荧光蛋白参数绿色荧光蛋白计算公式

1. 荧光蛋白简介

荧光蛋白（Fluorescent protein，FP）是一种天然存在于某些动植物等生物体内，具有荧光发射能力的蛋白质。它们有着复杂的结构和特殊的物理化学性质，被广泛应用于生物医学、生物技术等领域。其中，绿色荧光蛋白（Green fluorescent protein，GFP）是应用最广泛的一种，也是最常见的一种荧光蛋白。

2. GFP的特征

GFP具有以下几个特点：

- 在紫外光作用下，能够发射出稳定的绿色荧光；

- GFP分子中有一个色素基团，称为香豆素（chromophore），它是荧光的主要来源；

- GFP的分子量为27kDa，由238个氨基酸组成，结构非常稳定；

- GFP的荧光发射峰为509nm，与其吸收峰相差约30nm；

- GFP的荧光强度受到诸多因素的影响，如温度、pH值、离子浓度等。

3. GFP参数计算

为了更好地了解GFP的性质和应用，我们需要计算一些关键的参数。下面是常见的几个参数及其计算方法：

3.1. 色素基团的构象

GFP的香豆素色素基团是荧光的主要来源，因此了解它的构象非常重要。其中最重要的参数是内环部分的键长和键角。内环存在两种共

振式：高能和低能共振式。其键长和键角分别记为r和θ，则高能共

振式基态能量为E1=-πc^2/2r^2，低能共振式基态能量为

E2=πc^2/2r^2(1-cosθ)。因此，内环的基态能量是

Emin=E1cos^2(θ/2)+E2sin^2(θ/2)。实际计算时，通常采用分子动

力学（Molecular Dynamics，MD）方法，模拟GFP分子中香豆素色素

基团的构象变化。

3.2. 构象与荧光发射

内环的构象对GFP的荧光性质影响非常大。例如，在GFP分子中，香豆素基团紧密嵌入蛋白质的肽链中，使其无法自由旋转。因此，荧

光发射峰和吸收峰之间的距离很小，即Stokes位移很小。该参数通常

用以下公式计算：Stokes Shift = λ_emit - λ_abs，其中λ_emit

是荧光发射峰值波长，λ_abs是吸收峰值波长。

3.3. 荧光效率

荧光效率是指荧光发射光子的数量与吸收的光子数量的比值。在GFP中，荧光效率受到自身的荧光猝灭和非辐射转换的影响。因此，正确计算荧光效率需要考虑这些因素。通常采用荧光寿命法（Fluorescence Lifetime，FLT）来测量荧光寿命，然后根据以下公

式计算荧光效率：ϕ = FLTk_i / (1 + FLTk_i)，其中k_i是猝灭速率

常数。

3.4. 变构体的稳定性

GFP有许多变构体，主要是通过改变氨基酸序列来实现。这些变构体具有不同的荧光性质和稳定性。例如，GFPuv1是一种具有改良荧光

性质的变构体，它的发射峰值波长为509nm，荧光量子产率为0.81，

而且具有较高的稳定性。通常使用分子动力学模拟来探究变构体的稳

定性，以便进行进一步的优化设计。

4. GFP的应用前景

由于其良好的荧光性质和在生物体内的自然存在性，GFP被广泛应用于许多领域，如生物学、医学、生物技术等。其中最重要的应用包括：

- 标记和追踪细胞和生物分子的运动和位置；

- 研究蛋白质结构和功能的变化；

- 发展高通量筛选方法和药物设计；

- 探究生命本质和生命起源。

随着技术的不断发展，GFP及其相关技术也将在更多领域得到应用，推动生命科学和生物技术的进一步发展。

荧光蛋白 (整理)

