菌种筛选SOP

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1.目的 (2)

2.范围 (2)

3.职责 (2)

4.详述 (2)

4.1适用菌株 (2)

4.2实验准备 (2)

4.3一代种子筛选 (5)

4.4二代种子筛选 (6)

4.5注意事项 (8)

分发：研发实验室

1.目的

本SOP规定了菌种的筛选方法及操作要求，以达到实验员能正确操作的目的。

2.范围

本SOP适用于菌种的筛选实验。

3.职责

研发部从事菌种筛选的员工负责按照此规程执行，研发部主管负责监督此规程的实施。

4.详述

4.1适用菌株

4.1.1菌株为大肠杆菌；

4.1.2质粒为基因片段与pET载体连接构建而成；

4.1.3菌株抗性为氨苄青霉素(或所需)；

4.1.4蛋白表达方式为融合表达；

4.1.5诱导剂为IPTG。

4.2实验准备

4.2.13种枪头（1 ml、100 μl及10 μl）×2、Eppendorf管、冻

存管及移液管放入容器内，使用纸分别包好，121℃灭菌

20分钟。灭菌结束后立即取出放入超净工作台，使用期

限一个星期。

4.2.2取30个100 ml锥形瓶，使用封口纸包好，30支带盖试

管（10 mm×100 mm），放入器皿中，121℃灭菌20分

钟。灭菌结束后立即取出放入无菌操作间。

4.2.3一次性培养皿一袋5个、一次性过滤器若干、10 ml洁净

针管2支放入超净工作台，紫外灯照射30分钟以上。4.2.4氨苄青霉素（amp，100 mg /ml）：准确称取1.0 g氨苄青

霉素溶于10 ml水中，在超净工作台中，使用一次性0.22 μm过滤器过滤除菌，分装成1 ml，写好标签后置于-20℃

保存，使用期限三个月。

4.2.5IPTG（100 mM）：准确称取238.3 mg IPTG溶于10 ml

水中，在超净工作台中，使用一次性0.22 μm过滤器过滤

除菌，分装成1 ml后置于-20℃保存，使用期限一个月。

4.2.6LB平板×5：称取0.6 g蛋白胨、0.3 g 酵母粉、0.6 g NaCl

及1.2 g 琼脂粉，加入至100 ml锥形瓶中，加入60 ml

去离子水，溶解混匀，包好纱布及牛皮纸，121℃灭菌20

分钟。灭菌结束后冷却至不烫手，在超净工作台中，加

入60 μl上述过滤除菌的氨苄青霉素，摇匀后迅速倒入准

备好的培养皿中，每块培养皿倒入约10 ml LB溶液，共

计5块平板。溶液倒入后，将培养皿盖半开，吹干10-15

分钟。合上盖，注明培养基与抗性，用封口膜封好，放

置于4℃保存，72小时内使用，多余平板放在37℃培养，作为假阳性对照。

4.2.7LB培养基：称取

5.0 g蛋白胨、2.5 g 酵母粉及5.0 g NaCl，

加入至500 ml蓝盖瓶中，加入500 ml去离子水，溶解混

匀，微松瓶盖，121℃灭菌20分钟。灭菌结束后旋紧瓶

盖，冷却至室温，在超净工作台中加入500 μl上述过滤

除菌的氨苄青霉素，置于4℃保存，24小时内使用。

4.2.830%甘油：称取30 g甘油，加水混匀，定容至100 ml，

装入100 ml蓝盖瓶中，微松瓶盖，121℃灭菌20分钟。

灭菌结束后旋紧瓶盖，冷却至室温后，置于4℃保存，24

小时内使用。

4.2.9正常转化的菌平板。

4.3一代种子筛选

4.3.1活化：17:00在无菌超净工作台中，使用小枪头在转化平

板上挑选10颗大小适中、色泽正常，形状规则的单克隆，

分别放入含5 ml LB培养基（含100 μg/ml amp）的试管

中，写明编号，120 rpm ，37℃培养16小时进行活化。

4.3.2培养：次日9:00，在无菌超净工作台中，取10个灭菌的

100 ml锥形瓶，分别加入10 ml LB培养基（含100 μg/ml

amp）。在每支试管中取100 μl菌液依次接种至各含有

10 ml培养基的100 ml的锥形瓶中，写明编号，37℃，200

rpm培养4小时。

4.3.3保种：在无菌超净工作台中，取灭菌冻存管，在火焰下

打开盖子，加入400 μl30%甘油。在试管中取400 μl菌

液加入其中混匀，火焰下封好盖口。每支试管的菌种保

存3支，注明编号，置于-80℃保存。

4.3.4诱导：13:00时，在无菌超净工作台中，从每个锥形瓶中

取出1 ml菌液，稀释3倍测量菌液OD600值。此时菌液

OD600值约在1左右。同时向每个锥形瓶中加入90 μl准

备好的IPTG进行诱导，诱导终浓度为1 mM。放入摇床

继续培养，温度为37℃，摇床转速为200 rpm。

4.3.5收菌：诱导3小时后，每瓶菌液取1 ml加入至Eppendorf

管，10000 rpm，离心3分钟，弃净上清，收集菌体，置

于-20℃保存。同时从瓶中取菌液稀释10倍，测量OD600

值，此时菌液OD600值约在2-3。

4.3.6筛选：在每支含有菌体的Eppendorf管中，加入100 μl 1×

电泳液制作样品，按照蛋白电泳SOP进行操作。根据电

泳结果，结合细菌生长OD600值筛选出3个菌种。

4.4二代种子筛选

4.4.1划板：17:00从-80℃冰箱中取出筛好的3支冻菌菌种，快

速融化。在无菌超净工作台中，将接种环在火焰上来回

烧烤，并烧红至少半分钟，冷却后取冻菌。取含有amp

的LB平板，靠平板一侧沿同一方向划4-5条横线。将接

种环在火焰上再次烧红至少半分钟，冷却后，在平板上

沿刚才划线的垂直方向划7-8条横线。划好后合盖，标明

3支菌种编号，倒置于37℃恒温培养箱中，培养16小时。

次日9:00，确认平板上菌落生长良好，将其取出，用封

口膜封好，放置于4℃保存。

4.4.2活化：17:00在无菌超净工作台中，使用小枪头在3块平

板上各挑选5颗大小适中、形状规则的单克隆，分别放

入含10 ml LB培养基（含100 μg/ml amp）的试管中，共

