银耳菌种规范化生产工艺讲座_三_银耳两个纯菌种的单独分离与混合育成母种的技术

银耳菌种规范化生产工艺讲座(三)

)))银耳两个纯菌种的单独分离与混合育成母种的技术

丁湖广

(福建省古田县新元食用菌研究所,古田 352200)

关键词银耳纯白菌丝;香灰菌丝;分离;育种;交合

1 银耳纯菌丝分离操作技术

单独分离银耳纯菌丝和香灰菌丝,然后进行交合培养的母种,具有适应性好、抗逆力强、朵形美、产量高而稳的优点。可以利用两种菌丝的不同耐旱力,制定银耳纯菌丝分离方法:将新鲜银耳分离材料的基质,通过干燥器逼干,使不耐旱的香灰菌丝先行枯死,进而分离获得耐旱存活的银耳纯菌丝(图1)

。11袋栽银耳割掉子实体 21取出分离材料 31去掉疏松木屑的基质块41放干燥器内逼干 51分离部位取中 61接入试管内 71棉花塞口图1 银耳纯菌丝的分离过程

111 菌材选择在室内外袋栽或瓶栽银耳群体中,挑选长势好、朵形圆正、色白、耳片粗花、肥厚的银耳。认真观察耳基周围是否污染霉菌或放线菌等,袋内颜色是否均匀,若发现污染杂菌或出现杂斑的一律去除。一般以出耳后10~13天健壮期的为好。将挑选好的种耳袋(瓶)经表面消毒后,把子实体齐耳基切除;挖出耳基正下方及周围较硬的基质块,再将基质块切成半个火柴盒大小的方块,作为分离材料。112 强行逼干把基质块周围的木屑培养基刮除,将露出白色菌丝体的基质块用卫生纸或纱布包好,置于/玻璃干燥器0中,干燥器底层置于浓硫酸、五氧化二磷或变色硅胶,以达到脱水逼干效果。10~15天,香灰菌丝即枯死。也可将基质块用纱布包好,挂在通风处,经25天左右自然风干后,即可进行分离。113 定位分离经过干燥的菌材,从不同部位分离的菌丝,其种质有别:取浅层菌丝分离的菌种,菌丝容易发黄,并在试管内很快展开耳片,菌株生活力较弱,朵型小,易烂耳;若取深层菌丝分离的菌种,其生理成熟度低,也影响成活率。为了得到生活力旺盛,并适合培养料栽培的菌株,必须取中层以下至深层部位的进行分离。该部位分离所得的银耳菌种,成熟度适中,产量稳定。操作时将经脱水后的基质块,置于接种箱内,剥开菌丝,在基质块内层,自上而下或从左至右,用接种针挑取具白色菌丝的木屑小颗粒,移接在琼脂培养基上,一次可接20~30支试管。

114 控温培养接种后的试管,置于22~

24e 下,经8~10天的培养,银耳纯白菌

丝可以恢复生长。当纯白菌丝出现后,用接

种针挑取少许移接到琼脂培养基上培养。若

分离培养后还出现香灰菌丝,可继续将分离

材料干燥,使香灰菌丝全部死亡后再分离。

若培养基偏湿或表面存在水滴,培养后则易

出现以酵母状分生孢子方式增殖的现象,或

同时出现银耳纯菌丝与酵母状分生孢子。银

耳纯菌丝生长十分缓慢,在适温下培养20

天左右,其菌落只有豆粒大小。

Zhejiang Shiyongjun 2010,18(4):9~12

115 提纯扩大上述第一次分离出来的银耳纯菌丝,待菌落长到黄豆大小时,应进行纯化扩大培养。方法是用接种针在银耳菌落边缘,挑取小米粒大小带培养基的银耳纯菌丝,移接到试管培养基斜面上,每管斜面接2~3个点,然后置于23~25e 下培养10天左右。当接种点周围出现白色短密的菌丝,形似绣球状的白毛团,而培养基不变色,此即为银耳纯菌种。

2 香灰菌丝分离操作技术

获得银耳纯菌丝后,还得分离作为/开路先锋0的伴生菌香灰菌丝,其来源与分离技术如下。

211 从种木中分离在野生银耳生长的木材中或栽培银耳的段木中,都存在抗逆性及分解基质能力较强的香灰菌丝,经过驯化培养,其性状都十分优良。袋栽银耳的培养基内的香灰菌丝,常因反复移植使用,生命力不如前者旺盛。分离香灰菌丝时,应选取子实体洁白、朵大、开瓣清楚、无病虫害、无烂头和无杂菌的种木,在靠近子实体基部,截取一段作为分离材料。在接种箱内割掉子实体,并熏蒸灭菌,然后从木材断面褐色花纹较密处,切下一小块木材,用011%升汞溶液进行表面消毒后,置于培养皿内。再用经火焰灭菌后的解剖刀,削去木材外层,用刀尖将木材切成粗细如同火柴梗,长015厘米的小段。取一小段接入琼脂培养基的斜面上,移接后的试管置于24~28e 下,培养5~6天菌丝萌发。随着培养时间的延长,菌丝产生色素溶入培养基中,使之变成黑色。当菌丝长至斜面1P 2时,挑取菌落前端的菌丝,转管纯化培养4~5天,便可得到纯香灰菌丝体。

212 从木屑培养基中分离在接种箱无菌条件下,打破(剪开)银耳菌种瓶(袋)底部,从大理石状黑色花纹上选取香灰菌丝生长的前端,挑取米粒大小,移接到琼脂培养基斜面上,培养2~3天后斜面上的接种点出现灰白色菌丝,继续培养1~2天,产生绒毛状气生菌丝,并能分泌黑色素使培养基逐渐变为棕黑色。当菌丝长至斜面1P 2时,挑取生长旺盛、爬壁力强的香灰菌丝的前端,转管纯化。香灰菌丝生长较快,在24~28e 下培养4~5天,便可获得纯香灰菌丝。

3 两种菌丝的特征与交合育成母种的方法

银耳纯菌丝和香灰菌丝单独分离时,由于分离技术不同,分离效果也不一样。大致可以得到下列几种结果:只得到银耳纯菌丝;只得到羽毛状香灰菌丝;得到银耳纯菌丝和香灰菌丝;得到酵母状分生孢子和香灰菌丝。如果有杂菌干扰,情况就更复杂了。为了得到有生产价值的菌种,在分离的第一周内,必须每天观察一次,判断认定银耳纯菌丝或香灰菌丝各已单独分离出来,然后用于交合母种。

311 两种菌丝的辨别

(1)银耳纯菌丝的特征。白色、淡黄色,以及白至黄的各种中间色。气生菌丝直立、斜立或平贴于培养基表层,基内菌丝生于培养基里面。菌丝直径115~3微米,有横隔膜,有明显的锁状连合,生长速度比一般食用菌缓慢。在培养基表面会出现扭结的菌丝团,并逐渐胶质化,变成小原基,长成小耳片。当双核菌丝开始胶质化,是菌丝进入结实阶段的标志。双核菌丝移植后,受菌龄、发育程度、培养基表面的游离水和机械刺激等的影响,或继续长菌丝,或迅速胶质化,或变成酵母状分生孢子。

(2)香灰菌丝的特征。初期白色,常有特别细长的主干和侧生的、略呈羽毛状的分枝,老菌逐渐变成浅黄、浅棕色,培养基逐渐由淡褐色变为黑色或墨绿色。培养基表面的气生菌丝呈灰白色、细绒状,有时有碳质的黑疤。分生孢子梗呈扫帚状,较少见,产生时为黄绿色至草绿色,近椭圆形,直径3~5微米,在段木表面还可形成扁平黑色的子座。已知羽毛状香灰菌丝绝不单是1个种,可能有2个属3~4个种。312 两种菌丝交合育成母种的方法经纯种分离法而得到单一的银耳纯菌丝或香灰菌丝,如果单独接种在棉籽壳或木屑等培养基上培养,是无法形成银耳子实体的。在生产上必须将两者混合培养才能形成高产优质的银耳子实体。因此,人工培育的银耳菌种,必须是银耳纯菌丝与香灰菌丝的混合体。两种菌丝交合

