大肠菌群计数检验步骤
大肠菌群计数检验步骤
第一法大肠菌群MPN 计数
操作步骤
6.1、样品的稀释
6.1.1、固体和半固体样品：称取25g 样品，放人盛有225ml磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内，8 00or/min-10 000r/min 均质1 min-2 min ，或放人盛有225ml磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1 min-2 min ，制成1:10 的样品匀液。
6.1.2、液体样品：以无菌吸管吸取25ml样品，置盛有225ml磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分棍匀，制成1:10 的样品匀液。
6.1.3、样品匀液的pH 值应在6.5-
7.5 之间，必要时分别用1mol/L 氢氧化钠（NaOH ）或1 mol/L 盐酸（HCI ）调节。
6.1.4、用1ml无菌吸管或微量移液器吸取1:10 样品匀液1ml，沿管壁缓缓注人9ml磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用1 支1ml无菌吸管反复吹打，使其混合均匀，制成1:100 的样品匀液。
6.1.5、根据对样品污染状况的估计，按上述操作，依次制成10 倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释1 次，换用1 支1ml无菌吸管或吸头。从制备样品匀液至样品接种完毕，全过程不得超过15 min 。
6.2、初发酵试验
每个样品，选择3 个适宜的连续稀释度的样品匀液（液体样品可以选择原液），每个稀释度接种3 管月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤，每管接种1ml（如接种量超过1ml，则用双料LST肉汤）, 36℃±1℃培养24h±Zh ，观察倒管内是否有气泡产生，如未产气则继续培养至48h±2h 。记录在24h 和48h 内产气的LST 肉汤管数。未产气者为大肠菌群阴性，产气者则进行复发酵试验。
6.3、复发酵试验
用接种环从所有48h±2h 内发酵产气的LST 肉汤管中分别取培养物l环，移种于煌绿乳糖胆盐( BGLB）肉汤管中，36℃±1℃培养48h±2h ，观察产气情况。产气者，计为大肠菌群阳性管。
6.4、大肠菌群最可能数（MPN ）的报告
根据大肠菌群阳性管数，检索MPN 表（见附录B ) ，报告每克（或毫升）样品中大肠菌群的MPN 值。
第二法大肠菌群平板计数
8、操作步骤
8.1、样品的稀释
按6.1 进行。
8.2、平板计数
8.2.1、选取2 个～3 个适宜的连续稀释度，每个稀释度接种两个无菌平皿，每皿1ml。同时分别取1ml生理盐水加人两个无菌平皿作空白对照。
8.2.2、及时将15 mL-20ml冷至46℃的结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA ）约倾注于每个平皿中。小心旋转平皿，将培养基与样液充分混匀，待琼脂凝固后，再加3 mL-4mlVRBA 覆盖平板表层。翻转平板，置于36℃±l℃培养18h-24h 。
8.3、平板菌落数的选择
选取菌落数在30-150 之间的平板，分别计数平板上出现的典型和可疑大肠菌群菌落。典型菌落为紫红色，菌落周围有红色的胆盐沉淀环，菌落直径为0.5 mm 或更大。
8.4、证实试验
从VRBA 平板上挑取10 个不同类型的典型和可疑菌落，分别移种于BGLB 肉汤管内，36℃±1℃培养24h-48h ，观察产气情况。凡BGLB 肉汤管产气，即可报告为大肠菌群阳性。
8.5 、大肠菌群平板计数的报告
经最后证实为大肠菌群阳性的试管比例乘以8.3 中计数的平板菌落数，再乘以稀释倍数，即为每克（或毫升）样品中大肠菌群数。
第三法大肠菌群PetrifilmTM 测试片法
10、操作步骤 10.1 样品的稀释
按6.1 进行。
10.2、测定
10.2.1、样品接种及培养
将待检样品选取2 个-3 个适宜的连续稀释度，每个稀释度接种两张测试片。将PetrifilmT M 大肠菌群测试片置于平坦实验台面，揭开上层膜，用吸管吸取1ml样液垂直滴加在测试片的中央，将上层膜缓慢盖下，避免气泡产生和上层膜直接落下。把压板（平面底朝下）放置在上层膜中央，轻轻地压下，使样液均匀覆盖于圆形的培养面积上，切勿扭转压板。拿起压板，静置至少1 min 以使培养基凝固。将测试片的透明面朝上置于培养箱内，堆叠片数不超过20片，36℃±1℃培养24h±2h 。
10.2.2、判读
培养24h±Zh 后应立即计数，可目测或用标准菌落计数器、放大镜或PetrifilmTM 自动判读仪来计数。红色有气泡的菌落确认为大肠菌群。圆形培养区边缘上及边缘以外的菌落不作计数。当培养区域出现大量气泡，大量不明显小菌落或培养区呈暗红色三种情况，表明大肠菌群的浓度较高，需要进一步稀释样品以获得更准确的读数。
10.3、大肠菌群测试片计数的报告
选取菌落数在15-150 之间的测试片，计数其红色有气泡的菌落数，两个测试片的平均菌落数乘以稀释倍数即为每克（或毫升）样品中的大肠菌群菌落形成单位（CFU ）数。如果所有稀释度测试片上的菌落数都小于15 ，则计数稀释度最低的测试片上的平均菌落数乘以稀释倍数报告；如果所有稀释度的测试片上均无菌落生长，则以小于1 乘以最低稀释倍数报告；如果最高稀释度的菌落数大于150 ，计数最高稀释度的测试片上的平均菌落数乘以稀释倍数报告。计数菌落数大于150 的测试片时，可计数一个或两个具有代表性的方格内的菌落数，换算成单个方格内的菌落数后乘以20 即为测试片上估算的菌落数（圆形生长面积为20cm2 ,）。报告单位以CFU/g （或CFU/mL ）表示。
大肠菌群平板计数法的注意事项
