发酵饲料生产工艺与应用

灵璧县立腾同创农牧科技有限责任公司

二0一二年十一月

目录

安徽省立腾同创农牧科技有限公司简介

安徽省立腾同创农牧科技有限公司企业文化

安徽省立腾同创农牧科技有限公司的十年发展战略—————

安徽省立腾同创农牧科技有限公司的第一个发展五年发展计划

第一章发酵饲料生产的菌种及发酵工艺

第二章发酵饲料生产技术

第一章发酵饲料生产的菌种及发酵工艺

第一节概述

一、发酵饲料的定义

发酵饲料的定义是：在人为可控制的条件下，以植物性农副产品为主要原料，通过微生物的代谢作用，降解部分多糖、蛋白质和脂肪等大分子物质，生成有机酸、可溶性多肽等小分子物质，形成营养丰富、适口性好、活菌含量高的生物饲料或饲料原料。

采用发酵技术生产的动物饲料或饲料原料，其特性主要是：（1）含有大量的活性微生物；

（2）多数以厌氧发酵方式进行生产；

（3）未经干燥的物料含水量通常在30%以上；

（4）物料的酸性物质明显增加，营养组成更合理；

（5）生产原料以植物性农副产品为主。

也有发酵成品是经过干燥处理的，比较典型的有发酵豆粕和发酵棉粕。在发酵过程中有大量的活性乳酸菌和酵母菌发生的代谢作用，经过干燥以后，乳酸菌基本都失活了，但是它们也属于发酵饲料。

二、发酵饲料的概述

发酵饲料的生产工艺基本都是以固态发酵的方式进行的，生产菌种以乳酸菌、芽孢杆菌和酵母菌为主，绝大多数采用厌氧或兼性厌氧发酵。发酵物料的含水量为30%~50%，发酵时间和温度受

环境影响很大，基本不进行人为控制和调节。

在实际生产中也有采用好氧发酵方式进行的，生产菌种以霉菌和假丝酵母为主，生产用的蛋白原料主要是一些乳酸菌和酵母菌难以降解的杂粕和胶质蛋白。但是生产设备复杂，物料温度和湿度变化很大，控制及其困难。成品主要是作为饲料蛋白原料的替代物，能降低饲料生产成本，但基本不具备生物学活性和功能。本节主要论述厌氧固态发酵工艺，常规的发酵饲料生产流程如：原料→消毒→冷却接种→培养→干燥→包装

工业化规模的微生物发酵过程基本上都是纯培养过程，原料需要消毒，空气需要过滤等。这些操作都是为了确保在发酵产品生产和储存过程中不受杂菌的侵袭和干扰，但也正是这些常规操作使产品的生产成本居高不下，影响了微生物发酵产品在动物饲养中的大剂量使用。

大量试验证明，在不考虑动物饲养成本的前提下，大剂量（在配合饲料中添加 5.0%以上）使用高活菌含量的微生物发酵饲料可以明显改善动物的生产性能，提高动物的健康水平，甚至可以进行无抗生素饲养。但是采用传统的生产工艺获得的高活菌产品其生产成本通常都在10元/kg以上，如果以10%的比例使用在配合饲料中，每吨配合饲料的成本至少需要增加800元，这个增加值对传统的畜禽养殖业来说是难以接受的。降低发酵饲料生产成本最直接的方式就是简化生产工艺，其中原料的蒸煮、消毒和干燥是最耗能的操作过程，是导致生产成本增加的主要步骤，也是导致生产设备投资增加的主要原因。如能简化生产操作工艺步骤，