15支，写明编号，120 rpm ，37℃培养16小时进行活化。

4.4.3培养：第三日9:00，在无菌超净工作台中，取15个灭菌

的100 ml锥形瓶，分别加入10 ml LB培养基（含100 μg/ml

amp）。在每支试管中取100 μl菌液依次接种至各含有

10 ml培养基的100 ml的锥形瓶中，写明编号，37℃，200

rpm培养4小时。

4.4.4保种：在无菌超净工作台中，取灭菌冻存管，在火焰下

打开盖子，加入400 μl30%甘油。在试管中取400 μl菌

液加入其中混匀，火焰下封好盖口。每支试管的菌种保

存20支，注明编号，置于-80℃保存。

4.4.5诱导：13:00时，在无菌超净工作台中，从每个锥形瓶中

取出1 ml菌液，稀释3倍测量菌液OD600值。此时菌液

OD600值约在1左右。同时向每个锥形瓶中加入90 μl准

备好的IPTG进行诱导，诱导终浓度为1 mM。放入摇床

继续培养，温度为37℃，摇床转速为200 rpm。

4.4.6收菌：诱导3小时后，每瓶菌液取1 ml加入至Eppendorf

管，10000 rpm，离心3分钟，弃上清，收集菌体，置于

-20℃保存。同时从瓶中取菌液稀释10倍，测量OD600

值，此时菌液OD600值约在2-3。

4.4.7筛选：在每支含有菌体的Eppendorf管中，加入100 μl 1×

电泳液制作样品，按照蛋白电泳SOP进行操作。根据电

泳结果，结合细菌生长OD600值筛选出最好的菌种。

4.5注意事项

4.5.1无菌操作环节要注意规范操作，尤其在冻菌环节，切忌

交叉污染。

4.5.2肉眼可见有异常（变色或者有异物等）或者通过检测生

长有异常（OD600值过高或过低）的菌立即淘汰，停止下

步操作，并作好记录。

4.5.3一代菌种编号：例如Z130329-3，Z表示连接转化的一代

菌种；130329表示转化日期：年月日；3表示当次筛选

的3号菌。

4.5.4二代菌种编号：例如130412-2-7，130412表示筛选日期：

年月日；2表示第2块平板（同一代菌种编号中的筛选

结果菌号一致）；7表示第二块平板上筛选的7号菌。

4.5.5所有需要灭菌的溶液，瓶口用盖子密封的，在灭菌前需

要在盖子外面包上纸进行密封，灭菌结束后在超净台内

降温，待温度降低至不烫手时打开纸质密封，快速拧紧瓶盖。

4.5.6认真测量菌种OD600值，并对电泳结果及时记录。

乳酸菌菌种的分离筛选方法

乳酸菌菌种的分离筛选方法乳酸细菌是一类能利用发酵糖产生大量乳酸的细菌通称。为兼性厌氧菌，杆状或球状，革兰氏阳性菌，无芽孢，不运动。营养要求高，需要提供丰富的肽类氨基酸维生素。在琼脂表面或内层形成较小的白色或淡黄色的菌落。通常用作为有益微生物的菌种有乳酸乳杆菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、粪肠球菌、乳酸片球菌、双歧杆菌、屎肠球菌、戊糖片球菌等。乳杆菌常用MRS琼脂作半选择培养基。当乳杆菌仅是复杂区系中的部分菌类时，SL培养基常用作为选择性培养基。对于芽孢乳杆菌常用GYP培养基，链球菌有TYC培养基、MS培养基。M17培养基被用作乳球菌的分离培养基。嗜酸乳杆菌属于乳杆菌属的一个种。其特性为：杆菌，两端圆，不运动，无鞭毛。粪肠球菌为革兰氏阳性，圆形或椭圆形。乳酸片球菌细胞呈球状，直径0.6~1.0μm，在直角两个平面交替形成四联状，一般细胞成对生，单生者罕见，不成链状排列。革兰氏阳性，不运动，兼性厌氧。在MRS培养基上菌落小，呈白色。沿洋菜穿刺线的生长物呈丝状。乳酸菌在一般琼脂培养基上形成微小菌落，不易观察，所以分离时先富集培养并选择合适的培养基。分离培养基一般添加西红柿、酵母膏、吐温-80等物质，也常常加入醋酸盐，因醋酸盐能抑制部分细菌生长，对乳酸菌无害。培养基中添加碳酸钙，乳酸溶解培养基中的碳酸钙形成透明圈，作为分离鉴别的依据，通过对生成的乳酸量进行性能鉴定。乳酸菌生长繁殖时需要多种氨基酸，维生素及微氧，一般菌落比较小。分离培养基一般可添加西红柿酵母膏油酸吐温等物质，均具有促进生长作用。也常常添加醋酸盐抑制有些细菌的生长，对乳酸菌无害。一.筛选方法： 1.溶钙圈法：利用一些产酸类细菌在含CaCO3的培养基上产生CaCO3溶解圈，从而筛选出这些产酸类细菌，可用于乳酸菌的筛选。其中培养基中加入CaCO3的作用是：①鉴别能产生酸的细菌；②中和产生的酸，以维持培养基的PH。筛选过程：样品预处理→梯度稀释至10-6→选择合适的稀释度涂布→37℃培养

菌种筛选方法 (2)

菌种筛选方法在实际工作中，为了提高筛选效率，往往将筛选工作分为初筛和复筛两步进行。初筛的目的是删去明确不符合要求的大部分菌株，把生产性状类似的菌株尽量保留下来，使优良菌种不致于漏网。因此，初筛工作以量为主，测定的精确性还在其次。初筛的手段应尽可能快速、简单。复筛的目的是确认符合生产要求的菌株，所以，复筛步骤以质为主，应精确测定每个菌株的生产指标,测得的数据要能够反映将来的生产水平。 1 从菌体形态变异分析有时，有些菌体的形态变异与产量的变异存在着一定的相关性，这就能很容易地将变异菌株筛选出来。尽管相当多的突变菌株并不存在这种相关性，但是在筛选工作中应尽可能捕捉、利用这些直接的形态特征性变化。当然，这种鉴别方法只能用于初筛。有人曾统计过3,484个产维生素B2的阿舒假囊酵母(Eremoth ecium ashbyii)的变异菌落，发现高产菌株的菌落形态有以下特点：菌落直径呈中等大小（8-10毫米），凡过大或过小者均为低产菌株；色泽深黄色，凡浅黄或白色者皆属低产菌株。又如，在灰黄霉素产生菌荨麻青霉(Penicillium urticae)的育种中，曾发现菌落的棕红色变深者往往产量有所提高，而在赤霉素生产菌藤仓赤霉（Gibberell a fujikuroi）中，却发现菌落的紫色加深者产量反而下降。 2 平皿快速检测法平皿快速检测法是利用菌体在特定固体培养基平板上的生理生化反应，将肉眼观察不到的产量性状转化成可见的

