×106个细菌/ml、1×107个细菌/ml定量为1×103、1×104、1×105、1×106、1×107，制作标准曲线，结果如图3，相关系数达0.99842。

Fig .3 Standard curve of P.aeruginosa by real-time PCR

图3 荧光定量PCR定量铜绿假单胞菌菌液浓度的标准曲线图

1.2.5.5 精密度实验精密度实验是保证试剂盒的重复性和稳定性的实验。将1×103个/ml 和1×105个/ml浓度的菌液进行10次重复DNA提取，将所提取的DNA作为模板，进行荧

光定量PCR扩增，反应条件与1.2.5.1同，结果如图4。

Fig.4 Precision result of P.aeruginosa by real-time PCR

图4 铜绿假单胞菌精密度实验的荧光定量PCR结果图

1.2.5.6 临床样本的检测从南京儿童医院取得10例已鉴定为阳性的标本培养物，培养物为半固体状态。将培养物经过一定的处理提取DNA，取5 μl做模板，进行荧光定量PCR扩

增，反应条件与1.2.5.1同，结果如图5。

Fig .5 Detection result of positive samples by real-time PCR

图5 阳性标本的荧光定量PCR结果图

2 结果分析

2.1 特异度实验

特异度实验采用铜绿假单胞菌的近源种：荧光假单胞菌、菊苣假单胞菌、恶臭假单胞菌，它们同属假单胞菌的菌株，与铜绿假单胞菌之间有较高的同源性，定量荧光PCR后只有铜绿假单胞菌有明显的“S”型扩增曲线，见图1。说明该引物探针对铜绿假单胞菌有很高的特异度。为了证实该引物探针扩增的片段为铜绿假单胞菌ETA基因的片段，我们将PCR的产物进行了克隆和测序，结果与绿脓杆菌DNA比对，证明了扩增的片段为ETA基因的片段。

2.2 灵敏度实验

当模板为1×103个/ml所提取的DNA时，加入5 μl的模板DNA依然能保证扩增曲线呈典型的“S”型，结果如图2。这个结果表明，该引物探针的灵敏度非常高。

2.3 精密度实验

精密度实验结果如图4，10次重复提取DNA的扩增曲线重复性良好，各重复样品之间的变异系数小于0.1。在不同批次培养的菌液之间和同批次培养的菌液不同批次提取的DNA 之间都进行过灵敏度实验和精密度实验，结果表明，在不同批次培养的菌液之间和同批次培养的菌液不同批次提取的DNA之间的无太大的差异，特异度、灵敏度和稳定度都能很好的保证。

2.4 临床样本的检测

已检测10例临床样本阳性培养物，检测结果全为阳性（如图5）。此部分实验仍在进行中。

3 讨论

使用传统的铜绿假单胞菌检测方法耗时长、操作复杂，不宜做大批量样本的检测，在类似食品和化妆品等其他需大批量检测的方面，传统的检测方法暴露出其种种弊端。而在临床上由于检测的时间长更可能会导致延迟诊断和治疗。用荧光定量PCR检测方法耗时短、操

作简单、灵敏度高，这些优点都既能满足在食品和化妆品检测中需做大批量样本的检测的需要，也能满足在临床上需快速检测作出判断的需要。因此，铜绿假单胞菌荧光定量PCR检测试剂盒是特异度好、灵敏度高，且省时省力的检测技术，具有广泛的实际用途。

参考文献

[1] 张伟，李闻，张伟尉，等. 基于PCR技术的绿脓杆菌快速检测方法研究. 中国卫生检验杂志，2005，

15（9）：1065.

[2] Liu PV,Hsieh H.Exotoxins of Pseudomonas aeruginosa.I.Factors that influence the production of exotoxinA.

J InfectiousDiseases，1973，128 (4 )：506 – 513.

[3] KP Song，TK Chan，ZL Ji ，et al. Rapid identication of Pseudomonas aeruginosa from ocular isolates by

PCR using exotoxinA–specific primers. Molecular and Cellular Probes，2000，14：199-204.