de novo测序
关于De novo测序
新一代测序技术相对于传统的Sanger测序有什么优势？
答：Sanger测序法用了十三年才完成了第一个人类基因组图谱，而如今利用新一代测序技术平台则只需要几个月就可以完成。新一代测序技术平台利用大量并行处理的能力读取多个短DNA片段，然后拼接成较长的contig和scaffold，技术更加先进，具有高准确性、高通量、高灵敏度和低运行成本等突出优势。
从头拼接中，contig、scaffold、N50等代表什么？
Read：一次测序中仪器读取的核苷酸长度
Contig：通过重叠部分将相邻reads组装形成的单元称为contig。
Scaffold：利用双端测序等其他方法的信息，定位contigs在染色体上的线性排列或相对位置关系，并连接起来形成较长的scaffold序列。
N50：把contig或scaffold从大到小排序，并对其长度进行累加，当累加长度达到基因组序列长度一半时，最后一个contig或scaffold长度。
何为从头测序中的框架图，精细图，完成图？
答：框架图是指经生物信息学分析后，拼接得到的基因组覆盖度大于95%，基因区覆盖度达到98%以上，contig N50达到5Kb，scaffold N50达到20Kb，单碱基错误率在十万分之一以下。
精细图是指经生物信息学分析后，拼接得到的基因组覆盖度大于98%，基因区覆盖度达到99%以上，contig N50达到20Kb，scaffold N50达到300Kb，单碱基错误率低于十万分之一，gap
数不超过100个。
完成图是指经生物信息学分析后，拼接得到完整的基因组序列，单碱基错误率低于十万分之一。
De Novo测序应该是选择454还是solexa？
(1) 两种测序方法都可以完成基因组的De Novo拼接，建议使用两种测序方式，结果组合拼接，
可以重复利用两种技术的优势。
(2) 需要根据基因组的情况，如果杂合度偏高，重复序列偏多，建议增加454测序的比例。
(3) 如果基因组相对简单，从成本考虑建议增加Solexa测序比例。
(4) 454主要是成本和通量限制，Solexa主要是目前无法克服150bp以上的短串联重复序列。
(5) 454也不能测通700bp以上的短串联重复序列，如果这个等级的重复序列造成拼接的瓶颈，需
要补充Sanger数据。
哪些因素会影响测序结果的质量？
答：(1)个体的杂合度：个体的杂合度越高，拼接难度越大，甚至可能导致序列无法拼接。
(2) 物种基因组的多态性：由于一些物种的个体太小，单个个体提取的基因组DNA的量可能难
以满足测序的要求(如一些寄生虫)，如此便需要混合多个个体进行基因组DNA抽提以用于测序。
对于这类情况，需要评估该物种基因组的多态性，如果基因组的多态性太高，会影响后续基因组的
拼接。
(3) DNA样本的质量：对于细菌与真菌而言，样品来源一定要单一菌落无污染，动植物样本也要
尽量纯合，且无污染，否则会严重影响测序结果的质量。另外制备基因组不能小于23Kb，如果片段过小，在基因组片段化(Fragment)的过程中容易造成小片段丢失，导致构建的测序文库不能完整的覆盖全基因组，对测序结果产生重大的影响。
(4) 另外如果基因组的某些区域的GC含量过高(GC%≥65%)会使测序过程中出现偏向性，导致
某些区域的覆盖率太低，从而影响后续的拼接和注释。
(5) 对于重复序列过多的物种，大量重复序列的存在会产生许多错误的重叠，造成拼接产生的
contigs过短，从而导致结果的严重偏差。
基因组是如何组装的？
答：一般来说，针对以Roche 454 FLX+测序结果为主的组装策略如下：
(1) 先利用短序列组装软件对paired-end数据进行de novo拼接，组装成contigs，这个阶段一
般需要提供高覆盖度的paired-end测序数据，需要耗费大量的计算机内存，这也是基因组组装最困难的一步；
(2) 逐步加入长插入片段的mate-pair数据搭建scaffold，一般来说，mate-pair的测序深度不会
太高，通过mate-pair双端距离信息，把contigs连接成更大的scaffold；
(3) 复查paired-end和mate-paired插入片段长度信息，填补gap；
(4) 有时候会加入Sanger的数据，会对填补gap和延长contigs起到很大的帮助作用。
比较基因组分析的常见内容有哪些？
答：比较基因组学是指在基因组图谱和序列分析的基础上，对已知基因和基因的结构进行比较，了解基因的功能，表达调控机制和物种进化过程的学科。一般包括以下几个方面的内容：
(1) 和近缘物种进行成对基因组比对。可以利用两基因组之间编码顺序上和结构上的同源性，
通过已知基因组的作图信息定位另外基因组中的基因，从而揭示基因潜在的功能及基因组的内在结构的变化。
(2) 和近缘物种进行多基因组比对。当在两种以上的基因组间进行序列比较时，实质上就得到
了序列在系统发生树中的进化关系。基因组信息的增多使得在基因组水平上研究分子进化、基因功能成为可能。通过对多种生物基因组数据及其垂直进化、水平演化过程进行研究，就可以对与生命至关重要的基因的结构及其调控作用有所了解。
Read：一次测序中仪器读取的核苷酸长度
Contig：通过重叠部分将相邻reads组装形成的单元称为contigs。
Scaffold：利用双端测序的信息，连接contigs至较长的scaffold序列。
Coverage depth：测序时每个碱基被测序的平均次数。
Coverage ratio：被测序到的碱基占全基因组大小的比例。