"形态"变化。具体的有纸片培养显色法、变色圈法、透明圈法、生长圈法和抑制圈法等，见图。这些方法较粗放，一般只能定性或半定量用，常只用于初筛，但它们可以大大提高筛选的效率。它的缺点是由于培养平皿上种种条件与摇瓶培养，尤其是发酵罐深层液体培养时的条件有很大的差别，有时会造成两者的结果不一致。图平皿快速检测法示意图平皿快速检测法操作时应将培养的菌体充分分散，形成单菌落，以避免多菌落混杂一起，引起"形态"大小测定的偏差。 1) 纸片培养显色法将饱浸含某种指示剂的固体培养基的滤纸片搁于培养皿中，用牛津杯架空，下放小团浸有3%甘油的脱脂棉以保湿，将待筛选的菌悬液稀释后接种到滤纸上，保温培养形成分散的单菌落，菌落周围将会产生对应的颜色变化。从指示剂变色圈与菌落直径之比可以了解菌株的相对产量性状。指示剂可以是酸碱指示剂也可以是能与特定产物反应产生颜色的化合物。 2) 变色圈法将指示剂直接掺入固体培养基中，进行待筛选菌悬液的单菌落培养，或喷洒在已培养成分散单菌落的固体培养基表面，在菌落周围形成变色圈。如在含淀粉的平皿中涂布一定浓度的产淀粉酶菌株的菌悬液，使其呈单菌落，然后喷上稀碘液，发生显色反应。变色圈越大，说明菌落产酶的能力越强。而从变色圈的颜色又可粗略判断水解产物的情况。 3) 透明圈法在固体培养基中渗入溶解性差、可被特定菌利用的营养成分，造成浑浊、不透明的培养基背景。将待筛选在菌落周围就

营养缺陷型菌株的筛选

营养缺陷型菌株的筛选采用辐射，化学试剂等因素处理细菌，以提高其变异几率，关键步骤是进行营养缺陷型微生物的筛选工作，营养缺陷型是指通过诱变产生的，由于发生了丧失某酶合成能力的突变，因而只能在加有该酶合成产物的培养基中才能生长的突变株。营养缺陷型的筛选与鉴定涉及下列几种培养基：基本培养基（MM，符号为[-]）是指仅能满足某微生物的野生型菌株生长所需的最低成分的合成培养基。完全培养基(CM，符号为[+])是指可满足某种微生物的一切营养缺陷型菌株的营养需要的天然或半合成培养基。补充培养基（SM，符号为[A]或[B]等）是指在基本培养基中添加某种营养物质以满足该营养物质缺陷型菌株生长需求的合成或半合成培养基。营养缺陷型菌株不仅在生产中可直接作发酵生产核苷酸、氨基酸等中间产物的生产菌，而且在科学实验中也是研究代谢途径的好材料和研究杂交、转化、转导、原生质融合等遗传规律必不可少的遗传标记菌种。营养缺陷型的筛选一般要经过诱变、淘汰野生型、检出和鉴定营养缺陷型四个环节。现分述如下：第一步，诱变剂处理：与上述一般诱变处理相同。

第二步，淘汰野生型：在诱变后的存活个体中，营养缺陷型的比例一般较低。通过以下的抗生素法或菌丝过滤法就可淘汰为数众多的野生型菌株即浓缩了营养缺陷型。抗生素法有青霉素法和制霉菌素法等数种。青霉素法适用于细菌，青霉素能抑制细菌细胞壁的生物合成，杀死正在繁殖的野生型细菌，但无法杀死正处于休止状态的营养缺陷型细菌。制霉菌素法则适合于真菌，制霉菌素可与真菌细胞膜上的甾醇作用，从而引起膜的损伤，也是只能杀死生长繁殖着的酵母菌或霉菌。在基本培养基中加入抗生素，野生型生长被杀死，营养缺陷型不能在基本培养基中生长而被保留下来。菌丝过滤法适用于进行丝状生长的真菌和放线菌。其原理是：在基本培养基中，野生型菌株的孢子能发芽成菌丝，而营养缺陷型的孢子则不能。通过过滤就可除去大部分野生型，保留下营养缺陷型。第三步，检出缺陷型：具体方法很多。用一个培养皿即可检出的，有夹层培养法和限量补充培养法；在不同培养皿上分别进行对照和检出的，有逐个检出法和影印接种法。可根据实验要求和实验室具体条件加以选用。现分别介绍如下：

乳酸菌菌种分离筛选方法

菌种筛选方法

常用的菌种的筛选方法如下：（1）施加选择性压力分离法主要是利用不同种类的微生物其生长繁殖对环境和营养的要求不同，如温度、pH、渗透压、氧气、碳源、氮源等，人为控制这些条件，使之利于某类或某种微生物生长，而不利于其他种类微生物的生存，以达到使目的菌种占优势。而得以快速分离纯化的目的。如可以控制培养时的氧，可将好氧微生物和厌氧微生物分开；通过控制温度，可将嗜热微生物和非嗜热微生物分开；控制pH，可将嗜酸、嗜碱微生物分离等。在分离培养基中也可以加入不同的抗生素或试剂来增加选择性。如在分离放线菌和细菌时，可加入抗真菌抗生素；分离真菌时，可加入抗细菌药物。（2）随机分离方法有些微生物的产物对筛选没有直接的选择性指示作用，因此常采用随机分离方法分离。 A、抗生素产生菌的分离抗生素产生菌的分离常用抑菌圈法。实验必须用工具菌：采用抗生素的敏感菌，传统上常用金黄色葡萄球菌和枯草杆菌。 B、抗肿瘤药物产生菌的分离抗肿瘤药物产生菌的分离常用方法：生化诱导法、SOS生色检测法、DNA修复能力突变株。原理是利用DNA的损伤，微生物发生突变。B1、生化诱导法：将大肠杆菌的lacZ基因连接在λ噬菌体的PL启动子下，当DNA损伤时，诱发λ阻遏物CI分解，PL启动子启动lacZ基因转录，测定表达的?-半乳糖苷酶活性，来检测药物的存在。B2、SOS生色检测法：利用当DNA损伤时，可活化yecA蛋白，进而分解噬菌体的阻遏蛋白，再引起sifA基因启动lacZ基因转录，测定表达的?-半乳糖苷酶活性，来检测药物的存在。 C、生长因子产生菌的分离以氨基酸产生菌为例，介绍筛选方法。首先将待试菌接入加了抗真菌的化合物（如亚胺环己酮）的分离培养基中生长，然后采用影印法，将菌落复印到能支持氨基酸产生菌生长的培养基中，培养2-3天后，用紫外线杀司长好的菌落，再往此平板上面铺一层相应营养缺陷型菌株菌悬液，培养16小时后，被杀死的氨基酸产生菌的菌落周围应有一检测菌的生长圈。（3）目的微生物分离 A、根据形态筛选突变株 B、根据平板菌落生化反应筛选变株透明圈法、呈色圈法、抑菌圈法、浑浊圈法等。①透明圈法：在平板培养基中加入溶解性较差的底物，使培养基混浊。能分解底物的微生物便会在菌落周围产生透明圈，圈的大小初步反应该菌株利用底物的能力。该法在分离水解酶产生菌时采用较多，如脂肪酶、淀粉酶、蛋白酶、核酸酶产生菌都会在含有底物的选择性培养基平板上形成肉眼可见的透明圈。在分离某种产生有机酸的菌株时，也通常采用透明圈法进行初筛。在选择性培养

