绿色荧光蛋白(GFP)原核表达分析
石河子大学
分子生物学实验结课论文
绿色荧光蛋白(GFP)原核表达分析
学生姓名
学号
专业
年级、班级
指导教师
所在学院
中国·新疆·石河子
2016年1月
绿色荧光蛋白(GFP)原核表达分析
摘要：本实验主要探讨目的蛋白（GFP）在大肠杆菌中的表达的情况以及鉴定目的蛋白形成的是包涵体还是可溶性蛋白。本实验先对菌液进行培养、活化、然后采用IPTG分别对其不同时间点的诱导，用SDS-PAGE来确定目的蛋白的可溶性及其分子量，掌握GFP 诱导不同时间的表达情况的检测方法。
关键词：绿色荧光蛋白；SDS-PAGE；原核表达
1 前言
1.1实验目的
掌握聚合酶链式反应(PCR)的原理和操作方法；了解重组载体的构建方法；锻炼学生查阅文献资料、设计与优化实验的能力；加强学生对化学生物学中常用研究方法的认知。
1.2实验背景
绿色荧光蛋白（green fluorescent protein GFP) 是源于多管水母属等海洋无脊椎动物的发光蛋白，其在蓝光或紫外光下可发出明亮的绿色荧光，可以作为报告基因检测蛋白的特异性表达或进行细胞定位研究。与以往lacZ、CAT 等报告基因相比，有很多无可比拟的优越性: GFP 不具有种属依赖性，在多种原核和真核生物细胞中都表达；荧光强度高，稳定性高；不需要反应底物与其他辅助因子，受蓝光激发产生绿色荧光,尤其适用于体内的即时检测；另外GFP 分子量小，易于融合，适用于多种转化方式，对受体无毒害,安全可靠；并且通过替换一些特殊氨基酸，可以使之产生不同颜色的光，从而适应不同的研究需要。正是由于GFP 检测具有高灵敏度，操作简单，无需使用同位素等优点，近年来广泛用于基因的表达与调控、蛋白质的定位、转移以及相互作用、信号传递、转染与转化，以及细胞的分离与纯化等研究领域。绿色荧光蛋白还在监测目的基因表达、研究细胞内物质代谢及追踪细胞系的分化等方面有着广泛应用。采用GFP作为标记基因，可直接收集转化细胞供实验，缩短了筛选时间、减少对细胞活性的影响并可作为活体标记，为研究发育的基因调控和分子机制提供了一种简洁有效的手段。同时也正因为其荧光反应不是酶反应，所以当细胞本身还存在一些可以受蓝光激发和产生绿色荧光的物质，或者GFP表达频率不高的情况下，GFP的检测可能会产生一些假相，不易对荧光进行定量的测定。我们利用基因工程手段在大肠杆菌中高效的表达了GFP，制备出GFP抗体，利用抗原与抗体之间的特异性，在体外对GFP进行检测，可在一定程度上弥补上述GFP检测中可能出现的问题，可以作为一种重要的辅助手段用以提高GFP检测的灵敏度和准确度。
原核表达是将克隆基因插入合适载体后导入大肠杆菌，用于表达大量蛋白质的方法。选用原核表达系统的原因是易于生长和控制、用于细菌培养的材料不及哺乳动物细胞培养的材料昂贵、有各种各样的大肠杆菌菌株及与之匹配的具各种
特性的质粒可供选择。但是在大肠杆菌中表达的蛋白由于缺少修饰和糖基化、磷酸化等翻译后加工，常形成包涵体而影响表达蛋白的生物学活性及构象。包涵体是在某些生长条件下，大肠杆菌能积累某种特殊的生物大分子，它们致密地集聚在细胞内，形成被膜包裹的结构，具有水不溶性的特点。本实验主要是通过SDS-PAGE来检测绿色荧光的原核表达情况。
1.3流程图：
2材料与方法
2.1材料
2.1.1实验材料
质粒DNA;PCR产物、酶切质粒、DNA Marker;外源DNA片段：PCR扩增回收目的片段A和PGM-Tvector(Amp’,lacZ),带限制性内切酶末端的DNA溶液（目的片段A和载体片段pBL）;E.coli DH-5α受体菌（R-M-），自提的质粒或重组子;重组质粒DNA的菌落、BL21;重组GFP质粒、标准蛋白。
2.1.2实验仪器
PCR仪、PCR管、移液枪、离心机、电泳仪、涡旋振荡器、冰箱、透射仪、紫外透射仪、刀片、台式高速离心机、恒温水浴锅、微量移液枪、Eppendorf管、高压灭菌锅、超净工作台、制冰机、振荡培养箱、移液器、摇床、酒精灯、培养皿、接种环、酒精棉球、灭菌枪头、分光光度计。
2.1.3实验试剂
模板DNA、dNTP、TaqDNA聚合酶、引物、Buffer(内含Mg2+)、ddH2O、pGM-T
载体、T4DNA连接酶、限制性内切酶、DNA回收试剂盒、质粒小提试剂盒，其它生化试剂皆为国产分析纯。
2.2实验方法
2.2.1 PCR扩增目的基因片段
(1)依次混匀下列试剂，反应体系如下：
PCR反应体系各成分的量
ddH2O 9.5 μl
上游引物 1.0 μl
下游引物 1.0 μl
模板DNA 1.0 μl
TaqDNA聚合酶12.5 μl
Total 25 μl
混匀后瞬时离心
(2)将PCR管放入PCR仪中，设定PCR仪的循环参数。预变性94℃3 min，变性94 ℃30s，退火52℃30s，延伸72℃40s 30个循环。总延伸72℃ 4 min；
温度时间
预变性94℃3min
变性94℃30S
退火52℃30S
延伸72℃40S
总延伸72℃240S
(3)PCR扩增完毕后，取出PCR管放在冰盒上；
(4)取5μl扩增后产物，进行琼脂糖电泳检测。
2.2.2目的基因片段的琼脂糖凝胶电泳检测
（1）加20ml 1×TAE缓冲液于三角瓶中；
（2）精确称取0.2g琼脂糖加到三角瓶中，于微波炉中加热至完全熔化；
（3）冷却至60℃左右，加1μl的Goldview溶液，摇匀；
（4）轻缓倒入封好两端和加上梳子的电泳胶板中，静置冷却30分钟以上；
（5）轻轻拔除梳子，将胶放入电泳槽中，加入电泳缓冲液（TAE），使电泳缓冲液刚好没过凝胶约1mm；
（6）取5μl质粒DNA及2μl加样缓冲液混匀上样；
（7）110v约电泳0.5～1小时；
（8）紫外透射仪观察结果。
2.2.3 DNA的回收和纯化
回收PCR产物（采用天根时代DNA回收试剂盒）:
（1）用干净的刀片将需要的DNA条带从凝胶上切下来，分别放入 1.5ml 离心管中；
（2）以0.1g凝胶对应300μl的体积加入PN;
（3）50℃水浴放置10min，期间不断温和上下翻动离心管至胶完全溶解；
（4）将上述的得到的溶液加入到一个吸附柱中，吸附柱再放入收集管，12000rpm离心60s，弃掉废液；
（5）加入700μl漂洗液PW，12000rpm离心30s，弃掉废液；
（6）加入500μl漂洗液PW，12000rpm离心30s，弃掉废液；
（7）将离心吸附柱放回收集管，12000rpm离心2min；
（8）取出吸附柱，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间位置加入适当的洗脱缓冲液EB 30μl，洗脱缓冲液先在65℃水浴预热，冷却至室温，12000rpm 离心1min，然后将离心的溶液重新加回离心吸附柱中，12000rpm离心1min；
（9）电泳检测回收产物，余置于-20℃下保存。透射仪观察结果，并拍照。
2.2.4重组质粒的连接
把PCR扩增的目的基因片段产物与pGM-T载体连接，反应体系如下：
2.2.5大肠杆菌感受态细胞的制备
大肠杆菌感受态细胞的制备采用CaCl2法。
（1）将实验室保存的E.coli DH-5α菌株甘油管用无菌去离子水1:100稀释后，平板划线法接种在无抗生素的LB固体培养基上，37℃培养过夜，见有菌落长出，用接种环从平板上挑取一个单菌落，接种到20ml无抗生素的新鲜LB液体培养基中，37℃、200rpm震荡培养过夜，活化E.coli DH-5α菌株；