N50：把contig或scaffold从大到小排序，并对其长度进行累加，当累加长度达到基因组序列长度一半时，最后一个contig或scaffold长度。
高通量测序常用名词解释
什么是高通量测序？ 高通量测序技术（High-throughput sequencing，HTS）是对传统Sanger测序（称为一代测序技术）革命性的改变, 一次对几十万到几百万条核酸分子进行序列测定, 因此在有些文献中称其为下一代测序技术(next generation sequencing，NGS )足见其划时代的改变, 同时高通量测序使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能, 所以又被称为深度测序(Deep sequencing)。 什么是Sanger法测序（一代测序） Sanger法测序利用一种DNA聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物。直到掺入一种链终止核苷酸为止。每一次序列测定由一套四个单独的反应构成，每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)，并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于ddNTP 缺乏延伸所需要的3-OH基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处终止。终止点由反应中相应的双脱氧而定。每一种dNTPs和ddNTPs的相对浓度可以调整，使反应得到一组长几百至几千碱基的链终止产物。它们具有共同的起始点，但终止在不同的的核苷酸上，可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段，凝胶处理后可用X-光胶片放射自显影或非同位素标记进行检测。 什么是基因组重测序（Genome Re-sequencing） 全基因组重测序是对基因组序列已知的个体进行基因组测序，并在个体或群体水平上进行差异性分析的方法。随着基因组测序成本的不断降低，人类疾病的致病突变研究由外显子区域扩大到全基因组范围。通过构建不同长度的插入片段文库和短序列、双末端测序相结合的策略进行高通量测序，实现在全基因组水平上检测疾病关联的常见、低频、甚至是罕见的突变位点，以及结构变异等，具有重大的科研和产业价值。 什么是de novo测序 de novo测序也称为从头测序：其不需要任何现有的序列资料就可以对某个物种进行测序，利用生物信息学分析手段对序列进行拼接，组装，从而获得该物种的基因组图谱。获得一个物种的全基因组序列是加快对此物种了解的重要捷径。随着新一代测序技术的飞速发展，基因组测序所需的成本和时间较传统技术都大大降低，大规模基因组测序渐入佳境，基因组学研究也迎来新的发展契机和革命性突破。利用新一代高通量、高效率测序技术以及强大的生物信息分析能力，可以高效、低成本地测定并分析所有生物的基因组序列。 什么是外显子测序（whole exon sequencing） 外显子组测序是指利用序列捕获技术将全基因组外显子区域DNA捕捉并富集后进行高通量测序的基因组分析方法。外显子测序相对于基因组重测序成本较低，对研究已知基因的SNP、Indel等具有较大的优势，但无法研究基因组结构变异如染色体断裂重组等。 什么是mRNA测序（RNA-seq） 转录组学（transcriptomics）是在基因组学后新兴的一门学科，即研究特定细胞在某一功能状态下所能转录出来的所有RNA（包括mRNA和非编码RNA）的类型与拷贝数。Illumina 提供的mRNA测序技术可在整个mRNA领域进行各种相关研究和新的发现。mRNA测序不对引物或探针进行设计，可自由提供关于转录的客观和权威信息。研究人员仅需要一次试验即可快速生成完整的poly-A尾的RNA完整序列信息，并分析基因表达、cSNP、全新的转录、全新异构体、剪接位点、等位基因特异性表达和罕见转录等最全面的转录组信息。简单的样
高通量测序 名词解释
高通量测序基础知识汇总 一代测序技术：即传统的Sanger测序法，Sanger法是根据核苷酸在待定序列模板上的引物点开始，随机在某一个特定的碱基处终止，并且在每个碱基后面进行荧光标记，产生以A、T、C、G结束的四组不同长度的一系列核苷酸，每一次序列测定由一套四个单独的反应构成，每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)，并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH 基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处终止，使反应得到一组长几百至几千碱基的链终止产物。它们具有共同的起始点，但终止在不同的的核苷酸上，可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段，通过检测得到DNA碱基序列。 二代测序技术：next generation sequencing（NGS）又称为高通量测序技术，与传统测序相比，二代测序技术可以一次对几十万到几百万条核酸分子同时进行序列测定，从而使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能，所以又被称为深度测序（Deep sequencing）。NGS主要的平台有Roche（454 & 454+），Illumina（HiSeq 2000/2500、GA IIx、MiSeq），ABI SOLiD等。 基因：Gene，是遗传的物质基础，是DNA或RNA分子上具有遗传信息的特定核苷酸序列。基因通过复制把遗传信息传递给下一代，使后代出现与亲代相似的性状。 DNA：Deoxyribonucleic acid，脱氧核糖核酸，一个脱氧核苷酸分子由三部分组成：含氮碱基、脱氧核糖、磷酸。脱氧核糖核酸通过3',5'-磷酸二酯键按一定的顺序彼此相连构成长链，即DNA链，DNA链上特定的核苷酸序列包含有生物的遗传信息，是绝大部分生物遗传信息的载体。