培养成母种,一般需要30天左右。具体交合的方法有两种。

#10# 2010年

第18卷第4期

(1)在琼脂培养基上交合。用芽孢进行混合培养的,应先接种少许芽孢,待其萌发形成银耳菌丝后,再接种香灰菌丝。如果是用银耳纯菌丝进行混合培养,应将一块带琼脂培养基似米粒大的银耳纯菌丝,移到另1支琼脂斜面上,置22~24e 下培养5~7天。待银耳菌落直径达1厘米以上时,在其旁边接入一小点带琼脂培养基的香灰菌丝,在相同温度下继续培养7天左右,出现绣球状白毛团;10天后在白毛团上方出现无色或淡黄色水珠。香灰菌丝快速生长布满整个培养基,并分泌黑色素,使琼脂培养基底部呈黑色。这种混合菌丝体的银耳母种,1支试管一般只接1瓶原种。

(2)在木屑培养基上交合。先将带琼脂培养基的花生米大小的银耳纯菌丝团接入木屑培养基中央;再用接种针挑取香灰菌丝连同培养基,以小米粒大小移接在菌种瓶的木屑培养基上,两种菌丝块紧靠一起。然后置于22~24e ,空气相对湿度70%以下条件下培养15天左右。待香灰菌丝长至培养基3~4厘米深,瓶壁上可见黑色花纹;白毛团分泌淡黄色或浅褐色水珠时,继续培养5天,白毛团胶质化,出现淡黄色原基,并逐渐长出拇指大小的子实体时,即成木屑培养基母种。

4 银耳/非专一性0分离择优交合的育种方法

长期以来,我国银耳菌种分离方法强调/专一性0,即银耳菌丝和香灰菌丝分离时必须在同一耳木或同一袋木屑培养基上,分别获得银耳纯菌丝(包括酵母状分生孢子)和香灰菌丝进行交合。而不同地区或同一地区,不同耳木或不同木屑培养基获得的两种菌丝,不能随意调换,否则就可能导致失败。

自1993年开始,古田县兴达银耳研究所张汉文所长,开展在不同栽培地点、不同菌株、不同木屑培养基内,分离出银耳菌丝与香灰菌丝,经培养后进行择优调换,互相错开交合的育种试验。结果表明:/非专一性0的择优交合,从母种、原种、栽培种,直至用于袋栽生产,它与/专一性0对照组相比,菌丝生长状况与出耳时间、品质及产量都较优。这说明银耳菌种分离材料,也可以从异地引进野生或段木的香灰菌丝与当地木屑袋栽银耳纯菌丝交合,关键在于选取分离材料时择优母体。优中交合,使菌种不断优化,才能为银耳制种拓宽途径。该所每年都从四川通江等段木栽培地,引进长过银耳的木段,分离香灰菌丝,再与古田袋栽银耳纯菌丝交合,获得理想菌株。以此种/非专一性0交合育种方法,完成了宁德市科技局5征集野生银耳种源选育优良菌株研究6项目,选育出抗性强、产量高的2个新菌株,其出耳现场,

获得验收组专家好评。

图2 不同香灰菌丝接种在同一培养基上产生的拮抗线

/非专一性0的分离交合,长期被视为难题的原因,主要是当时研究银耳菌种的单位和专业人员不多,发现银耳两种菌丝的历史不长,纯菌丝亲和能力较弱,适应性不强,稍有不周,分离便告失败。所以,这种/非专一性0的问题一直未被解决。随着银耳人工驯化栽培方式的演变,由段木y 木屑瓶内开花y 木屑瓶外展片y 室内袋料栽培y 野外荫棚栽培;

由小面积发展到千家万户专业化、商品化、基地化

的大规模栽培。这种演变过程,使银耳菌丝的适应

性不断增强,/非专一性0交合,在生理上逐步适

应,这为/不同一0择优交合育种提供了内因条

件,这是生物进化的自然规律。但从不同野生耳木

或不同产地采集分离获得的香灰菌丝,接种在同一

培养基上,又会出现不亲和的拮抗线,说明香灰菌

品系之间有特殊个性。对此,还有待进一步探讨

(图2)。

5 母种转管扩接方法一般对分离获得的一代母种,都要进行扩大繁#

11#丁湖广:银耳菌种规范化生产工艺讲座(三)

殖,即选择菌丝粗壮、生长旺盛、颜色纯正、无杂菌的试管母种,或从科研部门引进母种,进行转管扩大繁殖,增加母种数量,以满足生产需要。银耳混合菌丝的试管母种,每支一般只能扩接成2~4支。转管次数不应过多,否则菌种长期处于营养生理状态,生命繁衍受到抑制,进而导致菌丝活力下降,营养生长期缩短,子实体变小,变薄,影响产量和品质。因此母种转管扩接,一般宜为3次。

母种转管扩接无菌操作技术如下。

511 消毒握管双手和菌种试管外壁,用75%酒精棉球擦拭;将菌种和斜面培养基的2支试管握在左手中,使中指位于2试管之间,斜面向上,并使其呈水平位置。

512 松塞灼口用右手将棉塞拧转松动,以利接种时拔出;右手拿接种针,对在接种时可能进入试管的部分,全部用火灼烧过;再用右手小拇指、无名指和手掌拔掉棉塞,夹住。靠手腕的动作不断转动试管口,并通过火焰灼烧。

513 接种入管将烧过的接种针伸入试管内,先接触没有长菌丝的培养基,使其冷却;然后将接种针轻轻接触菌种挑取少许,抽出试管,注意菌种块不能碰到管壁;随之将接种针上的菌种,迅速通过酒精灯火焰上方,伸进另一支试管,接入培养基中央。

514 回塞管口菌种接入后,灼烧管口,并在火焰上方将棉塞塞好。塞棉塞时不要用试管去迎棉塞,以免试管在移动时进入不净空气。

接种的整个过程应迅速、准确。最后将接好的试管贴上标签,送进培养箱(室)培养。

中国/80后0

的年轻人在俄罗斯当上平菇王

据俄罗斯中文媒体报道,25岁的留学生陈超和

李浩然在俄罗斯/借壳0一家公司做起了蔬菜和平菇

的生意,他们种菜卖菜,经过两年的打拼,闯出了一

片天地,并且挤垮了当地最大的平菇供应商。现在他

们拥有15个大棚,每个大棚有600~700平方米的面

积。他们除了种/主产品0平菇外,也种小西红柿和

白菜等蔬菜。在产量不断增加的情况下,产品仍然供

不应求。/我们的平菇已经占了圣彼得堡超过90%的

市场份额,这里大小超市里都有我们的产品。0陈超

和李浩然在接受记者采访时说。如今,农场里光平菇

一项每月的销售额就有60万元人民币。

人们担心未来这些年轻人在俄罗斯的发展能否像

现在这样一帆风顺,李浩然对此表示:/我们跟俄罗斯是合作关系。0他告诉记者:/自从苏联解体后,俄罗斯原有的社会分工就被打乱,擅长农业的高加索人更愿意从事蔬菜贩运及销售,而俄罗斯人又不愿从事农业劳作。所以,在这个领域几乎没有竞争。我们的种植反倒是对俄罗斯市场的一个补充。0