大肠菌群是经常用来衡量食品卫生情况的重要指标，绝大部分食品都会要 求检测的项目。在食品微生物实验室里，大肠菌群和菌落总数的检测频次应该是最高的，但检测过程中总会有一些小问题困扰着大家，以下来讲解一下大肠 菌群平板计数法的注意事项。 方法选择 相比于MPN计数法，平板计数法更适用于大肠菌群含量较高的食品。但大肠菌群多少算是含量较高呢国标里没有明确规定，但通常认为，产品大肠菌群以100CFU/g（mL）为界，超过这个含量一般认为是含量较高。但具体什么时候选用平板计数法进行大肠菌群的检测，大部分情况还是要看你的产品执行的标准。假如产品标准要求大肠菌群含量的单位为CFU/g（mL），那必须选用平板计数法。若是/g(mL)或者MPN/100g(mL)，就应选择MPN计数法，MPN法具体选用哪版国标 此处不再赘述。因此，根据自己产品的情况选择适当的检测方法。 培养基的要求 平板计数法使用的培养基为结晶紫中性胆盐琼脂培养基，简称VRBA。无论是国标，还是培养基的使用说明中都明确表示，VRBA是不需要进行灭菌的，煮沸2min即可使用。特地点出这一点是因为很多朋友都在问VRBA的灭菌条件，对不灭菌的培养基不信任，害怕出现检测异常，那是因为这些小伙伴们对其中的原理不清楚。大肠菌群的定义是在一定培养条件下能够在发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌，因此大肠菌群是不能形成芽孢的，在VRBA培养基煮沸的过程中，即使有大肠菌群存在也会被杀灭，所以从培养基带入污染的可能性是没有的。当然盛装培养基的容器是需要进行灭菌的，以免容器引入污染。另外，VRBA是一种选择性的培养基，含有的结晶紫对革兰氏阳性菌有比较强的抑制作用而对革兰氏阴性菌几乎没有作用，而且平板培养产生的菌落还需要进行复发酵的验证，因此VRBA培养基就不需要进行灭菌了。但值得注意 的是，VRBA需要现配现用，配制出的培养基应当在3h之内使用完毕。 稀释度的确定 国标中要求选择2-3个适宜的连续稀释度。什么样的稀释度是合适的呢这要根据计数来决定。计数环节要求选择菌落数在15CFU-150CFU的平板进行计数，
粪大肠菌群计数步骤--个人详细介绍
https://www.360docs.net/doc/c16644935.html,/asphtml/GB071.htm https://www.360docs.net/doc/c16644935.html,/ 粪大肠菌群计数步骤GB/T 4789.39-2008 一、设备和材料 除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下： 1 恒温培养箱：36 ℃±1 ℃ 。 2 冰箱：2℃~ 5 ℃ ． 3 恒温水浴箱：44.5 ℃±0.2 ℃ 。 4 天平：感量0.1g 。 5 均质器。 6 振荡器。 7 无菌吸管：1 mL （具0.01 mL 刻度）、10 mL （具0.1 mL 刻度）或微量移液器及吸头。 8 无菌锥形瓶：容量500 mL 。 9 无菌培养皿：直径90 mm 。 10 pH 计或pH 比色管或精密pH 试纸。 二、培养基及试剂 1月桂基硫酸盐胰蛋白胨（lauryl sulfate tryptose , LST ）肉汤 2 EC 肉汤（E.coli broth ) 3 无菌生理盐水：称取8.5g 氯化钠溶于1 000 mL 蒸馏水中，121 ℃ 高压灭菌15 min。 4 4mol/L 氢氧化钠（NaOH ) ：称取40g 氢氧化钠溶于1 000 mL 蒸馏水中 5 1 mol/L 盐酸（HCl ）：移取浓盐酸90 mL ，用蒸馏水稀释至1 000 mL
操作步骤 6.1 样品的稀释 6.1.1 固体和半固体样品：称取25g 样品，置盛有225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内，8000r/min ~10000r/min 均质1 min ~2 min ，制成1：10 样品匀液，或置225 mL 稀释液的无菌均质袋中，用拍打式均质器拍打1 min ~2 min ，制成1 : 10 的样品匀液。 6.1.2 液体样品：以无菌吸管吸取样品25 mL 置盛有225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成1 : 10 的样品匀液。 6.1.3 样品匀液的pH 值应在6.5 ~ 7.5 之间，必要时分别用1 mol/L 氢氧化钠（NaOH ）或1 mol/L 盐酸（HCI ）调节。 6.1.4 用1 mL 无菌吸管或微量移液器吸取1：10 样品匀液1 mL ，沿管壁缓缓注人盛有9 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用1 支1 mL 无菌吸管反复吹打，使其混合均匀，制成1：100 的样品匀液。 6.1.5 根据对样品污染状况的估计，按上述操作，依次制成10 倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释1 次，换用1 支1 mL 无菌吸管或吸头。从制备样品匀液至样品接种完毕，全过程不得超过巧min 。 6.2 初发酵试验 每个样品，选择3 个适宜的连续稀释度的样品匀液（液体样品可以选择原液），每个稀释度接种3 管月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST ）肉汤，每管接种1 mL （如接种量需要超过1 mL ，则用双料LST 肉汤）, 36 ℃±1 ℃ 培养24h±2h ，观察倒管内是否有气泡产生，如未产气则继续培养至48h±2h 。记录在24h 和48h 内产气的LST 肉汤管数。未产气者为粪大肠菌群阴性，产气者则进行复发酵试验。 6.3 复发酵试验 用接种环从所有48h±2h 内发酵产气的LST 肉汤管中分别取培养物1 环，移种于45 ℃ EC肉汤管中。
菌落总数、大肠菌群测定方法
菌落总数和大肠菌群测定（固体样品） 药品： 1、平板计数琼脂 2、月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤（LST） 3、煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLB） 4、氯化钠 设备材料： 烧杯、三角瓶、广口瓶、培养皿、刻度吸管、倒气管、玻璃 棒、试管、硅胶塞、洗耳球、棉花、布或报纸等。 一、准备工作 （指导书是按一个样品所需物品准备的，实验室可按样品量增加） 1、平板计数琼脂培养基准备----用于菌落总数测定 将三角瓶放在电子称上，去皮，按平板计数琼脂使用说明称量，加 200ml蒸馏水搅拌，放电炉上煮沸加热煮沸，充分溶解，盖上硅胶塞，用报纸或布包好，再用橡皮筋扎紧。 2、月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤----用于大肠菌群测定 （a）将烧杯放在电子称上，去皮，按使用说明称量，加100ml蒸馏水搅拌，放电炉上煮沸，充分溶解。 （b）用10ml（毫升）的吸管分装到9支（18*180规格）试管中，每支试管加10ml的月桂基溶液LST （合计90毫升）。 （c）9支试管分别放入倒气管（开口向下），排气，盖上硅胶塞。