高通量测序基础知识
高通量测序基础知识简介 陆桂 什么是高通量测序？ 高通量测序技术（High-throughput sequencing，HTS）是对传统Sanger测序（称为一代测序技术）革命性的改变,一次对几十万到几百万条核酸分子进行序列测定, 因此在有些文献中称其为下一代测序技术(next generation sequencing，NGS )足见其划时代的改变, 同时高通量测序使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能, 所以又被称为深度测序(Deep sequencing)。 什么是Sanger法测序（一代测序） Sanger法测序利用一种DNA聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物。直到掺入一种链终止核苷酸为止。每一次序列测定由一套四个单独的反应构成，每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)，并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处终止。终止点由反应中相应的双脱氧而定。每一种dNTPs和ddNTPs的相对浓度可以调整，使反应得到一组长几百至几千碱基的链终止产物。它们具有共同的起始点，但终止在不同的的核苷酸上，可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段，凝胶处理后可用X-光胶片放射自显影或非同位素标记进行检测。 什么是基因组重测序（Genome Re-sequencing） 全基因组重测序是对基因组序列已知的个体进行基因组测序，并在个体或群体水平上进行差异性分析的方法。随着基因组测序成本的不断降低，人类疾病的致病突变研究由外显子区域扩大到全基因组范围。通过构建不同长度的插入片段文库和短序列、双末端测序相结合的策略进行高通量测序，实现在全基因组水平上检测疾病关联的常见、低频、甚至是罕见的突变位点，以及结构变异等，具有重大的科研和产业价值。 什么是de novo测序 de novo测序也称为从头测序：其不需要任何现有的序列资料就可以对某个物种进行测序，利用生物信息学分析手段对序列进行拼接，组装，从而获得该物种的基因组图谱。获得一个物种的全基因组序列是加快对此物种了解的重要捷径。随着新一代测序技术的飞速发展，基因组测序所需的成本和时间较传统技术都大大降低，大规模基因组测序渐入佳境，基因组学研究也迎来新的发展契机和革命性突破。利用新一代高通量、高效率测序技术以及强大的生物信息分析能力，可以高效、低成本地测定并分析所有生物的基因组序列。 什么是外显子测序（whole exon sequencing） 外显子组测序是指利用序列捕获技术将全基因组外显子区域DNA捕捉并富集后进行高通量测序的基因组分析方法。外显子测序相对于基因组重测序成本较低，对研究已知基因的SNP、Indel等具有较大的优势，但无法研究基因组结构变异如染色体断裂重组等。
(完整版)测序常用名词解释整理
高通量测序领域常用名词解释大全 什么是高通量测序？ 高通量测序技术（High-throughput sequencing，HTS）是对传统Sanger测序（称为一代测序技术）革命性的改变, 一次对几十万到几百万条核酸分子进行序列测定, 因此在有些文献中称其为下一代测序技术(next generation sequencing，NGS )足见其划时代的改变, 同时高通量测序使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能, 所以又被称为深度测序(Deep sequencing)。 什么是Sanger法测序（一代测序） Sanger法测序利用一种DNA聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物。直到掺入一种链终止核苷酸为止。每一次序列测定由一套四个单独的反应构成，每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)，并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处终止。终止点由反应中相应的双脱氧而定。每一种dNTPs和ddNTPs的相对浓度可以调整，使反应得到一组长几百至几千碱基的链终止产物。它们具有共同的起始点，但终止在不同的的核苷酸上，可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段，凝胶处理后可用X-光胶片放射自显影或非同位素标记进行检测。
