鸡沙门氏菌的分离、鉴定及培养方法的研究

摘要

对某禽场发生的沙门氏菌病进行病料的分离、鉴定、培养，确诊禽场群感染的沙门氏菌菌群种类是白痢沙门氏菌、肠炎沙门氏菌和尚待进一步定群、定型的C菌株。药物敏感性试验结果表明，硫酸卡那霉素、菌必治、新霉素、多粘菌素B、环丙沙星等为高度敏感性药物。

关键词：沙门氏菌分离鉴定培养

I

目录

摘要...............................................................................................................I 1 前言 (1)

1.1研究的目的和意义 (1)

1.2国内外研究文献综述 (1)

1.3本文研究的主要内容 (2)

2 材料与方法 (2)

2.1 材料 (2)

2.1.1样品来源 (2)

2.1.2培养基 (3)

2.1.3染色液 (3)

2.1.4其他 (3)

2.2 方法 (4)

2.2.1涂片镜检 (4)

2.2.2增菌培养 (4)

2.2.3分离培养 (4)

2.2.4沙门氏菌初步确认 (5)

2.2.5纯培养 (5)

2.2.6运动性检查 (5)

2.2.7生化反应 (5)

2.2.8药敏试验 (5)

2.2.9白痢伤寒多价抗原血清学试验 (6)

2.2.10动物接种试验 (6)

3 结果 (6)

3.1各种采集样品分离、鉴定出的菌株分离率、菌株种类 (6)

3.2培养特征、形态及染色特性、运动性检查 (7)

3.2.1 A菌株 (7)

3.2.2 B菌株 (8)

3.2.3 C菌株 (8)

3.3禽场白痢、伤寒多价抗原血清学监测 (8)

3.4生化试验结果 (8)

3.5药敏试验结果分离菌株药敏试验结果 (9)

3.6动物接种试验 (10)

4 讨论与结论 (10)

参考文献 (11)

II

致谢 (12)

III

1 前言

1.1 研究的目的和意义

目的：沙门氏菌病是公共卫生学上具有重要意义的人畜共患病之一，其病原沙门氏菌属肠道细菌科，包括那些引起食物中毒，导致胃肠炎、伤寒和副伤寒的细菌。它们除可感染人外，还可感染很多动物包括哺乳类、鸟、爬行类、鱼、两栖类及昆虫。人畜感染后可呈无症状带菌状态，也可表现为有临床症状的致死疾，它可能加重病态或死亡率，或者降低动物的繁殖生产力。它不但会对畜牧业生产造成严重的经济损失，而且会严重威胁人类的健康。

通过研究沙门氏菌的治病原理让我们防范疾病。同时发掘、利用、改善和保护有益微生物，控制、消灭或改造有害微生物，为人类社会的进步服务。

意义：随着近年来世界范围内的食品安全恶性事件屡屡发生,食品污染与食源性疾病构成了一个巨大且不断扩大的世界性公共卫生问题,直接关系到人们的身体健康和社会稳定,

并且正成为阻碍国际食品贸易发展的重要因素。由于传统感染源普遍存在,新感染源不断出现以及食品工业过程复杂化、人们饮食习惯的改变、人口流动性增加等因素,使感染的流行模式发生明显变化,表现为食物中毒通常迅速大面积暴发,给人类的食品安全和健康带来威胁,同时也给食源性疾病的控制和预防带来新的挑战。在各种畜产品中,细菌性食物中毒最为常见,而由沙门氏菌引起的食物中毒病例在食物中毒中居于前列。动物性产品中含有多种丰富的营养成分,非常适宜于沙门氏菌的生长繁殖,人们一旦摄入了含有大量沙门细菌的动物

性产品，就会引起细菌性感染，进而在毒素的作用下发生食物中毒。沙门氏菌不仅危害人类健康还会给畜牧业带来巨大经济损失。因此加强畜产品卫生安全，防止沙门氏菌污染，不仅是发展畜牧业的需要，也是减少人类沙门氏菌食物中毒，保护人民群众身体健康的重要措施。了解沙门氏菌的概括，有助于对其检测，从而保证畜产品的质量，有利于畜牧业的发展和人的健康。