同时又能保证产品质量的安全稳定，就能使发酵饲料的生产和应用具备强大的市场竞争力。

第二节发酵饲料的生产菌种

发酵饲料的生产菌种很多，主要有：乳酸菌、芽孢杆菌、酵母菌和霉菌。

一、乳酸菌

目前生产中使用的乳酸菌至少有30多种。按乳酸菌的代谢途径，大致可归纳为四种类型：同型乳酸发酵、专性异型乳酸发酵、兼性乳酸发酵和双歧杆菌异型乳酸发酵。

（一）同型乳酸发酵

C6H12O6 ——→2CH3CH(OH)COOH

一分子葡萄糖分解成两分子乳酸，整个过程不产气，发酵转化理想，产物最合适，效率最高。典型的生产菌种主要有：德氏乳酸杆菌、嗜酸乳杆菌、唾液乳杆菌、嗜热乳杆菌、粪肠球菌、乳酸乳球菌。

（二）专性异型乳酸发酵

C6H12O6——→CH3CH(OH)COOH+CH3COOH+CO2↑

一分子葡萄糖转化成一分子乳酸和一分子乙酸，另外还释放一分子二氧化碳。相比同型乳酸发酵，这种发酵的转化效率要低得多，而且还有产气损失。典型的生产菌种主要有:发酵乳杆菌、高加索酸奶杆菌、短乳杆菌、巴氏乳杆菌。

（三）兼性乳酸发酵

兼性乳酸发酵能同时进行同型乳酸发酵和异型乳酸发酵，这两种代谢进行的程度和比例取决于菌种的性质和外界培养条件。典型的生产菌种有：植物乳杆菌、干酪乳杆菌、鼠李糖杆菌、清酒乳杆菌。

（四）双歧杆菌异型乳酸发酵

2C6H12O6——→2CH3CH(OH)COOH+3CH3COOH

比较典型的生产用菌种是动物双歧杆菌。双歧杆菌的培养要求很严格，对厌氧要求极高，目前还很难在实际生产中应用。

乳酸菌分布广、种类多，有杆状和球形两大类。有单个、成对和链状排列的，基本上都是厌氧菌或微需氧菌。在饲料青储、发酵开始时就繁殖，到饲料因密封缺氧后仍然能繁殖，只是增殖的速度慢一些，而乳酸的生成速度却快一些。

乳酸菌能分解饲料原料中的糖，形成乳酸。乳酸能提高饲料的营养价值和适口性，同时还能抑制大肠杆菌和沙门氏菌等有害微生物的生长代谢，使饲料产品能长期保存。在饲料青储和发酵的过程中，同型和异型乳酸发酵同时存在，产物除乳酸外还有少量乙醇和CO2。

二、芽孢菌

目前在生产中应用的芽孢菌有近十种，以杆菌为主，主要为以下三种：地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和蜡样芽孢杆菌。芽孢杆菌能耐受高温，在有氧和无氧条件下都能存活。在营养缺乏、干旱等条件下形成芽孢，在条件适应时又可以重新萌发成营养体。利

用芽孢杆菌发酵饲料的目的主要是为了消耗培养体系中残留的氧气，为乳酸菌创造一个厌氧环境。另外，近年来研究还发现，有些芽孢杆菌能产生杀灭大肠杆菌和沙门氏菌等有害微生物的细菌素（也称抗菌肽），这些抗菌肽有很强的针对性，只对某些类型的微生物细胞有破坏作用，对酵母菌和乳酸菌没有影响。

三、酵母菌

酵母菌是一类单细胞真菌，形态多种多样，主要有球形、卵形和丝状形（如假丝酵母），以出芽的无性繁殖为主，最适宜生长温度为25~35℃，pH偏酸性（4.0~6.0）。酵母菌基本上都是兼性厌氧菌，在有氧的条件下迅速增殖，在无氧的情况下进行酒精发酵（EMP）。目前在生产中应用的有20多种，主要为以下三种：酿酒酵母、热带假丝酵母、产朊假丝酵母。啤酒酵母和面包酵母是最常用的酿酒酵母。热带假丝酵母和产朊假丝酵母的生长速度很快，在适宜的温度和营养条件下，它们的世代倍增时间不超过3h，特别适合处理食品加工业产生的废水。