3、0.85%的生理盐水----用于样品稀释 将广口瓶去皮，称取氯化钠1.91g加225ml蒸馏水，摇匀，用报纸 或布包好，再用橡皮筋扎紧；同样配制第二瓶。 4、准备2个空试管，盖上硅胶塞----用于样品稀释。 5、准备8个培养皿，用布包扎好。 6、准备至少3支5ml和1支10ml带有刻度的吸管，用布包扎好（顶部可用棉球塞住，防止吸液时，液体不慎吸入洗耳球）。 7、准备操作的工具：剪刀1把、镊子1个、勺子等打开产品包装所需工具，用布包扎好。 二、使用灭菌锅灭菌 1、检查灭菌锅底部加热管水位是否正常，水位要高过加热丝。 2、将上面准备好的7步骤物品逐一放入锅内，注意：滴定管吸口向下，有棉球的向上。 3、盖上火菌锅盖子时，将排气管插到排气口内，注意从对角线开始拧紧螺丝，将排气阀打开（安全阀始终关闭），通电后，待排气阀放气3分钟后（锅内冷空气已经排完），关闭排气阀。 4、查看灭菌锅的压力表，当温度升到121°，压力升到0.1MP（兆帕）时，灭菌维持15分钟后（温度和压力不能过高或者过低），断电自然冷却到接近“ 0”度后，慢慢打开排气阀，再对角拧开灭菌锅。 三、无菌操作 进无菌室前的准备：放好工具（酒精灯，记号笔，消毒用75%酒精棉球，洗耳球，电子称），打开紫外线杀菌灯，杀菌30分钟后关闭，再等
10食品中大肠菌群计数测定的标准操作规程
食品中大肠菌群计数测定的标准操作规 程 1目的 规范食品中大肠菌群计数测定的标准操作规程。 2范围 本标准规定了食品中大肠菌群（Coliforms ）计数的方法。 本标准适用于食品中大肠菌群的计数。 3术语和定义 大肠菌群coliforms 在一定培养条件下能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽胞杆菌。 最可能数most probable number ，MPN 基于泊松分布的一种间接计数方法。 4责任 质量部组织制订、化验室负责实施。 5内容 设备和材料 除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下: 恒温培养箱：36 C± 1 Eo 冰箱：2 E?5 Eo 恒温水浴箱：46 E± 1 Eo 天平：感量g o 均质器。 振荡器。 无菌吸管：1 mL （具mL刻度）、10 mL （具mL刻度）或微量移液器及吸头。 无菌锥形瓶：容量500 mLo
无菌培养皿：直径90 mm
pH 计或 pH 比色管或精密 pH 试纸。 菌落计数器。 培养基和试剂 月桂基硫酸盐胰蛋白胨（Lauryl Sulfate Tryptose , LST ）肉汤：见附录A 中。 煌绿乳糖胆盐（ Brilliant Green Lactose Bile 结晶紫中性红胆盐琼脂（ Violet Red Bile Agar 磷酸盐缓冲液：见附录 A 中。 无菌生理盐水：见附录 A 中。 无菌1 mol/L NaOH :见附录A 中。 无菌1 mol/L HCl ：见附录 A 中。 大肠菌群MPN 计数法 检验程序 大肠菌群MP 计数的检验程序见图1。 图1大肠菌群MPN 计数法检验程序 操作步骤 样品的稀释 固体和半固体样品：称取 25 g 样品,放入盛有225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水 的无菌均质杯内，8000 r/min ?10000 r/min 均质1 min ?2 min,或放入盛有225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打 1 min ?2 min ,制成1:10的样品匀液。 液体样品：以无菌吸管吸取 25 mL 样品置盛有225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水 的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成 1:10 的 样品匀液。 样品匀液的pH 值应在? 之间，必要时分别用1 mol/L NaOH 或1 mol/L HCl 调 节。 用1 mL 无菌吸管或微量移液器吸取1:10样品匀液1 mL ,沿管壁缓缓注入9 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液 面），振摇试管或换用 1 支1 mL 无菌吸管反复吹打，使其混合均匀，制成 1:100 ,BGLB 肉汤：见附录A 中。 ,VRBA :见附录A 中。
大肠菌群测定方法
大肠菌群及检验 一、大肠菌群介绍 大肠菌群并非细菌学分类命名，而是卫生细菌领域的用语，它不代表某一个或某一属细菌，而指的是具有某些特性的一组与粪便污染有关的细菌，这些细菌在生化及血清学方面并非完全一致，其定义为：需氧及兼性厌氧、在37℃能分解乳糖产酸产气的革兰氏阴性无芽胞杆菌。一般认为该菌群细菌可包括大肠埃希氏菌、柠檬酸杆菌、产气克雷白氏菌和阴沟肠杆菌等。大肠菌群分布较广，在温血动物粪便和自然界广泛存在。调查研究表明，大肠菌群细菌多存在于温血动物粪便、人类经常活动的场所以及有粪便污染的地方，人、畜粪便对外界环境的污染是大肠菌群在自然界存在的主要原因。粪便中多以典型大肠杆菌为主，而外界环境中则以大肠菌群其他型别较多。大肠菌群是作为粪便污染指标菌提出来的，主要是以该菌群的检出情况来表示食品中有否粪便污染。大肠菌群数的高低，表明了粪便污染的程度，也反映了对人体健康危害性的大小。粪便是人类肠道排泄物，其中有健康人粪便，也有肠道患者或带菌者的粪便，所以粪便内除一般正常细菌外，同时也会有一些肠道致病菌存在（如沙门氏菌、志贺氏菌等），因而食品中有粪便污染，则可以推测该食品中存在着肠道致病菌污染的可能性，潜伏着食物中毒和流行病的威胁，必须看作对人体健康具有潜在的危险性。大肠菌群是评价食品卫生质量的重要指标之一，目前已被国内外广泛应用于食品卫生工