（2）按照1%接种量，从上述培养液中吸取菌液2ml，转瓶接入200ml新鲜的无抗生素的LB液体培养基中，37℃,200rpm震荡培养至OD600值为0.5左右；
（3）在已灭菌的10ml离心管中吸取上述培养液10ml，冰水浴10min后，4℃、6000rpm离心2min，收集菌体，弃上清；
（4）加2ml冰冷预热的0.1mol/LCacl2溶液，重悬菌体，冰浴10min，4℃、
6000rpm离心2min，收集菌体，弃上清；
（5）将每一份沉淀轻缓地悬于0.4～1ml含有20%甘油的0.1mol/L Cacl2的溶液中，轻轻重悬菌体沉淀，冰上放置10分钟；
（6）分装100μL/管（冰浴分装），置于-70℃冰箱中保存。
2.2.6连接产物转化感受态细胞
(1)转化用固体LB培养基平板制备：
向含100μg/ml氨苄青霉素（AMP）的固体LB培养基平板上加50mg/ml的IPTG16μl和20mg/ml的X-gal 40μL，用灭菌弯头玻璃棒涂布均匀，37℃避光倒置3h，让溶解X-gal的二甲基甲酰胺尽量挥发干净。加入ITPG和X-gal的转化用平板应避光保存，以防试剂见光分解。
（2）连接产物转化E.coli DH-5α感受态细胞：
①取5μl连接产物加到100μl E.coli DH-5α感受态细胞中。轻弹混匀，水浴20min。
②取出离心管，42 ℃水浴中热激90 后，立即置冰浴中冷却5min。
③向离心管中加入800μL 37℃预热的无抗生素的LB液体培养基。
④取出离心管，12000rpm离心2min，弃上清800μL，用剩余的约100μL上清将沉淀菌体吸打混匀后，在LB平板上涂布ITPG和X-gal。将平板倒置在37℃恒温箱中培养14h～18h，直至长出菌落，观察结果。
2.2.7重组质粒的菌落鉴定
本次实验所用的pGM-T vector 含Ampr、lacZ基因，所以有重组质粒的菌落为白色，没有重组质粒的菌落为蓝色。具体操作如下：
①挑取菌落：使用无菌枪头随即挑取5个白色菌落，放入含氨苄青霉素的LB液体培养基的1.5ml EP管，振荡培养4h以上，吸取0.5ul菌液作为PCR反应模板，其余继续培养。
②PCR反应体系与反应程序均与目的基因扩增条件一致。
③扩增产物取5ul用1%琼脂糖凝胶进行检测。
2.2.8提取重组质粒
将鉴定为阳性重组子的质粒EP管挑取出来，按照实验室提取质粒的试剂盒说明书操作。提取后，取5ul用1%琼脂糖凝胶进行检测。
2.2.9重组质粒双酶切
用限制性内切核酸酶BamHⅠ和SalⅠ对PCR阳性菌落提取的质粒做双酶切鉴定。酶切反应体系如下表。
体系成分体积
质粒 5.0ul
去离子水11ul
10×Buffer T 3.0ul
BamHⅠ（120U/ul）0.5ul
SalⅠ(100U/ul) 0.5ul
总体积20ul
37℃酶切过夜，70℃灭活酶活性。1%琼脂糖凝胶进行检测。
2.2.10 GFP基因重组表达质粒及诱导表达
（1）将上步经酶切鉴定得到的GFP目的片段与表达质粒连接，并转化至大肠杆菌BL21菌株。转化菌涂布于含有卡那霉素的LB琼脂平板上，37℃过夜培养；
（2）观察菌落生长情况，进行菌落PCR鉴定；
（3）将鉴定为阳性的菌落接种于20ml含50mg/L卡那霉素的LB培养基中，37℃摇菌培养过夜。
（4）按1:100稀释过夜菌，接种于100ml含有卡那霉素的LB培养基中，37℃摇菌继续培养至A600约为0.4-0.8。
（5）取部分液体作为未诱导的对照组，余下的加入IPTG诱导剂至终浓度为1mmol/L，于37℃诱导表达。每隔1h分别取菌体1ml，离心12000g，30s得到沉淀，观察蛋白表达情况。
2.2.11 SDS-PAGE检测诱导表达的蛋白
（1）取未诱导、诱导不同时间的培养物500ul于微量离心管中，室温高速离心1min。沉淀悬浮于100ul 1×SDS凝胶加样缓冲液中，100℃加热3min，室温高速离心1min后，冰上放置。
（2）安装电泳装置，配制12%分离胶倒入凝胶槽，加蒸馏水密封。待凝固后再倒入5%浓缩胶，插上梳子。待凝固后，拔出梳子，放入电泳槽中，上样，电泳。
（3）电泳结束后，将凝胶浸泡在染色液中，室温在摇床上缓慢染色4h。
（4）脱染：将染液回收，凝胶先用蒸馏水漂洗一次后侵入脱染液中脱染，更换几次脱色液，直至出现清晰的电泳带。
（5）脱色后，将凝胶保存在水中或是含20%甘油的水中；
（6）观察实验结果。
3 结果与分析
3.1 PCR扩增目的基因片段的琼脂糖凝胶电泳检测
M为Marker ，1-4为PCR扩增产物，产物长度约为750 bp，由于实验疏忽不严谨，条带不明显且不明确。
3.2 DNA回收电泳检测
由于操作不当，DNA片段分解了，没有回收到电泳条带。
3.3连接产物转化后的蓝白斑筛选
将目的基因片段与pMD18-T载体连接，并转化大肠杆菌E.coli DH5α菌株感受态，37℃，培养16h以后得到蓝白斑的菌落，白色菌落即有可能为含重组子的菌落（如下图）。
箭头所指处为蓝色菌落
3.4外源基因诱导表达
用IPTG诱导表达后呈现绿色，说明含外源基因GFP的质粒在大肠杆菌体内成功表达。绿色荧光的亮度增加说明随着诱导时间的增加，GFP基因表达量增加，而没有经IPTG诱导的菌体则不发出绿色荧光（如下图）。
3.5 GFP原核不同条件的诱导表达和检测
将诱导表达的蛋白处理后进行SDS-PAGE检测,确定其分子量大小。可以看到，诱导时间不同蛋白表达量不同，条带颜色不一样。由于实验疏忽，电泳条带不明显到时实验失败。电泳带淡有三种可能原因：
（1）电泳时，点样后等待时间过长，导致点样液扩散。
（2）目的质粒浓度低。
（3）机器曝光时间不对。
在实验过程中，等待点样时间较长，原因1有可能。在电泳带底部见模糊阴影，可能有杂DNA污染。我们并非在无菌的条件下做实验，电泳口也可能有杂质，PCR时也可能载体自连产生假阳性，这些情况都可能造成目的质粒浓度低。其他组的电泳结果也不是很亮，所以还可以调整曝光时间试试。
4 心得体会
本实验涉及知识面广，需要综合利用分子生物学、化学生物学、基因工程和微生物学中的基础理论知识和技术，有利于学生对几个学科间知识的融会贯通。实验中涉及步骤较多，需要1～2周时间才能完成，因此较适合作为高年级学生的综合实验。本实验对实验者的实验技能要求较高，实验过程中应用到一系列基本操作方法，需使用多种实验仪器，可以综合锻炼学生的实验技能。在实验教学过程中，教师要注意加强引导，实施开放式教学，给学生创建一个独立工作的环境。同时学生也可通过查阅文献，对给定的实验步骤进行优化，有利于开阔学生的视野，培养学生解决问题、分析问题的能力。绿色荧光蛋白是现代化学生物学中常用的一种分子成像标记物，被广泛应用于科学研究中。由于绿色荧光蛋白在紫外光激发下可以发出明亮的、肉眼可见的绿色荧光，有利于激发学生的实验热情，提高学生学习化学生物学的兴趣。由于本实验使用可进行亲和纯化的表达载体，因此也可以进行后续的蛋白质纯化及蛋白质电泳实验。