什么是基因组重测序（Genome Re-sequencing） 全基因组重测序是对基因组序列已知的个体进行基因组测序，并在个体或群体水平上进行差异性分析的方法。随着基因组测序成本的不断降低，人类疾病的致病突变研究由外显子区域扩大到全基因组范围。通过构建不同长度的插入片段文库和短序列、双末端测序相结合的策略进行高通量测序，实现在全基因组水平上检测疾病关联的常见、低频、甚至是罕见的突变位点，以及结构变异等，具有重大的科研和产业价值。 什么是de novo测序 de novo测序也称为从头测序：其不需要任何现有的序列资料就可以对某个物种进行测序，利用生物信息学分析手段对序列进行拼接，组装，从而获得该物种的基因组图谱。获得一个物种的全基因组序列是加快对此物种了解的重要捷径。随着新一代测序技术的飞速发展，基因组测序所需的成本和时间较传统技术都大大降低，大规模基因组测序渐入佳境，基因组学研究也迎来新的发展契机和革命性突破。利用新一代高通量、高效率测序技术以及强大的生物信息分析能力，可以高效、低成本地测定并分析所有生物的基因组序列。
全基因组从头测序(de novo测序)
全基因组从头测序(de novo测序) https://www.360docs.net/doc/c55429646.html,/view/351686f19e3143323968936a.html 从头测序即de novo 测序，不需要任何参考序列资料即可对某个物种进行测序，用生物信息学分析方法进行拼接、组装，从而获得该物种的基因组序列图谱。利用全基因组从头测序技术，可以获得动物、植物、细菌、真菌的全基因组序列，从而推进该物种的研究。一个物种基因组序列图谱的完成，意味着这个物种学科和产业的新开端！这也将带动这个物种下游一系列研究的开展。全基因组序列图谱完成后，可以构建该物种的基因组数据库，为该物种的后基因组学研究搭建一个高效的平台；为后续的基因挖掘、功能验证提供DNA序列信息。华大科技利用新一代高通量测序技术，可以高效、低成本地完成所有物种的基因组序列图谱。包括研究内容、案例、技术流程、技术参数等，摘自深圳华大科技网站 https://www.360docs.net/doc/c55429646.html,/service-solutions/ngs/genomics/de-novo-sequencing/ 技术优势: 高通量测序：效率高，成本低；高深度测序：准确率高；全球领先的基因组组装软件：采用华大基因研究院自主研发的SOAPdenovo软件；经验丰富：华大科技已经成功完成上百个物种的全基因组从头测序。 研究内容: 基因组组装■K-mer分析以及基因组大小估计；■基因组杂合模拟（出现杂合时使用）； ■初步组装；■GC-Depth分布分析；■测序深 度分析。基因组注释■Repeat注释； ■基因预测；■基因功能注释；■ ncRNA 注释。动植物进化分析■基因家族鉴定（动物TreeFam；植物OrthoMCL）；■物种系统发育树构建； ■物种分歧时间估算（需要标定时间信息）；■基因组共线性分析； ■全基因组复制分析（动物WGAC；植物WGD）。微生物高级分析 ■基因组圈图；■共线性分析；■基因家族分析； ■CRISPR预测；■基因岛预测（毒力岛）； ■前噬菌体预测；■分泌蛋白预测。 熊猫基因组图谱Nature. 2010.463:311-317. 案例描述 大熊猫有21对染色体，基因组大小2.4 Gb，重复序列含量36%，基因2万多个。熊猫基因组图谱是世界上第一个完全采用新一代测序技术完成的基因组图谱，样品取自北京奥运会吉祥物大熊猫“晶晶”。部分研究成果测序分析结果表明，大熊猫不喜欢吃肉主要是因为T1R1基因失活，无法感觉到肉的鲜味。大熊猫基因组仍然具备很高的杂合率，从而推断具有较高的遗传多态性，不会濒于灭绝。研究人员全面掌握了大熊猫的基因资源，对其在分子水平上的保护具有重要意义。 黄瓜基因组图谱黄三文, 李瑞强, 王俊等. Nature Genetics. 2009. 案例描述国际黄瓜基因组计划是由中国农业科学院蔬菜花卉研究所于2007年初发起并组织，并由深圳华大基因研究院承担基因组测序和组装等技术工作。部分研究成果黄瓜基因组是世界上第一个蔬菜作物的基因组图谱。该项目首次将传
农作物重要品种全基因组de novo测序
首页 科技服务 医学检测 科学与技术 市场与支持 加入我们 关于我们 提供领先的基因组学解决方案Providing Advanced Genomic Solutions 参考文献 [ 1 ] Li Y, Zhou G, Jiang W, et al. De novo assembly of soybean wild relatives for pan-genome analysis of diversity and agronomic traits[J]. Nature biotechnology, 2014, 32(10): 1045-1052. [ 2 ] Da Silva C, Zamperin G, et al. The high polyphenol content of grapevine cultivar tannat berries is conferred primarily by genes that are not shared with the reference genome. Plant Cell, 2013, 25(12):4777-88. [ 3 ] Qi XP, Li M, et al. Identification of a novel salt tolerance gene in wild soybean by whole-genome sequencing. Nature Communica－ tions, 2014(5). 