荧光一、定义荧光（fluorescence ）又作“萤光”，是指一种光致发光的冷发光现象。当某种常温物质经某种波长的入射光（通常是紫外线或X射线）照射，吸收光能后进入激发态，并且立即退激发并发出比入射光的的波长长的出射光（通常波长在可见光波段）；而且一旦停止入射光，发光现象也随之立即消失。具有这种性质的出射光就被称之为荧光。二、原理光照射到某些原子时，光的能量使原子核周围的一些电子由原来的轨道跃迁到了能量更高的轨道，即从基态跃迁到第一激发单线态或第二激发单线态等。第一激发单线态或第二激发单线态等是不稳定的，所以会恢复基态，当电子由第一激发单线态恢复到基态时，能量会以光的形式释放，所以产生荧光。荧光是物质吸收光照或者其他电磁辐射后发出的光。大多数情况下，发光波长比吸收波长较长，能量更低。但是，当吸收强度较大时，可能发生双光子吸收现象，导致辐射波长短于吸收波长的情况发射。当辐射波长与吸收波长相等时，既是共振荧光。荧光强度：荧光强度与该种物质的荧光量子产率、消光系数以及含量等因素有关。荧光量子产率Q：量子产率表示物质将吸收的光能转化为荧光的本领，是荧光物质发出光子数与吸收光子数的比值。荧光蛋白分子的亮度由其量子产率与消光系数的乘积决定，与成像检测灵敏度密切相关。三、荧光蛋白

1、绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）在光谱的绿光区（500nm-525nm）已经发现了多种荧光蛋白，而且来源广泛，包括不同种属的Aequorea 、桡足类动物、文昌鱼以及珊瑚。然而多数有齐聚反应，即使最好的荧光蛋白与EGFP相比，也没有明显的优点。或许目前活细胞成像最好的选择是GFP衍生的Emerald（祖母绿），它与EGFP的特性相似。Emerald包含F64L 和S65T突变，另外还有四个点突变从而改进了折叠、37℃时的突变率以及亮度。虽然Emerald比EGFP更有效，但含有快速光漂白成分，可能在某些环境下其定量成像会受到影响。下面主要介绍GFP及其衍生型荧光蛋白：（1）来源绿色荧光蛋白最早由美籍日裔科学家下村修于1962年在水母中发现。这种蛋白质在蓝色波长范围的光照激发下发出绿色荧光，其发光过程需要冷光蛋白质Aequorin的帮助，而且，这个冷光蛋白质可与钙离子（Ca2+）相互作用。在水母中发现的野生型绿色荧光蛋白的分子量较小，仅为27~30kDa，而编码GFP的基因序列也很短，为2.6kb。（2）性质 GFP由238个氨基酸残基组成。GFP序列中的65-67位残基（Ser65-Tyr66-Gly67）可自发形成荧光发色基团——对羟基苯咪唑啉酮GFP的激发光谱在400nm附近有一个主激发峰，在470nm附近有一个次激发峰。发射光谱在505nm附近有一尖锐的主发射峰，在540nm附近有一肩峰GFP的化学性质相当稳定，无光漂白现象（Photobleaching），用甲醛固定和石蜡包埋亦不影响其荧光性质。在细胞生物学与分子生物学领域中，绿色荧光蛋白基因常被用作报告基因。（3）野生型野生型GFP（wild type GFP, wtGFP）从一开始就引起了人们极大的兴趣，而且被用作新型的简单报告基因及体内标记，但GFP在异源生物体中的表达并非那么简单。例如，研究人员很早就发现需要在较高的温度下孵育才能在细胞或生物体中表达GFP，并且wtGFP在37℃的热稳定性差。这些都阻碍了它在转基因中的应用。这些难题促使人们进一步筛选分离wtGFP的变体。现在，人们已经找到了荧光强度更强且更耐热的变体。这些变体多数为经突变的脱辅基蛋白，它们可防止高温导致的错误折叠。近年来出现的新型wtGFP基因突变体的激发和发射谱发生了改变，热稳定性和荧光强度得到了提高，GFP报告基因在小鼠中的应用就是以这些变体作为基础的。（4）增强型绿色荧光蛋白（EGFP）现在，应用最为广泛的是红移变体增强型GFP（EGFP）。诸如EGFP这些红移变体的最大激发峰发生红向移动，大约为490nm，这一波长也恰好是多数分光设备、流式细胞仪及共聚焦显微镜的常用波长。EGFP有两个氨基酸突变，当被蓝光激发时，它发出的荧光要比wtGFP亮30-40倍。wtGFP和包括EGFP在内的多数变体半衰期长，所以不适合精确追踪表达的减少或损耗。（5）不稳定增强型绿色荧光蛋白（dEGFP）为克服这一问题，人们在1998年构建了不稳定增强型绿色荧光蛋白（dEGFP）。原理就是将EGFP的cDNA融合到小鼠鸟氨酸脱羧酶（Ornithine decarboxylase,