作中。 二、大肠菌群检验方法：由于大肠菌群指的是具有某些特性的一组与粪便污染有关的细菌，即：需氧及兼性厌氧、在37℃能分解乳糖产酸产气的革兰氏阴性无芽胞杆菌。因此大肠菌群的检测一般都是按照它的定义进行。目前国内采用的进出口食品大肠菌群检测方法主要有国家标准和原国家商检局制订的行业标准。两个标准方法在检测程序上略有不同。 （一）国家标准：国家标准采用三步法，即：乳糖发酵试验、分离培养和证实试验。乳糖发酵试验：样品稀释后，选择三个稀释度，每个稀释度接种三管乳糖胆盐发酵管。36±1℃培养48±2h，观察是否产气。分离培养：将产气发酵管培养物转种于伊红美蓝琼脂平板上，36±1℃培养18-24h，观察菌落形态。证实试验：挑取平板上的可疑菌落，进行革兰氏染色观察。同时接种乳糖发酵管36±1℃培养24±2h，观察产气情况。报告：根据证实为大肠杆菌阳性的管数，查MPN表，报告每100ml（g）大肠菌群的MPN值。 具体操作参见GB4789.3-94 《中华人民共和国国家标准食品卫生微生物学检验大肠菌群测定》 （二）原国家商检局制订的行业标准，等效采用美国FDA的标准方法，用于对出口食品中的大肠杆菌进行检测。本方法采用两步法：推测试验：样品稀释后，选择三个稀释度，每个稀释度接种三管LST肉汤。36±1℃培养48±2h，观察是否产气。证
大肠菌群的计数实验
大肠菌群计数实验 MPN计数法 一、设备和材料 250ML锥形瓶3个 100ML烧杯1个 250ML量筒1个 1000ML烧杯1个 15*150mm试管3个 1ML刻度吸管4个 18*180mm试管20个杜氏小管 玻璃棒1个接种环1个 剪刀1把药匙2个 均质器天平（感量0.1g） 电炉洗耳球 二、实验准备 1、配制培养基： LST培养基的配制： 用天平称取17.8gLST培养基于锥形瓶中 加入500ML蒸馏水 加热煮沸至完全溶解 分装于装有杜氏小管的大试管中，每管10ML，共10管高温灭菌备用 BGLB培养基的配制： 用天平称取20gBGLB培养基于锥形瓶中 加入500ML蒸馏水
加热煮沸至完全溶解 分装于装有杜氏小管的大试管中，每管10ML，高温灭菌备用 2、生理盐水 取4.25g氯化钠于大烧杯中 加入500ML蒸馏水溶解 取225ML生理盐水于锥形瓶中 分别取9ML生理盐水于3只小试管中 将分装好的生理盐水进行高温灭菌 3、灭菌：将均质杯、100ML烧杯、刻度吸管、剪刀、接种环、洗耳球高温灭菌备用 三、取样 在提交的产品中随机抽取三箱，从每箱中随机抽取未打开包装的产品1袋~3袋，抽取不低于250g的样品作为微生物指标检验试样。 四、检验程序
五、操作步骤 初发酵试验 1、称取25g 样品，放人盛有225m生理盐水的无菌均质杯内，8 00or/min-10 000r/min 均质1 min-2 min ，制成1:10 的样品匀液。 2、用1ml无菌吸管吸取1:10 样品匀液1ml，沿管壁缓缓注人9ml生理盐水的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管，使其混合均匀，制成1:100 的样品匀液。 3、换一只新的1ml无菌吸管吸取1:100样品匀液1ml，沿管壁缓缓注人9ml生理盐水的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管，使其混合均匀，制成1:1000 的样品匀液。 4、将三个连续稀释梯度的样品原液在进行10倍递增稀释时，吸取1 ml样品匀液于LST肉汤，每个稀释度接种三管。 5、同时做一组空白，在一支LST肉汤中接种1ml生理盐水。 6、 36℃±1℃培养24h±2h ，观察倒管内是否有气泡产生，如未产气则继续培养至48h±2h 。记录在24h 和48h 内产气的LST 肉汤
食品安全国家标准 大肠菌群计数
食品安全国家标准 食品微生物学检验大肠菌群计数 1范围 本标准规定了食品中大肠菌群（Coliforms）计数的方法。 本标准适用于食品中大肠菌群的计数。 2术语和定义 2.1 大肠菌群coliforms 在一定培养条件下能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽胞杆菌。 2.2 最可能数most probable number，MPN 基于泊松分布的一种间接计数方法。 3检验原理 3.1 MPN法 MPN法是统计学和微生物学结合的一种定量检测法。待测样品经系列稀释并培养后，根据其未生长的最低稀释度与生长的最高稀释度，应用统计学概率论推算出待测样品中大肠菌群的最大可能数。 3.2 平板计数法 大肠菌群在固体培养基中发酵乳糖产酸，在指示剂的作用下形成可计数的红色或紫色，带有或不带有沉淀环的菌落。 4 设备和材料 除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下： 4.1 恒温培养箱：36 ℃±1 ℃。 4.2 冰箱：2 ℃～5 ℃。 4.3 恒温水浴箱：46℃±1℃。 4.4 天平：感量0.1 g。 4.5 均质器。 4.6 振荡器。 4.7 无菌吸管：1 mL（具0.01 mL 刻度）、10 mL（具0.1 mL 刻度）或微量移液器及吸头。
4.8 无菌锥形瓶：容量500 mL。 4.9 无菌培养皿：直径90 mm。 4.10 pH 计或pH 比色管或精密pH 试纸。 4.11 菌落计数器。 5 培养基和试剂 5.1 月桂基硫酸盐胰蛋白胨（Lauryl Sulfate Tryptose，LST）肉汤：见附录A 中A.1。 5.2 煌绿乳糖胆盐（Brilliant Green Lactose Bile，BGLB）肉汤：见附录A 中A.2。 5.3 结晶紫中性红胆盐琼脂（Violet Red Bile Agar，VRBA）：见附录A 中A.3。 5.4 磷酸盐缓冲液：见附录A 中A.4。 5.5 无菌生理盐水：见附录A 中A.5。 5.6 无菌1 mol/L NaOH：见附录A 中A.6。 5.7 无菌1 mol/L HCl：见附录A 中A.7。
实验一 食品中大肠菌群的测定教学提纲
实验一食品中大肠菌群的测定
大肠菌群(M.R.N.)的测定 一、实验目的： （1）了解大肠菌群在食品卫生检验中的意义 （2）学习并掌握大肠菌群的检验原理和方法，以判别食品的卫生质量 二、实验原理： 大肠菌群系指一群能在37℃经24h能发酵乳糖，产酸产气，需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。该菌主要来源于人畜粪便，故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量，具有广泛的卫生学意义。它反映了食品是否被粪便污染，同时间接地指出食品是否有肠道致病菌污染的可能性。 食品中大肠菌群数系以每100g（或ml）检样内大肠菌群最近似数（the mo st probable number-简称MPN）表示。最近似数（most probable number-简称M PN）法是一种将样品“多次（管）稀释至无菌”的计数方法。将3个稀释梯度的检样稀释液接种于9支或15支试管培养基中，每个稀释度接种3支或5支。经培养后，根据结果查阅MPN检索表，就可得到原样品中微生物的估计数量。M PN测定方法尤其适用于带菌量极少、其他方法不能检测的食品。如水、乳制品及其他食品中大肠菌群的计数。 三、材料 1、样品 乳、肉、禽蛋制品、饮料、糕点、发酵调味品或其他食品。 2、菌种 大肠埃希氏菌（Escherichia coli） 产气肠杆菌（Enterobacteria aerogenes）