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绿色荧光蛋白（EGFP）的基因克隆 南方医科大学学院 摘要 本实验旨在学习基因克隆并检验，绿色荧光蛋白基因转化入宿主细胞后很稳定，对多数宿主的生理无影响，是常用的报道基因，便于实验。本实验通过将含有目的基因GFP的pEGFP-N1质粒和pMD18-T载体进行酶切、电泳、回收、连接、转入、筛选之后，把GFP基因成功导入到大肠杆菌DH5α(克隆菌)中，从而实现荧光蛋白基因的克隆和表达。 关键词：绿色荧光蛋白克隆表达 实验名称绿色荧光蛋白的基因克隆 2015- ~ 实验日期 实验地点 2015- 合作者指导老师 评分教师签名批改日期 一、实验目的 1.学习使用限制性内切酶进行DNA酶切的原理和方法。 2.学习掌握琼脂糖凝胶电泳的基本原理和操作方法。 3.掌握PCR技术原理和PCR仪的操作方法。 4.学习PCR产物的TA克隆的基本原理和操作步骤。 5.了解和掌握大肠杆菌的制备方法的基本原理和操作要点以及DNA转化大肠杆菌的原理和方 法。
6.掌握双酶切法鉴定重组DNA的基本原理和操作步骤，以及菌落PCR鉴定重组DNA的基本原 理和方法。 7.掌握IPTG诱导GFP基因表达的基本原理和操作步骤 二、实验原理 1.pEGFP-N1质粒 2.T载体
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目录 摘要······················································································ II 关键词 ···················································································· II Abstract ··················································································· II Key words ················································································ II 1 GPF的发现 (1) 2 GFP的结构及发光原理 (1) 2.1 GFP的结构 (1) 2.2 GFP的发光原理 (2) 3 GFP在生物技术中的应用 (2) 3.1 GFP作为报告基因 (2) 3.2 GFP用于研究病毒与宿主的关系 (3) 3.3 GFP用于药物筛选 (3) 3.4 GFP作为生物传感器 (3) 3.5 GFP用于融合抗体 (4) 3.6 GFP用于计算细胞生长速度 (4) 3.7 GFP用于基因表达调控 (4) 4 GFP存在问题及发展前景 (4) 参考文献 (5) 致谢 (5)
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何帮助GFP折叠和成熟的线索。另外，分子伴侣的存在也有助于GFP的折叠，反过来，这个发现也使GFP成为检测分子伴侣功能的一个好底物，因为GFP可以提供一个连续的、无破坏性的检测蛋白折叠成功的分析方法。 3绿色荧光蛋白的应用 3.1报告基因和细胞标记 GFP作为报告分子和细胞标记最明显的优势是无需底物或辅因子参与；无论在活细胞还是在完整的转基因胚胎和动物中，都能有效地监测基因转移的效率。但在这方面的应用中，最大的缺点就是没有放大作用，它不能象酶一样能通过加工无数的底物分子而将信号放大所以一般都需强启动子以驱动GFP基因在细胞内足量的表达也可用亚细胞分辨率的显微成像系统检测基因产物，靶入的基因被限制于一个细胞器内，GFP的浓度则相对提高了许多倍。 3.2融合标记 应用得最多和最成功的是GFP同宿主蛋白构成融合子来监测宿主蛋白的定位 和最后归宿既有荧光又有宿主蛋白原有的正常功能和定位的融合蛋白效果最佳GFP可融合于宿主蛋白的C端或N端，也可插入其内部迄今为止，GFP已成功地靶入了大部分细胞器中，如质膜、细胞核、内质网、高尔基体、分泌小体、线粒体、液泡和吞噬体等。 3.3 其它 GFP分子生色团的坚固外层保护荧光不被熄灭，但同时也降低了GFP分子的荧光对环境的敏感性通过随机重组和基因定向突变得到了多种对环境敏感的GFP，它们可用作环境指示剂如：对PH敏感GFP的可以测定细胞器内的PH值；通过基因工程，可GFP在中插入磷酸化位点以便用磷酸化控制GFP的荧光。另外，最近报道的利用靶入了水母GFP基因的丝蛋白昆虫病毒，感染蚕的幼虫，用改造的基因取代了蚕的正常基因，当蚕吐丝时这种丝是一种能在黑暗中发绿色荧光的纤维。 4应用特点 GFP这一新型报告基因，在短短几年时间内就得到了众多研究者的青睐，其原因就在于它具有以下优点：
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效的手段[3-4]。同时也正因为其荧光反应不是酶反应,所以当细胞本身还存在一些可以受蓝光激发和产生绿色荧光的物质,或者GFP表达频率不高的情况下,GFP的检测可能会产生一些假相,不易对荧光进行定量的测定。我们利用基因工程手段在大肠杆菌中高效的表达了GFP,制备出GFP抗体,利用抗原与抗体之间的特异性,在体外对GFP进行检测,可在一定程度上弥补上述GFP检测中可能出现的问题,可以作为一种重要的辅助手段用以提高GFP检测的灵敏度和准确度[5]。 原核表达是将克隆基因插入合适载体后导入大肠杆菌，用于表达大量蛋白质的方法。选用原核表达系统的原因是易于生长和控制、用于细菌培养的材料不及哺乳动物细胞培养的材料昂贵、有各种各样的大肠杆菌菌株及与之匹配的具各种特性的质粒可供选择。但是在大肠杆菌中表达的蛋白由于缺少修饰和糖基化、磷酸化等翻译后加工，常形成包涵体而影响表达蛋白的生物学活性及构象。包涵体是在某些生长条件下，大肠杆菌能积累某种特殊的生物大分子，它们致密地集聚在细胞内，形成被膜包裹的结构，具有水不溶性的特点。本实验主要是通过SDS-PAGE来检测绿色荧光的原核表达情况。 2 材料与方法 2.1 材料 30%分离胶贮液分离胶缓冲液（Tris-HC l缓冲液pH8.9）浓缩胶贮液浓缩胶缓冲液10%SDS 20%过硫酸铵（AP）染色液脱色液1×SDS上样缓冲液1×Tris-甘氨酸电泳缓冲液四甲基乙二
生化绿色荧光蛋白的基因克隆及表达开题报告
题目：绿色荧光蛋白（GFP）基因的基因克隆及在大肠杆菌中的表达 李宏远 2014236053 立题依据： 随着分子生物学和基因工程技术的迅速发展和广泛应用, 人们根据自己的意愿有目的、有计划、有根据、有预见地将外源基因导入动物细胞内, 使外源基因进行表达、阐明基因表达的调控机理或者通过与染色体基因组进行稳定整合，将生物性状传递给子代动物的研究方兴未艾[1]。 1.选材：大肠杆菌 大肠杆菌是第一个用于重组蛋白生产的宿主菌，它不仅具有遗传背景清楚、培养操作简单、转化和转导效率高、生长繁殖快、成本低廉、可以快速大规模地生产目的蛋白等优点。而且其表达外源基因产物的水平远高于其它基因表达系统，表达的目的蛋白量甚至能超过细菌中蛋白量的30 %，因此大肠杆菌是目前应用最广泛的蛋白质表达系统。 2.基因标记技术 基因标记技术是近年来发展起来的分子生物学技术。荧光蛋白基因在标记基因方面由于具有独特的优点而引起了科学家的广泛关注，现已被普遍应用到分子生物学研究的各个方面。荧光蛋白是海洋生物体内的一类发光蛋白，分为绿色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白、黄色荧光蛋白和红色荧光蛋白[2]。