(本刊编辑部摘编自2010161215中国特色农业信息网6)#12#

2010年

第18卷第4期

乳酸菌菌种的分离筛选办法

精心整理乳酸菌菌种的分离筛选方法乳酸细菌是一类能利用发酵糖产生大量乳酸的细菌通称。为兼性厌氧菌，杆状或球状，革兰氏阳性菌，无芽孢，不运动。营养要求高，需要提供丰富的肽类氨基酸维生素。在琼脂表面或内层形成较小的白色或淡黄色的菌落。通常用作为有益微生物的菌种有乳酸乳杆菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、粪肠球菌、乳酸片球菌、双歧杆菌、屎肠球菌、戊糖片球菌等。时，SL 培养基、MS 对乳酸菌无害。一.筛选方法： 1.溶钙圈法：利用一些产酸类细菌在含CaCO3的培养基上产生CaCO3溶解圈，从而筛选出这些产酸类细菌，可用于乳酸菌的筛选。其中培养基中加入CaCO3的作用是：①鉴别能产生酸的细菌；②中和产生的酸，以维持培养基的PH 。筛选过程：样品预处理→梯度稀释至10-6→选择合适的稀释度涂布→37℃培养48h →挑选产生溶

钙圈的菌落反复在MRS培养基上划线→挑起单菌落染色，经镜检确认为纯种→挑选革兰氏阳性单菌落→试管穿刺4℃冰箱保存。 2.溴甲酚绿指示剂法：培养基：MRS培养基（含溴甲酚绿酒精溶液）筛选过程：同上，不同之处是稀释涂布后长出菌落，挑取使溴甲酚绿变色的菌落。二.菌种的分离筛选 1.培养基： ★1.1麦芽汁碳酸钙培养基：麦芽汁（10BX）1L预先灭菌碳酸钙5-10g/LPH自然（分离用） ★★1.2吐温 ★1.3 酵母膏（分离用） 1.4 1.5 MgSO 4 1.6 ★★1.7 蛋白胨葡萄糖、琼脂18.0g 酸钙, 1.8BCP 乳糖5.0g蛋白胨5.0g酵母膏3.0g0.5℅溴甲酚紫10ml自来水1000ml pH6.5-7.0（分离用） 1.9BCG牛乳营养琼脂：脱脂奶粉10g，溶于50ml水中，加入1.6℅溴甲酚绿酒精溶液0.07ml，0.075Mpa20min。另取琼脂2.0g，溶于50ml水中，加酵母膏 1.0g溶解后调pH6.5-6.8，0.1Mpa20min.趁热在无菌操作下两者混合均匀，倒平板，37℃培养24h，检查是否有杂菌。

银耳营销策略分析报告书

产品 { 银耳 > 营销策略分析广西禾美生态农业股份有限公司二O—六年五月六日

目录 1. 产品特点 (1) 1.1市场价值 (1) 1.2产品背景 (1) 2. 产品市场环境 (2) 2.1主要产区 (2) 2.2近年产能量 (2) 3. 产品市场定位 (3) 3.1客户的细分 (3) 3.2定价的原则 (3) 3.3产品竞价 (4) 4. 销售包装、储存及物流 (6) 4.1产品包装 (6) 4.2产品储存 (7) 5. 渠道策略 (8) 5.1密集分销渠道方案 (8) 5.2附渠道拟进入门槛表 (10) 1. 产品特点 1.1市场价值富含胶原蛋白、氨基酸、矿物质及维生素，其中包含的膳食纤维可有效改善肠胃蠕动，减少脂肪吸收。还能增强肿瘤患者对放疗、化疗的耐受力。 I ■

1.2产品背景银耳，早在清朝时期就已经成为了人们的食用佳品，在古代由于银耳及其稀少发源于四川通江，其价格也非常的昂贵，往往一小匣子银耳就要花一、二十两银子才能买到。随着社会的发展和培育技术的进步，现在的银耳已经不再像旧时那样稀少，人们已经能够比较方便的买到银耳，有因为银耳具有银耳具有强精、补肾、润肠、益胃、补气、和血、强心、壮身、补脑、提神、美容、嫩肤、延年益寿之功效。所以银耳成为了众人所推崇的保健佳品。随着银耳的保健功效得到广泛传播，一些不良商人为了牟取暴利，将劣质银耳以次充好，或用有害化学品浸泡、熏烤加工银耳，这严重威胁到了广大群众的身体健康和对银耳产品的信任。在这样的情况下，广西禾美生态农业股份有限公司在看到了有机银耳的市场潜力，作为一个负责任、有担当的企业，建立一个致力于提供无污染有机鲜银耳与菌类生产基地势在必行。通过召集和组建一支国家级食用菌专家队伍，他们用严谨科学的态度，在银耳的生产过程中层层把关，全方位保证消费者的食品安全。 2. 产品市场环境 2.1主要产区银耳是中国的特产，野生银耳主要分布于中国四川省、浙江省、福建省、江苏省、江西省、安徽省、台湾省、湖北省、海南省、湖南省、广东省、香港特区、广西壮族自治区、贵州省、云南省、陕西省、甘肃省、内蒙古自治区和西藏等地区。 2.2近年产能量 2013年我国银耳产量为37.4万吨，2014年国内产量增长至39.5万吨，占

银耳菌种的制作

银耳菌种的制作 2012年8月14日来源：中国食用菌商务网字号[ 大中小] 母种、原种的制作把分离提纯后的银耳菌丝和香灰菌丝单独分开培养于试管中（详细的分离方法请浏览：银耳菌种的分离技术一文）。生产母种时，先取出银耳菌丝，并扩大到所需要的管数。然后放在25℃培养到银耳菌落直径约lcm左右。此时，再在每支长了银耳菌丝的试管中，接种极少量香灰菌丝，待两者长在一起时，就可以出售或用于原种生产了。如先接香灰菌丝，因香灰菌丝生长快，很快覆盖斜面，并很快消耗养料，其后接上的银耳菌丝就不易生长。若香灰菌丝和银耳菌丝同时接种在一支试管中，同样会出现银耳菌丝少、香灰菌丝数量多的缺陷。因此，生产银耳母种（试管种）时一定要注意接种的先后，以及注意控制两者的比例。制作银耳菌种有必要了解银耳及其“伴生菌”香灰菌丝的关系：在可以人工种植的食药用中，属于这种类型的菌目前仅有银耳和金耳。它们子实体的形成，银耳除了要有纯银耳菌丝外，还必须有“伴生菌”即香灰菌的帮助；金耳除了要有纯金耳菌丝外，还必须有粗毛硬革菌的帮助，两者缺一不可。在一般条件下，银耳和金耳的纯菌丝体生长相当缓慢，分解木质素、纤维素能力极弱，分别要依赖于香灰菌丝和粗毛硬革菌丝分解基质，提供它们生长发育所需的养分，否则便不可能形成子实体。所以在扩繁银耳、金耳母种时，必须将两种相应的菌丝体，移接在同一培养基上进行混合培养。现以银耳为实例介绍两种菌丝混合制种技术： 1、斜面母种混接法取纯银耳菌丝试管母种和新配制的PDA斜面试管各一支，连同接种器具一起放入接种室（箱）中，按无菌操作进行转接，即挑取米粒大小、带培养基菌种一块，移接于空白试管斜