菌种的筛选和分离

工业微生物菌种的分离与筛选来源：青岛海博一、微生物工业对菌种的要求 (一)、微生物工业的生产水平由三个要素决定：生产菌种的性能、发酵及提纯工艺条件、生产设备。其中生产菌种的性能是最重要的因素。（二）、微生物工业对菌种的要求是：（1）菌株高产，在较短的时间内发酵产生大量发酵产物的能力; （2）在发酵过程中不产生或少产生与目标产品相近的副产品及其他产物; （3）生长繁殖能力强，较强的生长速率，产孢子的菌种应该具有较强的产孢子能力; （4）能够高效地将原理转化为产品; （5）能利用广泛的原材料，并对发酵原料成分的波动敏感性小; （6）对需要添加的前体物质有耐受能力，并且不能将这些前体物质作为一般碳源利用; （7）在发酵过程中产生的泡沫要少; （8）具有抗噬菌体的能力；（9）遗传稳定性，二、工业用微生物菌种的来源及选育（一）微生物菌种的来源一般通过以下几个途径收集菌种、采集样品和分离筛选：（1）是根据资料直接向有科研单位、高等院校、工厂或菌种保藏部门索取或购买；（2）从大自然中采集样品分离；（3）从一些发酵制品中分离筛选目的菌株。当前发酵工业所用菌种总趋势是从野生菌转向变异菌，自然选用转向代谢育种，从诱发基因突变转向基因重组的定向育种。（二）微生物工业菌种的分离 1、野生菌株的分离、筛选过程（1）新菌种分离与筛选的步骤菌种分离的流程如下：标本采集→标本材料的预处理→富集培养→菌种初筛→菌种复筛→性能鉴定→菌种保藏①采样采样季节：以温度适中，雨量不多的秋初为好。采土方式：在选好适当地点后，用小铲子除去表土，取离地面5-15cm处的土约10g，盛入清洁的牛皮纸袋或塑料袋中，扎好，标记，记录采样时间、地点、环境条件等，以备查考。为了使土样中微生物的数量和类型尽少变化，宜将样品逐步分批寄回，以便及时分离。 ②标本预处理 ④纯种分离：采用划线分离法、稀释分离法等纯化方法获取单菌落。 ⑤高产菌株的筛选：这一步是采用与生产相近的培养基和培养条件，通过三角瓶的容量进行小型发酵试验，获得适合于工业生产用菌种。还要对菌种进行发酵性能测定， ⑥毒性试验：据有的国家规定，微生物中除啤酒酵母、脆壁酵母、黑曲霉、米曲霉和枯草杆

菌种的分离与筛选

一、微生物工业对菌种的要求 (一)、微生物工业的生产水平由三个要素决定：生产菌种的性能、发酵及提纯工艺条件、生产设备。其中生产菌种的性能是最重要的因素。（二）、微生物工业对菌种的要求是：（1）菌株高产，在较短的时间内发酵产生大量发酵产物的能力; （2）在发酵过程中不产生或少产生与目标产品相近的副产品及其他产物; （3）生长繁殖能力强，较强的生长速率，产孢子的菌种应该具有较强的产孢子能力; （4）能够高效地将原理转化为产品; （5）能利用广泛的原材料，并对发酵原料成分的波动敏感性小; （6）对需要添加的前体物质有耐受能力，并且不能将这些前体物质作为一般碳源利用; （7）在发酵过程中产生的泡沫要少; （8）具有抗噬菌体的能力；（9）遗传稳定性，二、工业用微生物菌种的来源及选育（一）微生物菌种的来源一般通过以下几个途径收集菌种、采集样品和分离筛选：（1）是根据资料直接向有科研单位、高等院校、工厂或菌种保藏部门索取或购买；（2）从大自然中采集样品分离；（3）从一些发酵制品中分离筛选目的菌株。当前发酵工业所用菌种总趋势是从野生菌转向变异菌，自然选用转向代谢育种，从诱发基因突变转向基因重组的定向育种。（二）微生物工业菌种的分离 1、野生菌株的分离、筛选过程（1）新菌种分离与筛选的步骤菌种分离的流程如下：标本采集→标本材料的预处理→富集培养→菌种初筛→　菌种复筛→性能鉴定→　菌种保藏①采样采样季节：以温度适中，雨量不多的秋初为好。采土方式：在选好适当地点后，用小铲子除去表土，取离地面5-15cm处的土约10g，盛入清洁的牛皮纸袋或塑料袋中，扎好，标记，记录采样时间、地点、环境条件等，以备查考。为了使土样中微生物的数量和类型尽少变化，宜将样品逐步分批寄回，以便及时分离。 ②标本预处理 ④纯种分离：采用划线分离法、稀释分离法等纯化方法获取单菌落。 ⑤高产菌株的筛选：这一步是采用与生产相近的培养基和培养条件，通过三角瓶的容量进行小型发酵试验，获得适合于工业生产用菌种。还要对菌种进行发酵性能测定， ⑥毒性试验：据有的国家规定，微生物中除啤酒酵母、脆壁酵母、黑曲霉、米曲霉和枯草杆菌作为食用无须作毒性试验外，其他微生物作为食用，均需通过两年以上的毒性试验。 2、菌种的分离方法（1）施加选择性压力分离法主要是利用不同种类的微生物其生长繁殖对环境和营养的要求不同，如温度、pH、渗透压、氧气、碳源、氮源等，人为控制这些条件，使之利于某类或某种微生物生长，而不利于其他种类微生物的生存，以达到使目的菌种占优势．而得以快速分离纯化的目的。如可以控制培

菌株筛选方法

第二章餐厨垃圾堆肥产酶菌株筛选 2 材料与方法 2.1 材料 2.1.1 实验材料 1）筛选材料：HM菌剂（河南恒隆态生物工程股份有限公司）；EM菌剂（江西天意集团）；金宝贝菌剂（北京华夏康源科技有限公司）；群林发酵剂（广西北海群林生物工程有限公司）。 2）发酵材料：餐厨垃圾（购自贵州大学南校区学生食堂）；稻草（购自铜仁市，晒干后粉碎至5mm左右）。 2.1.2 主要药品及试剂 2.1.3 实验仪器电子分析天平（EL-2005）西特传感技术有限公司高速台式离心机（TGL-161）Thermo公司冷冻离心机（2-16k）德国eppendorf公司标准型净化工作台上海锦星科学仪器有限公司低温冰箱〔BCD-108E）风华电器厂超低温冰箱(Forma-6C ULT) Thermo公司调温调湿箱（WS/08-01）重庆试验设备厂干燥箱（101-2）上海实验仪器总厂自动三重水蒸馏器（SZ-97）上海亚荣生化仪器厂高压灭菌锅（GMSX-280）英国阿斯太欧（Astell）公司循环水浴锅（RET7）Thermo公司电热恒温培养箱（DH3600) 天津泰斯特仪器有限公司