挖掘特异基因 解析特有性状 重要品种 全基因组 de novo 所研究品种 小片段文库大片段文库 HiSeq测序(>100X) 基因组组装 注释 全基因组序列比对 转录组遗传图谱等辅助验证 重要农艺性状解析 基因家族聚类分析 所研究品种基因组序列 已发表品种 基因组序列 已发表品种基因集合 所研究品种基因集合 变异检测 小的插入 缺失 SNP 倒位 易位大的插入 缺失 基因挖掘 新基因鉴定拷贝数扩增基因基因丢失正选择基因鉴定 物种 品种 发表杂志（年份） 物种 品种发表杂志（年份） 大豆 棉花 番茄 土豆 水稻 葡萄猪栽培大豆7种野生大豆 野生耐盐大豆雷德氏棉 亚洲棉 陆地棉栽培番茄 抗病番茄栽培土豆 耐寒土豆 Nature (2010) Nature Biotechnology (2014) Nature Communications (2014) Nature (2012)Nature Genetics (2014)Nature Biotechnology (2015)Nature (2012) Nature Genetics (2014) Nature (2011) Plant Cell (2015) 栽培水稻（粳稻）栽培水稻（籼稻） 短花药野生稻 非洲栽培稻五种野生稻三种栽培稻葡萄 丹娜葡萄杜洛克猪藏猪 Science (2002)Science (2002) 野生大豆泛基因组 阅读原文>> 诺禾致源的项目经验 诺禾致源在动植物全基因组测序领域一直处于领先地位， 以第一通讯作者发表基因组文章5篇（影响因子累计152.474），其中2篇为杂志封面文章。 近年来，诺禾通过自主研发软件与技术革新，成功地将项目周期压缩至14个月内，费用降低一半以上。 特有基因检测 对7株代表性野生大豆品种进行全基因组de novo 测序及比较基因组分析，发现每个大豆品种中有1,000~3,000个品种特有的基因。 高变区变异检测 在传统测序方法中，将研究物种短reads 比对参考基因组无法检测到变异位点；在全基因组de novo 方法中，将组装后的超长序列比对参考基因组可准确识别高变区域内的所有变异位点。性状解析方案设计 通过对重要品种高深度(>100X)测序，并进行基因组组装注释： 找到传统测序无法鉴定的高度变异位点，找到更多更准确的SNP位点；找到参考基因组中 所不存在的基因——品种特有基因。 2. 耐盐大豆耐盐基因的发现 2014年，研究人员对一株耐盐大豆开展了全基因组de novo 测序，并与栽培大豆基因组进行全基因组比对，通过一条跨过长达388 Kb 的重要功能区的scaffold，发现了巨大的结构变异，从而成功鉴定出耐盐基因。该基因在栽培大豆中被插入了一个长达3.4 Kb 的反转座子，影响了阳离子转运体功能，从而使栽培大豆失去了耐盐能力。 传统的测序手段，采用的是短reads 比对，因而对这类大的结构变异检测精度差、灵敏度低、甚至难以实现检测，而全基因组de novo 测序则能很好的克服该问题。阅读原文>> 案例分享 1. 丹娜葡萄全基因组测序揭示高丹宁含量性状的分子机制 丹娜葡萄被认为是丹宁含量最高的葡萄品种之一，由于富含丹宁等抗氧化分子，被认为有延缓衰老的作用。通过对其基因组测序，研究人员发现与丹宁合成有关的关键酶，几乎都能找到新的基因。很显然，只依赖已有的参考基因组，完全无法了解丹娜葡萄高丹宁含量这一性状的遗传基础，而全基因组de novo 测序则完美回答了该问题。阅读原文>> 重要品种基因组的价值 一些物种，虽然已有参考基因组，但仍然无法找到性状关联基因。 一方面，参考基因组与研究物种差异太大； 另一方面，性状相关基因处于基因组快速进化区域，变异极大，传统测序手段难以鉴定。 目前，de novo测序在有参品种重要性状探究方面的应用愈发广泛， 相关研究结果常见于国际顶级杂志上。
Ion torrent De novo测序文库构建方法 De-novo library
De novo测序文库构建方法 一、De novo测序的原理 De novo测序不需要任何参考序列，即可对某个物种进行测序，用生物信息学分析方法进行拼接、组装，从而获得该物种的基因组序列图谱。 利用全基因组从头测序技术，可以获得动物、植物、微生物的全基因组序列，从而推进该物种的研究。 De novo测序没有参考序列，需要建立不同片段大小及类型的测序文库，测序后的信息需要组装和拼接。 拟构建200bp和400bp Ion测序文库，以及Ion mate-pair测序文库。 二、文库构建技术路线 1. Ion 200 or 400-base-read library Workflow 基因组DNA提取 ↓ OD260/280检测，凝胶电泳检测，基因组大小评估，基因组定量 ↓ 超声波打断 ↓ 末端修复 ↓片段纯化 接头连接 ↓纯化 文库片段筛选（E-Gel胶回收） ↓ 文库片段扩增 ↓纯化 Agilent检测，Qubit定量 ↓
OneTouch、ES ↓ 上机测序 2. Ion mate-pair library 基因组DNA提取 ↓ 基因组定量检测 ↓ DNA破碎（HydroShear DNA Shearing Device）（压力挤压破碎大片段DNA） ↓ 末端修复 ↓ 文库片段选择（凝胶电泳，SOLiD凝胶回收试剂盒纯化） ↓ 文库片段定量 ↓ MP接头连接（SOLiD MP接头连接试剂盒） ↓纯化 Qubit定量 ↓ 确定DNA回收量，确定回收到的片段含量（含量不同，使用的试剂量不同） ↓ DNA片段环化 ↓ 分离纯化环状DNA ↓ 定量 ↓