3.绿色荧光蛋白 从水母(Aequorea victoria)体内发现的发光蛋白。分子质量为 26kDa，由238个氨基酸构成，第65～67位氨基酸(Ser-Tyr-Gly)形成发光团，是主要发光的位置。其发光团的形成不具物种专一性，发出荧光稳定，且不需依赖任何辅因子或其他基质而发光。绿色荧光蛋白基因转化入宿主细胞后很稳定，对多数宿主的生理无影响，是常用的报道基因。 【实验目的】 研究绿色荧光蛋白（Greed Fluorescent Protein，GFP）基因的基因克隆及在大肠杆菌中的表达。 【研究意义】 研究绿色荧光蛋白在大肠杆菌体内的基因克隆和表达。通过质粒重组形成所需要的重组质粒pET-28a-GFP，将重组质粒导入大肠杆菌体内，通过酶切、PCR及用IPTG诱导检测是否在大肠杆菌体内诱导表达成功。根据电泳结果及荧光现象得出结论，重组质粒在大肠杆菌体内成功诱导表达。 GFP的应用特点 检测方便：不需要外加底物和辅助因子，用内眼就可以观察到，在长紫外光照射下特别漂亮，以此作为标记，观察表达产物。
绿色荧光蛋白的研究现状与应用
绿色荧光蛋白的研究现状与应用 【摘要】绿色荧光蛋白（GFP）最早发现于水母体中，是一种十分重要的蛋白质。由于其众多的优点，现已在分子生物和细胞生物的研究中应用十分广泛。随着技术的进步和研究的进一步深入，GFP基因也在许多其他方面将发挥着越来越重要的作用。 【关键词】绿色荧光蛋白；生色团；报告基因 2008年10月8日，瑞典皇家科学院诺贝尔奖委员会授予三位科学家：日裔美国科学家下村修(Osamu Shimomura)、美国科学家马丁?查尔非(Martin Chalfie)和美国华裔科学家钱永健(Roger Y．Tsien)诺贝尔化学奖，以表彰他们在绿色荧光蛋白(GFP)研究方面做出的突出贡献。 1 绿色荧光蛋白的理论研究 1.1绿色荧光蛋白的发现 绿色荧光蛋白最早于1962年在维多利亚多管发光水母体内被发现，同时它也存在于水螅和珊瑚等腔肠动物体内。它的内源基团可以在蓝光或紫外光激发下发射绿光，属于生物发光蛋白。绿色荧光蛋白在水母体内之所以能发光，主要依靠水母素的辅助。水母素和GFP之间能发生了能量转移，在钙的刺激下，其能量可转移到GFP，刺激GFP发光。 1.2绿色荧光蛋白的结构和发光原理 1992年Prasher等克隆了GFP基因的cDNA并分析了其一级结构。野生型GFP基因组全长2600bp，由3个外显子和2个内含子组成，编码238个氨基酸，分子量约28kDa。GFP的三维立体结构是由11个β折叠围在四周形成一个中空的圆柱体，1条α折叠贯穿在圆柱体的中间，其中有一段位于65-67位的3个氨基酸残基（Ser-Tyr-Gly）形成的杂环咪唑啉结构组成生色团，位于圆筒中央并附着在α螺旋上。绿色荧光蛋白的发光原理是位于氨基酸第65位的Ser的羧基和67位的Gly的酰基经过亲核反应生成咪唑基，66位的Tyr通过脱氢使芳香团与咪唑基结合，形成对羟基苯甲酸咪唑环酮生色团发出荧光。GFP的最大和次大的激发波长分别是395nm和475nm。溶液中，395nm激发的荧光发射峰在508nm，375nm激发的荧光发射峰在503nm。 1.3绿色荧光蛋白的优点 绿色荧光蛋白的独特之处即它的优点很多，主要有：荧光反应不需要底物和任何其他辅助因子，只需要在蓝光和紫外光下照射，利用荧光显微镜甚至是直接用肉眼就可以观察，易于检测且灵敏度高；荧光性质稳定，对光漂白有较强的耐受性；无毒害，转化后细胞仍可连续传代；通用性好，无种属特异性；分子量小，易于构建载体；不受假阳性干扰，结果真实可靠；可进行活细胞定时定位观察；易于得到突变体。 2 绿色荧光蛋白的应用 1994年Chalfie等首次在大肠杆菌细胞和线虫中表达了GFP，开创了GFP 应用研究的先河。也正是由于绿色荧光蛋白的许多优点，使得其应用十分广泛。 2.1作为报告基因 GFP通常用作报告基因，可用来检测转基因效率，把GFP基因连接到目的基因的启动子之后，通过测定GFP的荧光强度就可以对该基因的表达水平进行检测。GFP最显著的优势是荧光反应不需要底物和其他辅助因子。有利必有弊，
克隆绿色荧光蛋白分子生物学实验报告
南方医科大学 绿色荧光蛋白的克隆 实验报告 年级专业 2014级生物技术 姓名朱旭峰 学号 3147020042
摘要 细菌质粒是一类双链、闭环的DNA，大小范围从1kb至200kb以上不等。各种质粒都是存在于细胞质中、独立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成份，通常情况下可持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下也会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。 质粒已成为目前最常用的基因克隆的载体分子，重要的条件是可获得大量纯化的质粒DNA分子。目前已有许多方法可用于质粒DNA的提取，下面主要介绍碱裂解法提取质粒DNA的方法。 Cloning of green fluorescent protein Abstract： Bacterial plasmid is a kind of double chain, closed-loop DNA, ranging from 1KB to 200kb. All plasmid is present in the cytoplasm, independently from the chromosome of autonomously replicating genetic component, usually under the condition of sustainable and stable in staining in the free state, but under certain conditions will irreversibly integrated into the host chromosome, with the replication of the chromosome replication and by cell split passed on to future generations. Plasmids have become the most commonly used gene cloning vector molecules, the important condition is to obtain a large number of purified plasmid DNA molecules. There are many methods can be used to extract plasmid DNA, the following are mainly introduced the method of extracting plasmid DNA by alkaline lysis method. 关键词 GFP 质粒提取感受态细菌细菌转化 1.前言 碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，纯化质粒DNA的方法通常是利用了质粒DNA相对较小及共价闭环两个性质。例如，氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心、离子交换层析、凝胶过滤层析、聚乙二醇分级沉淀等方法，但这些方法相对昂