3、培养基及试剂 单料乳糖胆盐发酵管、双料乳糖胆盐发酵管、乳糖胆盐发酵管、伊红美蓝琼脂（EMB）、革兰氏染色液、蛋白陈水、靛基质试剂、麦康凯(MA) 4、其它设备和材料 温箱(36土1)℃、水浴锅(44土0.5)℃、天平、显微镜、均质器或乳钵、温度计、平皿、试管、发酵管、吸管、载玻片、接种针。 四、实验步骤 (一)检验程序 大肠菌群检验程序见图 (二)操作步骤
总大肠菌群数量测定
总大肠菌群 在饮用水的微生物安全监测中，普遍采用正常的肠道细菌作为粪便污染指标，而不是直接测定肠道致病菌。 总大肠菌群系指一群需氧及兼性厌氧的，在37℃生长时能使乳糖发酵，在24h内产酸产气的革氏阴性无芽胞杆菌。总大肠菌群系指每升水样中所含有的总大肠菌群的数目。 总大肠菌群可用多管发酵法或滤膜法检验。 一多管发酵法 1应用范围 1.1本法适用于饮用水、水源水，特别是浑浊度含量高的水质中总大肠菌群的测定。 1.2水样中总大肠菌群数的含量，表明水被粪便污染程度，而且间接地表明有肠道致病菌存在。 2原理 根据总大肠菌群应具有的生物特性， 产气，能在选择性培养基上产生典型菌落。 3仪器 3.1显微镜 3.2革兰氏染色用有关器材。 3.3高压蒸汽灭菌器。 3.4干热灭菌箱。 3.5恒温箱。
3.6冰箱。 3.7放大镜。 3.8试管、平皿（直径 4培养基 4.1乳糖蛋白胨培养液 4.1.1成分 蛋白胨10g 牛肉膏3g 乳糖5g 氯化钠5g 1.6%溴甲酚紫乙醇溶液 蒸馏水1000ml 4.1.2制法 将蛋白胨、牛肉膏、 1.6%溴甲酚紫乙醇溶液， 灭菌20min，贮存于冷暗处备用。 4.2三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液 按上述乳糖蛋白胨培养液浓缩三倍配制。4.3品红亚硫酸钠培养基（供多管发酵法用）4.3.1成分 蛋白胨10g
乳糖10g 磷酸氢二钾3.5g 琼脂15~30g 蒸馏水1000ml 无水亚硫酸钠5g左右 5%碱性品红乙醇溶液 4.3.2储备培养基的制备如革兰氏阴性无芽胞杆菌， 9cm）、刻度吸管等，置于干热灭菌箱中 1ml 1000ml蒸馏水中加热溶解， 充分混匀，分装于装有倒管的试管中，在37℃24h内能发酵乳糖并产酸160℃灭菌2h 调整pH为7.2~7.4，再加入1ml置高压蒸汽灭菌器中，以115℃乳糖及氯化钠置于 20ml 先将琼脂加至900蒸馏水中，加热溶解，然后加入磷酸氢二钾及蛋白胨，混匀使之溶解，再以蒸馏水补足至1000ml，调整PH值为7.2~7.4，趁热用脱脂棉或绒布过滤，再加入乳糖，混匀后定量分装于烧瓶内，置高压蒸汽灭菌中以115℃灭菌20min，贮存于冷暗处备用。 4.3.3平皿培养基的配制 将上法制备的储备培养基加热融化，根据烧瓶内培养基的容量，用灭菌吸管按比例吸取一定量的5%碱性品红乙醇溶液，置于灭菌空试管中。再按比例称取所需的无水亚硫酸钠置于另一个灭菌空试管内，加灭菌水少许使其溶解后，置于沸水浴中煮沸10min以灭菌。
大肠菌群检测方法
大肠菌群检测方法 进入无菌室步骤 1．进入无菌室前应打开紫光灯进行灭菌，时间为0。5—1小时。 2．关灯后0?5小时后放可进入。 3．进入更衣间更换衣服，佩带口罩、帽子、鞋套 实验步骤 1，进入无菌室后，先把酒精灯点燃，然后在用酒精棉进行手部消毒。（酒精棉是用75%的酒精加入脱脂棉中制成） 2，准备双料管3根，单料管6根，培养皿7个。 3，直接从原液中吸取10ml放入双料管，（3根每根各10ml） 4，再吸取原液1ml放入单料管中（3根每根各1ml） 5，再吸取原液1ml放入培养皿中（2个培养皿各1ml） 6，再吸取原液1ml放入盐水管中制成－1梯度的样液 7，更换一根吸管，从－1梯度的样液吸取1ml样液放入单料管中（3根每根各1ml） 8，再吸取－1梯度样液1ml放入培养皿中（2个培养皿各1ml） 9，再把每个培养皿中到入营养琼脂平铺底部摇允（注另作3个培养皿：空气空白，把培养皿打开十分钟倒入营养琼脂平铺底部摇匀。琼脂空白，把培养皿中倒入营养琼脂平铺底部摇匀。盐水空白，吸1ml生理盐水放入培养皿中，倒入营养琼脂平铺底部摇匀。） 10，把全部作好的放入培养箱中，温度36C＋－1×C，大肠24H＋－2H，菌落48H＋－2H，（待培养皿中的琼脂凝固后反转过来放入培养箱中） 11，梯度：－1梯度为1ml原液加入9ml生理盐水配成 －2梯度为1ml－1梯度样液加入9ml生理盐水配成 －3梯度－4梯度配制方法和－1、－2梯度的配制方法一样 12，如果大肠初发酵产生气泡，用接种笔沾一个产气的液在伊红美兰平板上画之字形然后放入培养箱中36C，24H＋－2H 。（接种笔在每次使用前必须在酒精灯上消毒。所画之形不能划破伊红美兰琼脂表面） 13，取出后在用接种笔在伊红美兰平板之字形上挑菌，放入乳糖复发酵管中，然后再培养36C＋－1C，24H＋＋－2H。 14，再在伊红美兰平板之字形上挑菌，放到载玻片上作镜检。（方法见标准） 15，只有镜检成紫红色和乳糖复发酵管产气同时成立的情况下，才能断定这根管是不合格。16，清洗消毒这根试管前必须进行消毒霉菌，121C，0。5小时同时不能放气。
大肠菌群检验操作规程
大肠菌群计数检验操作规程 一、目的 建立大肠菌群计数检验的标准操作程序，使操作过程规范化。 二、适用范围 适用于大肠菌群计数的检验操作。 三、职责 1.检验人员 严格按检验操作规程进行检验。 2.QC主管 监督检查执行情况。 四、程序 1.范围 本方法适用于大肠菌群计数（coliforms）的测定 2.术语和定义 2.1 大肠菌群：在一定培养条件下能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性 无芽胞杆菌。 3. 设备和材料 除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下： 3.1 恒温培养箱：36℃±1℃，30℃±1℃。 3.2冰箱：2℃～5℃。 3.3 恒温水浴箱：46℃±1℃。 3.4天平：感量为0.1 g。 3.5均质器。 3.6振荡器。 3.7无菌吸管：1 mL（具0.01 mL 刻度）、10 mL（具0.1 mL 刻度）或微量移液器及吸