绿色荧光蛋白

绿色荧光蛋白(GFP)原核表达情况分析姓名：韩吉梅学号：2013107001 专业：作物栽培学与耕作学摘要：将含有绿色荧光基因的重组载体导入大肠杆菌中,经IPTG诱导产生大量融合蛋白,用SDS-PAGE来确定目的蛋白的可溶性及其分子量。考马斯亮蓝染色4小时再过夜脱色，观察目的蛋白的分子量大约为31.9kD,与预期值相符。关键字：绿色荧光蛋白SDS-PAGE 原核表达 1 前言绿色荧光蛋白（green fluorescent protein GFP) 是源于多管水母属等海洋无脊椎动物的发光蛋白，其在蓝光或紫外光下可发出明亮的绿色荧光，可以作为报告基因检测蛋白的特异性表达或进行细胞定位研究。绿色荧光蛋白还在监测目的基因表达、研究细胞内物质代谢及追踪细胞系的分化等方面有着广泛应用。由于GFP检测具有高灵敏度,操作简单,无需使用同位素等优点,近年来广泛用于基因的表达与调控、蛋白质的定位、转移以及相互作用、信号传递、转染与转化,以及细胞的分离与纯化等研究领域[1-2]。采用GFP作为标记基因,可直接收集转化细胞供实验,缩短了筛选时间、减少对细胞活性的影响并可作为活体标记,为研究发育的基因调控和分子机制提供了一种简洁有

效的手段[3-4]。同时也正因为其荧光反应不是酶反应,所以当细胞本身还存在一些可以受蓝光激发和产生绿色荧光的物质,或者GFP表达频率不高的情况下,GFP的检测可能会产生一些假相,不易对荧光进行定量的测定。我们利用基因工程手段在大肠杆菌中高效的表达了GFP,制备出GFP抗体,利用抗原与抗体之间的特异性,在体外对GFP进行检测,可在一定程度上弥补上述GFP检测中可能出现的问题,可以作为一种重要的辅助手段用以提高GFP检测的灵敏度和准确度[5]。原核表达是将克隆基因插入合适载体后导入大肠杆菌，用于表达大量蛋白质的方法。选用原核表达系统的原因是易于生长和控制、用于细菌培养的材料不及哺乳动物细胞培养的材料昂贵、有各种各样的大肠杆菌菌株及与之匹配的具各种特性的质粒可供选择。但是在大肠杆菌中表达的蛋白由于缺少修饰和糖基化、磷酸化等翻译后加工，常形成包涵体而影响表达蛋白的生物学活性及构象。包涵体是在某些生长条件下，大肠杆菌能积累某种特殊的生物大分子，它们致密地集聚在细胞内，形成被膜包裹的结构，具有水不溶性的特点。本实验主要是通过SDS-PAGE来检测绿色荧光的原核表达情况。 2 材料与方法 2.1 材料 30%分离胶贮液分离胶缓冲液（Tris-HC l缓冲液pH8.9）浓缩胶贮液浓缩胶缓冲液10%SDS 20%过硫酸铵（AP）染色液脱色液1×SDS上样缓冲液1×Tris-甘氨酸电泳缓冲液四甲基乙二