恒温摇床（SKY-2102C) 上海苏坤实业有限公司高速组织捣碎机（DS-1) 上海标本模型厂磁力双向搅拌器（90-1）上海亚荣生化仪器厂 pH计 ACS交直流两用电子计价秤昆明金瑞克电子衡器有限公司双金属温度计（WSS-411）天津市新华热工仪表有限公司河北铁狮磨浆机械有限公司秸秆揉丝饲料粉碎多用机（9R-30) 紫外分光光度计 2.1.6 培养基 1）初筛培养基（1）细菌培养基（%）：牛肉膏0.3；蛋白胨1.0；氯化钠0.5；琼脂粉2.0；pH7.2 （2）霉菌培养基（%）：磷酸二氢钾0.1；七水硫酸镁0.05；蛋白胨0.5；葡萄糖1.0；琼脂粉2.0；孟加拉红0.03；pH自然；链霉素30μg/m L （3）乳酸菌培养基（%）：蛋白胨1；牛肉膏1；酵母膏0.5；柠檬酸二铵0.2；葡萄糖2.0；吐温80 0.1；乙酸钠0.5；三水磷酸氢二钾0.2；七水硫酸镁0.058；七水硫酸锰0.025；琼脂粉2.0；pH6.2 （4）放线菌培养基（%）：可溶性淀粉2；氯化钠0.05；硝酸钾0.1；磷酸氢二钾0.05；七水硫酸镁0.05；七水硫酸亚铁0.001；重铬酸钾0.015；琼脂粉2.0；pH7.4；青霉素3μg/ml 2）复筛培养基（1）产淀粉酶筛选培养基（%）：可溶性淀粉0.2；蛋白胨1.0；酵母膏0.5；磷酸氢二钾0.3；七水硫酸亚铁微量；七水硫酸镁微量；琼脂粉2.0；pH7.0 【陈秋红,孙梅,施大林,等.益生菌酪酸菌CB-7发酵培养基及培养条件的研究.科学试验与研究[J].2009,4:7-10,21】（2）产脂肪酶筛选培养基（%）：硫酸铵0.1；磷酸氢二钾0.1；氯化钾0.05；七水硫酸镁0.01；橄榄油1.0；聚乙烯醇0.1；琼脂粉2.0；pH8.5 【刘敏,曹志军,焦艳芬,等. UHT 乳中产耐高温脂肪酶嗜冷菌的研究[J]. 内蒙古农业大学学报.2008,29(1):230-233】（3）产纤维素酶筛选培养基（%）：七水硫酸镁0.01；羧甲基纤维素钠1.5；氯

“产淀粉酶菌株的筛选”设计方案

产淀粉酶(a -淀粉酶)细菌菌株筛选实验目的： 1. 掌握从环境中采集样品并从中分离纯化某种微生物的完整操作步骤。 2. 巩固以前所学的微生物学实验技术。 3. 学习淀粉酶活性的测定方法。实验原理： 1. a -淀粉酶是一种液化型淀粉酶，它的产生菌芽孢杆菌，广泛分布于自然界，尤其是在含有淀粉类物质的土壤等样品中。 2. 从自然界筛选菌种的具体做法，大致可以分成以下四个步骤：采样、富集培养、初步筛选、分离纯化和性能测定。 a) 采样：即采集含菌种的样品采集含菌样品前应调查研究一下自己打算筛选的微生物在哪些地方分布最多，然后才可着手做各项具体工作。在土壤中几乎各种微生物都可以找到，因而土壤可说是微生物的大本营。例如厨房土壤、面粉加工厂和菜园土壤中淀粉的分解菌较多。 b) 富集培养：富集培养就是在所采集的土壤等含菌样品中加入某些物质，并创造一些有利于待分离微生物生长的其他条件，使能分解利用这类物质的微生物大量繁殖，从而便于我们从其中分离到这类微生物。 c) 初步筛选： i. (选择培养基) 初筛使用选择培养基对菌种进行培养，通过培养基的特殊成分，来筛选出目的菌种，从而进行培养。 ii. (鉴别培养基) 初筛利用鉴别培养基，通过添加一些特殊的试剂或成分来鉴别出目的菌种，从而筛选出来并对其进行培养。 d) 分离纯化：通过上述的筛选只能说我们要分离的目的菌种已经存在，但还要把夹杂在其中的杂菌除去，从而得到纯种的菌落。纯种分离的方法很多，主要有：平板划线分离法、稀释分离法、单孢子或单细胞分离法、菌丝尖端切割法等。 e) 性能测定：分离纯化得到的菌种之后，所分得的菌种是否具有实验所要求的性能，还必须要进行性能测定后才能决定取舍。实验材料： 1. 培养基配制： a) 培养基按以下比例配制后，加蒸馏水调至100%； b) 富集培养基：可溶性淀粉1%、蛋白胨1%、葡萄糖0.5%、NaCl 0.5%、牛肉膏 0.5%、pH7.0； c) 分离培养基：玉米粉2%、黄豆饼粉1.5%、琼脂粉0.8%、CaCl 0.02%、MgSO4 0.02%、NaCl 0.25%、K2HPO4 0.2%、柠檬酸钠0.2%、硫酸铵0.075%(溶解后加入) 、Na2HPO40.2%、pH7.0。 2. 主要试剂和溶液的配制： a) 2%淀粉溶液：准确称取淀粉2g 溶于100ml 0.1mol/L pH5.6 的柠檬酸缓冲液中。 b) 0.1mol/L 的柠檬酸缓冲液、pH=1.0 的盐酸 c）1%的3, 5-二硝基水杨酸：精确称取1g3, 5-二硝基水杨酸，溶于20ml 2mol/L 氢氧化钠溶液中，加入蒸馏水50ml，再加入四水酒石酸钾钠30g，待溶解后用蒸馏水定容100ml，盖紧瓶塞，隔绝CQ。 d）0.1%葡萄糖溶液：准确称取80 C烘干至恒重的无水葡萄糖0.1g，去离子水溶解后定容至100ml。