酵母菌的个体比乳酸菌大得多，直径通常为2~6μm，体积几乎是乳酸菌的1000倍左右。工业生产中常用的酵母菌主要有酿酒酵母和假丝酵母，酿酒酵母是生产啤酒、白酒等含乙醇类发酵物的重要菌种；假丝酵母主要用于好氧发酵生产动物饲料或者废水处理。

四、霉菌

目前在生产中应用的霉菌有近十种，主要为：米曲霉、黑曲霉、白地霉。一般来说利用霉菌发酵，基本上都是有氧发酵，发酵过

程会产生大量的代谢热，生产过程中料曲的温度控制往往是生产成败的关键。霉菌发酵目前采用浅盘发酵，料曲厚度不超过5cm。如果采用厚层发酵，需采用强通风装置，生产能耗很大，从这一点上说，霉菌发酵不适于生产饲料或者饲料原料。

目前，实际生产中利用霉菌主要是利用它能合成纤维素酶、半纤维素酶和蛋白酶的特性，利用廉价的粗蛋白原料作为发酵底物，生产高活性的蛋白饲料或者粗酶制剂。

五、选用生产菌种的基本原则

（一）安全性（必须同时符合以下两个要求）

（1）菌体本身不产生有毒有害物质。

（2）不会危害环境固有的生态平衡（主要针对某些基因工程菌）。

（二）有效性（能满足一个要求即可）

（1）菌种本身具有很好的生长代谢活力，能有效降解大分子好抗营养因子，合成小肽和有机酸等小分子物质。

（2）能保护和加强动物微生物区系的正平衡。

这种功效主要是指能有效维护和提高有益微生物在动物消化道中的数量优势，其可通过两种方式达到：一种方式是利用发酵饲料的生产菌种本身就是从饲养的目标动物的消化道中分离出来的有益菌，通过饲喂高比例的发酵饲料直接提高有益微生物的数量，形成数量优势；另一种方式是利用生产菌种或代谢产物可以选择性地抑制或者杀灭有害微生物，形成有益菌的数量优势。实现第二种途径的方式可以多种多样，比较常用的有：耗尽氧气，

降低体系的氧化还原电位；降低环境的pH值；代谢物中含有能选择性杀灭大肠杆菌和沙门氏菌等有害微生物的抗菌物质等。

第三节发酵饲料生产菌种之间的相互关系目前人类可利用的这些发酵技术基本上都是纯培养技术，而实际上在自然界中很难找出单一微生物存在的生态环境。据已有的微生物研究报道，地球上存在的微生物超过100万种，而人类所分离的纯种累计不超过10万种，做过比较系统研究的不超过1万种。根据目前已有的研究成果，大体可以把微生物之间的关系分为以下几种：中性共生、同住、互惠共生、共生、竞争、拮抗和寄生。

一、中性共生

这是指两种或两种以上的微生物同时存在于同一个环境中，但是它们之间没有直接的生态关系，各自生活互不干扰。例如淡水中生长的衣藻和水生细菌。

二、同住

这是指两种微生物同处在一个栖所内，其中一个获益，另一个不受影响。常见的现象是一种微生物产生一种代谢物供另一种微生物作为营养物质，或者产生适合于另外一种微生物生长的环境。发酵饲料生产中比较常见的例子有以下几种：酵母菌能在高浓度的糖液（25%左右）中生长。当糖被酵母菌消耗以后，糖浓度的降低就有利于不耐受高渗透压的微生物（如乳酸菌）的生长。能分泌淀粉酶的微生物（芽孢菌）水解淀粉产生寡糖和单糖，为另外一些只能利用还原性单糖的微生物生长提供营养。

还有一种比较特殊的同住微生物，好气性菌可消耗氧气，降低环境的氧化还原电位，使之适合于厌氧微生物的生长。这种同住关系只能产生在开始阶段，在后期就不是同住关系了。这种现象在发酵饲料到生产过程中经常遇到，也是利用微生物组合发酵生产发酵饲料的重要理论基础。