绿色萤光蛋白

绿色萤光蛋白(green fluorescent protein)，简称GFP，这种蛋白质最早在一种学名Aequorea victoria的水母中发现。其基因所产生的蛋白质，在蓝色波长范围的光线激发下，会发出绿色萤光。这个发光的过程中还需要冷光蛋白质Aequorin的帮助，且这个冷光蛋白质与钙离子(Ca+2)可产生交互作用。由水母Aequorea victoria中发现的野生型绿色萤光蛋白，395nm和475nm分别是最大和次大的激发波长，它的发射波长的峰点是在509nm，在可见光绿光的范围下是较弱的位置。由海肾(sea pansy)所得的绿色萤光蛋白，仅有在498nm有一个较高的激发峰点。在细胞生物学与分子生物学领域中，绿色萤光蛋白基因常被用作为一个报导基因(reporter gene)。一些经修饰过的型式可作为生物探针，绿色萤光蛋白基因也可以克隆到脊椎动物(例如:兔子上进行表现，并拿来映证某种假设的实验方法。我们这边细胞组的基本上都在用这个东东。标记细胞 GFP的分子结构和发光机制绿色荧光蛋白为一个由238个氨基酸残基组成的单链，GFP有两个吸收峰，主峰在395nm，次峰在470nm，其荧光发射峰在509nm。GFP 的化学性质相当稳定，其变性需要在90℃或pH<4或pH>12的条件下用6mollL盐酸胍处理，这一性质与GFP的结构特性相关。 Yang等的研究表明，GFP是由两个相当规则的内含一个α-螺旋和外面包围l1个β-折叠的β-桶状结构组成的二聚体，β-桶状结构直径约3nm，高约4nm。β折叠彼此紧密结合，象桶板一样形成桶状结构的外围，并且形成了一个规则的氢键带。桶状结构和位于其末端的短α螺旋以及环状结构一起组成一个单独的致密结构域，没有可供扩散的配体进入缝隙。这种坚实的结构保证了其稳定和抗热、抗变性的特点。 GFP的生色基团附着于α-螺旋上，几乎完美的包被于桶状结构中心。位于圆桶中央的α-螺旋含有一个由六肽组成的发光中心，而发光团是由其中的三肽Ser65-Tyr66-Gly67经过环化形成了对羟基苯咪唑啉酮。GFP的生色基团是蛋白质自身催化环化的结果，环化是一个有氧过程，在严格厌氧条件下GFP不能形成荧光，因为GFP的生色团形成需要O2使Tyr66脱氢氧化。生色基团通过Tyr66的脱质子(酚盐)和质子化状态(羟酚基)的转换决定荧光发射，此模型为Yang等的晶体学证据所支持。 GFP在生物技术中的应用研究 1．分子标记作为一种新型的报告基因，GFP已在生物学的许多研究领域得到应用。利用绿色荧光蛋白独特的发光机制，可将GFP作为蛋白质标签(protein tagging)，即利用DNA重组技术，将目的基因与GFP基因构成融合基因，转染合适的细胞进行表达，然后借助荧光显微镜便可对标记的蛋白质进行细胞内活体观察。由于GFP相对较小，只有238个氨基酸，将其与其他蛋白融合后不影响自身的发光功能，利用GFP的这一特性已经加深了我们对细胞内一些过程的了解，如细胞分裂、染色体复制和分裂，发育和信号转导等。1996年，Ehrdardt等人首次报道了利用GFP的特性研究细胞分化蛋白FtsZ的定位。研究显示FtsZ在细胞分裂位点形成了一个环状物，且至少有9种蛋白在细胞分裂中起重要作用，尽管对这些蛋白功能仍然不是很清楚，但是利用GFP融合蛋白已经搞清楚了它们聚合的顺序以及在蛋白定位中的一些特征。利用GFP来检测目标蛋白的定位已为我们提供了一种对细胞内的一些基本的生理过程进行更详尽观察的新方法。除用于特定蛋白的标记定位外，GFP亦大量用于各种细胞器的标记如细胞骨架、质膜、细胞核等等。Shi等人曾报道将GFP融合到大肠杆菌细胞膜表面用作标记蛋白，这一技术将有助于提高多肽库的筛选效率、疫苗的研制、构建细胞生物传感器用作环境检测以及探测信号转导过程等等。这些都为传统生物学研究提供了新思路和新方法，成为交叉学科研究的热点。 2．药物筛选许多新发展的光学分析方法已经开始利用活体细胞来进行药物筛选，这一技术能从数量众多的化合物中快速筛选出我们所感兴趣的药物。基于细胞的荧光分析可分为三类：即根据荧光的密度变化、能量转移或荧光探针的分布来研究目标蛋白如受体、离子通道或酶的状态的变化。荧光探针分布是利用信号传导中信号分子的迁移功能，将一荧光蛋白与信号分子相偶联，根据荧光蛋白的分布情况即可推断信号分子的迁移状况，并推断该分子在迁移中的功能。由于GFP分子量小，在活细胞内可溶且对细胞毒性较小，因而常用作荧光探针。在细胞体内分子之间的相互作用非常复杂，其中很多涉及到信号分子在细胞器之间的迁移。例如当信号分子和某一特殊受体结合后常会导致配体-受体复合物从某一细胞区域迁移到另一区域，而这一迁移过程通常会介导一重要的生理功能。因而，这些受体常常被用作药物筛选的目标，若某一药物具有与信号分子类似的功能，那么该药物即具有潜在的医药价值。利用GFP荧光探针，将很容易从数量众多的化合物中判断出那些化合物具有与信号分子相似的能引起配体一受体复合物迁移并介导生理反应的功能，且这一筛选过程简单方便，所需成本也很低。利用这一原理，已经成功构建了一个筛选模型用于研究药物介导的糖皮质激素受体(hGR)的迁移过程。在一96孔板中培养细胞，并以一编码hGR GFP蛋白的质粒转染该细胞。当细胞用待筛选的药物处理后，hGR-GFP从细胞质迁移人细胞核的过程可实时或在某一时段