头。 3.8 无菌锥形瓶：容量500 mL。 3.9无菌培养皿：直径90 mm。 3.10 pH计或pH比色管或精密pH试纸。 3.11菌落计数器。 4.培养基和试剂 4.1 月桂基硫酸盐胰蛋白胨（Lauryl Sulfate Tryptose，LST）肉汤：见附录A中A.1。 4.2 煌绿乳糖胆盐（Brilliant Green Lactose Bile，BGLB）肉汤：见附录A中A.2 4.3磷酸盐缓冲液：见附录 A中 A.3。 4.4无菌生理盐水：见附录 A中 A.4。 4.5无菌 1 mol/L NaOH：见附录 A中 A.5。 4.6无菌 1 mol/L HCl：见附录 A中 A.6。
5.检验程序 大肠菌群MPN计数的检验程序见图1。 图1大肠菌群MPN计数法检验程序 6.操作步骤 6.1 样品的稀释 6.1.1 固体和半固体样品：称取25 g 样品置盛有225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内，8000 r/min～10000 r/min 均质 1 min～2 min，或放入盛有225 mL 稀释液的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打 1 min～2 min，制成1:10 的样品匀液。 6.1.2 液体样品：以无菌吸管吸取25 mL 样品置盛有225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成1:10 的样品匀液。 6.1.3样品匀液的pH值应在6.5～ 7.5 之间，必要时分别用1 mol/L NaOH或1 mol/L HCl 调
大肠杆菌实验报告
大肠杆菌紫外线诱变及抗药性菌株筛选 0740063 阿噟兰 1.前言 抗生素能破坏细菌细胞壁的结构，使细菌的繁殖和生长受到抑制。但某些细菌对抗生素表现出抗性，原因是其基因发生了改变，产生能抵抗抗生素的性状。在自然情况下，细菌的基因突变率很低，而且突变是不定向的，因此在自然条件下，想要获得有抗性的细菌是很困难的。当给与适当的物理条件时，其突变率会大大增加。如当用α射线、β射线、γ射线、Χ射线、中子和其他粒子、紫外线、微波等物理因素辐射时，能够促进遗传物质突变。DNA 对紫外线（UV）有强烈的吸收作用，尤其是碱基中的嘧啶，它比嘌呤更为敏感。紫外线引起DNA 结构变化的形式有DNA 链断裂、碱基破坏、胸腺嘧啶二聚体等。因此，紫外线通常作为诱变剂，用于微生物菌种选育。一般细胞分裂越旺盛，诱变剂量越大，突变率高，诱变最有效的波长253~265 nm。选择合适的诱变剂量对于获得较高突变率十分关键，过高或过低的辐射剂量会导致菌株死亡或诱变不充分而降低诱变效果。 在紫外线诱变下，菌株发生不定向的突变，想要得到需要的特向变异必须对诱变后的菌株做筛选。本实验想要得到的是能够抵抗抗生素的菌株，因此可以用抗生素培养基作为筛选培养基对菌种进行筛选。若菌株没有发生定向突变，则该菌株不能在抗性培养基上正常生长，只有发生了定向突变才可能在筛选培养基上正常生长。 紫外线对于菌株有诱变作用外，对菌株还有较强的致死作用，因为紫外线改变了菌株的基因结构导致菌株无法正常生长繁殖。 因此，通过本实验的操作，在合适的照射剂量的设置下，比较不同不同照射剂量下的致死效果和突变率，并初步分析两者的相关性。在分析死亡曲线和诱变率曲线的基础上，能了解诱变育种的机理和方法，为做进一步的诱变实验做准备。 2.材料和方法 实验材料、仪器和试剂 菌种：大肠杆菌 仪器：超净台、离心机、高压灭菌锅、培养箱、磁力搅拌器、培养皿、涂布器、移液管、移液器 试剂：牛肉膏蛋白胨培养基相关试剂、硫酸卡那霉素水溶液（50mg/ml）、生理盐水 实验方法 2.2.1制备培养基 普通培养基——牛肉膏蛋白胨培养基（400ml）： 牛肉膏5g 蛋白胨10g Nacl 5g 琼脂20g 蒸馏水1000ml 按配方配制好培养基后置于灭菌锅中115℃15min，倒平板，4皿*15ml*5组+2皿*15ml=22皿*15ml=330ml 筛选培养基(200ml)：含抗生素50mg/L。（卡那霉素属于氨基糖苷类抗生素，能结合细菌核糖体的30S亚基上的16SrRNA，阻断细菌蛋白质的合成。） 牛肉膏5g 蛋白胨10g Nacl 5g 琼脂20g 蒸馏水1000ml 硫酸卡那霉素水溶液（50mg/ml），按配方先不要加硫酸卡那霉素配制然后115℃15min灭菌，取出培养基后冷却至60℃时将硫酸卡那霉素加入培养基中，充分震荡混匀，倒平板，2皿*15ml*5组+2皿*15ml=12皿*15ml=180ml 2.2.2制备菌悬液（106 ~ 108个/mL） ①固体培养：大肠杆菌划线或涂布接种于固体培养基，37℃培养24-48h。 ②菌悬液：用适量生理盐水刮洗菌落，倒入一个无菌小三角瓶（或试管）中，充分振荡使菌
食品中大肠菌群计数测定的标准操作规程
规范食品中大肠菌群计数测定的标准操作规程。 2范围 本标准规定了食品中大肠菌群（Coliforms）计数的方法。 本标准适用于食品中大肠菌群的计数。 3术语和定义 大肠菌群coliforms 在一定培养条件下能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽胞杆菌。 最可能数most probable number，MPN 基于泊松分布的一种间接计数方法。 4责任 质量部组织制订、化验室负责实施。 5内容 设备和材料 除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下： 恒温培养箱：36 ℃±1 ℃。 冰箱：2 ℃～5 ℃。 恒温水浴箱：46 ℃±1 ℃。 天平：感量 g。 均质器。 振荡器。 无菌吸管：1 mL（具 mL 刻度）、10 mL（具 mL 刻度）或微量移液器及吸头。无菌锥形瓶：容量500 mL。 无菌培养皿：直径90 mm。