三、互惠共生

这是两种微生物互惠互利的现象，比较典型的菌种是阿拉伯糖乳杆菌和粪链球菌的组合。阿拉伯糖乳杆菌不能合成苯丙氨酸，粪链球菌不能合成叶酸。阿拉伯糖乳杆菌不能在缺少苯丙氨酸的培养基上生长，粪链球菌也不能在没有叶酸的培养基上生长。但是把它们组合在一起，却可以共同在没有苯丙氨酸也没有叶酸的培养基上生长，因为它们能相互为对方提供必需的限制性营养物质。这种现象在自然界中普遍存在，发酵饲料的菌种组合应该多考虑这种组合优势。

四、共生

共生是指两种微生物在同一个严酷环境中彼此相依为命。比较典型的例子是地衣，它是蓝细菌（或蓝藻）与真菌共同组成的一个形态和生理单位。蓝藻或蓝细菌的细胞仅限于特定的层内，地衣内的菌丝交织成菌丝组织，形成一个稠密的外皮层。皮层下为蓝藻的细胞层，在下面为菌丝疏松交织的菌髓层。真菌可以从蓝藻获得碳水化合物，真菌菌丝所摄取的水和无机盐又可以提供给蓝藻，因此地衣能耐干旱、潮湿和抗寒冷。这种现象在发酵饲料的生产过程中很难遇到，少有实用的例子。

五、竞争

当两种微生物对某种环境因子有相同要求时，就会发生生存竞争。由于微生物的世代时间比较短，代谢强度大，所以生存竞争往往表现的很激烈。

在一个生存环境内，不同的时间会出现不同的优势种。这种优势微生物在某种环境下能最有效地适应当时的环境，而环境条件一旦改变，就可能被另一种微生物代替并发育成新的优势种。目前工业化发酵生产之所以采用纯种培养，其主要原因就是消除其他微生物的竞争。目标代谢物合成能力强的微生物其生长速度往往比较低，至少比同类的野生菌低。野生菌的代谢活动是很“经济的”。如果从生长速度分析，它们的物质和能量的利用效率要远高于生产菌种。但是，由于生产成本的限制，发酵饲料的生产往往不能采用纯种培养，所以微生物之间的生存竞争不可避免。如何巧妙利用微生物之间的生存竞争是研究微生物发酵饲料生产的一个非常重要的课题。从理论上分析，通过控制调节微生物生存环境可以调整物料中微生物的种类和数量分布，从而达到利用微生物有益菌群种群优势发酵饲料的目的，但是到目前为止，有关方面的成熟技术还是很少。

六、拮抗

一种微生物可以产生不利于另一种微生物生存的代谢物质，或者通过代谢活动改变生存环境，而这种环境不利于其他周围微生物的生长，这种现象就称为“拮抗”。如：青贮饲料接种的乳酸菌和醋酸菌在发酵过程中，不断降低pH值，结果绝大多数不

耐酸的微生物不能生存，甚至趋向死亡。酵母菌在无氧条件下将糖发酵成酒精，当酒精浓度达到一定数值时，其他微生物就不能生存。

研究发现拮抗还具有明显选择性，农业部饲料工业中心分离获得的枯草芽孢杆菌MA139能分泌杀灭大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的抗菌肽（细菌素），但对自身、酵母菌和乳酸菌的生长代谢基本没有影响，这种拮抗的选择性是发酵饲料研究所希望的。

七、寄生

一种微生物生活在另一种微生物体内或体外，依靠摄取寄生细胞的营养进行生长繁殖，并使后者遭受损害甚至死亡，这种现象称之为寄生。这种现象在饲料发酵过程中可能存在，目前在研究中还没有遇到。

