人脑胶质瘤中肿瘤干细胞的体外培养及生物学特性(1)

胚胎干细胞培养有新法

胚胎干细胞培养有新法 2010-12-22 来源：科技日报责编：杨婷据美国每日科学网12月19日报道，美国研究人员发现，利用软凝胶基质代替硬培养皿来培养小鼠胚胎干细胞，无需添加昂贵的生长因子，便可让干细胞培养物长时间维持同质的多能状态。研究人员表示，这一技术在未来的再生医学中有着巨大的应用前景。相关论文发表在《公共科学图书馆·综合》杂志上。干细胞研究面临的主要障碍就是如何让小鼠胚胎干细胞培养物保持一种均一的多能状态。多能干细胞可自发地分化成皮肤或者肌肉等不同的组织类型，长期以来，科学家都是利用一种被称作生长因子的化学物质来维持干细胞的多能态不变，但即便如此，培养出来的干细胞还是会很快进入各自的分化阶段，呈现出不同的基因表达和形态，这种多样性分化使得干细胞培养物很难被诱导生成所需的特定组织。该研究负责人之一、伊利诺伊大学基因组生物学研究所动物科学教授田中哲也表示，可以从培养一群同质的未分化细胞入手，诱使其分化成特定的细胞类型以实现临床应用。研究小组发现，多能小鼠胚胎干细胞喜欢“抱团”黏附在一起，而处于群体边缘、与坚硬的培养皿接触的细胞分化速度相对较快，于是他们决定对小鼠胚胎干细胞进行机械学研究而非化学研究。由于干细胞比成熟细胞要柔软10倍，研究人员猜测是否是培养皿和细胞之间的机械力刺激了细胞分化，并通过前期研究证实，即使很小的机械力也可诱导细胞分化。接下来，研究小组将小鼠胚胎干细胞分成3组进行平行试验：第一组用加入了生长因子的常规培养基培养；第二组采用与这些细胞同样硬度的软凝胶基质进行培养，并加入生长因子；第三组同样用软凝胶基质培养，但没有加入生长因子。结果显示，即使缺乏生长因子，利用软凝胶基质培养的干细胞在3个多月传代20次后仍能表现出更明显的同质性和多能性。研究合作者、伊利诺伊大学机械科学和工程系教授王宁(音译)说，这体现了事物的两面性：机械力能够诱导分化，但如果降低培养基和干细胞之间的机械力，就可以将干细胞保持在多能状态。这项研究证实了在干细胞分化过程中力学环境的重要性不亚于化学生长因子。在活的有机体中，细胞只在短期内分泌生长因子，而机械力则始终在影响每个细胞。研究小组下一步打算利用这种新技术来培养诱导多能干细胞(iPS)，虽然iPS 细胞医学应用前景广阔，但也是出了名的难以培养。田中哲也说：“我们可以试

肿瘤干细胞培养技术

肿瘤干细胞培养技术随着干细胞生物学以及肿瘤学研究的不断深入，肿瘤干细胞已成为当前肿瘤研究的热点。肿瘤干细胞的体外培养在肿瘤干细胞研究领域具有不可替代的重要地位，通过分离、纯化及培养肿瘤干细胞可以对其生物学特性如异质性、肿瘤的演化、转移和抗药性等进行研究，为肿瘤的早期诊断与治疗提供了新的思路和策略。肿瘤干细胞的体外培养多采用无血清培养基(serum free medium, SFM)，根据不同的细胞类型加入适当的细胞因子联合培养以防止其分化。肿瘤细胞系或者是临床肿瘤组织联合采用机械和胶原酶消化肿瘤组织得到单细胞悬液，经过流式细胞仪或者免疫磁珠分选的方法得到肿瘤干细胞使用无血清培养基在37℃，5％CO2饱和湿度的条件下进行体外培养，但值得注意的是临床肿瘤组织的获取应该越新鲜越好，最好是在外科手术后1小时内进行处理否则将影响肿瘤干细胞细胞的活性，不利于体外培养。无血清培养基有很多种，针对不同的细胞类型有专门的无血清营养液出售。无血清培养基具有以下的优点：各批产品之间成分相对明确、质量相对一致；便于控制培养的生理环境；特殊细胞类型的优化配方有利于提高细胞的稳定性，使不同类型的细胞能在最有利于各自生长的环境中持续传代培养；依据不同类型的细胞、甚至不同的细胞系(株)都可能有各自的无血清培养基。总的来说可以分为基础营养基及附加成分两大部分[1]。基础培养基一般采用人工合成的培养基主要有DMEM、DMEM/F12、UltraCULTURETM、神经干细胞专用无血清培养基、黑色素瘤专用培养基等其中以DMEM/F12(1:1，Invitrogen)最为常用。附加成分是指在基础培养基中加入各种不同细胞生长所需的营养成分，包括①营养因子：胰岛素、转铁蛋白和亚硒酸钠、牛血清白蛋白、B27、L－谷氨酰胺；②细胞因子：白血病抑制因子、表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、神经生长因子、血小板衍化生长因子等。使用无血清培养基培养的细胞经胰酶消化传代后不使用血清终止胰酶的作用，可使用0.1％－0.5%大豆胰酶抑制剂(soybean trypsin inhibitor)。一、肿瘤干细胞培养中几种常见的细胞因子 (一)白血病抑制因子LIF(leukemin inhibitory factor,LIF) 是白介素6(IL-6)细胞因子家族中的一员，是典型的多功能生长因子，具有多种生物学功能：对细胞生长、增殖与分化有着广泛的作用，抑制分化促进干细胞增殖。胚胎干细胞的体外培养需要添加LIF以抑制其分化，维持其多能性。LIF可抑制成纤维细胞生长因子(Fibroblast Growth Factor ,FGF)、β转移生长因子(β-transforming Growth