绿色荧光蛋白(GFP)标记亚细胞定位

绿色荧光蛋白(GFP)标记亚细胞定位绿色荧光蛋白(Green Fluorescent Protein, GFP)是一种自然存在于海洋水母Aequorea victoria中的荧光蛋白，其拥有强烈的绿色荧光。由于其广泛应用于细胞生物学和生物化学领域，GFP 已经成为研究生物过程和信号传递的强有力工具。 GFP的结构由238个氨基酸组成，具有一个单独的蛋白质区域，称为圆柱螺旋(Beta-can)。GFP基因含有GFP编码序列，该序列通过表达可以产生GFP蛋白质。GFP的荧光性质是由三个氨基酸残基组成的染色体枢纽部分决定的，即丝氨酸(Tyr66)、谷氨酸(Pro68)和脯氨酸(Ala80)。在GFP的自然状态下，并不发出荧光。但当该基因被转录和翻译成蛋白质之后，在有氧条件下，GFP的氨基酸序列会发生类似于玉米的光合作用过程，使得GFP的荧光激活。在细胞生物学领域，GFP被广泛用作标记工具，以帮助研究人员观察细胞内部的某些组分或结构。研究人员可以通过将GFP基因与目标蛋白的基因融合，使目标蛋白在表达时也表达GFP。由于GFP的荧光性质，这样就可以通过荧光显微镜直接观察到目标蛋白的位置和分布。通过GFP技术，科学家们得以研究细胞核或细胞器在发育过程中的变化，以及探索细胞活动的机制。此外，通过将GFP 基因与多个目标蛋白的基因融合，科学家们可以标记多种细胞结构，并观察它们在细胞活动过程中的相互关系和动态变化。