醋酸菌菌种分离筛选方法

醋酸菌菌种分离筛选方法醋酸菌的细胞为椭圆至杆状，单个成双或成链，鞭毛周生或端生，运动或不运动，革兰氏阴性菌，好氧菌，一般在乙醇或其他可氧化物的酵母煮液或酵母消化液培养基生长旺盛。醋酸的钠盐和钙盐与三氯化铁共热，生成红褐色沉淀，原液变成无色。可进行分离菌鉴别。 1.培养基： 1.1米曲汁乙醇碳酸钙培养基：米曲汁（10-12BX）1000mlCaCO 310-15g95℅乙醇30-40ml（灭菌后加入）PH自然 1.2葡萄糖碳酸钙培养基：葡萄糖15g/L酵母膏10g/L CaCO 315g/LPH 6.8 1.3乙醇30mL/L酵母膏10g/L葡萄糖10g/L CaCO 310-15g/L（常规筛选培养基）PH 6.8-7.0注：常规培养基中的碳酸钙易沉淀，平板不易观察到透明圈，选择米曲汁乙醇碳酸钙培养基为好。 1.4醋酸菌保存培养基：酵母膏15g/L葡萄糖10g/L CaCO 315-20g/L琼脂15-20 g/L 3-4滴乙醇/试管。 1.5液体种子和发酵培养基：乙醇30-35mL/L膏酵母10g/葡萄糖10g/L KH 2PO 40.5g/L MgSO 40.5g/L PH 6.5-6.8 2.菌种筛选：

2.1集菌：1-2g（5ml）样品，在无菌下加入30-50ml/250ml米曲汁乙醇液体培养基（0.5ml 0.02℅结晶紫醋酸溶液/100ml培养液）中， 130-33℃震荡培养24-48h，集菌液PH明显下降，有醋味，镜检细胞革兰氏染色阴性。形态与醋酸菌相符即可分离。 2.2混菌法分离：（分离及初筛）适度稀释10-5、10-6、10-7取1.0ml菌液置于无菌平板或涂布中，每个梯度平行两次，米曲汁乙醇碳酸钙培养基倒平板，30℃24-48h，观察有小菌落出现，菌落周围形成透明圈，圈的大小因菌而异。挑透明圈出现早且菌落丰厚，边缘整齐，生长旺盛不同的菌落转接于曲汁乙醇碳酸钙斜面，30-33℃24-48h。根据菌落周围溶解透明圈大小初步筛选出产酸高的菌种。 2.3性能测定：（复筛）不同菌落接种于液体曲汁乙醇培养基（30-50ml/250ml）中，30℃震荡培养24-48h。2.3.1镜检：染色镜检细胞整齐，椭圆或短杆状，革兰氏阴性菌。 2.3.2性能测定：醋酸定性分析：取发酵液（离心去菌体）5.0ml于洁净试管中，用10℅氢氧化钠中和PH至7.0，加入1℅三氯化铁溶液2-3滴，摇匀，观察溶液是否变黄褐色，加热共沸，形成红褐色沉淀，原液变无色者为产醋酸细菌。生酸量测定：1.0ml发酵液于150ml三角瓶中，加中性蒸馏水10-20ml，酚酞指示剂2滴，用0.1mol/l氢氧化钠滴定至微红色。醋酸量（g/100mL）=氢氧化钠摩尔浓度.Vx60.06x10-3/样品毫升数x100 2同时，进行单因素试验，分别考察醋酸速度，耐高温，耐酒精度，耐低酸度等主要生产性能，选择优势菌株。 3

菌种筛选SOP

菌种筛选SOP 制订：日期：签名：年月日制订部门：签名：审核：日期：年月日批准：日期：签名：年月日文件号：版本号：修订日期：年月日执行日期：年月日目录 1.目的 (2) 2.范围 (2) 3.职责 (2) 4.详述 (2) 4.1适用菌株 (2) 4.2实验准备 (2) 4.3一代种子筛选 (5) 4.4二代种子筛选 (6) 4.5注意事项 (8) 分发：研发实验室

1.目的本SOP规定了菌种的筛选方法及操作要求，以达到实验员能正确操作的目的。 2.范围本SOP适用于菌种的筛选实验。 3.职责研发部从事菌种筛选的员工负责按照此规程执行，研发部主管负责监督此规程的实施。 4.详述 4.1适用菌株 4.1.1菌株为大肠杆菌； 4.1.2质粒为基因片段与pET载体连接构建而成； 4.1.3菌株抗性为氨苄青霉素(或所需)； 4.1.4蛋白表达方式为融合表达； 4.1.5诱导剂为IPTG。 4.2实验准备

4.2.13种枪头（1 ml、100 μl及10 μl）×2、Eppendorf管、冻存管及移液管放入容器内，使用纸分别包好，121℃灭菌 20分钟。灭菌结束后立即取出放入超净工作台，使用期限一个星期。 4.2.2取30个100 ml锥形瓶，使用封口纸包好，30支带盖试管（10 mm×100 mm），放入器皿中，121℃灭菌20分钟。灭菌结束后立即取出放入无菌操作间。 4.2.3一次性培养皿一袋5个、一次性过滤器若干、10 ml洁净针管2支放入超净工作台，紫外灯照射30分钟以上。4.2.4氨苄青霉素（amp，100 mg /ml）：准确称取1.0 g氨苄青霉素溶于10 ml水中，在超净工作台中，使用一次性0.22 μm过滤器过滤除菌，分装成1 ml，写好标签后置于-20℃ 保存，使用期限三个月。 4.2.5IPTG（100 mM）：准确称取238.3 mg IPTG溶于10 ml 水中，在超净工作台中，使用一次性0.22 μm过滤器过滤除菌，分装成1 ml后置于-20℃保存，使用期限一个月。 4.2.6LB平板×5：称取0.6 g蛋白胨、0.3 g 酵母粉、0.6 g NaCl 及1.2 g 琼脂粉，加入至100 ml锥形瓶中，加入60 ml