胚胎干细胞的体外诱导分化模型

胚胎干细胞的体外诱导分化模型马宗源　李祺福(厦门大学生命科学学院福建厦门361005) 胚胎干细胞是具有全能性及无限制的自我更新与分化能力的一类特殊的细胞群体,它能通过祖细胞为中介,分化为各种类型的体细胞,可重演体内干细胞的分化过程。自80年代从小鼠囊胚的内细胞团分离到胚胎干细胞并建系到现在已建立了神经细胞、肌肉细胞、上皮细胞、造血细胞等体外分化体系。将胚胎干细胞体外分化成为可利用的分化模型,无论从组织结构、细胞及分子水平都体现了体内分化过程的体外重演,再加上胚胎干细胞系具有体系简单,影响因子少,可控制,便于研究等特点,因此可用于研究早期胚胎发育和细胞分化调控;可成为器官移植和修复器官的细胞来源;还可用于新型药物筛选。 1　胚胎干细胞的生物学特性胚胎干细胞具有与早期胚胎相似的结构特征,具有较高的核质比和整倍体核型。体外培养的细胞紧密堆积,呈克隆状生长,具有发育分化的多潜能性和无限制的自我更新能力,碱性磷酸酶染色呈阳性,具有高的端粒酶活性,早期胚胎细胞均表达胚胎阶段特异性抗原SSEA-1、SSEA-3、SSEA-4、T RA-1-81、T R A-1-60等;表达种系转录因子OCT-4,并且可将O CT-4基因作为细胞多能性的一个标志;白介素6型细胞因子家族参与维持调节胚胎干细胞未分化状态。胚胎干细胞建系的过程中要解决的问题在于体外不断增殖的过程中保持未分化的状态,但是细胞如何维持其未分化状态的机理并不清楚。研究发现主要是通过膜上的特异受体蛋白gp130来发挥作用,细胞因子受体蛋白g p130可激活JA N U S、酪氨酸激酶,JA K-ST A T、M EK/M A P K等信号途径,而JAK/ST A T3和M EK/ ERK信号途径则处于相对平衡的状态。另外,一些未知的膜结合分子也参与胚胎干细胞的增殖与分化。分离纯化及鉴定调节细胞的自我更新及分化的未知分子已成为研究的热点。 2　胚胎干细胞为基础的分化模型胚胎干细胞要维持其未分化的状态,需要在胚胎饲养层中加入分化抑制因子。一旦改变了维持胚胎干细胞未分化状态的条件,胚胎干细胞首先形成胚胎小体,胚胎小体有外中内三胚层,继续分化可形成多种类型的细胞。在体外分化培养时,可自发形成有节律性跳动的心肌细胞,同时还形成骨骼肌、神经细胞、上皮细胞等。由于体外胚胎细胞可重演体内胚胎细胞的发育过程,并且基因的表达时相与体内的胚胎发育过程是相似的,在这一过程中加入外源的诱导分化因子并与相关的调控基因结合,可使胚胎干细胞分化为各种类型的细胞。现在已初步建立了神经细胞、肌肉细胞、上皮细胞和造血细胞等体外分化模型。 2.1　神经细胞　体外培养胚胎干细胞可模拟从未定型细胞向功能性神经元转化的过程,并且其基因的表达时相与体内的胚胎发育过程相似。在分化的早期表达N FL、N F M基因,后期则表达N eur ocan基因。维甲酸及神经生长因子可诱导胚胎干细胞定向分化为神经细胞,是常用的诱导分化物,它能上调神经元特异基因的表达,同时下调中胚层基因的表达。将神经元特异的SOX2基因转进胚胎干细胞,再经维甲酸诱导,可表达90%以上的具有神经元标志的神经细胞。可能是外源基因和维甲酸同时拮抗分化抑制因子的作用,阻碍细胞向其他的方向分化,迫使其向神经元的方向分化。维甲酸能诱导胚胎干细胞分化为C-氨基丁酸能和多巴胺能神经元,而维甲酸分别结合无血清培养基和含胎牛血清的培养基培养胚胎干细胞后发现,采用无血清培养时,几乎检测不到分化的多巴胺能神经元的存在;但在有血清培养时,却能检测到大量的多巴胺神经元。这暗示血清中的某些未知的因子和维甲酸共同起到定向诱导分化化为特定组织细胞,将这些细胞回输体内,从而达到长期治疗的目的。干细胞的医学应用还包括体外克隆人体器官,然而这比体内移植干细胞要复杂的多。相信随着研究的不断深入,来自人体干细胞的器官应用于临床治疗已为期不远。干细胞研究与应用不仅在疾病治疗方面有着极其诱人的前景,而且将对克隆动物,转基因动物生产,发育生物学,新药物的开发与药效、毒性评估等领域产生极其重要的影响。参考文献　1　Th omson J A,Itsk ovitz-Eldor J os eph,Shapiro S S,et al. Em bryonic s tem cell lin es d erived from human b las tocysts.S cience,1998,282:1145—1147. 　2　Sh amb lott M J,Axelman J,W ang S,et al.Derivation of Plurip otent stem cells from cultured human primordial germ cell.Proc Natl Acad S ci U SA,1998,95:13726—13731. 　3　Jack son K A,M i T,Goodell M A.Hematopoietic potential of s tem cells isolated from murie s keletal mus cle.Proc Natl Acad Sci USA,1999,96:14482— 14486. 　4　裴雪涛.干细胞研究现状与展望.高技术通讯,2001, (6):93—95. (BH)