环化DNA缺口修复及SOLiD文库试剂盒纯化 ↓ T7核酸外切酶、S1核酸酶酶切 ↓纯化 末端修复 ↓ 文库片段于链霉素亲和素微珠相连 ↓ 连接Ion接头 ↓ 缺口修复、与扩增凝胶条带检测（确定循环数） ↓ 片段扩增 ↓SOLiD试剂盒纯化 片段切胶回收 ↓ Agilent检测 ↓ Q-PCR定量 ↓ 文库构建完成 三、文库构建用到的试剂盒 Ion Library Adaptors and Primers and 5500 SOLiD Mate-Paired Library Kit Mate-Paired Library Enzyme Module Mate-Paired Library Amplification Module Mate-Paired Library Oligo module Library Micro Column Purification Kit Agencourt AMPure XP 60 mL Kit
测序常用名词解释
测序常用名词解释整理
作者: 日期:
高通量测序领域常用名词解释大全 物种基因组大小发表时间拟南芥(Arabidopsis ilialiaiiaj125Mb2000J1 sativa)400Mb2002.4 %^(Populus trichocaipa)480Mb2006.9葡萄(Vitis vinifera)490Mb2007.9小yL^^(Physcomtrella patens)480Mb2008J 番木瓜(Cnnd 口papa) -a)370Mb2008.4咼粱(Soj^ghutn bicolor)P 730Mb2009J 玉来侶％mays）2300Mb2009JI 黄瓜f a ?mi ber)350M2009.11 ^^^jlycine max)1100Mb2010,1 一穗短柄草(Brachypodiim distachyon)355Mb 2010.2 什么是高通量测序？ 高通量测序技术（High-throughput seque ncing, HTS ）是对传统San ger测序（称为一代测序技术）革命性的改变，一次对几十万到几百万条核酸分子进行序列测定,因此在有些文献中称其为下一代测序技术（next generation sequencing NGS ）足见其划时代的改变，同时高通量测序使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能,所以又被称为深度测序（Deep sequencing。 什么是Sanger法测序（一代测序） San ger法测序利用一种DNA聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物。直到掺入一种链终止核苷酸为止。每一次序列测定由一套四个单独的反应构成，每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸（dNTP）,并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸（ddNTP）。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G A、T或C处终止。终止点由反应中相应的双脱氧而定。每一种dNTPs和ddNTPs的相对浓度可以调整，使反应得到一组长几百至几千碱基的链终止产物。它们具有共同的起始点，但终止在不同的的核苷酸上，可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段，凝胶处理后可用X-光胶片放射自显影或 非同位素标记进行检测。
微生物基因组denovo测序分析流程
#流程大放送#微生物基因组Denovo测序分析 知因无限 一介绍 微生物基因组De novo测序分析也叫微生物基因组从头测序分析，指不依赖于任何参考序列信息就可对某个微生物进行分析的测序分析技术，用生物信息学的方法进行序列拼接获得该物种的基因组序列图谱，然后进行注释等后续一系列的分析。微生物Denovo基因组测序及分析技术可以应用于医药卫生等领域。 二技术应用领域 1、基因组图谱的系统性构建 例子：过去几个月，肠病毒D68令数百名美国儿童患病。华盛顿大学的研究人员测序和分析了肠病毒D68（EV-D68）的基因组，这一成果将发表在新一期的Emerging Infectious Diseases杂志上。（Genome Sequence of Enterovirus D68 from St. Louis, Missouri, USA）肠病毒D68（EV-D68）能在儿童中引起严重的呼吸道疾病。其基因组序列可以“帮助人们开发更好的诊断测试，”共同作者Gregory Storch说。“有助于解释病毒感染为什么会造成严重的疾病，以及EV-D68为什么比过去传播得更广。”（来自于生物通的报道） 2、微生物致病性和耐药性位点检测及相关基因功能研究 例子：根据分泌蛋白、毒力因子、致病岛、必需基因等结果去探讨所测物种致病性和耐药性。 3、微生物的比较基因组分析，确定各个近缘微生物中的系统发育关系 二基本分析流程图
三可能的结果展示图 示例图1 微生物基因组的功能注释