1.2 国内外研究文献综述

1885年沙门氏等在霍乱流行时分离到猪霍乱沙门氏菌，故定名为沙门氏菌属。沙门氏菌属有的专对人类致病，有的只对动物致病，也有对人和动物都致病。沙门氏菌

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病是指由各种类型沙门氏菌所引起的对人类、家畜以及野生禽兽不同形式的总称。感染沙门氏菌的人或带菌者的粪便污染食品，可使人发生食物中毒。据统计在世界各国的种类细菌性食物中毒中，沙门氏菌引起的食物中毒常列榜首。我国内陆地区也以沙门氏菌为首位。

1.3 本文研究的主要内容

目前我国市场不规范，变质、假货、劣货屡见不鲜。某场因改进配方，在种育成期、产蛋期的中添加肉骨粉替代植物性蛋白，事先未对样品进行沙门氏菌检测，结果不慎购入大批污染了沙门氏菌的肉骨粉，造成种阳性率大增，种蛋孵化率、健雏率下降的情况。本实验通过对某种场的病料、泄殖腔拭子、粪便、饲槽饮水、污水、新鲜蛋、禽舍空气等样品进行细菌分离、鉴定及培养，摸清该场沙门氏菌感染种类。

2材料与方法

2.1材料

2.1.1样品来源

某种禽场：病雏3只、成年发病蛋3只。病料取心、肝、脾、肾、胆囊、畸形卵细胞、部分输卵管。雏泄殖腔拭子20只份、成年蛋泄殖腔拭子20份。雏粪20只份、成年蛋粪20只份。雏饲槽饮水5份、成年蛋饲槽饮水5份、污水5份。新鲜蛋10个。空气取样：雏舍S.S琼脂培养皿打开3～5分钟取样5份、成年蛋舍S.S琼脂培养皿打开3～5分钟取样5份。取样5份，其中雏料3份、蛋料2份。血清样品：场随机抽取68日龄海兰蛋血清50只份、440日龄依莎蛋血清50只份。

2.1.2培养基

营养肉汤培养基（肉水1000毫升、蛋白胨10克、氯化钠5克）。普通营养琼脂（肉水1000毫升、蛋白胨10克、氯化钠5克、琼脂20～30克）。S.S琼脂（眎胨5克、乳糖10克、胆盐8.5～10克、柠檬酸钠0.5克、牛肉膏5克、琼脂20克、0.5%

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中性红水溶液4.5毫升、0.1%煌绿溶液0.33毫升、蒸馏水1000毫升）。三糖铁培养基（牛肉浸膏3克、枸椽酸铁0.3克、酵母膏3克、葡萄糖1克、蛋白胨20克、酚红0.024克、氯化钠5克、硫代硫酸钠0.3克、乳糖10克、琼脂12克、蔗糖10克、水1000毫升）。煌绿蛋白胨增菌液（0.5%氯化钠和1%蛋白胨的蛋白胨混合液混合，调整pH为7.0灭菌待用；1:10000煌绿水溶液。使用时取10毫升蛋白胨液加入各试管中，再加入0.4毫升的1:10000煌绿水溶液）。鲜血琼脂（无菌取健康家兔血液，加到盛有无菌5%柠檬酸钠的容器中，一般血液与5%柠檬酸的比例约为9：1，混匀，置冰箱中保存。将灭菌的营养琼脂冷却至45～50℃时，加入无菌鲜血达5%，混匀，无菌倾注于平皿）。糖、醇发醇管（蛋白胨1克、氯化钠0.5克、蒸馏水100毫升，所需的葡萄糖、鼠李糖、蕈糖、乳糖、蔗糖和甘露醇、卫茅醇、肌醇、山梨醇分别加入0.5～1克，1.6%溴甲酚紫酒精溶液0.1毫升）。尿素发酵管（蛋白胨1克、葡萄糖1克、氯化钠5克、磷酸二氢钾2克、蒸馏水1000毫升、0.4%酚红溶液3毫升、20%尿素100毫升）。枸椽酸钠发酵管（枸椽酸钠1克、氯化钠5克、K2HPO41克、琼脂20克、硫酸镁0.2克，NH4H2PO41克、1%溴麝香草酚蓝酒精溶液10毫升、蒸馏水1000毫升）。蛋白胨水（蛋白胨1克、氯化钠0.5克、蒸馏水200毫升）。硫化氢试验培养基（肉汤琼脂100毫升、10%硫代硫酸钠溶液2.5毫升、10%醋酸铅溶液3毫升），以上发酵培养基按要求实验室自制。