小鼠胚胎干细胞培养

以下培养针对于小鼠的R1胚胎干细胞系，其它胚胎干细胞的培养可以参考。不过人的胚胎干细胞培养不可以采用下面的protocol，需要用专用的protocol和培养基。一般培养－－维持ES细胞处于未分化状态 ES细胞培养用含有LIF（白血病抑制因子）和Feed细胞的培养基（高糖）来阻止细胞的分化。为细胞提供包被有0.1％明胶的平板作为粘附细胞的基质。建议每2－3天从达到80％－90％融合的平板按1：8的比率传代细胞一次，细胞传代以后，在将细胞接种在0.1％明胶包被的培养皿之前，通过预先将细胞接种在没有经过包被的组织培养板2个小时，使分化细胞粘附，从而将分化和未分化细胞分开。将细胞全程置于37℃，5％CO2，100％湿度条件下培养。如果在Feed细胞，那么就需要采用MMC进行处理，抑制Feed细胞增殖，但仍然能保持其分泌LIF因子的活性。下文中暂不提及Feed细胞。Feed细胞可以来源于STO细胞或原代胚胎成纤维细胞。培养基 ES: 配制一20×不含DMEM，HS，LIF的溶液（该溶液也能用于EB培养基－－见下文）。分装在50ml 离心管中，（稀释为2×，每管42ml），贮存在-20℃。通过将21ml该溶液，HS和LIF加入450ml DMEM中制备培养基，0.22 μm滤膜过滤。贮存于4℃，时间不要超过2周。贮存液 DMEM（高糖）马血清（HS） L-谷氨酰胺（200mM） MEM NEAA（10mM） HEPES（1M） β-巯基乙醇（55Mm） PEST LIF 复苏细胞细胞被冻存在10％二甲基亚砜（DMSO）中防止结晶的形成，结晶的形成会损害细胞。然而，二甲基亚砜对细胞有毒性，快速的进行细胞复苏是很重要的。步骤： 1．从液氮中取出一管细胞； 2．将冻存管置于37℃水浴中2分钟（或放到管内溶液恰好完全溶解）； 3．将细胞转移到一15ml Falcon管中； 4．加入5ml ES培养基（用培养基冲洗冻存管）； 5．离心3分钟； 6．弃上清，用2ml ES培养基重悬细胞，至少吹打10次； 7．接种在明胶包被（见下文）的6孔或6cm组织培养皿； 8．孵育。冻存细胞冻存液

胚胎干细胞体外诱导分化综述

胚胎干细胞体外诱导分化综述摘要：由于胚胎干细胞具有自我更新、高度增值和多向分化的潜能，因此，自20世纪90年代开始，对胚胎干细胞的研究成为生物学领域和医药工程领域研究的一个焦点。本文从胚胎干细胞的分离、体外诱导胚胎干细胞的原理和定向分化的机制、胚胎干细胞体外诱导的方法、定向分化的细胞、应用前景和研究存在的问题对胚胎干细胞进行综述。关键词：胚胎干细胞；体外培养；诱导分化；应用干细胞是一种具有多分化潜能和自我更新功能的早期未分化细胞。在特定条件下，它可以分化成不同的功能细胞，形成多种组织和器官，它包括胚胎干细胞和成体干细胞。前者指早期胚胎的多能干细胞，后者是存在于胎儿和成体不同的组织内的多潜能干细胞这些细胞具有自我复制能力，并产生不同种类的具有特定表型和功能的成熟细胞的能力，能够维持机体功能的稳定，发挥生理性的细胞更新和修复组织损伤作用[4,9,10]。胚胎干细胞（embryonic stem cell,ESC)是从着床前胚胎内内细胞团(inner cell mass,ICM)或原始生殖细胞经体外分化抑制培养分离的一种全能性细胞[1]。它能在体外长期不断自我更新,并保持多向分化潜能,可以分化为内、中、外三个胚层的几乎所有类型细胞。自1981年Evans和Kauffman[2,8]用不同的方法首次成功分离得到小鼠胚胎干细胞以来,小鼠胚胎干细胞成为近20年来人们用来研究发育分化、基因表达调控、基因治疗等最理想的模型，并且有大量研究表明小鼠胚胎干细胞可以在体外被诱导分化为绝大多数类型的成体细胞.1998年Thomson等首次成功分离并建立人胚胎干细胞系。自此，人胚胎干细胞不但提供了一个研究人类自身发育分化的良好机会,而且如果人胚胎干细胞能像小鼠胚胎干细胞一样可以在体外诱导形成各种成体细胞,那么利用这些诱导分化形成的成熟细胞将有可能进行细胞和组织替代治疗, 包括糖尿病、帕金森病、早老性痴呆、心血管疾病和肿瘤等多种目前临床上难以治愈的疾病。 1 胚胎干细胞的分离自Thomson成功分离并建立人胚胎干细胞系后，多年以来，人们研究出很多胚胎干细胞的分离方法，在这里主要介绍三种： 1.1 分离自胚胎内细胞团内细胞团又称胚细胞（embryoblast）,是一团于哺乳动物初期胚胎中的一个细胞团块。从早期胚胎内细胞团（inner cell mass,ICM）分离是获得胚胎干细胞的主要途径。由于不同动物的胚胎发育存在差异，因此应注意取材时间。可通过免疫外科手术法、机械剥离法、组织培养法等方法除去胚胎滋养层细胞获得囊胚内细胞团（ICM）细胞进行体外分化抑制培养。 1.2分离自原始生殖细胞

小鼠胚胎干细胞培养实验步骤

细胞的原代培养点击次数：540 作者：佚名发表于：2009-03-06 16:26转载请注明来自丁香园一、原代细胞培养原理原代细胞培养是将机体内的某组织取出，分散成单细胞，在人工条件下培养使其生存并不断生长、繁殖的方法。借助这种方法可以观察细胞的分裂繁殖、细胞的接触抑制以及细胞的衰老、死亡等生命现象。 ? 幼稚状态的组织和细胞，如：动物的胚胎、幼仔的脏器等更容易进行原代培养 ? 掌握无菌操作技术 ? 了解小鼠解剖操作技术 ? 了解原代细胞培养的一般方法与步骤 ?了解培养细胞的消化分散 ? 了解倒置显微镜的使用二、实验材料 ? 实验动物：孕鼠或新生小鼠 ? 液体：细胞生长液（内含20%小牛血清） 0.25%胰蛋白酶平衡盐溶液 70%乙醇 ?器材：灭菌镊子、剪刀若干把灭菌培养皿、细胞培养瓶、小瓶、烧杯若干个吸管若干支酒精灯原代细胞培养方法三、胰酶消化法（1）胰酶消化法操作步骤——取材 a. 用颈椎脱位法使孕鼠迅速死亡。