示例图2 微生物基因组的系统进化关系 注：以上图片和文字来自参考文献21。 六参考文献 [1] Hong-Bin Shen, and Kuo-Chen Chou, "Virus-mPLoc: a fusion classifier for viral protein subcellular location prediction by incorporating multiple sites", Journal of Biomolecular Structure & Dynamics, 2010, 28: 175-86. [2]Hong-Bin Shen and Kuo-Chen Chou, "Virus-PLoc: A fusion classifier for predicting the subcellular localization of viral proteins within host and virus-infected cells.", Biopolymers. 2007, 85, 233-240. [3] Ren Zhang and Yan Lin, (2009) DEG 5.0, a database of essential genes in both prokaryotes and eukaryotes. Nucleic Acids Research 37, D455-D458. [4] The CRISPRdb database and tools to display CRISPRs and to generate dictionaries of spacers and repeats. BMC Bioinformatics. 2007 May 23;8(1):172. [5] The Pfam protein families database: M. Punta, P.C. Coggill, R.Y. Eberhardt, J. Mistry, J. Tate, C. Boursnell, N. Pang, K. Forslund, G. Ceric, J. Clements, A. Heger, L. Holm, E.L.L. Sonnhammer, S.R. Eddy, A. Bateman, R. D. Finn Nucleic Acids Research (2014) Database Issue 42:D222-D230. [6] Clustal W and Clustal X version 2.0.(2007 Nov 01) Bioinformatics (Oxford, England) 23 (21) :2947-8.PMID: 17846036. [7] Felsenstein, J. 2004. PHYLIP (Phylogeny Inference Package) version 3.6. Distributed by the author. Department of Genome Sciences, University of Washington, Seattle. [8] Li et al (2010). De novo assembly of human genomes with massively parallel short read
动植物denovo测序数据分析流程
#流程大放送#动植物基因组Denovo测序分析 一介绍 动植物基因组Denovo测序分析也叫从头测序分析，不依赖于任何参考序列信息就可对某个微生物进行测序分析，使用生物信息学方法进行序列拼接获得该物种的基因组序列图谱，并进行基因组结构注释、功能注释、比较基因组学分析等一系列的后续分析，该类型测序分析结果可以广泛应用于农林鱼牧医药及海洋等各个方面。 二技术应用领域 （1）动植物基因组图谱的系统性构建 例子：12月2日发表在Nature Communications杂志上的弹涂鱼，又称跳跳鱼，是世界上唯一一种能在陆地上活动的鱼类。它们适应独特的生境，生活在近海沿岸及河口高潮区以下的滩涂上或是咸淡水的交界处。弹涂鱼既能在水中呼吸，也能在空气中呼吸。研究显示，弹涂鱼的鱼鳃中有关氨排泄的几个基因经历了正向选择，“表明它们对于弹涂鱼耐受环境氨的能力很重要”。此外，研究人员还对弹涂鱼的视觉相关基因进行了研究。脊椎动物从水生向陆生过渡是一个重要的进化事件，而弹涂鱼基因组为此提供了宝贵的信息。（来自生物通的报道） （2）复杂性状基因的研究和动植物分子育种应用 例子：比如掌握了小麦的基于单条染色体的全基因组序列资源，植物育种家便有了新的高质量工具，可以用来加速育种计划、鉴定控制复杂性状的基因，如产量、谷物质量、病害、抗虫、以及非生物逆境胁迫等。他们从而能培育出新一代更加高产和更有持续性的小麦品种，在不断变化的环境中满足人口增长的需求。（来自于生物通的报道） 三基本分析流程图
五可能的结果展示 示例图1 系统发生树构建
示例图2 近缘物种间比较基因组分析 注：以上图片及图片皆来自参考文献[1]和[2]。 六参考文献 [1]Yanhua Qu，etc. Ground tit genome reveals avian adaptation toliving at high altitudes in the Tibetan plateau.nature communications, Received 21 Nov 2012 | Accepted 29 May 2013 |. [2] Ying-hui Li,etc. De novo assembly of soybean wild relatives for pan-genome analysis of diversity and agronomic traits. Nature Biotechnology 32, 1045–1052 (2014)