微生物菌种的分离和纯化方法

从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物分离与纯化。在分子生物学的研究及应用中，不仅需要通过分离纯化技术从混杂的天然微生物群中分离出特定的微生物，而且还必须随时注意保持微生物纯培养物的“纯洁”，防止其他微生物的混入。 1、用固体培养基分离和纯化单个微生物在适宜的固体培养基表面或内部生长、繁殖到一定程度可以形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞生长群体，称为菌落。当固体培养基表面众多菌落连成一片时，便成为菌苔。不同微生物在特定培养基上生长形成的菌落或菌苔一般都具有稳定的特征，可以成为对该微生物进行分类、鉴定的重要依据。大多数细菌、酵母菌、以及许多真菌和单细胞藻类能在固体培养基上形成孤立的菌落，采用适宜的平板分离法很容易得到纯培养。所谓平板，即培养平板的简称，它是指固体培养基倒入无菌平皿，冷却凝固后，盛固体培养基的平皿。这方法包括将单个微生物分离和固定在固体培养基表面或里面。固体培养基用琼脂或其它凝胶物质固化的培养基，每个孤立的活微生物体生长、繁殖形成菌落，形成的菌落便于移植。最常用的分离、培养微生物的固体培养基是琼脂固体培养基平板。这种由Kock建立的采用平板分离微生物纯培养的技术简便易行，100多年来一直是各种菌种分离的最常用手段。1.1 稀释倒平板法首先把微生物悬液作一系列的稀释（如1:10、1:100、1:1000、1:10000），然后分别取不同稀释液少许，与已熔化并冷却至50℃左右的琼脂培养基混合，摇匀后，倾入灭过菌的培养皿中，待琼脂凝固后，制成可能含菌的琼脂平板，保温培养一定时间即可出现菌落。如果稀释得当，在平板表面或琼脂培养基中就可出现分散的单个菌落，这个菌落可能就是由一个细菌细胞繁殖形成的。随后挑取该单个菌落，或重复以上操作数次，便可得到纯培养。 1.2 涂布平板法因为将微生物悬液先加到较烫的培养基中再倒平板易造成某些热敏感菌的死亡，且采用稀释倒平板法也会使一些严格好氧菌因被固定在琼脂中间缺乏氧气而影响其生长，因此在微生物学研究中常用的纯种分离方法是涂布平板法。其做法是先将已熔化的培养基倒入无菌平皿，

乳酸菌菌种的分离筛选方法解读

乳酸菌菌种的分离筛选方法乳酸细菌是一类能利用发酵糖产生大量乳酸的细菌通称。为兼性厌氧菌，杆状或球状，革兰氏阳性菌，无芽孢，不运动。营养要求高，需要提供丰富的肽类氨基酸维生素。在琼脂表面或内层形成较小的白色或淡黄色的菌落。通常用作为有益微生物的菌种有乳酸乳杆菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、粪肠球菌、乳酸片球菌、双歧杆菌、屎肠球菌、戊糖片球菌等。乳杆菌常用MRS琼脂作半选择培养基。当乳杆菌仅是复杂区系中的部分菌类时，SL培养基常用作为选择性培养基。对于芽孢乳杆菌常用GYP培养基，链球菌有TYC培养基、MS培养基。M17培养基被用作乳球菌的分离培养基。嗜酸乳杆菌属于乳杆菌属的一个种。其特性为：杆菌，两端圆，不运动，无鞭毛。粪肠球菌为革兰氏阳性，圆形或椭圆形。乳酸片球菌细胞呈球状，直径0.6~1.0μm，在直角两个平面交替形成四联状，一般细胞成对生，单生者罕见，不成链状排列。革兰氏阳性，不运动，兼性厌氧。在MRS培养基上菌落小，呈白色。沿洋菜穿刺线的生长物呈丝状。乳酸菌在一般琼脂培养基上形成微小菌落，不易观察，所以分离时先富集培养并选择合适的培养基。分离培养基一般添加西红柿、酵母膏、吐温-80等物质，也常常加入醋酸盐，因醋酸盐能抑制部分细菌生长，对乳酸菌无害。培养基中添加碳酸钙，乳酸溶解培养基中的碳酸钙形成透明圈，作为分离鉴别的依据，通过对生成的乳酸量进行性能鉴定。乳酸菌生长繁殖时需要多种氨基酸，维生素及微氧，一般菌落比较小。分离培养基一般可添加西红柿酵母膏油酸吐温等物质，均具有促进生长作用。也常常添加醋酸盐抑制有些细菌的生长，对乳酸菌无害。一.筛选方法： 1.溶钙圈法：利用一些产酸类细菌在含CaCO3的培养基上产生CaCO3溶解圈，从而筛选出这些产酸类细菌，可用于乳酸菌的筛选。其中培养基中加入CaCO3的作用是：①鉴别能产生酸的细菌；②中和产生的酸，以维持培养基的PH。筛选过程：样品预处理→梯度稀释至10-6→选择合适的稀释度涂布→37℃培养

银耳营销策略分析报告

产品（银耳）营销策略分析广西禾美生态农业股份有限公司二○一六年五月六日

目录 1.产品特点 ............................................. 1.1市场价值 .......................................... 1.2产品背景 .......................................... 2.产品市场环境 ......................................... 2.1主要产区 .......................................... 2.2近年产能量 ........................................ 3.产品市场定位 ......................................... 3.1客户的细分 ........................................ 3.2定价的原则 ........................................ 3.3产品竞价 .......................................... 4.销售包装、储存及物流 ................................. 4.1产品包装 .......................................... 4.2产品储存 .......................................... 5.渠道策略 ............................................. 5.1密集分销渠道方案................................... 5.2附渠道拟进入门槛表.................................

DB35-T137.5-2001古田银耳菌种制作规程

ICS 67.080.20 B 39 备案号： DB35 古田银耳标准综合体菌种制作规程福建省质量技术监督局发布

前言本部分是古田银耳标准综合体中菌种制作规程，规定了菌种制作的术语和定义、基本设备、一级种制作、二级种培养、三级种培养、病虫害防治、菌种质量要求、检验方法、标志包装保存运输。本标准由福建省质量技术监督局、福建省农业厅提出。本标准主要起草单位：古田县质量技术监督局、古田县食用菌办公室。本标准主要起草人：林祖寿、蔡金波、张国雄、彭冬祥、徐彦彦、张汉文、戴维浩。

古田银耳标准综合体菌种制作规程 1 范围本标准规定了古田银耳标准综合体菌种制作中的术语和定义、基本设备、一级种制作、二级种培养、三级种培养、病虫害防治、菌种质量要求、检验方法、标志包装保存运输。本规程适用于古田银耳菌种制作。 2术语和定义下列术语和定义适用于本标准。 2.1 耳片银耳子实体的瓣片。 2.2 耳基银耳子实体基部，呈桔黄色或垩白色、硬实、蒂状与培养基质相联结的部分。 2.3 交合将培养成熟的银耳纯菌丝与香灰菌丝按一定比例混合，培育有生产价值的银耳菌种的方法。 2.4 基质块在银耳子实体的耳基正下方,由以银耳纯菌丝为主和少量香灰菌丝、培养基扭结而成的硬块层。2.5 基内分离在生长子实体的培养基内分离出菌种的专门技术。 2.6 分泌液银耳菌种正常的生理活动产生的无色、清黄或清红色的分泌液。 2.7 吐黑水银耳菌种被病原菌污染，或培养条件不适宜出现的异常现象。 2.8 “杨梅霜病”（俗名）菌种受为害时，局部表面出现白色粉斑，周围白毛团生长受抑制或逐渐消溶。 2.9 “死菌” 菌种受为害时，前期香灰菌丝可生长，中期香灰菌丝稀疏，菌丝前端出现粉红色或褐色，后期香灰菌丝停止生长。 3 基本设备 3.1 原料仓库面积等于或大于20m2，建在制种厂的西北向，要求干燥、通风、环境卫生、远离畜、禽舍。 3.2 洗涤室面积等于或大于10m2，水泥地面，平整，有水源。室内配备：台秤，工业天平，50、100、500ml 量杯，铁铲，水桶，铝锅，电炉，煤气炉，小压板，瓶刷，试管筐，试管（18×180mm），玻璃漏斗，漏斗架，纱布，棉塞，750ml菌种瓶。 3.3 灭菌室要求水泥地面，有水源。室内配备：手提高压蒸汽灭菌锅，卧式高压蒸汽灭菌锅。 3.4 菌种培养室

菌种筛选方法 (2)