pH 计或pH 比色管或精密pH 试纸。 菌落计数器。 培养基和试剂 月桂基硫酸盐胰蛋白胨（Lauryl Sulfate Tryptose，LST）肉汤：见附录A 中。煌绿乳糖胆盐（Brilliant Green Lactose Bile，BGLB）肉汤：见附录A 中。结晶紫中性红胆盐琼脂（Violet Red Bile Agar，VRBA）：见附录A 中。 磷酸盐缓冲液：见附录A 中。 无菌生理盐水：见附录A 中。 无菌1 mol/L NaOH：见附录A 中。 无菌1 mol/L HCl：见附录A 中。 大肠菌群MPN 计数法 检验程序
大肠菌群MPN计数的检验程序见图1。 图1 大肠菌群MPN 计数法检验程序 操作步骤 样品的稀释 .1 固体和半固体样品：称取25 g 样品,放入盛有225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内,8000 r/min～10000 r/min 均质1 min～2 min,或放入盛有225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1 min～2
食品中大肠菌群的测定(附MPN检索表)
实验六食品中大肠菌群的测定 一、概述 (一)大肠菌群的定义及范围 根据国家1994年颁布的食品卫生检验方法微生物学部分，大肠菌群(coliform bacteria)系指一群在37℃、24h能发酵乳糖，产酸、产气，需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。 大肠菌群主要是由肠杆菌科中四个菌属内的一些细菌所组成，即艾希氏菌届、拘橼酸杆菌属、克雷伯氏菌属及肠杆菌属，其生化特性分类见表5-4。 表5-4 大肠菌群生化特性分类表 由上表可以看出，大肠菌群中大肠艾希氏菌I型和Ⅲ型的特点是，对靛基质、甲基红、v-P和拘橼酸盐利用四个生化反应分别为“十十一一”，通常称为典型大肠杆菌；而其他类大肠杆菌则披称为非典型大肠杆菌。 (二)大肠菌群的测定意义 1、粪便污染的指标细菌 早在1892年，沙尔丁格(Schardinger)氏首先提出大肠杆菌作为水源中病原菌污染的指标菌的意见，因为大肠杆菌是存在于人和动物的肠道内的常见细菌。一年后，塞乌博耳德“斯密斯(Theobold．Smith)氏指出，大肠杆菌因普遍存在于肠道内，若在肠道以外的环境中发现，就可以认为这是由于人或动物的粪便污染造成的；从此，就开始应用大肠杆菌作为水源中粪便污染的指标菌。 据研究发现，成人粪便中的大肠菌群的含量为：108个／g一109个／g。若水中或食品中发现有大肠菌群，即可证实已被粪便污染，有粪便污染也就有可能有肠道病原菌存在。根据这个理由，就可以认为这种含有大肠菌群的水或食品供食用是不安全的。所以目前为评定
食品的卫生质量而进行检验时，也都采用大肠菌群或大肠杆菌作为粪便污染的指标细菌。当然，有粪便污染，不一定就有肠道病原菌存在，但即使无病原菌，只要被粪便污染的水或食品，也是不卫生的，不受人喜欢的。 2．粪便污染指标菌的选择 作为理想的粪便污染的指标菌应具备以下几个特性，才能起到比较正确的指标作用。 ①存在于肠道内持有的细菌，才能显示出指标的特异性。 ⑧在肠道内占有极高的数量，即使被高度稀释后，也能被检出。 ⑧在肠道以外的环境中，其抵抗力大于肠道致病菌或相似，进入水中不再繁殖。 ④检验方法简便，易于检出和计数。 在食品卫生微生物检验中，可作为粪便污染指标菌依据的上述条件，粪便中数量最多的是大肠菌群，而且大肠菌群随粪便排出体外后，其存活时间与肠道主要致病菌大致相似，在检验方法上，也以大肠菌群的检验计数简便易行。因此，我国选用大肠菌群作为粪便污染指标菌是比较适宜的。 另外，作为粪便污染的指标细菌还有：分叉杆菌(Bifidobacterium)、拟杆菌(Bacteroides)、乳酸菌、肠杆菌科中的梭状芽胞和底群链球菌等，据报道，拟杆菌是人体肠道内第二个较大的菌群；厌气性乳酸菌占人体肠道内细菌组分的50％以上，一般粪便中该菌量为109个／g —1010个／g。肠道内属于肠杆菌科的细菌，除上述的细菌外，还有克雷伯氏菌属(Klebsiella)、变形杆菌和副大肠杆菌等，也可以充当粪便污染指标菌。很多研究者认为，在冷踪食品或冷冻状态照射处理过的食品中，大肠杆菌可比其他多种病原菌容易死亡，因此，像这类食品，用大肠菌群作为指标菌就不够理想，而底群链球菌对低温抵抗力强，作为这类食品的粪便污染指标菌就比较适宜。上述的这些肠道内的其他细菌，虽与粪便有关，因均比不上大肠菌群所具备的指标特异性，所以目前还没有列入作为公认的粪便污染的指标细菌。 当然，大肠菌群作为粪便污染指标菌也有一些不足之处： ①饮用水中含有较少量大肠菌群的情况下，有时仍能引起肠道传染病的流行。 ⑧大肠菌群在一定条件下能在水中生长繁殖。 ②在外界环境中，有的沙门氏菌比大肠菌群更有耐受力。 3．大肠菌群作为粪便污染指标菌的意义 粪便污染的食品，往往是肠道传染病发生的主要原因，因此检查食品中有无肠道菌，这对控制肠道传染病的发生和流行，具有十分重要的意义。 许多研究者的调查证明，人、畜粪便对外界环境的污染是大肠菌群在自然界存在的主
食品中大肠菌群的测定附mpn检索表)
实验六食品中大肠菌群的测定一、概述 (一)大肠菌群的定义及范围 根据国家1994年颁布的食品卫生检验方法微生物学部分，大肠菌群(coliform bacteria)系指一群在37℃、24h能发酵乳糖，产酸、产气，需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。 大肠菌群主要是由肠杆菌科中四个菌属内的一些细菌所组成，即艾希氏菌届、拘橼酸杆菌属、克雷伯氏菌属及肠杆菌属，其生化特性分类见表5-4。 表5-4 大肠菌群生化特性分类表
注：+，表示阳性；—，表示阴性；+/-，表示多数阳性，少数阴性。 由上表可以看出，大肠菌群中大肠艾希氏菌I型和Ⅲ型的特点是，对靛基质、甲基红、v-P和拘橼酸盐利用四个生化反应分别为“十十一一”，通常称为典型大肠杆菌；而其他类大肠杆菌则披称为非典型大肠杆菌。 (二)大肠菌群的测定意义 1、粪便污染的指标细菌 早在1892年，沙尔丁格(Schardinger)氏首先提出大肠杆菌作为水源中病原菌污染的指标菌的意见，因为大肠杆菌是存在于人和动物的肠道内的常见细菌。一年后，塞乌博耳德“斯密斯(Theobold．Smith)氏指出，大肠杆菌因普遍存在于肠道内，若在肠道以外的环境中发现，就可以认为这是由于人或动物的粪便污染造成的；从此，就开始应用大肠杆菌作为水源中粪便污染的指标菌。 据研究发现，成人粪便中的大肠菌群的含量为：108个／g一109个／g。若水中或食品中发现有大肠菌群，即可证实已被粪便污染，有粪便污染也就有可能有肠道病原菌存在。根据这个理由，就可以认为这种含有大肠菌群的水或食品供食用是不安全的。所以目前为评定食品的卫生质量而进行检验时，也都采用大肠菌群或大肠杆菌作为粪便污染的指标细菌。当然，有粪便污染，不一定就有肠道病原菌存在，但即使无病原菌，只要被粪便污染的水或食品，也是不卫生的，不受人喜欢的。 2．粪便污染指标菌的选择 作为理想的粪便污染的指标菌应具备以下几个特性，才能起到比较正确