de novo测序
关于De novo测序 新一代测序技术相对于传统的Sanger测序有什么优势？ 答：Sanger测序法用了十三年才完成了第一个人类基因组图谱，而如今利用新一代测序技术平台则只需要几个月就可以完成。新一代测序技术平台利用大量并行处理的能力读取多个短DNA片段，然后拼接成较长的contig和scaffold，技术更加先进，具有高准确性、高通量、高灵敏度和低运行成本等突出优势。 从头拼接中，contig、scaffold、N50等代表什么？ Read：一次测序中仪器读取的核苷酸长度 Contig：通过重叠部分将相邻reads组装形成的单元称为contig。 Scaffold：利用双端测序等其他方法的信息，定位contigs在染色体上的线性排列或相对位置关系，并连接起来形成较长的scaffold序列。 N50：把contig或scaffold从大到小排序，并对其长度进行累加，当累加长度达到基因组序列长度一半时，最后一个contig或scaffold长度。 何为从头测序中的框架图，精细图，完成图？ 答：框架图是指经生物信息学分析后，拼接得到的基因组覆盖度大于95%，基因区覆盖度达到98%以上，contig N50达到5Kb，scaffold N50达到20Kb，单碱基错误率在十万分之一以下。 精细图是指经生物信息学分析后，拼接得到的基因组覆盖度大于98%，基因区覆盖度达到99%以上，contig N50达到20Kb，scaffold N50达到300Kb，单碱基错误率低于十万分之一，gap 数不超过100个。 完成图是指经生物信息学分析后，拼接得到完整的基因组序列，单碱基错误率低于十万分之一。 De Novo测序应该是选择454还是solexa？ (1) 两种测序方法都可以完成基因组的De Novo拼接，建议使用两种测序方式，结果组合拼接， 可以重复利用两种技术的优势。 (2) 需要根据基因组的情况，如果杂合度偏高，重复序列偏多，建议增加454测序的比例。 (3) 如果基因组相对简单，从成本考虑建议增加Solexa测序比例。 (4) 454主要是成本和通量限制，Solexa主要是目前无法克服150bp以上的短串联重复序列。 (5) 454也不能测通700bp以上的短串联重复序列，如果这个等级的重复序列造成拼接的瓶颈，需 要补充Sanger数据。 哪些因素会影响测序结果的质量？ 答：(1)个体的杂合度：个体的杂合度越高，拼接难度越大，甚至可能导致序列无法拼接。 (2) 物种基因组的多态性：由于一些物种的个体太小，单个个体提取的基因组DNA的量可能难 以满足测序的要求(如一些寄生虫)，如此便需要混合多个个体进行基因组DNA抽提以用于测序。 对于这类情况，需要评估该物种基因组的多态性，如果基因组的多态性太高，会影响后续基因组的
高通量测序常用名词科普
高通量测序常用名词汇总 一代测序技术：即传统的Sanger测序法，Sanger法是根据核苷酸在待定序列模板上的引物点开始，随机在某一个特定的碱基处终止，并且在每个碱基后面进行荧光标记，产生以A、T、C、G结束的四组不同长度的一系列核苷酸，每一次序列测定由一套四个单独的反应构成，每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)，并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH 基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处终止，使反应得到一组长几百至几千碱基的链终止产物。它们具有共同的起始点，但终止在不同的的核苷酸上，可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段，通过检测得到DNA碱基序列。 二代测序技术：next generation sequencing（NGS）又称为高通量测序技术，与传统测序相比，二代测序技术可以一次对几十万到几百万条核酸分子同时进行序列测定，从而使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能，所以又被称为深度测序（Deep sequencing）。NGS主要的平台有Roche（454 & 454+），Illumina（HiSeq 2000/2500、GA IIx、MiSeq），ABI SOLiD等。 基因：Gene，是遗传的物质基础，是DNA或RNA分子上具有遗传信息的特定核苷酸序列。基因通过复制把遗传信息传递给下一代，使后代出现与亲代相似的性状。 DNA：Deoxyribonucleic acid，脱氧核糖核酸，一个脱氧核苷酸分子由三部分组成：含氮碱基、脱氧核糖、磷酸。脱氧核糖核酸通过3',5'-磷酸二酯键按一定的顺序彼此相连构成长链，即DNA链，DNA链上特定的核苷酸序列包含有生物的遗传信息，是绝大部分生物遗传信息的载体。 RNA：Ribonucleic Acid，，核糖核酸，一个核糖核苷酸分子由碱基，核糖和磷酸构成。核糖核苷酸经磷酯键缩合而成长链状分子称之为RNA链。RNA是存在于生物细胞以及部分病毒、类病毒中的遗传信息载体。不同种类的RNA链长不同，行使各式各样的生物功能，如参与蛋白质生物合成的RNA有信使RNA、转移RNA和核糖体RNA等。 16S rDNA："S"是沉降系数，是反映生物大分子在离心场中向下沉降速度的一个指标，值越