菌种筛选方法在实际工作中，为了提高筛选效率，往往将筛选工作分为初筛和复筛两步进行。初筛的目的是删去明确不符合要求的大部分菌株，把生产性状类似的菌株尽量保留下来，使优良菌种不致于漏网。因此，初筛工作以量为主，测定的精确性还在其次。初筛的手段应尽可能快速、简单。复筛的目的是确认符合生产要求的菌株，所以，复筛步骤以质为主，应精确测定每个菌株的生产指标,测得的数据要能够反映将来的生产水平。 1 从菌体形态变异分析有时，有些菌体的形态变异与产量的变异存在着一定的相关性，这就能很容易地将变异菌株筛选出来。尽管相当多的突变菌株并不存在这种相关性，但是在筛选工作中应尽可能捕捉、利用这些直接的形态特征性变化。当然，这种鉴别方法只能用于初筛。有人曾统计过3,484个产维生素B2的阿舒假囊酵母(Eremoth ecium ashbyii)的变异菌落，发现高产菌株的菌落形态有以下特点：菌落直径呈中等大小（8-10毫米），凡过大或过小者均为低产菌株；色泽深黄色，凡浅黄或白色者皆属低产菌株。又如，在灰黄霉素产生菌荨麻青霉(Penicillium urticae)的育种中，曾发现菌落的棕红色变深者往往产量有所提高，而在赤霉素生产菌藤仓赤霉（Gibberell a fujikuroi）中，却发现菌落的紫色加深者产量反而下降。 2 平皿快速检测法平皿快速检测法是利用菌体在特定固体培养基平板上的生理生化反应，将肉眼观察不到的产量性状转化成可见的

"形态"变化。具体的有纸片培养显色法、变色圈法、透明圈法、生长圈法和抑制圈法等，见图。这些方法较粗放，一般只能定性或半定量用，常只用于初筛，但它们可以大大提高筛选的效率。它的缺点是由于培养平皿上种种条件与摇瓶培养，尤其是发酵罐深层液体培养时的条件有很大的差别，有时会造成两者的结果不一致。图平皿快速检测法示意图平皿快速检测法操作时应将培养的菌体充分分散，形成单菌落，以避免多菌落混杂一起，引起"形态"大小测定的偏差。 1) 纸片培养显色法将饱浸含某种指示剂的固体培养基的滤纸片搁于培养皿中，用牛津杯架空，下放小团浸有3%甘油的脱脂棉以保湿，将待筛选的菌悬液稀释后接种到滤纸上，保温培养形成分散的单菌落，菌落周围将会产生对应的颜色变化。从指示剂变色圈与菌落直径之比可以了解菌株的相对产量性状。指示剂可以是酸碱指示剂也可以是能与特定产物反应产生颜色的化合物。 2) 变色圈法将指示剂直接掺入固体培养基中，进行待筛选菌悬液的单菌落培养，或喷洒在已培养成分散单菌落的固体培养基表面，在菌落周围形成变色圈。如在含淀粉的平皿中涂布一定浓度的产淀粉酶菌株的菌悬液，使其呈单菌落，然后喷上稀碘液，发生显色反应。变色圈越大，说明菌落产酶的能力越强。而从变色圈的颜色又可粗略判断水解产物的情况。 3) 透明圈法在固体培养基中渗入溶解性差、可被特定菌利用的营养成分，造成浑浊、不透明的培养基背景。将待筛选在菌落周围就

乳酸菌菌种分离筛选方法

微生物的分离与培养知识点

微生物的分离与培养知识小结与专题训练一、微生物的培养和分离技术 1.微生物生长需要的营养物质一般都含有水、碳源、氮源、无机盐牛肉膏又称牛肉浸膏，是采用新鲜牛肉经过剔除脂肪、消化、过滤、浓缩而得到的一种棕黄色至棕褐色的膏状物。有牛肉自然香味，易溶于水，水溶液呈淡黄色。牛肉膏当中含有肌酸、肌酸酐、多肽类、氨基酸类、核苷酸类、有机酸类、矿物质类及维生素类的水溶性物质。蛋白胨，是有机化合物。蛋白胨是将肉、酪素或明胶用酸或蛋白酶水解后干燥而成的外观呈淡黄色的粉剂。蛋白质经酸、碱或蛋白酶分解后也可形成蛋白胨。在胃内蛋白质的初步消化产物之一就是蛋白胨。蛋白胨富含有机氮化合物，也含有一些维生素和糖类。能为微生物提供C源、N源、生长因子等营养物质。对异养微生物来说，含C、H、O、N的有机化合物既是碳源，又是氮源、能源。 2.培养基的制作合格与否通过未接种的培养基表面是否有菌落生长来验证 3.常用的无菌技术有 ⑴对实验操作的空间、操作者的衣着和手进行清洁和消毒。 ⑵将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等进行灭菌。 ⑶为避免周围环境中的微生物的污染，实验操作应在酒精灯火焰附近进行。 ⑷实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围物品相接触。考点细化： ①灭菌是指使用强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子。消毒是指用较为温和的理化方法仅杀死物体表面或内部一部分对人体有害的微生物，不包括芽孢、孢子。 ②灭菌的方法有灼烧灭菌、干热灭菌、高压蒸汽灭菌，灼烧灭菌用于接种用的金属工具；干热灭菌用于能耐高温的，需要保持干燥的玻璃器皿等；高压蒸汽灭菌用于培养基等 ③消毒的方法有煮沸消毒法，用于液体消毒；巴氏消毒法，用于不耐高温的液体；化学药剂（如用体积分数70%-75%的酒精）或紫外线消毒，用于物体表面的消毒。 4.微生物的纯培养指的是防止外来杂菌入侵。 5.配制固体培养基的步骤：计算、称量、溶化、（调节pH、分装、包扎）灭菌、倒平板 6.微生物接种的方法最常用的是平板划线法和稀释涂布平板法。平板划线法是通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作。将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。在数次划线后培养，可以分离到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体，这就是纯化的菌落。 ★平板划线法中的注意事项 ①操作第一步即取菌种之前及每次划线之前都需要进行火焰灼烧灭菌，划线操作结束时，仍需灼烧接种环，每次灼烧目的如下表：

银耳生产工艺规程

xxxxxxxx有限公司生产工艺规程 1 目的：建立银耳生产工艺规程，用于指导现场生产。 2 范围：银耳生产过程。 3 职责：生产部、生产车间、质保部。 4 制定依据：《药品生产质量管理规范》（2010修订版）《甘肃省中药饮片炮制规范》1980 年版。 5 产品概述 5.1 产品基本信息 5.1.1 产品名称：银耳 5.1.2 规格：统 5.1.3 性状：本品呈类扁球形或不规则的块状，灿然若花，大小不一，直径3～18cm，由众多细小而薄的波状卷曲的子实体瓣片组成，子实体瓣片黄白色或淡黄褐色，半透明，体轻，质硬而脆。有特殊气味，味淡。 5.1.4 企业内部代码：C275 5.1 5性味与归经：甘、平。 5.1.6功能与主治：滋阴润肺，生津，益气活血。用于虚劳咳嗽，痰中带血，虚热口渴，肺热肺燥，衄血，咯血，肺痿。 5.1.7 用法与用量：3～9g。 5.1.8 贮藏：置阴凉干燥处，防蛀。 5.1.9包装规格：3g/袋；5g/袋；10g/袋；30g/罐；40g/罐；50g/罐；0.5kg/袋；1kg/袋；10kg/袋；15kg/袋；25kg/袋。 5.1.10 贮存期限：36个月

5.2 生产批量：5-10000kg 5.3 辅料：无 5.4 生产环境：一般生产区 6 工艺流程图 6.1 银耳工艺流程图： 6.2 生产操作过程与工艺条件： 6.2.1领料 6.2.1.1饮片车间根据批准的批生产指令，按照“生产过程物料管理程序”，凭填写品名、编码、领料量、数量的指令单到原料库领取银耳原料。 6.2.1.2领料过程中必须核对原料品名、编码、件数、数量、合格标志等内容。 6.2.2净制： 6.2.2.1取原料，置于不锈钢挑选台上，按照《净制岗位标准操作规程》手工挑选，除去杂质。用清洁过的重器，将净选后的银耳打成碎块，将净银耳置净料袋或周转箱。 6.2.2.2净制结束后,称量,标明品名、批号、总件数、总数量。将净制后的银耳运至车间中转间，及时清场并填写生产记录。