2.1.3染色液

革兰氏染色液结晶紫染色液（甲液：结晶紫2.0克、95%乙醇20毫升；乙液：草酸铵0.8克、蒸馏水80毫升。使用时将甲液稀释5倍，即加20毫升甲液于80毫升乙液中，混合即成），按要求实验室自制。革兰氏碘溶液（碘片1克、碘化钾2克、蒸馏水300毫升。先将碘化钾加入3～5毫升蒸馏水中，溶解后再加碘片，用力摇匀，使碘片完全溶解后，再加蒸馏水至足量），按要求实验室自制。95%的酒精（用作脱色剂）。沙黄复染液（2.5%番红纯酒精溶液10毫升、蒸馏水90毫升，混合即成），按要求实验室自制。

2.1.4其他

药敏试纸；沙门氏菌A-F群O多价血清；白痢伤寒多价抗原。健康14日龄雏16只。

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2.2方法

2.2.1涂片镜检

取肝、脾、肾组织直接涂片，革兰氏染色（结晶紫染色1～2分钟，水洗后加碘液助染1～2分钟，水洗后95%脱色半分钟，水洗后沙黄染液重染0.5～1分钟，水洗、滤纸吸干），用10×100倍油镜检查，均未见典型细菌。

2.2.2增菌培养

发病雏和成年蛋增菌培养：取肝、脾、异常卵泡、输卵管1～2克，剪碎后，分别放入装有10毫升煌绿蛋白胨增菌液的试管中，于37℃温箱中培养24小时。雏和成年蛋泄殖腔拭子增菌培养：将火柴棍棉球泄殖腔抹拭物无菌操作放入装有5毫升煌绿蛋白胨增菌液的试管中，于37℃温箱中培养24小时。雏粪增菌培养：取粪样品1份加到9份煌绿蛋白胨增菌液中，于37℃温箱中培养24小时。雏饲槽饮水、蛋饲槽饮水、污水增菌培养：取2毫升水样放入8毫升煌绿蛋白胨增菌液中，37℃温箱培养48小时。新鲜蛋增菌培养：取10个新鲜蛋，用碘酒将蛋壳表面消毒，打破蛋壳，把蛋清和蛋黄全部倒入装有玻璃珠的瓶内摇匀，取出30毫升接种在150毫升煌绿蛋白胨增菌液中，于37℃温箱中培养48小时。增菌培养：无菌称取3份雏料、2份蛋料，分别置于225毫升煌绿蛋白胨增菌液中，于37℃温箱中培养48小时。

2.2.3分离培养

取各增菌培养物划线接种到S.S选择培养基上，37℃温箱培养24小时。

2.2.4沙门氏菌初步确认

采用平板凝集法。用接种环圈蘸取沙门氏杆菌A-F群O多价血清至玻片上3～4环，再用接种棒挑取S.S培养基分离典型菌落少许混匀，并用生理盐水和大肠杆菌作对照比较，观察是否出现絮状凝集沉淀，从而初步筛选出沙门氏菌。

2.2.5纯培养

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挑取筛选出的沙门氏菌落，接种到三糖铁培养基上，于37℃温箱培养24小时。