b. 把整个孕鼠浸入盛有75%乙醇的烧杯中数秒钟消毒，取出后放在大平皿中携入超净台。 c. 用无菌的镊子和剪子在前腿下作一腹部水平切口，用无菌镊子将皮肤扯向后腿。 d. 用另一无菌的剪刀和镊子切开腹部，取出含有胚胎的子宫，置于无菌的培养皿上。 e. 剔除胚胎周围的包膜（若胚胎较大，应剪去头、爪），将胚胎放于无菌的含有平衡盐溶液的培养皿中。 f. 漂洗胚胎，去掉平衡盐溶液。继续用平衡盐溶液漂洗胚胎直至清洗液清亮为止。（2）胰酶消化法操作步骤——切割 a. 将部分胚胎转移至一个无菌小瓶中，用平衡盐溶液漂洗。 b. 然后用眼科手术剪刀小心地绞碎胚胎，直到成1mm3左右的小块，再用平衡盐溶液清洗，洗到组织块发白为止。 c. 静置，使组织块自然沉淀到管底，弃去上清。（3）胰酶消化法操作步骤——消化、接种培养 a. 视组织块量加入5-6倍的0.25%胰酶液，37℃中消化20-40分钟，每隔5分钟振荡一次，或用吸管吹打一次，使细胞分离。 b. 加入3-5ml细胞生长液以终止胰酶消化作用（或加入胰酶抑制剂）。 c. 静置5-10分钟，使未分散的组织块下沉，取悬液加入到离心管中。 d. 1000rpm，离心10分钟，弃上清液。 e. 加入平衡盐溶液5ml，冲散细胞，再离心一次，弃上清液。 f. 加入细胞生长液l-2ml（视细胞量），血球计数板计数。 e. 将细胞调整到5×105/ml左右，转移至25ml细胞培养瓶中，37℃下培养。（4）胰酶消化法操作步骤——消化、接种培养

人骨髓间充质干细胞的贴壁分离与体外培养

万方数据

ＩＳＳＮ１６７３—８２２５ＣＮ２１．１５３９／Ｒ赵凌云，等人骨髓间充质干细胞的贴壁分离与体外培养ｗｗＭ．ｚｇｌｃｋｆ，ｃｏｍｋｆ２３３８５０８３＠ｓｉｎａ．ｃｏｍ０引言骨髓间充质干细胞是具有形成骨、软骨、脂肪、神经和成肌细胞能力的多种分化潜能的细胞亚群，取材方便，易于体外扩增，可进行自体移植，而不存在组织配型和免疫排斥的问题，被认为是骨组织工程中最佳的种子细胞。本实验目的在于建立一种可行的骨髓间充质干细胞取材和分离扩增的培养方法。１材料和方法设计：开放性实验。单位：解放军济南军区总医院脊髓修复科。材料：实验于２００６—０２／１２在解放军济南军区总医院脊髓修复科完成。骨髓来源于解放军济南军区总医院脊髓修复科收治的脊髓完全性损伤患者，对本实验均知情同意。基础培养液由含体积分数为０．１５胎牛血清和低糖仪一ＭＥＭ配置。低糖ｄ－ＭＥＭ培养基（Ｈｙｃｌｏｎｅ）；淋巴细胞分离液（密度１．０７７ｇ／ｍＬ，上海试剂二厂生产）；胰蛋白酶，胎牛血清（Ｇｉｂｉｃｏ）；Ｃ０２培养箱（上海力申科学仪器有限公司，ＨＦ９０）；生物安全柜（上海力申科学仪器有限公司，ＨＦｓａｆｅ一１２００／ｃ）；倒置显微镜（Ｌｅｉｃａ）；离心机（ＪＯＵＡＮＢ４ｉ多功能台式机）。设计、实施、评估者：设计、实施为第一作者，评估为第二、三作者，均经过系统培训，未使用盲法评估。方法：骨髓间充质干细胞的分离及传代培养：在无菌条件下，以含５ｍＬ肝素钠生理盐水的２０ｍＬ注射器，于患者髂后上棘穿刺抽取骨髓组织６ｍＬ，移入含５ｍＬ肝素钠生理盐水的试管内，混匀，而后沿管壁缓慢加入含１０ｍＬ淋巴细胞分离液的离心管中，２０００ｒ，ｍｉｎ离心２０ｍｉｎ，小心吸取界面层细胞，用Ｄ—Ｈａｎｋｓ平衡盐溶液洗２次，２０００ｒ／ｍｉｎ离心８ｍｉｎ，加入基础培养液，血细胞计数板计数，调整细胞的浓度，将细胞悬液按１０９—１０１０Ｌ－１接种于培养瓶，放置３７℃、体积分数为０．０５的Ｃ０２饱和湿度孵箱中培养。于培养后的两三天更换培养液，并用Ｄ－Ｈａｎｋｓ平衡盐溶液冲洗２次，以去除未贴壁的造血细胞，以后每３ｄ换液一次，进一步去除未贴壁的细胞。观察细胞生长情况，待细胞融合成片、长满培养瓶底部后，用质量浓度为２．５ｇ／Ｌ的胰蛋白酶流过所有细胞表面，盖好瓶盖，将培养瓶放在倒置显微镜下观察，发现细胞变圆，部分脱壁，控制消化时间不超过３ｍｉｎ，立即加入２ｍＬ有血清培养液终止消化，用弯头吸管轻轻吹打细胞生长区域，吹打过程中不要用力，结束后再用少量培养液漂洗一遍，然后加入适５６５０量培养液计数，分别接种在新的培养瓶内。骨髓间充质干细胞的生长曲线的绘制：取第３代生长状态良好的细胞，用质量浓度为２．５ｇ／Ｌ的胰蛋白酶消化制成细胞悬液，接种至２４孔培养板，３孔／组，细胞１×１０４／孔，每孔加入培养液１ｍＬ，放置３７℃、体积分数为０．０５的Ｃ０２孵箱中培养。以细胞数为纵坐标，时间为横坐标，绘制细胞生长曲线。骨髓间充质干细胞贴壁率的测定：取第３代生长状态良好的细胞，用质量浓度为２．５ｇ／Ｌ的胰蛋白酶消化制成细胞悬液，接种至２４孔培养板，３孔／组，细胞１×１０４／孔，每孔加入培养液１ｍＬ，放置３７℃、体积分数为０．０５的Ｃ０２孵箱中培养，每隔２ｈ进行细胞贴壁率检测。主要观察指标：①骨髓间充质干细胞的形态学观察。②骨髓间充质干细胞的生长曲线。③骨髓间充质干细胞的贴壁率。统计学分析：由第一作者采用ＥＳＡ４．０软件进行统计处理，数据以娃ｓ表示。２结果２．１骨髓间充质干细胞的形态学观察倒置显微镜下，骨髓间充质干细胞接种１ｄ即贴壁，２ｄ时贴壁细胞较多。经冲洗和换液去除悬浮细胞后，贴壁细胞继续培养３ｄ开始增殖，伸展为椭圆型、短梭型、多角型及不规则型等（图１）。至１４ｄ细胞密集在集落中心，基本铺满瓶底，第３～５代细胞呈均匀一致的长梭型，排列成旋涡状或放射状（图２）。图１原代培养的骨髓间充质干细胞贴壁后３ｄ开始增殖，伸展为椭圆型、短梭型、多角型及不规则型等（倒置显微镜，ｘ２０）２．２骨髓间充质干细胞的生长曲线骨髓间充质干细胞传代后３ｄ内处于潜伏期，３ｄ后进入生长期，７ｄ后进入平台期。第３代骨髓间充质干细胞生长曲线见图３。Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ１２００。Ｓｈｅｎｙａｎｇ１１０００４ｋｆ２３３８５０８３＠ｓｉｎａ．ｃｏｍｗｗｗ．ｚｇｌｃｋｆ．ｃｏｍ　万方数据