绿色荧光蛋白
绿色荧光蛋白（GFP）的转化表达及免疫印迹检测 王媛0811142 南开大学生命科学学院生物技术08级 一、摘要： 本实验利用酶切方法检测载体中所含GFP片段后，通过转化的方法把绿色荧光蛋白（GFP）外源基因转入大肠杆菌进行表达，通过免疫印记杂交方法（western blotting）分析GFP在大肠杆菌中的表达，在分离检测的全过程中（转化平板，细胞裂解，电泳，电转移），均可通过紫外灯清晰地检测到颜色亮丽的绿色荧光蛋白。 关键词：绿色荧光蛋白免疫印记杂交 二、引言： 绿色荧光蛋白是一种源于水母(Aequorea Victoria)等海洋无脊椎动物的蛋白，分子量为26.9KD。GFP的开放阅读框架长度约为740bp，编码238个氨基酸残基。GFP表达后折叠环化，在氧存在下，由65～67位的氨基酸残基环化，形成发色基团，无需添加任何酶和底物，在长紫外或蓝光激发下就能发荧光，荧光性质稳定，可保持10分钟。GFP能在不同的细胞内稳定表达，无种属、组织和位置特异性，对细胞无毒性且检测方法简单，将其作为报告基因已广泛应用于细胞生物学和分子生物学领域。 免疫印记又称蛋白质印记，是在凝胶电泳技术和固相免疫测定技术基础上发展起来的一种免疫检测技术。其原理是将膜与胶放在中间，上下加滤纸数层，做成“Sandwich”样的转移单位，并且保证带负电的蛋白质向阳极转移，即膜侧连接阳极或面向阳极，从而将电泳分离的蛋白从凝胶转移至固相载体上。 三、实验材料、仪器及方法： 3.1 实验材料 3.1.1 菌种 E.coli DH5α(pETH)菌株 E.coli DH5α(pETH-GFP)菌株 E.coli BL21菌株 E.coli BL21 (pETH)菌株E.coli BL21 (pETH-GFP）)菌株 3.1.2 试剂与材料 LB培养基（自己配置灭菌）Amp（100mg/ml）IPTG(10mg/ml) CaCl2(1M) 50*TAE Acry/Bis 贮存液分离胶缓冲液浓缩胶缓冲液泳动缓冲液（5*）上扬缓冲液（5*）转移缓冲液PBS 1.5% A.P.S 质粒小量提取试剂盒Eco RI限制性内切酶DNA Maker Protein Maker pH试纸 3.1.3 仪器 紫外检测仪、超声波细胞粉碎机、垂直板式电泳系统、半干式蛋白质印迹电转移系统等。3.2 实验方法 1、配置LB培养基，包括液体、固体培养基后灭菌；分别接种pETH-GFP/DH 5α（LA 4ml）一支，pETH/DH 5α(LA 4ml)一支，BL21（LB 4ml）四支 2、按照protocal,利用tiangen质粒提取试剂盒分别提取pETH-GFP/DH 5α、pETH/DH 5α质粒后，按照酶切体系混匀后，至于37℃温箱酶切2h。 3、制备0.8%琼脂糖凝胶，20ml每块，加入适量EB，按照点样顺序点样后，60V恒压电泳，约0.5~1h.后，凝胶自显影拍照（胶图见后面实验结果） 4、取40μlBL21菌液接种于4mlLB，37℃，200rpm，约2.5h,此时OD600=0.3~0.5，利用氯化钙法制备感受态细胞，制备完成至于冰上备用。 5、铺制平板，1块LB，4块LA，冷却凝固后于37℃倒置烘干备用。其中两块LA平板上面涂布IPTG（100μl+100μl水），正置备用。 6、按照阴性对照、空白对照、GFP基因转化表达、GFP基因的转化四组分别进行转化，涂板，37℃倒置过夜培养，紫外灯下观察，呈绿色荧光的单菌落即为转化子。记录各板菌落数
绿色荧光蛋白GFP的研究进展及应用_吴沛桥
■通信作者 E mail :baxiaoge1957@yahoo .com .cn 绿色荧光蛋白GFP 的研究进展及应用 吴沛桥1 ,巴晓革 2■ ,胡海1,赵静 1 (1.南京农业大学生命科学学院,南京210095;2.山东药品食品职业学院,威海264210) 摘要:源于多管水母属等海洋无脊椎动物的绿色荧光蛋白(GFP ),是一种极具应用潜力的标记物,有着 极其广泛的应用前景。我们就GFP 的理化性质、荧光特性、改进和应用研究进行了综述。 关键词:绿色荧光蛋白(GFP );标记物;荧光特性;进展;改进;应用 中图分类号:Q51,503;R318 文献标识码:A 文章编号:1672-6278(2009)01-0083-04 Research Progress and Application of Green Fluorescent Protein WU Peiqiao 1 ,BA Xiaoge 2 ,HU Hai 1 ,ZHAO Jing 1 (1.Nanjing Agricultu ral University ,College of Life Science ,Nanj ing 210095,China ; 2.Shandong Drug and Food V ocatio nal College ,W eihai 264210,China ) A bstract :The green fluorescent protein (GFP )from the jellyfish Aequorea vietoria is a great potential for application of the marker ,has a wide range of applications .The article on the physical and chemical properties ,the fluorescence characteristics ,improvement and application of GFP are reviewed . Key words :Green fluorescent protein ;Marker ;Fluorescence characteristics ;Progress ;Improvement ;Application 1 引 言 发光是海洋无脊椎动物中普遍存在的现象,一些腔肠动物包括水母、水螅和珊瑚等受到机械性干扰时都可发射绿色荧光,而栉水母类发射蓝色荧光。绿色荧光蛋白(Green fluorescent pr otein ,GFP )是一类存在于这些腔肠动物体内的生物发光蛋白。1962年Shimomura 等 [1] 首先从多管水母(Ae quoria victoria ) 中分离出一种分子量为20kD 的称为A equorin 的蛋白。由于水母整体荧光及提取的蛋白质颗粒荧光都呈绿色,因此,人们将这种蛋白命名为绿色荧光蛋白。随后,人们从不同动物体内提取出了各种不同的GFP ,其中研究较为深入的是来自多管水母科(Aequorleidae )和海紫罗兰科(Renillidae )的GFP ,即 Ae quoria GFP 和Renilla GFP 。 2 GFP 的理化性质,荧光特性及其改进 2.1 GFP 的理化性质 从水母体内分离到的GFP 基因,长达2.6kD ,由 3个外显子组成,分别编码69、98和71个氨基酸。GFP 本身是一种酸性,球状,可溶性天然荧光蛋白。A equoria GFP 分子量约27×103 ,一级结构为一个由238个氨基酸残基组成的单链多肽;而Renilla GFP 是分子量为54kD 的同型二聚体。