除了在细胞生物学领域的应用外，GFP还被广泛应用于分子生物学、生物化学、药物筛选和基因治疗等领域。由于GFP 的高度稳定性和荧光强度，它可以作为生物化学实验中定量和定位特定蛋白质的工具。此外，GFP作为标记基因在基因治疗研究中也发挥着重要作用，用于追踪和监测基因表达和转导的进程。尽管GFP已经成为生物科学研究中广泛应用的工具，但也存在一些局限性。首先，GFP的结构和功能对温度和酸碱度非常敏感，因此在特殊环境中的应用可能受到限制。此外，GFP 的荧光信号在某些细胞或组织中可能受到强烈的自然荧光干扰，降低其检测的灵敏度。为了克服GFP的一些局限性，科学家们一直在进行改进和优化。例如，通过对GFP进行突变，已经产生了一系列具有不同荧光颜色的变体，如蓝色荧光蛋白、黄色荧光蛋白等，扩展了荧光蛋白的应用范围。此外，通过结合GFP与其他技术，如光遗传学和光学显微术，也进一步提高了荧光蛋白在细胞研究中的可用性和灵敏度。总的来说，绿色荧光蛋白(GFP)是细胞生物学和生物化学领域中的一种重要工具，通过其高度荧光的特性，可以帮助科学家们观察和研究细胞内的某些组分和结构。尽管GFP仍然存在一些局限性，但通过不断的改进和优化，它在生物科学研究中的应用前景仍然广阔。随着科技的不断发展，绿色荧光蛋白(GFP)的应用也在不断地拓展。除了在细胞生物学和生物化学研究中的应用外，GFP还被广泛应用于分子生物学、生物医

gfp绿色荧光蛋白检测原理

gfp绿色荧光蛋白检测原理 GFP（Green Fluorescent Protein）是一种自然存在于水母中的蛋白质，最早被发现于1962年。由于其独特的荧光性质，GFP已经成为生物成像和分子生物学研究中的重要工具。GFP绿色荧光蛋白检测原理是一种非常常见的检测方法，下面我们将一步步介绍该原理。首先，我们需要了解GFP的结构和性质。GFP由238个氨基酸组成，其中包括三个特定的氨基酸序列，这些序列决定了GFP的二级和三级结构，从而决定了其荧光性质。GFP在紫外线和蓝光的激发下能够产生绿色荧光，这是由于其内部含有一个芳香族环结构（环肽），在外界刺激下受激发并发出流明绿色的荧光。在GFP检测中，我们通常使用荧光显微镜来观察样品。为了实现这一点，我们需要将GFP引入到细胞、病毒或其他生物体中，并使用特定的荧光标记物标记它们。这些标记物可以通过短脉冲激光激发荧光，然后使用荧光显微镜观察荧光信号。由于GFP的某些特定结构，我们可以通过观察荧光强度和形态来确定GFP的位置和数量，从而对细胞或病毒的行为和功能进行研究。此外，许多GFP变种已经被开发出来，这些变种具有不同的发射波长和荧光强度，可以用于不同类型的研究。例如，我们可以使用蓝色荧光蛋白（BFP）来标记细胞核，使用黄色荧光蛋白（YFP）来标记细胞质，用红色荧光蛋白（RFP）来标记细胞膜，从而实现全面的细胞成像。总之，GFP绿色荧光蛋白检测原理是一种基于GFP独特荧光性质的生物成像技术，通过标记和激发荧光信号来观察生物分子和细胞结构。随