神经干细胞体外培养技术

神经干细胞体外培养与鉴定一前言神经干细胞(Neural stem cells, NSC S)是神经系统内能产生神经元和胶质细胞的未分化原始细胞【1-2】。文献报道，NSC具有无限增殖、自我更新和多向分化能力，在适宜的环境条件下，能分化形成各种靶组织细胞【3-5】。此外，NSC 还可用作为是细胞移植治疗的有效载体，被广泛用于神经疾病细胞或载体治疗。根据目前的研究结果，其主要作用包括下列三方面：①NSC分化成宿主细胞来替代丢失细胞的作用；②分泌多种细胞因子发挥生物学功能；③桥接作用【6-8】。基于NSC的上述特性，从而奠定了NSC在细胞替代治疗中有广泛应用前景，而如何获取NSC则是科学研究和临床实践中首先面临的关键问题。本实验拟建立绿色荧光蛋白（Green fluorescent protein，GFP）转基因小鼠NSCs原代和传代培养技术，为后面的实验提供方法支持。二实验所需仪器、试剂及其配制（一）实验仪器光学显微镜（Olympus,Japan）倒置荧光显微镜（LEICA DMIRB）冰冻切片机（Leica CM1900，Germany）光明DZKW型电热恒温水浴锅（北京市光明医疗仪器厂） XK96-A快速混匀器（姜堰市新康医疗器械有限公司）HT-200 电子天平（成都普瑞逊电子有限公司川制）FA1004型精密电子天平(上海良平仪器仪表有限公司) MP 8001单臂脑立体定位仪(深圳市瑞沃德科技有限公司) 10μl微量进样器（Pressure-Lok，PRECISION SAMPLING CORP，BATON ROUGE， LOUISIANA，Made in USA） 0.5ml、1ml Eppendorff管（Ependorff）手术器械：眼科剪、解剖剪、显微剪、显微有齿镊及无齿镊、蚊式钳、刀柄刀片等。

胚胎干细胞体外培养.

胚胎干细胞体外培养 (一)胚胎干细胞的来源目前胚胎干细胞的主要来源有：①囊胚的ICM及受精卵发育至桑葚胚之前的早期胚胎细胞；②从胚胎生殖嵴及肠系膜中分离原始生殖细胞PGCs后培养建系的胚胎生殖细胞(embryonic germ cells，EG细胞)，也具有ESCs的特性，可以分化为各种类型的成熟细胞；③体细胞核转移(somatic cell nuclear transplantation，SCNT)至去核卵母细胞后培育出来的全能细胞。其中囊胚的ICM最为常用。 (二)胚胎干细胞的分离 1.分离获取ESCs的时间：以既保证ESCs的全能性又要有足够的细胞数量为原则来确定ESCs分离获取的最佳时间。以ICM为ESCs来源时：小鼠取3～5天囊胚；猪取9～10天囊胚；羊取7～8天囊胚；牛取6～7天桑葚胚或早期囊胚；人取7～10天囊胚。以PGCs取ES细胞时：小鼠取1 2.5天胎儿生殖嵴；大鼠可取10.5天尿囊、中胚层组织块、12.5天背肠系膜或1 3.5～1 4.5天生殖嵴；牛取29～35天胎儿生殖嵴；人取35～63天的生殖嵴。 2.分离获取ESCs的方法：从PGCs分离ESCs的方法常为机械剪切与消化相结合法，即把采取的胚胎组织充分剪碎，采用EDTA、EDTA/胰酶消化。从囊胚分离ICM的方法主要有三种： (1)免疫外科学方法：体外培养的小鼠胚泡去除透明带后，经兔抗JCR小鼠脾脏细胞抗血清(抗H-26)作用30分钟，移至1∶6稀释的新鲜豚鼠血清中作用30分钟，Hank’s液冲洗，此时胚泡的滋养外胚层呈空泡状，用眼科手术刀挑去死了的滋养层细胞，留存ICM 细胞用于培养。这种方法利用囊胚腔对抗体的不通透性，通过抗体、补体结合对细胞的毒性杀伤作用，去除滋养层细胞，保留ICM细胞进行培养。 (2)组织培养法：在小鼠受精2.5天后切除卵巢，给予外源激素，使胚胎继续发育，但延缓着床，4～6天后，由子宫冲取胚泡进行培养。结果滋养层细胞生长并推开饲养层细胞，在培养皿底壁上铺展；而ICM细胞增殖，垂直向上生长，形成卵圆柱状结构，在显微镜下用细玻璃针挑出这种柱状结构，消化传代。Evans和Kaufman采用这种方法第一个建立了小鼠ESCs系。 (3)显微外科学方法：小鼠受精后3～4天，由子宫冲取胚泡，利用显微操作系统直接从胚泡中吸出ICM细胞进行培养。由于免疫外科学方法需要特殊的试剂去除透明带和滋养层，易对内细胞群造成损伤，而显微外科学方法需要专门的仪器设备，且对人员的技术水平要求较高，均难以推广应用。组织培养法将胚泡接种在饲养层上，模拟体内胚泡的着床，更接近自然发育过程，内细胞群增殖旺盛，较易获得胚胎干细胞样集落。 (三)胚胎干细胞的培养和建系 ESCs的分离培养和建系是其得以应用的前提。ESCs建系的原理是：将分离获取的ICM 或PGCs与饲养层共同培养，使之增殖而又保持其未分化状态，这样代代相传从而使ESCs