微生物是发酵饲料的动力来源，研究发酵饲料中微生物的相互关系是获得高质量发酵饲料的必要前提，也是饲料发酵生产的核心。

第四节发酵饲料的生产工艺

一、固态厌氧发酵高活性生物饲料

相对于好氧发酵，厌氧发酵的能耗低，微生物代谢产生的热量也要小得多，生产过程往往不需要翻拌散热。另外，发酵产品只要密封得当，即使长期存放也不会腐败变质。

目前比较典型的固态厌氧发酵生物饲料的成功例子主要有两种：一种是适合养殖户自产自用的袋装发酵饲料；另一种是属

于规模化流水线生产的袋装发酵饲料。它们接种的微生物基本一致，主要有酵母菌、乳酸菌和芽孢杆菌。

适合养殖户自产自用的发酵袋是一种普通的密封包装袋，物料接种以后装袋，再将袋口用绳扎紧，物料的含水量为30%~40%。开始时，酵母菌消耗袋内残留的氧气进行增殖和呼吸代谢，同时也为乳酸菌创造一个厌氧的生活环境。然后，酵母菌在无氧条件下进行糖酵解，产生酒精和CO2，乳酸菌也同时增殖、代谢，产生有机酸。随着袋内气压的不断增加，不断有CO2带着酒精和有机酸排出袋外，管理饲料的饲养员可以根据排出的酸香味来判定物料发酵的成熟度。

有氧发酵阶段：

C6H12O6+6O2——→6CO2+6H2O

无氧发酵阶段：

C6H12O6——→2CO2+2C2H5OH(乙醇)

在夏季，发酵3~5d就有明显的酸香味。在冬季，时间需要延长。如果环境温度低于12℃，发酵就有可能归于失败。酵母在低温下长期代谢低迷，不产生CO2，使得外界的O2长时间与接种的乳酸菌接触，会导致乳酸菌活力大减，甚至死亡。

事实证明，如果环境温度适宜，时间控制得当，采用上述袋装式土办法发酵，也可以获得质量很好的微生物发酵饲料，活性乳酸菌的含量能达到108cuf/g以上。将其在生羊配合饲料中添加15%~20%，生羊采食量能明显提高，最多能提高10%以上，而

且增重速度和健康水平也有显著提高。这种工艺虽然简单，但是受限制的因素很多，质量标准也很难把握，实际推广有一定困难。为了使这种袋装发酵技术进入程序化、工业化应用，发酵饲料的质量能得到有效保证，必须完成以下几个前提：发酵过程不受环境温度限制；产品质量不受存放时间限制，或者保质期能达到三个月以上；产品在储存和运输过程中不受外界空气干扰。

农业部饲料工业中心的微生物发酵饲料课题组发明了呼吸膜可移动式固态厌氧发酵饲料（也称袋装发酵饲料）生产技术。

这种发酵技术的具体工艺流程如图1-1。

原料接种以后直接进入包装袋中，包装袋上附加一个可以调节气压的硅胶膜。在发酵过程中，微生物会产生CO2等气体，使得袋内的气压大于外界常压。当袋内气压达到某一临界值时，气体通过硅胶膜排到外界。但是外界的气体始终没有机会进入发酵体系，从而也就排除了外界杂菌的干扰。

研制的特定微生物菌种组合能使乳酸菌迅速繁殖，占据数量优势，原料不需要消毒就可以直接用于接种培养。

这种工艺很简单，如果以日产30t计算，设备投资不超过40万元，特别适合在我国广大农村推广使用。

第三章发酵饲料生产技术

第一节发酵饲料用乳酸菌的分离筛选乳酸菌是一类最常见的益生菌，生物饲料的发酵生产一般都离不开乳酸菌。乳酸菌种类很多，市场上流行的产品也极多，至少有20多种。大量实验证明，只有动物消化道国有的微生物才能在消化道内定植，外源微生物只能短时间存活在消化道内，不可能长期融合到动物消化道的微生态系统中。筛选发酵饲料的生产菌种，其主体应该来源于最终适用的动物消化道，而乳酸菌细菌是动物消化道内起主要作用的微生物。