菌种筛选方法

菌种筛选方法 5.6 菌种筛选方法所有的微生物育种工作都离不开菌种筛选。尤其是在诱变育种工作中，筛选是最为艰难的也是最为重要的步骤。经诱变处理后，突变细胞只占存活细胞的百分之几，而能使生产状况提高的细胞又只是突变细胞中的少数。要在大量的细胞中寻找真正需要的细胞，就象是大海捞针，工作量很大。简洁而有效的筛选方法无疑是育种工作成功的关键。为了花费最少的工作量，在最短的时间内取得最大的筛选成效，就要求采用效率较高的科学筛选方案和手段。因为诱变育种中的筛选工作最复杂，所以，本节主要讨论诱变育种的筛选方法，这些方法也为其它育种方法的筛选提供了借鉴。 5.6.1菌种筛选方案在实际工作中，为了提高筛选效率，往往将筛选工作分为初筛和复筛两步进行。初筛的目的是删去明确不符合要求的大部分菌株，把生产性状类似的菌株尽量保留下来，使优良菌种不致于漏网。因此，初筛工作以量为主，测定的精确性还在其次。初筛的手段应尽可能快速、简单。复筛的目的是确认符合生产要求的菌株，所以，复筛步骤以质为主，应精确测定每个菌株的生产指标。 5.6.2 菌种筛选的手段筛选的手段必需配合不同筛选阶段的要求，对于初筛，要力求快速、简便，对于复筛，应该做到精确，测得的数据要能够反映将来的生产水平。 5.6.2.1 从菌体形态变异分析有时，有些菌体的形态变异与产量的变异存在着一定的相关性，这就能很容易地将变异菌株筛选出来。尽管相当多的突变菌株并不存在这种相关性，但是在筛选工作中应尽可能捕捉、利用这些直接的形态特征性变化。当然，这种鉴别方法只能用于初筛。有人曾统计过3,484个产维生素B2的阿舒假囊酵母(Eremohow(event)" class="t_tag">thecium ashbyii)的变异菌落，发现高产菌株的菌落形态有以下特点：菌落直径呈中等大小（8-10毫米），凡过大或过小者均为低产菌株；色泽深黄色，凡浅黄或白色者皆属低产菌株。又如，在灰黄霉素产生菌荨麻青霉(Penicillium urticae)的育种中，曾发现菌落的棕红色变深者往往产量有所提高，而在赤霉素生产菌藤仓赤霉（Gibberella fujikuroi）中，却发现菌落的紫色加深者产量反而下降。 5.6.2.2 平皿快速检测法平皿快速检测法是利用菌体在特定固体培养基平板上的生理生化反应，将肉眼观察不到的产量性状转化成可见的"形态"变化。具体的有纸片培养显色法、变色圈法、透明圈法、生长圈法和抑制圈法等，见图5.6.1。这些方法较粗放，一般只能定性或半定量用，常只用于初筛，但它们可以大大提高筛选的效率。它的缺点是由于培养平皿上种种条件与摇瓶培养，尤其是发酵罐深层液体培养时的条件有很大的差别，有时会造成两者的结果不一致。图 5.6.1 平皿快速检测法示意图平皿快速检测法操作时应将培养的菌体

菌种的筛选和分离复习课程

菌种的筛选和分离

工业微生物菌种的分离与筛选来源：青岛海博一、微生物工业对菌种的要求 (一)、微生物工业的生产水平由三个要素决定：生产菌种的性能、发酵及提纯工艺条件、生产设备。其中生产菌种的性能是最重要的因素。（二）、微生物工业对菌种的要求是：（1）菌株高产，在较短的时间内发酵产生大量发酵产物的能力; （2）在发酵过程中不产生或少产生与目标产品相近的副产品及其他产物; （3）生长繁殖能力强，较强的生长速率，产孢子的菌种应该具有较强的产孢子能力; （4）能够高效地将原理转化为产品; （5）能利用广泛的原材料，并对发酵原料成分的波动敏感性小; （6）对需要添加的前体物质有耐受能力，并且不能将这些前体物质作为一般碳源利用; （7）在发酵过程中产生的泡沫要少; （8）具有抗噬菌体的能力；（9）遗传稳定性，二、工业用微生物菌种的来源及选育（一）微生物菌种的来源一般通过以下几个途径收集菌种、采集样品和分离筛选：（1）是根据资料直接向有科研单位、高等院校、工厂或菌种保藏部门索取或购买；（2）从大自然中采集样品分离；（3）从一些发酵制品中分离筛选目的菌株。当前发酵工业所用菌种总趋势是从野生菌转向变异菌，自然选用转向代谢育种，从诱发基因突变转向基因重组的定向育种。（二）微生物工业菌种的分离 1、野生菌株的分离、筛选过程（1）新菌种分离与筛选的步骤菌种分离的流程如下：标本采集→标本材料的预处理→富集培养→菌种初筛→菌种复筛→性能鉴定→菌种保藏 ①采样采样季节：以温度适中，雨量不多的秋初为好。采土方式：在选好适当地点后，用小铲子除去表土，取离地面5-15cm处的土约10g，盛入清洁的牛皮纸袋或塑料袋中，扎好，标记，记录采样时间、地点、环境条件等，以备查考。为了使土样中微生物的数量和类型尽少变化，宜将样品逐步分批寄回，以便及时分离。

菌种的筛选和分离

工业微生物菌种得分离与筛选来源:青岛海博一、微生物工业对菌种得要求 (一)、微生物工业得生产水平由三个要素决定:生产菌种得性能、发酵及提纯工艺条件、生产设备。其中生产菌种得性能就是最重要得因素。 (二)、微生物工业对菌种得要求就是: (1)菌株高产,在较短得时间内发酵产生大量发酵产物得能力; (2)在发酵过程中不产生或少产生与目标产品相近得副产品及其她产物; (3)生长繁殖能力强,较强得生长速率,产孢子得菌种应该具有较强得产孢子能力; (4)能够高效地将原理转化为产品; (５)能利用广泛得原材料,并对发酵原料成分得波动敏感性小; (6)对需要添加得前体物质有耐受能力,并且不能将这些前体物质作为一般碳源利用; (7)在发酵过程中产生得泡沫要少; (8)具有抗噬菌体得能力; (9)遗传稳定性, 二、工业用微生物菌种得来源及选育 (一)微生物菌种得来源一般通过以下几个途径收集菌种、采集样品与分离筛选: (1)就是根据资料直接向有科研单位、高等院校、工厂或菌种保藏部门索取或购买; (2)从大自然中采集样品分离; (３)从一些发酵制品中分离筛选目得菌株。当前发酵工业所用菌种总趋势就是从野生菌转向变异菌,自然选用转向代谢育种,从诱发基因突变转向基因重组得定向育种。 (二)微生物工业菌种得分离 1、野生菌株得分离、筛选过程 (1)新菌种分离与筛选得步骤菌种分离得流程如下: 标本采集→标本材料得预处理→富集培养→菌种初筛→菌种复筛→性能鉴定→菌种保藏 ①采样采样季节:以温度适中,雨量不多得秋初为好。采土方式:在选好适当地点后,用小铲子除去表土,取离地面5—１５ｃm处得土约10g,盛入清洁得牛皮纸袋或塑料袋中,扎好,标记,记录采样时间、地点、环境条件等,以备查考。为了使土样中微生物得数量与类型尽少变化,宜将样品逐步分批寄回,以便及时分离。 ②标本预处理 ④纯种分离:采用划线分离法、稀释分离法等纯化方法获取单菌落。 ⑤高产菌株得筛选:这一步就是采用与生产相近得培养基与培养条件,通过三角瓶得容量进行小型发酵试验,获得适合于工业生产用菌种。还要对菌种进行发酵性能测定,