肿瘤干细胞培养技术分享

肿瘤干细胞培养技术肿瘤干细胞起源：最初形成肿瘤的不一定是肿瘤干细胞（Cancer stem cells, CSCs），尽管肿瘤起始细胞有时能和CSCs互换；CSCs的存在最早是在40年前被提出来的，支持CSCs 存在的最佳证据来源于对恶性血液疾病急性白血病的研究；CSCs也被很多学者称之为肿瘤传播细胞（Tumor propagating cells, TPCs）；图中显示：CSCs不仅可以来源于正常干细胞的突变，还可以由祖细胞分化的细胞获得无限增殖潜力而形成、由分化的细胞去分化后突变形成。肿瘤干细胞特征： 1、CSCs的迁移对肿瘤远处转移的影响：CD133+胰腺癌细胞具有形成肿瘤的能力；这些细胞能够进行连续传代，说明其具有自我更新能力（Self-renewal capacity），且能够通过制造分化的、非致瘤的子代从而产生肿瘤异质性；临床生存分析也表明CD133和肿瘤患者的无疾病生存和总生存率相关；还发现，经历上皮间充质转化（EMT）的肿瘤细胞呈现CSC特性。

2、CSCs具有一些干细胞的特征，如休眠、DNA修复机制激活以及对细胞凋亡的天然抗性等。 3、CSCs对治疗耐受； Ref: Drug Discov Today, PMID: 24819719 其耐受的主要机制包括：药物外排，最经典的耐药机制为ABC（ATP-binding cassette）转运蛋白、抗凋亡通路、干扰细胞分化、乙醛脱氢酶、缺氧环境等等。肿瘤干细胞的分离：荧光激活细胞分选（FACS）和磁珠细胞分选（MACS）是分选CSCs的主要技术；FACS是通过细胞水平特殊蛋白表达、细胞培养、表观遗传学变化以及细胞标志物CD44、CD133等的表达方式来分离细胞；MACS是

人胚胎干细胞培养手册

人胚胎干细胞培养手册操作指南运输和保存：人胚胎干细胞（hESCs）和PMEFi被装在含90％FCS和10％二甲基亚砜的冻存管中，hESCs 4×105/管，可接种一个3.5cm培养皿（或六孔板的一个孔），PMEFi 4×106/管，可接种一块六孔板。冻存管用干冰运输，收到后，hESCs投入液氮，PMEFi放入－80℃保存。培养条件：温度：37±0.5℃ CO2浓度：5.1±0.6％相对湿度：85-100% 主要技术： 1．细胞培养：当进行hESC培养时，总的培养原则必需遵守，所有的操作都应该在相应的细胞培养间和超净台内按无菌技术进行。此外，通过安装空气处理和过滤设备减少空气颗粒制造一个相对洁净的空间。当接触和细胞有关的一切试剂和材料时，应该带手套（包括开冰箱门）。工作间在使用前后要用70％的异丙醇彻底消毒。 2．培养液和材料所有的培养液和试剂在使用前都要用0.2μm的滤膜过滤；培养瓶和TC材料在拿进培养间之前都应该用70％异丙醇消毒。 3．细胞处理为了便于操作，最好不要同时处理两个以上的标本。操作时，在室温和低CO2的时间不要太长。所有的细胞离心：室温，500－600g，5分钟。

培养液准备： MEF和hESCs培养液在无菌条件下进行，完成后用0.2μm的滤膜过滤。当准备hESCs培养液时，保持一致性很重要。如有可能，尽量使用相同的试剂。使用满足于附录提供的血清替代品尤为重要。生长因子应该最后添加，需要强调的是bFGF进行重悬时需要蛋白载体，在少量培养液中不要试图重悬它。 MEF培养液： hESCs培养液：冷冻培养液：90％FCS+10%二甲基亚砜, 0.2μm的滤膜过滤,4℃保存。明胶准备：用超纯水配制0.1％明胶溶液，加热确保明胶完全溶解，使用前高压或0.2μm 的滤膜过滤。明胶包被：接种细胞前，用0.1％明胶溶液包被培养皿，37℃至少30分钟，分别用1.5或4ml包被35mm或10cm培养皿。在接种MEF前吸除明胶溶液。

[胚胎干细胞培养标准化操作规程]培养胚胎干细胞

[胚胎干细胞培养标准化操作规程]培养胚胎干细胞胚胎干细胞培养标准化操作规程6/28/01 目录一、细胞二、一般培养-保持胚胎干细胞处于未分化状态培养基细胞复苏冻存细胞明胶包被细胞传代三、体外分化培养基包被有多聚鸟氨酸/纤维结合蛋白的培养板体外分化方法四、移植细胞的准备细胞多能性胚胎干细胞产生于小鼠胚泡 1、表达绿色荧光蛋白的B5-ES细胞。由Dr、 Nagy的实验室制备。 2、D3-ATCC; CRL-19