一、样品的采集

为了获得合适的生产用乳酸菌，样品的采集很重要。适合于实

际生产的乳酸菌必须来源于健康动物的消化道，最好是在发生了瘟疫的养殖场而幸存的畜禽。发生瘟疫的养殖场，动物大比例死亡，幸存的畜禽虽少，但是生命力很顽强，是极好的生产菌种采集样本。

以下以筛选符合生羊健康养殖需要的生物饲料用乳酸菌为例，叙述样品的采集和乳酸菌的分离。在实验室中对生羊进行攻毒试验，在饲料中不断加大大肠杆菌（实验用E.ColiK88,这是一种常见的攻毒试验用大肠杆菌）的用量，以检验生羊的抵抗力。经过5~7d的试验，生羊的健康水平越来越差。我们选择其中两头最健康的生羊进行屠宰，在无菌环境中提取它的胃液、小肠液和大肠液，迅速保存在无菌生理盐水（NaCl的浓度为0.9%）中。目标乳酸菌一般都是厌氧菌，为了确保乳酸菌的活力，需要尽可能降低生理盐水的氧化还原电位。最简便的方法是在溶液中加入适量的半胱氨酸，半胱氨酸有巯基（—SH），有很好的还原力，可以消除溶液中残余的氧。

二、乳酸菌的分离纯化

样品中的目标乳酸菌含量一般都不是很高，而且还污染了其他杂菌。为了提高筛选成功的几率，在样品进行分离纯化以前，可以对样品进行选择性增殖培养，以增加目标乳酸菌的含量。样品的增殖培养比较简单，把经过适当处理的样品接种到适于目标乳酸菌生长的培养基中。比较常用的是牛奶增殖培养液，在无抗生素牛奶中补充6%~8%的蔗糖，高温消毒、冷却，然后用氮气或者二氧化碳驱除溶液中残留的空气，再接入适量采

集的样品，在30~32℃条件下厌氧培养10~24h。如果样品中的目标乳酸菌含量比较低，可以适当延长培养时间。

样品经过预增殖培养以后，目标乳酸菌含量明显提高，可以进入下一步分离纯化操作。

乳酸菌分离培养基通常采用MRS琼脂培养基，其营养组成与pH 如下：蛋白胨：5.0g/L；牛肉浸膏：4.0g/L；酵母膏：2.0g/L；葡萄糖：12.0g/L；玉米浆：10.0mL;司盘80：1ml;磷酸氢二钾：1.0g/L；三水乙酸钠：3.0g/L；柠檬酸三铵：1.0g/L；硫酸镁：0.1g/L；硫酸锰：0.03g/L；琼脂：18.0g/L。pH6.2±0.2。

加热溶解上述各组分，配制成均匀的溶液，分装在厌氧滚管中（每个管中加5~6mL）。在115℃消毒杀菌30min。冷却至50℃左右后，在冰水中滚动滚管，使固体培养基均匀凝固在管壁上。为了指示培养基的氧化还原电位，可以在培养基中加入极少量的刃天青（一种显色剂），浓度0.02%就足够了。在低电位时培养基显蓝色，随氧化还原电位不断上升，培养基的颜色逐步由蓝转为浅蓝、粉红、红色。如果培养基的颜色转成粉红就基本不合格了。同增殖培养过程一样，在MRS分离培养基中加入适量的半胱氨酸可以在一定时间内维持环境的低电位。

分离纯化培养基准备好以后，就可以进行目标乳酸菌的分离操作了。

在超净工作台上（或者其他无菌环境中），对经过增殖培养的样品进行梯度稀释，稀释液还是用无菌的生理盐水，把稀释后的样品接种到厌氧滚管中，密封（滚管有密封盖）。在30~32℃条