KJWI-QA-27 大肠菌群计数方法作业指导书
食品有限公司版本:A/1 日期:2012-05-25页数: Page 1 of 12标题：大肠菌群计数方法 文件修改记录 版本修订 次数 修订日期修订内容 0 0 2011-02-14 A 1 2012-05-25 修订
食品有限公司版本:A/1 日期:2012-05-25页数: Page 1 of 12标题：大肠菌群计数方法 分发号 : ______(仅适用于控制文件) (仅盖有红色印章的文件才有效) 1.0目的 规定大肠杆菌计数的方法。 2.0适用范围 适用于加多宝凉茶、浓缩汁、工艺水等产品或原辅材料中的大肠杆菌群的计数。 3.0术语 3.1大肠菌群：一群在36℃条件下培养48h能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧格 兰仕隐形无芽孢杆菌。 3.2MPN最可能数（most probable number）：基于泊松分布的一种间接计数方法。 4.0职责 4.1质检部：负责按此方法对加多宝来凉茶、浓缩汁、工艺水等产品或原辅材料中大肠 菌群进行计数。 5.0流程图 见附录A、附录B。 6.0内容及要求 6.1设备和材料 除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其它设备和材料如下： 6.1.1恒温培养箱：36℃±1℃ 6.1.2冰箱：2℃-5℃ 6.1.3恒温水浴箱：46℃±1℃ 6.1.4天平：感量0.1g 6.1.5振荡器 6.1.6无菌吸管：1ml（具0.01刻度）、10ml（具0.1刻度）或微量移液器及吸 头。 6.1.7无菌锥形瓶：容量500ml 6.1.8无菌试管：18×200ml
食品有限公司版本:A/1 日期:2012-05-25页数: Page 1 of 12标题：大肠菌群计数方法 6.1.9小导管 6.1.10无菌培养皿：直径90mm 6.1.11菌落计数器 6.2培养基和试剂 6.2.1月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤 6.2.2煌绿乳糖胆盐（BGLG）肉汤 6.2.3乳糖胆盐发酵培养基（LBB） 6.2.4乳糖蛋白胨培养基（LPB） 6.2.5伊红美蓝琼脂培养基（EMB） 6.2.6结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA） 6.2.775%乙醇溶液 6.2.8无菌生理盐水：称取8.5g氯化钠溶于1000ml蒸馏水中，121℃高压灭菌 15min 6.3大肠菌群MPN计数法 6.3.1加多宝凉茶、浓缩汁等产品及原辅材料中大肠菌群的测定 6.3.1.1样品稀释 a、固体和半固体样品：称取25g样品置于盛有225ml无菌生理盐水的无菌均质 袋中，用拍击式均质器拍打1-2min，制成1：10的样品匀液。 b、液体样品：以无菌吸管吸取25ml样品置于盛有225ml的无菌生理盐水的无 菌锥形瓶中，充分混匀，制成1：10的样品匀液。 c、用1ml无菌吸管吸取1：10样品匀液1ml，沿管壁缓慢注入盛有9ml无菌生 理盐水的试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管，制 成1：100的样品匀液。 d、根据对样品污染状况的分析，按上述操作，依次制成10倍递增系列稀释样 品匀液。注意每递增稀释依次，换用一次1ml灭菌吸管。从制备样品匀液至 样品接种完毕，全过程不得超过15min 6.3.1.2初发酵试验 a、每个样品，选择3个适宜的连续稀释度的样品匀液（液体样品可以选择原 液），每个稀释度接种3管月桂基硫酸胰蛋白胨（LST）肉汤，每管接种1ml （如果接种量超过1ml，则用双料LST肉汤）。
大肠杆菌和大肠菌群计数方法
大肠杆菌和大肠菌群计数方法 Enumeration of Escherichia coli and the coliform 章节内容： ?传统检测大肠菌群和大肠杆菌的方法 ?LST-MUG法检测冷藏和冷冻食品中的大肠杆菌 （除双壳类软体动物制品外） ?瓶装水检测方法 ?贝类和贝类肉制品检测方法 ?柑桔类水果汁中大肠杆菌检测方法 ?大肠菌群和大肠杆菌计数的其他方法 ?参考文件 大肠埃希氏菌，以前常称大肠杆菌，于1885年由德国儿科医生Theodor Escherich 发现，广泛存在于人类和温血动物的肠道中，是人类和动物肠道中需氧性共生菌的优势菌群，维持宿主健康部分生理功能必需的肠道菌。 大肠埃希氏菌属肠杆菌科，肠杆菌科包括许多种细菌，致病菌有沙门氏菌、志贺氏菌、和耶尔森氏菌。虽然大多数的大肠埃希氏菌为非致病菌，但是当宿主免疫力降低或细菌侵入肠道的外组织或器官时，可引起肠外感染。某些血清型可产生毒素，为致病性大肠埃希氏菌，可引起人类腹泻。 1892年，Shardinger建议把大肠杆菌作为粪便污染的指标。由于大肠杆菌广泛存在于人类和动物中，而在其他地方少见。再者，大肠杆菌能发酵葡萄糖（以后改为为乳糖）产生气体。与已知的非产气致病菌容易区别开来。 因此，大肠杆菌的检测已成为水和食品的近期粪便污染指标，表明可能含有致病菌。肠道中柠檬酸盐菌，克雷伯氏菌和肠杆菌能发酵乳糖，与大肠杆菌的生物型非常相似，使得把大肠杆菌作为健康威胁的指标，在实际应用中很复杂。于是，大肠菌群这个术语用来描述这类肠道菌，大肠菌群不是一个分类学上的定义，而是一个工作定义，指的是一群在35℃培养48h，产酸产气的，革兰氏阴性的芽孢杆菌。1914年，每国公共健康协会把大肠菌群作为一个重要的卫生标准。 虽然大肠菌群很容易检测到，但不一定与粪便污染有关系，因为在自然环境样品中也常存在。于是，粪大肠菌群就作为粪便污染的指标。首先由Eijkman提出，指的是在高温下发酵乳糖，是总大肠菌群的亚群，同时也称为耐热大肠菌群。粪大肠菌群的检测，除水、贝类、贝类养殖水在44.5℃进行，其他所有食品都在45.5℃进行。粪大肠菌群包含绝大部执蟪Ω司? 克雷伯氏菌也作为粪大肠菌群,但克雷伯氏菌的检出被认为与粪便污染并无关系。因此,大肠杆菌又被作为一个重要指标。快速鉴定大肠杆菌的新方法采用，使检测大肠杆菌相对容易了。