34、我们得到时大约传了17代。 3、J1-由Dr、 Jaenish的实验室友情提供。我们得到时大约传了7－9代。 4、J1rtTA-rtTA表达J1细胞，由Dr、 Jaenish的实验室友情提供。 5、表达黄色荧光蛋白的YC5-ES细胞，由Dr、 Nagy的实验室提供。一般培养--维持ES细胞处于未分化状态 ES细胞培养用含有ESGRO的高糖培养基来阻止细胞的分化。为细胞提供包被有％明胶的平板作为粘附细胞的基质。建议每2－3天从达到80％－90％融合的平板按1：8的比率传代细胞一次，细胞传代以后，在将细胞接种在％明胶包被的培养皿之前，通过预先将细胞接种在没有经过包被的组织培养板2个小时，使分化细胞粘附，从而将分化和未分化细胞分开。将细胞全程置于37℃，5％CO2，100％湿度条件下培养。培养基 ES: 配制一20×不含DMEM，HS，ESGRO的溶液。分装在50ml FALCON管中，，贮存在-20℃。通过将21ml该溶液，HS和ESGRO 加入450mlDMEM中制备培养基，μm滤膜过滤。贮存于4℃。注：一瓶DMEM是500ml。贮存液

小鼠胚胎干细胞培养实验步骤一般培养-保持胚胎干细胞处于未分化 ...

小鼠胚胎干细胞培养实验步骤一般培养-保持胚胎干细胞处于未分化状态培养基细胞复苏冻存细胞明胶包被细胞传代体外分化培养基包被有多聚鸟氨酸/纤维结合蛋白的培养板（使用或不使用盖玻片）体外分化方法注：以下培养针对于小鼠的R1胚胎干细胞系，其它胚胎干细胞的培养可以参考。不过人的胚胎干细胞培养不可以采用下面的protocol，需要用专用的protocol 和培养基。一般培养--维持ES细胞处于未分化状态 ES细胞培养用含有LIF（白血病抑制因子）和Feed细胞的培养基（高糖）来阻止细胞的分化。为细胞提供包被有0.1％明胶的平板作为粘附细胞的基质。建议每2－3天从达到80％－90％融合的平板按1：8的比率传代细胞一次，细胞传代以后，在将细胞接种在0.1％明胶包被的培养皿之前，通过预先将细胞接种在没有经过包被的组织培养板2个小时，使分化细胞粘附，从而将分化和未分化细胞分开。将细胞全程置于37℃，5％CO2，100％湿度条件下培养。如果在Feed 细胞，那么就需要采用MMC进行处理，抑制Feed细胞增殖，但仍然能保持其分泌LIF因子的活性。下文中暂不提及Feed细胞。Feed细胞可以来源于STO细胞或原代胚胎成纤维细胞。培养基 ES: 配制一20×不含DMEM，HS，LIF的溶液（该溶液也能用于EB培养基--见下文）。分装在50ml 离心管中，（稀释为2×，每管42ml），贮存在-20℃。通过将21ml 该溶液，HS和LIF加入450ml DMEM中制备培养基，0.22 μm滤膜过滤。贮存于4℃，时间不要超过2周。贮存液 DMEM(高糖) 马血清（HS） L-谷氨酰胺（200mM） MEM NEAA（10mM） HEPES（1M） β-巯基乙醇（55Mm） PEST LIF

肿瘤细胞培养(完整版)

第6章肿瘤细胞的培养肿瘤细胞培养是研究癌变机理、抗癌药的敏感性、肿瘤细胞和癌分子生物学特性的重要手段。癌细胞是比较容易培养的细胞，当前所建立的细胞系中癌细胞是最多的。应用体外细胞培养技术进行肿瘤研究具有许多优点： (1)可免受机体内环境因素的影响，避免了个体差异性，便于探索各种物理、化和生物因素对肿瘤细胞生命活动的影响。 (2)既便于从细胞水平上研究肿瘤细胞的结构与功能，又便于从基因及分子水平上研究癌变的发生机理； (3)可长期传代、保存，便于观察肿瘤细胞生物学特性和遗传行为的改变。 (4)可用于快速筛选抗癌药物和研究耐药机理。 (5)研究周期短，比较经济。但是它也有缺点，如长期培养可使细胞生物学特性发生改变；体外实验所得的结果不能完全代表体内的情况，应与体内试验结合研究更为合理等。一、肿瘤细胞培养的生物学特性 1、形态和性状形态不规则，细胞界限清晰，伸展较差，核膜、核仁轮廓明显，核仁多、核浆丰富。折光性强，电镜观察细胞表面微绒毛多而细密，与肿瘤细胞具不定向运动和铺着不依赖性有关。 2、生物特性癌细胞在无血清或低血清(2%～5%)时仍能生长，营养要求不高，因能自分泌促增殖因子，在软琼脂培养时单个细胞能形成集落，生长方向性消失，再加上失去了接触抑制，癌细胞数量增多时可呈多层重叠生长，细胞饱和密度大，有丰富的三极有丝分裂，分裂指数高，细胞倍增周期短。 3、永生性永生性也称不死性，在体外培养中表现为可无限制传代而不凋亡(Apoptosis)，体外培养的肿瘤

细胞系(株)都表现有这种特性。但体外培养的永生性和体内肿瘤的恶性(包括侵润性)是两种性状，受不同基因调控的，因恶性肿瘤多数在体外培养时并不那么容易获得成功，生长增殖能力并不旺盛，有时只能传若干代，说明体外培养的永生性可在体外培养后获得的。另外，体外培养的许多细胞系，如NIH3T3、Rat-1 10T1/2等均具有永生性而无恶性。但两者有相关性，永生性可能是细胞恶性变的某一阶段。 4、侵润性侵润性是肿瘤细胞扩张性增殖行为，体外培养的肿瘤细胞仍保持有这种特性，当与正常组织混合培养时，能侵润入其他正常组织中，甚至能穿透人工隔膜。 5、异质性所有肿瘤细胞都是由增殖能力、遗传性、起源、周期状态等性状不同的细胞组成，属于异质性，其中有的衰老、退化，有的处于周期阻滞状态，只有那些处于活跃增殖的肿瘤干细胞才是支持肿瘤生长的成分，肿瘤干细胞易于生长增殖，分离培养干细胞的方法称干细胞培养(有干细胞系和数个亚系组成)。 6、细胞遗传性失去二倍体核型，呈异倍体或多倍体，常有标记染色体出现，正常细胞与恶性肿瘤细胞的区别，如表6-1所示。表6-1 区别正常成纤维细胞与恶性肿瘤细胞的指标正常成纤维细胞恶性肿瘤细胞形态棱形或多角形，伸展良好，折光较弱，核浆比例小，嗜碱性弱，核仁较少较小，多核巨细胞少见多角形或细长形，伸展较差，折光强，核浆比例大，嗜碱性强，核仁多、大，常见多核巨细胞生长特性排列有方向性，单层生长，方向性消失，多层重叠生