抗噬菌体菌株筛选

抗噬菌体菌株筛选噬菌体的分离取疑似噬菌体感染的生产菌株斜面或平板，用无菌蒸馏水将菌苔洗下，无菌过滤或离心，收集滤液或上清液。在摇瓶培养基中接种1%生产菌株的孢子或细胞悬浮液，适温下培养24 h，加入1%的上述滤液或56离心上清液，继续培养24 h，无菌离心或过滤，收集上清液或滤液。取上述上清液或滤液和生产菌株的孢子或细胞悬浮液各0.25ml，混匀后加在生产菌株的平板培养基上，用刮棒涂布均匀，适温下培养48~96h，确认是否生成噬菌斑。噬菌体的纯化与增殖将上述平板上长出的噬菌斑用接种针移入生产菌株培养12~24 h的摇瓶培养液中，继续培养24 h左右，无菌过滤或离心收集滤液或上清液。取上述滤液或上清液和生产菌株的孢子或细胞悬浮液各0.25 ml ，混匀后加在生产菌株的平57 板培养基上，用刮棒涂布均匀，适温下培养48~96h，确认是否生成噬菌斑。重复以上两个步骤，使噬菌体达到纯化和增殖的目的。最终所得滤液或上清液作为纯化噬菌体原液置冰箱保存。噬菌体效价的测定取6支灭菌并烘干的小试管，分别标注 1 0-1、1 0-2、1 0-3、1 0 -4、1 0-5和10-6，各加入0.9 ml 无菌蒸馏水。在10-1小试管中加入纯化噬菌体原液0.1ml，混匀后取出0.1ml移入10-2小试管中，如此类推，分别获得 6 个稀释度的噬菌体稀释液。在 5 支灭菌并烘干且分别标注10-3、10-4、10-5、10-6和10-7的小试管中，分别加入0.1 ml 上述10-2、10-3、10-4、10-5和10-6的噬菌体稀释液和0.9 ml生产菌株的孢子或细胞悬浮液，摇匀后再加入50C的生产菌株琼脂培养基，迅速摇匀后分别倾入标注10-3、10-4、10-5、10-6和10-7的灭菌培养皿中，凝固后置适温下培养48~96 h，对所形成的噬菌斑计数。抗噬菌体菌株选育步骤斜面範子悬浮液T不同様释度平板分离培养.苗落计数 /诱变处理 J6O80C下处理5*：L5min t抗性捡测* /不同稀释度平板分离培养、菌落计懿单菌落 J 屮只选取抗性检测具冇最大抗性的舒面恐浮液进入卜」步敢菌落分离+ K /扌富瓶发酵余全部j Ai^i fa销毁*如耒能获彳&抗效价测定性，则反复遊行上述步?骤。噬菌体抗性的检测

菌种的筛选及目标菌种的确定(待修改)

菌种的筛选及目标菌种的确定我国市场上对于奶酪的消费需求以每年15％的速度在快速增长，但是由于起步较晚，目前年需求量仅为5000 t~6 000 t左右，人均不到5 g，与世界上的乳品消费大国相比有很大的差距。影响我国奶酪生产的因素主要有两个：一是奶酪的品种单一，价格比较高；二是我国大多数消费者不适应干酪的口味。影响干酪品质的主要因素有原料奶的性质，发酵剂的种类，凝乳酶种类，原料乳的杀菌方式，凝乳的温度和时间，凝块切割的大小，加盐量，氯化钙添加量等。其中发酵剂菌种直接影响干酪的口味、产率和许多功能性质，因此选择适当的菌种制作发酵剂，在干酪生产中具有重要意义。欧洲的新型发酵制品中已经成功添加了乳酸杆菌、双歧杆菌、干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌GG等。作为益生菌乳酸杆菌和双歧杆菌是经常被使用到的。世界范围内有超过70多种乳制品包括酸奶、酪乳、冷冻甜品和乳粉中添加了乳酸杆菌和双歧杆菌。随着科技的进步，益生菌也被制成了粉剂、胶囊和片剂。到20世纪初．科学家们才开始研究产生这种有益特效的原因。大量不同种属益生菌被相继发现。其中属于乳酸菌属和双歧菌属的很多细菌他们天然存在于人体的肠胃之中。具有令人满意的特性并且在临床拥有良好纪录的益生菌包括：詹氏乳杆菌L1(L．jolul—sollii Lal)。鼠李糖乳杆菌GG(L．rhamnosus GG)．干酪乳杆菌Shirota(Lcasei shirota)，嗜酸乳杆菌NCFBl478 ，动物型双歧杆菌Bbl2以及罗伊氏乳杆菌。乳酸菌属中的56种已经被发现．乳酸杆菌是日常应用最广泛的。乳酸杆菌繁殖的最高温度不超过45℃．最佳繁殖温度为35～40℃。其繁殖须在弱酸性条件(pH值为6．4～4．5)下进行，当pH值达到4．0～3.6 时，繁殖停止。在良好的酸性条件(pH值为6．p5．5)下其耐酸性介于滴定酸度0．3％，1．9％之间。目前．双歧杆菌属中有29种，其中14种是从人体(口腔溃疡面、排泄物及阴道)分离出来的，12种从动物的肠道和瘤胃中分离出来的。另外3种来自于蜜蜂。双歧杆菌适宜的生长酸度pH值为6.0~7．0，当pH 值低于4．5～5．0或高于8．伊8．5时则停止生长。同时其适宜生长温度为37.1℃．其最低和最高生长温度分别为25℃和45℃。功能性益生菌的健康益处含有益生菌的产品据称具有很多的健康益处．这些益处包括：抗微生物活性、预防胃肠感染、促进乳糖代谢、抗诱变性、增强免疫力、预防肠炎及幽门螺杆菌感染等。其中一些健康益处已经被人们认可，而其他的一些益处则还停留在动物实验阶段。进一步的研究还有待通过人体实验来验证这些益处。值得注意的是益生菌具有的健康益处来自于特定的菌株。而非特定菌的种类或菌属。同时需要指出的是并不是某个菌株具有全部的健康益处。也不是某个菌种的所有菌株都具有健康益处。目前世界范围广泛使用的益生菌都是来自乳酸杆菌属和双歧杆菌属。还有一些研究也表明诸如小球菌属、明串珠菌属、丙酸杆菌属和粪肠球菌属都具有一些潜在的特性。其中粪肠球菌要比乳酸杆菌拥有更好的pH稳定性。并且其产生的细菌素可以防止某些肠道病原菌的侵袭。这些特性可以使之作为益生菌来使用。具有较多临床数据的菌株分别是鼠李糖乳杆菌GG。干酪乳杆菌砌细，动物型双歧杆菌以及布拉酵