两种GFP 有不同的激发光谱,A equoria GFP 在395nm 具有最高光吸收峰,肩峰为473nm ;Renilla GFP 在498nm 具有强烈的光吸收,肩峰为470nm 。两种GFP 含有相同的 生色团,发射光谱基本相同(λmax =508～509nm )。 GFP 性质极其稳定,易耐受高温处理,甲醛固定和石蜡包埋不影响其荧光性质。其变性需在90℃或pH <4.0或pH >12.0的条件下用6mol L 盐酸胍处理,一旦恢复中性环境,或去除变性剂,虽然变性的蛋白质并不能完全复性,但是复性蛋白质同天然蛋白质对温度、pH 变化的耐受性、抗胰蛋白酶消解的能力是相同的。更重要的是,它们在很大的pH 范围内(pH7～12.2)的吸收、发射光谱也是相同的。Renilla GFP 的稳定性就更为显著。它在上述一系列的变性条件下都很稳定,不易变性。根据Sheen 生物医学工程研究 J ournal of Biomedical Engineering Res earch 2009,28(1):83～86
对绿色荧光蛋白(GFP)的了解及应用
对绿色荧光蛋白的了解及应用 学院：生命科学学院 姓名：马宗英 年级：2011 学号：2011012923
前言 绿色荧光蛋白(green fluorescent protein)，简称GFP，是一种具有奇妙特性的“光学蛋白质”。这种蛋白质从成分和结构上来说，没有丝毫的特殊性，它的组成单元是20种常见的氨基酸，二级结构也是普通的α螺旋和β片层。但是，这种蛋白质却具有一个非常特别的性质——发出绿色荧光。 【关键词】绿色荧光蛋白生命科学应用 一、绿色荧光蛋白 绿色荧光蛋白最早是由下村修等人于1962年在一种学名Aequorea victoria的水母中发现的。其基因所产生的蛋白质，在蓝色波长范围的光线激发下，吸收蓝光的部分能量，发出绿色荧光。 野生型水母GFP的一级序列已由其cDNA序列推导出来[1]，它至少存在4种同源GFP，但这些突变并不影响GFP的基本功能，只是使突变的GFP具有了新的性质。 生色团是GFP发出荧光的物质基础，也是GFP结构中的一个重要组成部分。GFP的生色团位于氨基酸序列64~69位的六肽内,65~67位的丝氨酸、脱氢酪氨酸、甘氨酸通过共价键形成的对羟基苯甲基咪唑环酮是一个独特的、相当稳定的环状三肽结构,构成了GFP生色团的核心[2],见图1。图2为生色团的形成机制。 图1 多管水母中GFP生色团的化学结构和附近序列 图2生色团的形成机制 目前人们对GFP的荧光发光机制并不十分清楚，大家只是认为，GFP是生物发光过程中的能量受体，并且是最终的发光体，不同的生物发光机制各不相同，不同的突变体发光机
制也有很大差异。 二、GFP在生命科学中的应用 1、作为蛋白质标签（protein tagging） 利用绿色荧光蛋白独特的发光机制，可将GFP作为蛋白质标签（protein tagging），即利用DNA重组技术，将目的基因与GFP基因构成融合基因，转染到合适的细胞中进行表达，然后借助荧光显微镜便可对标记的蛋白质进行细胞内的活体观察。由于GFP只有238个氨基酸，相对较小，所以将其与其它蛋白质融合后并不影响自身的发光功能。利用GFP来检测目标蛋白的定位已为我们提供了一种对细胞内的一些基本的生理过程进行更为详尽的观察的新方法。如细胞分裂、染色体复制和分裂、发育和信号转导等过程的研究均是借助绿色荧光蛋白进行标记。 GFP作为蛋白质标签除用于特定蛋白质的标记定位外，还大量用于各种细胞成分的标记如细胞骨架、质膜、细胞核等等。曾经有人将GFP融合到大肠杆菌细胞膜表面用作标记蛋白，这将有助于提高多肽库的筛选效率、疫苗的研制、构建细胞生物传感器用作环境监测以及探测信号转导过程等等，以上都可以为传统生物学研究提供新思路和新方法。 2、药物筛选 利用细胞表面标记,通过流体细胞分光光度计或荧光活化细胞筛选仪,可以分离与纯化特殊类型的细胞;同时还可利用不同颜色GFP衍生物标记相关蛋白质,来观察在单细胞内相互作用的靶细胞,再借助于荧光激活细胞分离器、等聚焦显微镜分离出目的细胞,从而可方便地用于大规模筛选新的药物。 另一方面，利用GFP来进行药物筛选由于必须与迁移的信号分子相偶联的限制，其筛选容量相对较低，但是由于GFP在细胞内的穿透性强及独特的发光机制，因而在药物筛选中具有相当大的应用潜力。 3、用于免疫学 可采用基因工程的方法生产GFP标记抗体，以取代传统的免疫学标记方法，建立一种简便、快速的免疫诊断新技术。相比于一般的标记物，GFP对光稳定、对抗体的标记率可达100%，而且因为GFP是直接与抗体结合，所以无需添加任何底物，可以避免非抗原抗体结合的背景干扰等。 线粒体中表达的GFP是研究比较成功的一种小分子抗体，因为它可以在宿主细胞内大量表达，易于基因工程操作，尤其易于构架抗体融合蛋白。因融合抗体具有与抗原结合及发射荧光两种特性，故这一人工分子可用做免疫染色的检测试剂，直接应用于流式细胞仪和免疫荧光的标记及肿瘤的检测等等。 在制备抗体时，为便于表达蛋白的分离纯化，一般在单链抗体的N端或C端插入一6×His 序列，便于用Ni-NTA亲和层析柱纯化目标蛋白。但这一技术也存在一些问题，由于抗体分子内存在二硫键，而在原核表达系统内由于抗体不能正确折叠，容易形成包涵体，表达出来的目标蛋白无活性，需要在氧化还原体系中进行复性。但近来也有报道在动物细胞细胞质中成功表达出具有抗原结合活性的单链抗体，若能成功解决融合抗体的表达问题，则在免疫染色及肿瘤检测这一领域融合抗体将扮演极为重要的角色。 除了以上应用之外，绿色荧光蛋白还普遍应用于跟踪观察微生物、发育机理研究、细胞筛选以及生物传感器等许多生命科学研究中。 三、GFP的突变及其应用 GFP作为一种新型标记物，正受到科学界的广泛关注，而且野生型的GFP也不断地在被改造，著名的生物学家钱永健所完成的单点突变(S65T) 显著提高了GFP的光谱性质,其荧
绿色荧光蛋白的研究
绿色荧光蛋白的分子生物学 及其应用 吴琦 四川农业大学 二○○九年十二月
2008年诺贝尔化学奖获得者及其贡献下村修，日本人，名古屋大学理学博士毕业后赴美，先后在美国普林斯顿大学、波士顿大学和伍兹霍尔海洋生物实验所工作。1962 年从一种水母中发现了荧光蛋白，被誉为生物发光研究第一人。钱永健，美籍华裔，现为美国加州大学圣迭戈分校生物化学及化学系教授、美国国家科学院院士、国家医学院院士，2004年沃尔夫医学奖得主。其主要贡献在于利用水母发出绿光的化学物来追查实验室内进行的生物反应，他被认为是这方面公认的先驱。马丁·沙尔菲，美国哥伦比亚大学生物学教授，他获奖的主要贡献在于向人们展示了绿色荧光蛋白作为发光的遗传标签的作用，这一技术被广泛运用于生理学和医学等领域 。
1962年Shimomure 等首先从维多利亚水母(Aequorea Victoria )中分离出了GFP (Green-Fluorescent Protein) 。绿色荧光蛋白的研究史 维多利亚水母 (Aequorea Victoria)
A test tube containing a sample of a cyan (greenish-blue) fluorescent protein from a sea anemone illuminated by ultra-violet light from below.