人骨髓间充质干细胞体外培养模型的建立和表型分析

经验交流文章编号１００６－８１４７（２０11）０4-0458-03 人骨髓间充质干细胞体外培养模型的建立和表型分析刘长乐1，李广平1，郑心田1，孟恒星2，邱录贵2，娄建石3 （1.天津医科大学第二医院心脏科，天津300211；2.中国协和医科大学血液病学研究所，天津300020；3.天津医科大学药理学教研室，天津300070）关键词骨髓间充质干细胞；流式细胞术；培养模型中图分类号 Q813 文献标识码 B 骨髓（bone marrow ，BM ）中包含有两类干细胞，即造血干细胞和间充质干细胞(mesenchymal stem cells ，MSCs)。MSCs 属混杂细胞群，其表面抗原标志尚未完全确定。MSCs 作为多能干细胞具有可塑性，有报道显示在细胞因子作用下可以在体外诱导分化为骨骼肌细胞、脂肪细胞、心肌细胞、上皮细胞和血管内皮细胞，并且参与体内组织新生、损伤修复和重建[1]。本实验应用改进的密度梯度离心法、差异贴壁法和酶消化法建立MSCs 的体外培养扩增模型，寻找高度特异性的表面抗原，以利于干细胞移植的广泛应用。1材料与方法 1.1材料（1）BM ：39岁男性健康志愿者5mL 。（2）仪器：FACScar 流式细胞仪（Beckman -Coulter ），倒置相差显微镜（OLYMPUS ），荧光显微镜（OLYM －PUS ），恒温培养箱（Forma Scientific ），高速低温离心胞系MHCC97-H 的增殖。骨髓间充质干细胞旁分泌物质或许通过分泌细胞因子影响肝癌细胞某一信号通路促进细胞增殖的。 AFP 是CBRH-7919肝癌细胞分泌的一种蛋白，本研究发现随着骨髓间充质干细胞旁分泌物质浓度的升高，AFP 也逐渐升高，表明骨髓间充质干细胞旁分泌物质也增强了7919肝癌细胞分泌AFP 的功能。骨髓间充质干细胞促进肝癌细胞增殖的具体机制目前尚未明确，目前有以下几种学说：免疫抑制影响肿瘤基因的表达，分泌细胞因子以及参与肿瘤血管形成等[4-7]。邵志红等[5]发现大鼠骨髓间充质干细胞能通过影响Walker-256肝癌细胞VEGF 和nm23的表达,促进肝癌细胞的增殖。Li 等[6]发现人骨髓间充质干细胞是通过分泌细胞因子进而影响TGFβ信号通路促进肝癌细胞增殖的。尽管骨髓间充质干细胞对肝癌增殖的确切机制尚未明确，但有效地抑制骨髓间充质干细胞的促增殖作用具有重要的意义，其有可能成为新的抗癌靶点。笔者将继续研究骨髓间充质干细胞旁分泌物质促进肝癌细胞增殖的内在机制，为肝癌治疗带来新的希望。参考文献：［1］Lu YR,Yuan Y,Wang XJ,et al.The growth inhibitory effect of mesenchymal stem cells on tumor cells in vitro and in vivo[J].Can-cer Biol Ther,2008,7(2):245 ［2］乔玲，赵铁军，山长亮，等.人间充质干细胞抑制肝癌细胞增殖的作用及其基因表达谱分析[J].中国生物化学与分子生物学报，2007，23(12):1037 ［3］陈双庆，王培军，李铭华，等.磁标记骨髓间充质干细胞对肝细胞癌的抑制作用[J].临床放射学杂志，2009，28(10):1454 ［4］Djouad F,Plence P,Bony C,et al.Immunosuppressive effect of mesenchymal stem cells favors tumor growth in allogeneic animals [J].Blood，2003,102(10):3837 ［5］邵志红，王培军，李铭华，等.大鼠骨髓间充质干细胞移植对 Walker-256肝癌生长影响的实验研究[J].中华医学杂志，2009，89(7):491 ［6］Li GC,Ye QH,Xue YH,et al.Human mesenchymal stem cells in-hibit metastasis of a hepatocel lular carcinoma model using the MHCC97-H cell line [J].Cancer Sci,2010,101(12):2546 ［7］Zhu W,Xu W,Jiang R,et al.Mesenchymal stem cells derived from bone marrow favor tumor cell growth in vivo [J].Exp Mol Pathol,2006,80(3):267 ［8］Zheng JF,Liang LJ.Transplanted bone marrow stromal cells are not cellular origin of hepatocellular carcinomas in a mouse model of carcinogenesis[J].World J Gastroenterol,2008,14(19):3015 ［9］Leek RD,Harris AL,Lewis CE.Cytokine networks in solid human tumors:regulation of angiogenesis[J].J Leukoc Biol,1994,56(4):423 ［10］Budhu A,Wang XW.The role of cytokines in hepatocellular carci-noma[J].J Leukoc Biol,2006,80(6):1197 （2011-04-27收稿）作者简介刘长乐（1979-），男，主治医师，硕士，研究方向：冠心病、心律失常；通信作者：李广平，Email ：tjcardiol@https://www.360docs.net/doc/c111266223.html, 。Ｖｏｌ．１7熏Ｎｏ．4Dec.２０11 天津医科大学学报 Journal of Tianjin Medical University 第１7卷4期２０11年12月 458