件下培养1~2d。

为了提高筛选几率，可以同时做多个稀释梯度样品的培养。如果两天以后不出现理想的菌落，可以再延长培养时间。

虽然乳酸菌的最适宜生长温度是37~40℃，但是在分离筛选过程中，培养温度应适当调低，以降低其生长速度，这样菌落之间的差异可以更明晰，也更有利于挑选理想的菌种。

经过上述分离操作，我们获得了5株乳酸菌，它们分别是：

1.来源于羊胃的格氏乳杆菌（Lactobacillus gasseri）;

2.来源于十二指肠的罗伊氏乳杆菌（Lactobacillus reuteri）;

3.来源于小肠的屎肠球菌（Enterococcus faecium）;

4.来源于空肠的嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）;

5.来源于结肠的发酵乳杆菌（Lactobacillus fermentium）。

三、发酵力和耐酸稳定性分析

为了后续生产应用的需要，我们对分离获得的乳酸菌进行发酵力测定和耐酸稳定性试验。发酵力测定比较简单，主要测定其乳酸菌的产量，具体方法如下：

接种分离获得的细菌纯种于试管培养液中，30~32℃恒温培养12h，然后再扩大接种到牛奶瓶中，30~32℃恒温培养6h，测定乳酸含量。

在乳酸发酵的过程中乳酸通常以乳酸钙的形式存在，通过去除发酵液中的葡萄糖和蛋白质，并加入适当浓度硫酸酸化，钙离子

转化成难溶的硫酸钙沉淀，使溶解度不高的乳酸钙全部转变为乳酸。乳酸在铜离子的催化下，与浓硫酸作用生成乙醛，乙醛能与对羟基联苯作用生成在 565 nm 处有特征吸收的紫色物质。在一定浓度范围内，乳酸含量与 565 nm 处波长吸光度呈线性关系，因此，可以通过测定 565 nm 处的吸光度来测定乳酸的含量。

实验室乳酸含量的测定

一、原理

稀乳酸在浓硫酸作用下加热，可以变成乙醛。乙醛与羟基联苯作用可以生成红色的复合物，在565nm条件下比色测定，可以确定乳酸含量。

二、试剂

1. 4.0%硫酸铜溶液

将4g无水硫酸铜溶解在水溶液中，定容至100ml。

2. 羟基联苯（C6H5·C6H4OH）溶液

将1g羟基联苯溶解于100ml浓度为0.08mol/L的NaOH溶液中，储存在褐色试剂瓶中。

3.乳酸标准液

将280mg纯乳酸锂溶于水中，配成250mL溶液，其乳酸浓度为1mg/mL，存放于4℃冰箱中。在做标准曲线时将溶液稀释10倍，使乳酸含量为100μg/mL。在分别取1，2，3，4，5，6mL稀释液，稀释配制成1，2，3，4，5，6μg/mL乳酸标准液。

4.浓硫酸溶液

在比色管中分别加入1mL乳酸标准液和0.05mL硫酸铜溶液，然

后加入6mL浓硫酸，放置5min，冷却至20℃以下。

三、标准曲线的制备和乳酸含量的测定

在上述比色管中加入0.05mL羟基联苯溶液，混合均匀，在室温下放置6~8h，过夜。在565nm波长下进行比色测定，绘制标准曲线。

（1）最大吸收波长的确定

乳酸发酵液样品显色后，表明，最大吸收波长为 565 nm。

图2-1最大吸收波长的确定

（2）最佳显色条件的选择

结果表明，氢氧化钙和浓硫酸的加入量对显色反应影响显著，其余因素的作用不显著，最佳显色条件为A2B3C2D1E1F3，即氢氧化钙 0.05g，20%硫酸铜 0.8 ml，浓硫酸 6 ml，对羟基联苯 0.125 ml，静置时间 15 min，加热显色时间 5 min。

（3）乳酸标准曲线的制备

乳酸标准应用液浓度在 10~80 μg/ml范围内与吸光度值基本呈