设计实验：微生物菌种的分离纯化、培养、、鉴定以及保藏技术

设计实验：微生物菌种的分离纯化、培养、、鉴定以及保藏技术一．实验目的 1.学习大肠菌群分离纯化、鉴定的原理。 2.掌握平板表面涂布法、平板划线法的分离技术。 3.学习掌握菌种保藏的原理和方法。二.实验原理菌种的分离纯化从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物分离与纯化。在分子生物学的研究及应用中，不仅需要通过分离纯化技术从混杂的天然微生物群中分离出特定的微生物，而且还必须随时注意保持微生物纯培养物的“纯洁”，防止其他微生物的混入。 1.涂布平板法因为将微生物悬液先加到较烫的培养基中再倒平板易造成某些热敏感菌的死亡，且采用稀释倒平板法也会使一些严格好氧菌因被固定在琼脂中间缺乏氧气而影响其生长，因此在微生物学研究中常用的纯种分离方法是涂布平板法。 2.平板划线法最简单的分离微生物的方法是平板划线法，其原理是将微生物样品在固体培养基表面多次作“由点到线”稀释而达到分离目的的。划线的方法很多，常见的比较容易出现单个菌落的划线方法有斜线法、曲线法、方格法、放射法、四格法等。大肠菌群的培养鉴定大肠菌群能在乳糖胆盐液体培养液中生长，并且产气产酸，使培养液变色。还能在伊红美兰固体培养上生长，形成黑紫色的菌落，有的还有金属光泽。其他病原菌的菌落呈粉红色。再做镜检观察是无芽孢的革兰氏阴性杆菌（呈红色）。即可鉴定是有大肠菌群的菌存在。菌种保藏菌种保藏是将微生物的菌种经长时间的保存，不污染其它杂菌，及可保持其形态特征和生理性状，减少变异，防止衰老，以便于将来使用。保藏菌种一般是选用它的休眠休，如孢子；芽孢等等，并且要创造一个低温；干燥；缺氧；避光和缺少营养的环境条件，以利于休眠体能长期地处于休眠状态。对于不产孢子的微生物，应使其新陈代谢处于最低状态，又不会死亡，从而达到长期保存的目的三.实验器材 1.菌种：污水中的大肠菌群、酵母菌和霉菌 2、培养基：乳糖胆盐液体培养基、伊红美蓝琼脂（EMB）、营养琼脂培养基、麦芽汁固体斜面培养基和马铃薯固体斜面培养基。 3.器材：接种环、安培瓶、干燥器、冰箱、产气管、试管、培养皿、无菌平皿、无菌玻璃涂棒移液管、电炉、双目显微镜、恒温培养箱、无菌操作台、高压灭菌锅、恒温干燥箱等。 4.试剂：革兰氏一(草酸铵结晶紫)、革兰氏二(路哥氏碘液) 、革兰氏三（95%乙醇）、革兰氏四（蕃红）；试剂：医用液体石腊（比重0.83～0.89）。四．试验方法及步骤 1.大肠菌群的分离纯化第一天 a．涂布平板法：将已熔化的营养琼脂培养基倒入无菌平皿，制成无菌平板，冷却凝固后，将一定量的含大肠菌群的污水滴加在平板表面，再用无菌玻璃涂棒将菌液均匀分散至整个平板表面，置培养箱中37℃培养24小时。经培养后挑取单个菌落。第二天 b．平板划线法：经培养后挑取单个菌落，接种环以无菌操作沾取少许菌落，在无菌伊红美兰琼脂培养基平板表面进行连续划线，微生物细胞数量将随着划线次数的增加而减少，并逐步分散开来，如果

银耳精深加工产业化项目可行性实施报告

银耳精深加工产业化项目可行性研究报告

一、总论（一）项目名称和建设单位 1、项目名称：银耳精深加工产业化 2、建设性质：新建 3、建设地点：某县民胜镇周子坪食用菌园区 4、建设单位：某野生食品有限公司 5、项目负责人：（二）建设容与规模本项目建在某县民胜镇周子坪村，位于通巴快车道（省道S201线），距县城5公里，占地面积15亩，建设某银耳速溶方便食品、银耳茶（复合袋泡茶）、某银耳多糖含片三条生产线，达产后，年可转化某银耳100 吨，生产精深加工产品1100吨。（三）项目总投资项目总投资：1800万元。（四）资金筹措项目单位自筹及其他资金800万元。商请银行贷款1000万元（五）投资使用计划项目总投资1800万元，其中：固定资产投资1290万元，占总投资的72%，无形资产及递延资产110万元，占总投资的6%，流动资金400万元，占总投资的22%。（六）建设期限项目建设期限18个月，2011年01月至2012年06月。

（七）项目效益本项目达产年可实现销售收入3200万元，实现利润270万元，新增税金150万元，新增就业岗位160个，带动种植农户年均增收12000元。二、项目单位基本情况（一）企业基本情况某野生食品有限公司成立与一九九八年七月，公司注册企业类型为有限责任公司，注册资本550万元，位于省某县诺江镇诺江中路855号。主要从事以某银耳、黑木耳、香菇为主的食用菌、中药材、野生山珍的生产、加工、销售及产品研制开发。（二）企业人员及开发能力企业法定代表人的基本情况：某，男，现年45岁，中共党员，大专文化，经济师职称，董事长，现任中共市第二届党代表，市民营科技企业联合会常务理事、副会长。先后被团中央、国家农业部授予“全国农村青年创业致富带头人称号”，市“十年创辉煌劳动模”；省农委、省乡镇企业局授予省第五届、第六届创业之星，市授予“再就业创业带头人”，市市委、市政府授予市质量兴市先进个人，“首届十杰民营科技企业家”、“市创业之星”等荣誉。曾主持研制开发了“精耳薯丝”新产品，该产品被省人民政府授予农业博览会银奖，并荣获国家专利。企业人员基本情况：现有在职员工201人，大专以上专业技术人员58人，其中从事新产品研制和开发的专业技术人员22人，技术人员占公司总人数的29%。生产和销售人员占公司总人数的68%。

菌种培养

在自然界里，食用菌都不是单独存在的，而是和许多细菌、放射菌、霉菌等生活在一起的。所谓菌种分离，就是把这些和食用菌一起生活的杂菌分离出来，通过培养，获得纯的优良菌种。菌种分母种、原种、栽培种。 (一）母种的分离培养食用菌母种的分离，可分为孢子分离法、组织分离法以及基内菌丝分离等。 1.孢子分离法孢子分离法，是用食用菌的有性孢子或无性孢子萌发成菌丝，培养成菌种的方法。这种菌种生活力较强，但孢子个体之间有差异，且自然分化现象较严重，变异大，需经出菇试验才能在生产上应用。（l）单孢分离法：是每次或每支试管只取一个担孢子，让它萌发成菌丝体来获得纯菌种的方法。蘑菇和草菇用单孢分离得到的菌丝，有结实能力，可采用此法分离生产纯菌种。单孢分离生产上较少采用，而且技术复杂，一般采用多孢分离法。（2）多孢分离法：就是把许多孢子接种在同一培养基上，让它们萌发、自由交配来获得食用菌纯菌种的一种方法。具体操作方法，有以下几种： ①种菇孢子弹射法：选择个体健壮、朵形圆正，无病虫害、出菇均匀、高产稳产，适应性强的八九分成熟的种菇，切去大部分，菌柄用无菌水冲洗数遍后再用已灭菌的纱布或脱脂棉、滤纸吸干表面水分。在接种箱或无菌室内，把种菇的菌褶朝下用铁丝倒挂在玻璃漏斗下面，漏斗倒盖在培养皿上面；上端小孔用棉花塞住。培养皿放在一个铺有纱布的搪瓷盘上，静置12～20小时，菌褶上的孢子就会散落在培养皿内。形成一层粉末状孢子印（平菇极淡紫色，蘑菇、草菇为褐色，香菇、金针菇孢子印白色）。用接种针沾取少量孢子在试管中的琼脂外面或培养皿上划线接种。待孢子萌发，生成菌落时，选孢子萌发早、长势好的菌落进行试管培养。还可用孢子采集器收集孢子。方法是选好种菇后，按上述程序，轻轻掀开玻璃钟罩，