2.2.6运动性检查

采用压滴法、悬滴法、半固体穿刺培养法及平板挖沟培养法检查各菌株细菌运动性。其中悬滴检查方法为：取洁净的凹玻片一块，于其凹窝的四周整齐地涂以适量的凡士林。另取洁净盖玻片一块，用接种环于其中央滴上一小滴生理盐水或透明肉汤，再用接种环取待检团体培养物少量，混匀于液滴内；取起并翻转盖玻片，使液滴向下，以其对角线垂直于载玻片四边的位置，轻轻盖在凹玻片的凹窝上，略加轻压，使盖玻片四周与凡士林密着，封闭凹窝，即可进行镜检。镜检时显微镜要放在平坦、稳固之处，不能倾斜或震动，放上悬滴标本片后，先用低倍镜找到液滴，移至视野中央，然后转换高倍镜和调查光线稍暗，对焦观察。半固体培养基穿刺培养法为：以灭菌接种针蘸取纯培养物，垂直穿刺接种于半固体培养基的琼脂柱中，置37℃温箱中培养18～24小时，然后取出检查。平板挖沟培养法：以无菌操作在平板中心横过挖去一条1

厘米宽的琼脂条，使平板中间形成一条小沟，放置一条4×0.5厘米的无菌滤纸横跨于两边培养基上，使与小沟相垂直。在滤纸条的一顶端接种待检细菌的纯培养物，置37℃温箱中培养，每天观察生长情况，直至七天。如接种端的隔沟对边也生长出同样细菌，则表示该菌有运动力。

2.2.7生化反应

将各三糖铁培养基纯培养物挑取菌落接种于生化发酵管内，于37℃温箱培养后进行观察。结果见表1。

2.2.8药敏试验

将分离出的细菌接种于肉汤蛋白胨培养基，37℃培养48小时，至肉汤变浑，试管底出现多量絮状沉淀。取菌汤2毫升覆盖在营养琼脂培养皿表面，倒弃多余菌液，将药敏试纸贴于培养基上，放入37℃温箱培养24小时，测量抑菌圈大小。

2.2.9白痢伤寒多价抗原血清学试验

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取场采集的68日龄海兰蛋血清50只份和440日龄依莎蛋血清50只份30ml与白痢伤寒多价抗原30ml在玻片上混合，轻轻摇动玻片，数分钟后出现絮片状凝集者为阳性。

2.2.10动物接种试验

将A菌株、B菌株和C菌株的普通营养琼脂平板培养物用生理盐水洗下后制成菌悬液，采用滴鼻和口服方法进行动动。

3结果

3.1各种采集样品分离、鉴定出的菌株分离率、菌株种类见表1。

表1样品分离、鉴定出的菌株分离率、菌株种类

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3.2培养特征、形态及染色特性、运动性检查

3.2.1 A菌株

将纯培养物分别接种在普通琼脂、鲜血琼脂、S.S琼脂、营养肉汤培养基中经37℃培养24小时后，在普通琼脂平板上长出圆形、边缘整齐、湿润、稍隆起的光滑菌落，单在3.2mm、密集1mm左右。在鲜血琼脂平板上菌落特点与普通琼脂平板上相同，其大小、形状与鲜血平板相同；在营养肉汤中肉汤轻度混浊，管底有絮状沉淀，无菌膜及菌环。纯培养物进行涂片染色镜检，见有革兰氏阴性细长杆菌（0.3～0.4um×1.2～2.2um），无芽胞及芙膜。经压滴法、悬滴法、半固体穿刺培养法及平板挖沟培养法检查，均无运动性。

3.2.2 B菌株

将纯培养物分别接种在普通琼脂、鲜血琼脂、S.S琼脂、营养肉汤培养基中经37℃培养24小时后，在普通琼脂平板上长出圆形，稍隆起、闪光而边缘无滑的菌落，大

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小1.5～1.8mm，在鲜血琼脂平板上菌落特点与普通琼脂增板上相同，未见溶血现象；在S.S琼脂上生长出无色半透明，中心带黑色的菌落，其大小、形状与鲜血平板相同；在营养肉汤中肉汤中度混浊，管底有絮状沉淀，无菌膜及菌环。纯培养物进行涂片染色镜检，无菌膜及菌环。纯培养物进行涂片染色镜检，见有革兰氏阴性0.6～