绿色荧光蛋白的研究史 1992年Prasher等克隆了GFP基因的cDNA，并分析了GFP 的一级结构。
绿色荧光蛋白的研究史 1994年Chalfie等首次在大肠杆菌细胞和线虫中表达了GFP，开创了GFP应用研究的先河。
绿色荧光蛋白GFP研究进展
万方数据
２００４年６月绿色荧光蛋白（ＧＦＰ）研究进展７１ 随着生命科学和医学研究的不断深入，研究者们迫切需要一种能够在活体中表达且易于检测的报告基因，现有的报告基因主要有：分泌型胎盘磷酸酯酶（ｓ秘Ｐ）、Ｂ一半乳糖苷酶（互丑ｃｚ）、８一葡糖苷酸酶（ＧＵＳ）、萤火虫荧光素酶（ＬＵｃ）等，但这些基因的检测方法并不理想，它们都需要底物和辅助因子，因而在活体中的应用受到限制。最近，一种全新的非酶性报告基因——绿色荧光蛋白（ＧＦＰ）引起了人们的关注，该蛋白能够自身催化形成发色结构并在蓝光激发下发出绿色荧光。作为报告基因，ＧＦＰ是目前唯一能在活细胞中表达的发光蛋白；作为荧光标记分子，ＧＦＰ既具有敏感的标记检测率，又没有放射性的危害。最近又发现Ｇ即还是一个良好的细胞间信号传递的动态标记分子，可以跟踪观测第二信使。近来关于ＧＦＰ方面的研究和综述越来越多，但多是针对某一方面的特点或应用，作者将ｃＦＰ基础理论和应用研究进展作一简要综述。 ｌＧＦＰ基础理论研究进展 １．１发展历史 １９６２年蹦ｎ舢ｕ飓等…首先从多管水母属（枷ｒｉａ、ｒｉｃｔｏ． ｒｉａ）中分离出了ｃＦＰ；１９９２年Ｐｒａｓｌｌｅｒ等ｕ３克隆了ＧＦＰ基因的ｃＤＮＡ，并分析了ＧＦＰ的一级结构；１９９４年ｃｈ址ｅ等ｂ３首次在大肠杆菌细胞和线虫中表达了ＧＦＰ，开创了ＧＦＰ应用研究的先河，之后很快发现ＧＦＰ能在多种异源细胞中表达，ＧＦＰ在细胞学、分子生物学和医学、病毒学等领域中迅速掀起了一股热潮；１９９ｒ７年１０月１８—２２日在美国Ｎｅｗ—Ｊ嘲ｙ专门召开了一次关于ＧＦＰ的国际会议。 １．２ＧＦＰ结构、生化特性、发光机制、光谱特性 １．２．１结构 由正常野生型ｃＦＰ（ｗｔＧ即）的ｃＤＮＡ序列推出的蛋白质一级结构，由２３８个氨基酸残基组成，ｓＤ卜ＰＡＧＥ凝胶电泳测定 其分子量为２７—３０ｌ【Ｄ。晶体学证据Ｈ’表明，ＧＦＰ中央是一个Ｂ罐（ｐ一锄）结构。ＧＦＰ的生色团位于“一６９的六肽内。生色团在翻译后２—４ｈ内自动催化形成，并且ＧＦＰ在合成后需经过一定的折叠过程形成正确的构象后才有功能。ＧＦＰ生色团的形成需要Ｑ，使６６位氨基酸残基的ａ、８键间脱氢，这就意味着ＧｆＰ在严格厌氧条件下不能形成荧光。 １．２．２生化特性 ＧＦＰ在４５０—４９０姗蓝光下最稳定，在３４０—３９０衄或３９５一‰的范围内，会发生光漂白现象；强还原剂如５ｎ蝴Ｎ啦ｓ０４或２ｎ蹦ｆ韬ｑ能使ＧＦＰ转变为非荧光形式，但一旦重新暴露在空气或氧气中，ＧＦＰ荧光便会立即恢复；弱还原剂和中度氧化剂（如生物材料的固定脱水剂戊二酸或甲醛等）对ｃＦＰ荧光影响不大，但ＧＦＰ对某些封片指甲油特别敏感；在离体状态下，Ｇ即对高温（７０℃）、碱性、除垢剂、盐、有机溶剂和大多数普通酶（链霉蛋白酶ｈＤＩ塘∞除外）有较强抗性，ＧＦＰ荧光在ｐｍ．Ｏ一１２．Ｏ时稳定，在ｐＩｌ５．５—７．０时开始受到影响，在高温（＞７０℃）、极端ｐＨ或胍基氯化物条件下，ＧＦＰ会变性，荧光消失，一旦外界条件恢复正常，荧光将部分恢复【５】。 １．２．３发光机制 目前对ＧＦＰ的荧光发光机制还不清楚，Ｍ（Ｈｉ∞等人曾提出一个能量传递模式图来解释水母的发光机制，但并未获得认同。ｃＩＩ砒嘶等怕。对ＧＦＰ进行了光谱分析，结合前人工作提出，ＧＦＰ有两个明显的吸收带，对应于ＧＦＰ的两种不同构象的基态Ａ和Ｂ。基态Ａ对应于３９５姗的吸收峰，基态Ｂ对应于４７５姗的吸收峰，基态Ａ占优势，基态Ｂ的分子数量约是基态Ａ的１，６，两种基态间能缓慢地转换，但激发态（＊）之间的转换很快且发生了质子转移，Ａ。快速高效地衰变至另一激发态，应该存在一个中间过度态Ｉ，质子转移使Ａ。转变成Ｉ。，Ｉ’回迁到基态Ｉ时产生发射峰５０４姗的荧光，构象改变使Ｉ’转变成Ｂ。，由Ｂ。到Ｂ发射荧光而不发生质子转移。目前，对于ＧＦＰ的作用机理较为认同的仅仅是：ＧＦＰ是生物发光过程中的能量受体，并且是最终的发光体，不同的生物发光机制各不相同，不同的突变体发光机制也有很大差异。 收稿日期：２００３—０９—２５：修回日期：２００３一１２二１５ 基金项目：生活垃圾及农业废气物处理技术与示范工程项目（２００２从６０１０１２—０２） 作者简介：汪恒英（１９７９一），女，硕士生，专业方向为环境工程，ＥｒＩｌ８ｉｌ：ｗｈ∞舀ｒＩｇ＠ｙａｈ∞．Ⅻ；。通讯联系人（ＡｕｔＩｌ∞ｈ∞Ｔｅ叩‘ｘＩｄｅＩｌｃｅ）。 １．２．４光谱特性 ｗ蚓ＦＰ的光谱是所有ＧＦＰ中最复杂的，其荧光激发主峰在３９５ｎｍ，在４７５砌处有一个峰高仅为主峰１，３的小峰。溶液 中，３９５咖激发的荧光发射峰在５０８锄。４７５砌激发的在５０３姗，这类ＧＦＰ的生色团至少由两种不同的化学组分组成，即中性酚和阴离子酚。４７５姗峰随ＧＦＰ分子生色团的去质子化或阴离子生色团的增加而增加，３９５砌则随着ＧＦＰ分子生色团的质子化或中性生色团的增加而增加。野生型ＧＦＰ在室温或低于室温下表达时，Ｇ即几乎都能正确而快速地折叠，但高于室温时，折叠速度却剧烈下降，这种温度的敏感性无碍于水母。因为在它们的生活环境中是不可能遇到温水的，但ＧＦＰ折叠受温度影响却限制了ＧＦＰ的应用；另外，栅具有两个激 发峰的光谱，在应用中也是弊大于利。因此，为拓宽ＧＦＰ的应用，有必要根据不同的用途，对ｗｔＧＦＰ进行适当的改造。 １．３Ｇ卯的改进 目前主要通过以下几个途径得到突变体ＧＦＰ【引：更换ＧＦＰ生色团氨基酸；改变碱基组成；除去ＧＦＰ基因中隐蔽剪接位点；插入植物内含子；更换强启动子等。突变体ＧＦＰ增加了荧光强度和热稳定性，促进了生色团的折叠，其荧光特性也得到了改善，甚至出现红色、黄绿色、蓝色等多种颜色的荧光蛋白，大大拓宽了ＧＦＰ研究的领域。以下是ＧＦＰ突变体的部分典型代表。（１）增强型ｃ即：Ｇｌ】ｏｈｏｎ等将Ｓｅｒ６５用ｍ替代，ＰＩ蒯用ＩＪｅｕ替代，使ｃＦＰ的荧光强度提高了３５倍，而且激发后１６—２４ｈ后仍可稳定地测定荧光；（２）人工ＧＦＰ：刻咖ｋｌｌｉｎ等哺１改变了栅基因编码区中８８个密码子中的９２个碱基而用人类 基因组中常用的密码子代替，将ＧＦＰ的荧光强度提高２２倍，适合在哺乳动物细胞中高效表达；（３）红移荧光蛋白（ＲＳＦＰ）：ＨｅｉＩＩｌ等旧１将ｗｔＧＦＰ中的ｓｅｒ６５用７ｎｌｒ替代，得到突变体．