细菌分离培养及移植

细菌分离培养及移植在细菌学诊断中，分离培养是不可缺少的一环。分离培养的目的主要是在含多种细菌的病料或培养物中挑选出某种细菌。在分离培养时应注意：选择适合于所分离细菌生长的培养基、培养温度、气体条件等。同时应严格按无菌操作程序进行实验，并做好标记。 [目的要求] (1)掌握细菌分离培养的基本要领和方法。 (2)掌握厌氧菌培养的原理及其方法。 [实验材料] 菌种：大肠杆菌斜面、大肠杆菌与金黄色葡萄球菌混合培养肉汤等。器械：剪刀、记号笔(以上小组共用)。培养基：普通肉汤和普通琼脂斜面、普通琼脂和鲜血琼脂平板、酒精灯、接种环(以上每人一套)。 [需氧性细菌分离培养法] 1．划线分离培养法此法为常用的细菌分离培养法。平板划线培养的方法甚多，可按各人的习惯选择应用，其目的都是达到使被检材料适当的稀释，以求获得独立单在的菌落，防止发育成菌苔，以致不易鉴别其菌落性状。划线培养时须注意以下几点：

(1)左手持皿，用左手的拇指、食指及中指将皿盖揭开呈20。左右的角度(角度愈小愈好，以免空气中的细菌进入皿中将培养基污染)。 (2)右手持接种环，从大肠杆菌与金黄色葡萄球菌混合培养肉汤中取少许材料涂布于培养基边缘，然后将接种环上多余的材料在火焰中烧毁，待接种环冷却后，再与所涂材料的地方轻轻接触，开始划线，方法如图(5-l)。 (3)划线前先将接种环稍稍弯曲，这样易和平皿内琼脂面平行，不致划破培养基。 (4)划线中不宜过多地重复旧线，以免形成菌苔。 (5)接种完毕，在皿底上作好菌名、日期和接种者等标记，平皿倒扣，置37℃培养。 2．纯培养的获得与移植法将划线分离培养37℃24h的平板从温箱取出，挑取单个菌落，经染色镜检，证明不含杂菌，此时用接种环挑取单个菌落，移植于琼脂斜面培养，得到的培养物，即为纯培养物，再作其他各项试验检查和致病性试验等。具体操作方法如下：

菌种的筛选和分离

工业微生物菌种的分离与筛选来源：青岛海博一、微生物工业对菌种的要求 (一)、微生物工业的生产水平由三个要素决定：生产菌种的性能、发酵及提纯工艺条件、生产设备。其中生产菌种的性能是最重要的因素。（二）、微生物工业对菌种的要求是：（1）菌株高产，在较短的时间内发酵产生大量发酵产物的能力; （2）在发酵过程中不产生或少产生与目标产品相近的副产品及其他产物; （3）生长繁殖能力强，较强的生长速率，产孢子的菌种应该具有较强的产孢子能力; （4）能够高效地将原理转化为产品; （5）能利用广泛的原材料，并对发酵原料成分的波动敏感性小; （6）对需要添加的前体物质有耐受能力，并且不能将这些前体物质作为一般碳源利用; （7）在发酵过程中产生的泡沫要少; （8）具有抗噬菌体的能力；

（9）遗传稳定性，二、工业用微生物菌种的来源及选育（一）微生物菌种的来源一般通过以下几个途径收集菌种、采集样品和分离筛选：（1）是根据资料直接向有科研单位、高等院校、工厂或菌种保藏部门索取或购买；（2）从大自然中采集样品分离；（3）从一些发酵制品中分离筛选目的菌株。当前发酵工业所用菌种总趋势是从野生菌转向变异菌，自然选用转向代谢育种，从诱发基因突变转向基因重组的定向育种。（二）微生物工业菌种的分离 1、野生菌株的分离、筛选过程（1）新菌种分离与筛选的步骤菌种分离的流程如下：标本采集→标本材料的预处理→富集培养→菌种初筛→菌种复筛→性能鉴定→菌种保藏 ①采样采样季节：以温度适中，雨量不多的秋初为好。采土方式：在选好适当地点后，用小铲子除去表土，

取离地面5-15cm处的土约10g，盛入清洁的牛皮纸袋或塑料袋中，扎好，标记，记录采样时间、地点、环境条件等，以备查考。为了使土样中微生物的数量和类型尽少变化，宜将样品逐步分批寄回，以便及时分离。 ②标本预处理 ④纯种分离：采用划线分离法、稀释分离法等纯化方法获取单菌落。 ⑤高产菌株的筛选：这一步是采用与生产相近的培养基和培养条件，通过三角瓶的容量进行小型发酵试验，获得适合于工业生产用菌种。还要对菌种进行发酵性能测定， ⑥毒性试验：据有的国家规定，微生物中除啤酒酵母、脆壁酵母、黑曲霉、米曲霉和枯草杆菌作为食用无须作毒性试验外，其他微生物作为食用，均需通过两年以上的毒性试验。 2、菌种的分离方法（1）施加选择性压力分离法主要是利用不同种类的微生物其生长繁殖对环境和营养的要求不同，如温度、pH、渗透压、氧气、碳源、氮源等，人为控制这些条件，使之利于某类或某种微

菌种的分离与培养

菌种的分离与培养在自然界里，食用菌都不是单独存在的，而是和许多细菌、放射菌、霉菌等生活在一起的。所谓菌种分离，就是把这些和食用菌一起生活的杂菌分离出来，通过培养，获得纯的优良菌种。菌种分母种、原种、栽培种。 (一）母种的分离培养食用菌母种的分离，可分为孢子分离法、组织分离法以及基内菌丝分离等。 1.孢子分离法孢子分离法，是用食用菌的有性孢子或无性孢子萌发成菌丝，培养成菌种的方法。这种菌种生活力较强，但孢子个体之间有差异，且自然分化现象较严重，变异大，需经出菇试验才能在生产上应用。（l）单孢分离法：是每次或每支试管只取一个担孢子，让它萌发成菌丝体来获得纯菌种的方法。蘑菇和草菇用单孢分离得到的菌丝，有结实能力，可采用此法分离生产纯菌种。单孢分离生产上较少采用，而且技术复杂，一般采用多孢分离法。（2）多孢分离法：就是把许多孢子接种在同一培养基上，让它们萌发、自由交配来获得食用菌纯菌种的一种方法。具体操作方法，有以下几种：

①种菇孢子弹射法：选择个体健壮、朵形圆正，无病虫害、出菇均匀、高产稳产，适应性强的八九分成熟的种菇，切去大部分，菌柄用无菌水冲洗数遍后再用已灭菌的纱布或脱脂棉、滤纸吸干表面水分。在接种箱或无菌室内，把种菇的菌褶朝下用铁丝倒挂在玻璃漏斗下面，漏斗倒盖在培养皿上面；上端小孔用棉花塞住。培养皿放在一个铺有纱布的搪瓷盘上，静置12～20小时，菌褶上的孢子就会散落在培养皿内。形成一层粉末状孢子印（平菇极淡紫色，蘑菇、草菇为褐色，香菇、金针菇孢子印白色）。用接种针沾取少量孢子在试管中的琼脂外面或培养皿上划线接种。待孢子萌发，生成菌落时，选孢子萌发早、长势好的菌落进行试管培养。还可用孢子采集器收集孢子。方法是选好种菇后，按上述程序，轻轻掀开玻璃钟罩，将种菇柄朝下插在孢子采收器的钢丝架上，放在培养皿正中央。随即盖好玻璃罩，用纱布将钟掌周围塞好。并在纱布上倒少许升汞或无菌水。移入20℃ 左右恒温箱培养。 ②褶上涂抹法：按无菌操作分离时；应选择成熟的种菇，用接种针直接插入褶片之间，轻轻抹取褶片表面子实体尚未弹射的孢子，再在培养基上划线接种。 ③钩悬法：取成熟菌盖的几片菌褶或一小块耳片（黑木耳、毛木耳、白木耳〕，用无菌不锈钢丝（或铁丝、棉线等其他悬挂材料）悬挂于三角瓶内的培养基的上方，勿使接触到培