1um×1.8um杆菌，单在或两个成链，无芽胞及芙膜。经压滴法、悬滴法、半固体穿刺培养法及平板挖沟培养法检查，均无运动性。

3.2.3 C菌株

将纯培养物分别接种在普通琼脂、鲜血琼脂、S.S琼脂、营养肉汤培养基中经37℃培养24小时后，在普通琼脂上长出圆形、稍隆起、边缘光滑的菌落，大小1mm，在鲜血琼脂平板上菌落特点与普通琼脂平板上相同，未见溶血现象；在S.S琼脂上生长出无色半透明菌落，其大小、形状与鲜血平板相同；无菌膜及菌环。纯培养物进行涂片染色镜检见有0.3～0.4um×1.3～2.5um杆菌，单在，无荚膜、无芽胞。经压滴法、悬滴法、半固体穿刺培养法及平板挖沟培养法检查，均无运动性。

3.3禽场白痢、伤寒多价抗原血清学监测

68月龄海兰蛋检测50只份血清阳性6只份，阳性率12%。440日龄依莎蛋检测50只份，阳性5份，阳性率10%。

3.4生化试验结果

分离出的A菌株发酵葡萄糖、麦芽糖、鼠李糖、蕈糖、甘露醇、卫茅醇、枸椽酸盐；不发酵乳糖、蔗糖、肌醇；靛基质阴性、V-P阴性、M·R阳性，产生硫化氢、过氧化酶阴性。分离出的B菌株发酵葡萄糖、麦芽糖、甘露醇、鼠李糖、蕈糖、甘露醇；不发酵乳糖、蔗糖、肌醇；靛基质阴性，V-P阴性，产生硫化氢。分离出的C菌株发酵葡萄糖、尿素，不发酵乳糖、蔗糖、麦芽糖、蕈糖、甘露醇、山梨醇、肌醇、枸椽酸盐、卫茅醇、硫化氢阴性，V-P阴性、过氧化酶阴性。

3.5药敏试验结果分离菌株药敏试验结果见表2。

表2 药敏试验结果

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3.6动物接种试验

雏接种后第3天早上部分开始出现症状，随后其他试验雏相继出现症状，并与自然发病症状相同，其中A菌株较B菌株、C菌株症状严重。一周内统计灭亡病雏，A 菌株试验组全部死亡，B菌株试验组死亡1只，C菌株试验组死亡2只，试验雏死后进行剖检，并取脏器涂片镜检和培养特性观察，结果与所分离菌株完成全致，滴服生理盐水对照组雏全部存活。

4讨论与结论

根据临床症状、病理剖检、病料的分离、鉴定以及禽场环境的监测，确诊禽场群感染的沙门氏菌菌群种类是白痢沙门氏菌、肠炎沙门氏菌和尚待进一步定群、定型的C菌株。药物敏感性试验结果表明，硫酸卡那霉素、菌必治、新霉素、多粘菌素B、环丙沙星等为高度敏感性药物。

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参考文献

1.陆承平：《兽医微生物学》.中国农业出版社，2001

2.王利明，刘宏艳：“禽沙门氏菌的分离和鉴定”.《畜牧兽医科技信息》,2009年第2期

3.马呈珠，薛良辉，张红，王晓红：“山东省286起沙门菌食物中毒分析”.《中国食品卫生杂志》，2005年第1期

4.李庆德，原志伟，沈巍：“沙门氏菌的危害及其快速检测方法的研究进展”.《湖北畜牧兽医》,2010年第1期

5.丁福辉，赵立山，吕晓东：《兽医化验技术》. 中国农业出版社，1999

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致谢

时光荏苒，我即将结束我的大学生活，迈向新的工作岗位。在我学习生活期间，老师们对我进行了无私的帮助和严格的教导，特别要向我的指导教师何老师致以敬意。他以严谨的学风，广博的知识，热忱的态度赢得了广大学生的尊敬。在我论文创作完成期间，他给予我莫大的帮助与鼓励。

我还要向我学院其他教师致意，向曾经传授我知识的老师等表达我真诚的谢意，正是在您们的言传身教下，我才得以成长、进步。

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