Ｓ６５Ｔ—ＧＦＰ，激发谱中只有一个峰，且红移至４９０姗，用蓝光即可激发ＲＳＦＰ，使之更适于普通荧光显微镜（订ｒｃ）观察；（４）蓝色荧光蛋白（ＢＦＰ）：双突变体Ｙ６６Ｈ，Ｙ１４５一划能在３８１呦光的激发下产生４４５砌的蓝光，这种蓝光还能进一步激发ＧＦＰ产生绿光，即发生荧光共振能量转移（耶回）现象，为不同蛋白质之间及细胞器之间的相互作用研究开辟了更为广阔的视野。 除以上类型的ＧＦＰ突变体以外，人们还通过定点突变得到了一些可用作指示剂的ＧＦＰ突变型如：ｐＨ敏感ＧＦＰ，可被用来测量细胞器或更小颗粒的ｐＨ值，并记录其变化，最近又有报道利用靶人了水母ＧＦＰ基因的丝蛋白昆虫病毒，感染蚕的幼虫，用改造的基因取代了蚕的正常基因，当蚕吐丝时，这种 丝是一种能在黑暗中发绿色荧光的纤维。 ２卿应用研究进展 ２．１应用特点 ＧＦＰ这一新型报告基因，在短短几年时间内就得到了众多研究者的青睐，其原因就在于它具有以下优点： （１）检测方便：因为ＧＦＰ荧光反应不需要外加底物和辅助因子，也就不存在这些物质可能难于进入细胞的问题，只需紫外光或蓝光激发，即可发出绿色荧光，用荧光显微镜甚至肉眼就可以观察到，且灵敏度高，对于单细胞水平的表达也可识别。 （２）荧光稳定：ＧＦＰ对光漂白有较强的耐受性，能耐受长时间的光照；ＧＦＰ在ｐｍ一１２范围内也能正常发光；对高温（７０℃）、碱性、除垢剂、盐、有机溶剂和大多数普通酶（链霉蛋白酶Ｐｂ驯雠除外）都有较强抗性。 （３）无毒害：从目前的研究结果来看，ＧｆＰ对生活的细胞基本无毒害，对目的基因的功能也没有影响，转化后细胞仍可连续传代。 （４）共用性和通用性：首先表现在ＧＦＰ的表达几乎不受种属范围的限制，在微生物、植物、动物中都获得了成功的表达；其次是ｃＦＰ没有细胞种类和位置上的限制，在各个部位都可以表达发出荧光。 （５）易于构建载体：由于ＧＦＰ分子量较小，仅为２７—３０如，编码ＧＦＰ的基因序列也很短，为２．６ｌ【ｂ，所以很方便地同其它序列一起构建多种质粒，而不至于使质粒过大影响转化频率。 （６）可进行活细胞定时定位观察：对活细胞中蛋白的功能研究，更能接近自然真实的状态。通过ＧＦＰ可实时观察到外界信号刺激下，目的蛋白的变化过程，借助于近来广泛使用的 万方数据
绿色荧光蛋白
知识介绍 绿色荧光蛋白 马金石 (中国科学院化学研究所 北京 100190) 摘 要 绿色荧光蛋白是46多年前从多管水母体内发现的,它可以在蓝光或紫外光激发下发射绿光。 由于它稳定的结构和光物理性质,又易于在细胞内表达,近些年作为标记物已经被广泛地应用于生命科学领 域。本文简要介绍了水母发光蛋白与绿色荧光蛋白的关系、绿色荧光蛋白的结构、发色团的形成、发光机制、变异体以及它的特点和应用。 关键词 绿色荧光蛋白 基因表达 结构 发色团 生物发光 Green Fluorescent Protein Ma Jinshi (Insti tute of Chemistry,Chinese Academy of Sciences,Beijing100190) Abstract Green fluorescent protein(GFP)was discovered46years ago from A equorea V ictoria,it can emit green light under exci tation of blue or UV irradiation.GFP as a marker for gene expression and localization of gene products has been widely used in life sciences for the past years because of its stable structure and photophysical property and easy expression in cells.A brief introduction on the relationship of aequorin and GFP,GFP structure,chromophore formation,and the mechanism of bioluminescence,also the variants,characteri stic and application are presented in this paper. Keywords Green fluorescent protein,Gene expression,Structure,Chromophore,Bioluminescence 由于对绿色荧光蛋白(Green Fluorescent Protein,GFP)的发现、机理研究以及利用做出的特殊贡献,瑞典皇家科学院诺贝尔奖委员会将2008年度诺贝尔化学奖授予美国科学家下村修(Osamu Shimomura)、马丁 沙尔菲(Martin Chalfie)和美籍华裔化学家钱永健(Roger Y Tsien)。 化学奖评选委员会主席贡纳尔 冯 海伊内和评委莫恩斯 艾伦贝里对绿色荧光蛋白的评价指出,这是当代生物学的重要工具,借助这一 指路标 ,科学家们已经研究出监控脑神经细胞生长过程的方法,这在以前是不可能实现的。他们说,下村修1962年在北美西海岸的水母中首次发现了一种在紫外线下发出绿色荧光的蛋白质,即GFP。随后,马丁 沙尔菲在利用GFP做生物示踪分子方面做出了贡献;钱永健让科学界更全面地理解GFP的发光机理,对GFP作了改造,通过改变其氨基酸排序合成出了能吸收、发射不同颜色(蓝色、蓝绿色和黄色)光的荧光蛋白,为同时追踪多种生物细胞变化的研究奠定了基础。 我国在生命科学领域已经广泛应用GFP,对它的介绍和应用的文章也有很多[1~6]。国外的综述可阅读钱永健和Zimmer的文章,最新的是Shaner等的文章[7~9]。化学界对它的了解可能较少,在此做个简单介绍。 1 生物发光与水母 先从生物发光说起,生物体的发光现象称为生物发光。植物界有细菌植物门的发光细菌和真菌植物门的发光蘑菇,动物界从原生动物到脊椎动物都有,脊椎动物中主要是鱼类。从发光生物的分布来 2008 10 25收稿,2008 11 04接受