通江银耳菌种质量标准

通江银耳菌种质量标准一、一级菌种(试管种)鉴定标准 1、感观鉴定 (1)优质纯银耳菌丝在马铃薯洋菜培养基上洁白、粗壮、短齐向上、周围有淡黄色水珠、长势旺盛。 (2)优质纯羽毛状菌丝(俗称香灰菌丝) ，在马铃薯洋菜培养基上生长迅速，菌丝平爬，状如羽毛，爬壁能力强，转色快，由初生白色转为草绿色，最后转为褐色。 (3)纯银耳菌丝与纯羽毛状菌丝配对要适时。银耳菌丝在新培养基上生长七天，方可配对羽毛状菌丝。 (4)配对后的优质银耳一级种(试管种)应无明显拮抗线，以及黄、红、绿、黑等异常现象。 2、显微镜检查鉴定 (1)挑取少量纯银耳菌丝，置于载玻片中央的无菌水滴上，用解剖针拨散，盖上玻片，放大1500 倍观察，正常菌丝一般具有透明、分枝、有横隔和明显的锁状联合。 (2)挑取少量的纯羽毛状菌丝，置于载玻片中央无菌水滴上，用解剖针拨散菌丝，加碘酒或美蓝等染色后进行镜检，正常菌丝一般具有菌丝粗壮(状如羽毛) 、分枝、锁状联合多而密，无其它异常现象。 (3)用无菌操作法，将纯银耳菌丝、纯羽毛状菌丝分别注入 2 毫升液体培养基，在25 —28 C之间培养24 —48小时，取滴镜检菌丝恢复情况和有无其它异常物的出现。

3、生理特点鉴定 (1)纯银耳菌丝、纯羽毛状菌丝对冷反应：将培养7 天的两种菌丝(或菌液)置于—196 C的液氮罐内7天后取出复苏，立即镜检其在视野下是否有活力？同时移入新鲜马铃薯洋菜培养基上，在25 —28 C的条件下培养48小时，观察菌丝的恢复力强否。 (2)纯银耳菌丝、纯羽毛状菌丝对热反应：将培养7 天后的两种菌丝分别置于35 C、38 C、40 C的温度下，观察多长时间活力消失。 (3)淡水生存：将培养好的菌液取1 毫升，注入1000 毫升的蒸溜水中，置于25 C的条件下24小时后，镜检其菌丝活力有无减弱。 (4)药物敏感试验鉴定银耳生产的整套工艺流程比较多，各环节所需杀菌、杀虫的药品各不相同，浓度也不相同。因此，哪种药物、哪种浓度，对纯银耳菌丝、纯羽毛状菌丝接近临界死亡，菌种生产厂家应注明。 5、抽样：每100 支试管必须任取10 支进行各项指标检验。二、二级菌种鉴定标准 1 、原料标准 (1)青杠木屑(或其它阔叶树木屑) ：粗细均匀、新鲜、无杂质、无泥沙、无霉烂变质。 (2)麸皮(或米糠)：新鲜无虫蛀、无霉变、无杂质，麸皮内不掺尾粉，米糠内不掺粗糠。 (3)石膏食用或药用系列均可。 (4)糖类：可用白糖、红糖、葡萄糖、麦芽糖等，不能用糖精(或矿物质炼的糖)。

病原菌的分离培养和纯化

普通植物病理学实验十七、病原菌的分离培养和纯化一、目的要求 (1)了解分离与纯化微生物的基本原理及方法。 (2)掌握倒平板的方法和组织分离、稀释分离、平板划线分离的基本操作技术。 (3)掌握在平板、斜面及液体培养基上培养病原菌及观察其培养性状的方法。二、基本原理植物病原菌的分离培养，是植物病理实验室工作中的基本技能。为了获得某微生物的纯培养，一般是根据该微生物对营养、酸碱度、氧气等条件要求不同，而供给它们适宜的生活条件，即让病原菌生活在适宜的培养基上，或加入某种抑制剂造成只利于此菌生长，而抑制其他菌生长的环境，从而得到纯菌株。植物病原真菌的分离方法主要有组织分离法和稀释分离法两种。最常用的方法是组织分离法，而稀释分离法主要用于病组织上产生大量孢子的病原真菌的分离。病原细菌的分离方法以划线分离法为最常用，在有些情况下也采用稀释分离法。为了获得分离菌的纯培养，必须要进行分离菌的纯化，纯化的方法类似于分离工作中采用的稀释分离法或划线分离法。三、材料、仪器与用具 1．材料(依当地情况进行选择，下列材料供参考) (1)稻瘟病叶、病节、病穗颈(pyricularia orycae)。 (2)玉米大斑病叶(exserohilum turcicum)。 (3)玉米弯孢菌叶斑病叶(curvularia lunata)。 (4)玉米小斑病叶(bipolaris maydis)。 (5)番茄灰霉病果(botrytis cinefca)。

(6)黄瓜菌核病果(sclerotinia sclerotiorum)。 (7)黄瓜细菌性角斑病叶(pseudomonas syringaepv．1achrymans)。 (8)水稻白叶枯病叶(xanthomonas campestms 。 (9)大豆细菌性斑点病叶(pseudomonas syringaepv．glycinea)。 (10)白菜软腐病叶(erudnia carotovora subsp．carotovora)。 2．培养基pda培养基；肉膏蛋白胨培养基；加寄主组织煎汁的培养基等。 3．仪器与用品超镜工作台、培养箱、培养皿、吸管、吸水纸、三角玻璃棒、剪刀、解剖刀、镊子、接种铲(针)、接种环(铒)、70％酒精、0．1％升汞、酒精灯、火柴、记号笔、橡皮筋套、可调式电炉、铝锅等。0．1％升汞溶液配制：升汞1e 浓盐酸2．5ml 蒸馏水1000ml。先将升汞溶于盐酸中，待充分溶解后，再加水稀释。升汞是剧毒药物，在操作时应特别小心。四、实验操作 (一)病原真菌的分离 1．组织分离法按照以下步骤进行： (1)取灭菌培养皿一个，置于湿纱布上，在皿盖上用玻璃铅笔注明分离日期、材料和分离人的姓名。提示：为了保证无菌操作，应注意下面几点：工作前最好将所需的物品都放在超净工作台内，工作中临时去取容易带来杂菌；保证工作人员自身的洁净，工作前用肥皂洗手；无菌操作前还要用70％酒精擦拭双手；工作中，特别在使用无菌操作间时，呼吸要轻，不要说话。 (2)用无菌操作法向培养皿中加入25％乳酸1--2滴(可减少细菌污染)，然后将融化而冷至60c 左右的pda培养基倒人培养皿中，每皿倒10--15ml，轻轻摇动使之成平面。凝固后即成平板培养基。提示：加入25％乳酸1～2滴，可基本保证平板上不出现污染细菌苗落。除乳酸外，在培养基中加入适当的抗菌素抑制细菌的生长，也是常用的方法。加青霉素(20μg／ml)可以抑制g+细菌生长；加多黏霉素b(5．0μg／ml)可以抑制g—细菌生长；加链霉素(40μg／ml)或氯霉素(50μg／ml)可以抑制大部分细菌的生长。除了氯霉素可在灭菌前加入外，其他抗菌素都应在灭菌后并冷却到45c左右(以手背触三角瓶感到烫，但尚可以忍耐为宜)’时加