着越来越多的GFP变种的开发，这种技术将成为生物学研究中不可或缺的工具之一。

荧光蛋白

绿色荧光蛋白开放分类：化学奖相关背景知识技术植物生理学科学自然科学绿色萤光蛋白(green fluorescent protein)，简称GFP，这种蛋白质最早是由下村修等人在1962年在一种学名Aequorea victoria的水母中发现。其基因所产生的蛋白质，在蓝色波长范围的光线激发下，会发出绿色萤光。由于具有自发荧光等特性，在分子生物学和细胞生物学领域得到广泛应用。GFP作为一种报告分子，在检测蛋白表达、蛋白和细胞荧光示踪、研究蛋白质之间相互作用和构象变化中，起到了重要的作用。绿色荧光蛋白- 简介及其发光机理绿色荧光蛋白(GreenFluorescent Protein,简称GFP)是一种在美国西北海岸所盛产的水母中所发现的一种蛋白质。这类学名为Aequorea victoria的水母有着美丽的外表,生存历史超过1.6亿年。1962年，下村修正是在这种水母的发光器官内发现天然绿色荧光蛋白。它之所以能够发光,是因在其包含238个氨基酸的序列中，第65至67个氨基酸(丝氨酸—酪氨酸—甘氨酸)残基,可自发地形成一种荧光发色团。当蛋白质链折叠时，这段被深埋在蛋白质内部的氨基酸片段，得以“亲密接触”,导致经环化形成咪唑酮，并发生脱水反应。但此时还不能发射荧光，只有当有分子氧存在的条件下，发生氧化脱氢，方能导致绿色荧光蛋白发色团的“成熟”，形成可发射荧光的形式。上述绿色荧光蛋白发色团的形成过程，系由几位科学家分别研究完成的。绿色荧光蛋白不仅无毒，而且不需要借助其他辅酶，自身就能发光,可以让科学家在分子水平上研究活细胞的动态过程。当绿色荧光蛋白的基因和我们感兴趣的有机体内所拟研究的蛋白质基因相融合时，蛋白质既能保持其原有的活性，绿色荧光蛋白的发光能力也不受影响。通过显微镜观察这种发光的“标签”，科学家就能做到对蛋白质的位置、运动、活性以及相互作用等一目了然。在一个活体中有数万种不同的蛋白质,这些蛋白质精细地控制着重要的化学进程。如果蛋白机制发生故障，通常就会t发生疾病。绿色荧光蛋白可帮助研究这类机制，这就是为什么绿色荧光蛋白成为生物科学极其重要的工具。在它的帮助下，科学家还能对各种细胞的命运了如指掌,比如,脑神经细胞是如何发育起来的，或者癌症细胞是如何扩散的……

荧光蛋白参数绿色荧光蛋白计算公式

荧光蛋白参数绿色荧光蛋白计算公式 1. 荧光蛋白简介荧光蛋白（Fluorescent protein，FP）是一种天然存在于某些动植物等生物体内，具有荧光发射能力的蛋白质。它们有着复杂的结构和特殊的物理化学性质，被广泛应用于生物医学、生物技术等领域。其中，绿色荧光蛋白（Green fluorescent protein，GFP）是应用最广泛的一种，也是最常见的一种荧光蛋白。 2. GFP的特征 GFP具有以下几个特点： - 在紫外光作用下，能够发射出稳定的绿色荧光； - GFP分子中有一个色素基团，称为香豆素（chromophore），它是荧光的主要来源； - GFP的分子量为27kDa，由238个氨基酸组成，结构非常稳定； - GFP的荧光发射峰为509nm，与其吸收峰相差约30nm； - GFP的荧光强度受到诸多因素的影响，如温度、pH值、离子浓度等。 3. GFP参数计算为了更好地了解GFP的性质和应用，我们需要计算一些关键的参数。下面是常见的几个参数及其计算方法：

3.1. 色素基团的构象 GFP的香豆素色素基团是荧光的主要来源，因此了解它的构象非常重要。其中最重要的参数是内环部分的键长和键角。内环存在两种共振式：高能和低能共振式。其键长和键角分别记为r和θ，则高能共振式基态能量为E1=-πc^2/2r^2，低能共振式基态能量为 E2=πc^2/2r^2(1-cosθ)。因此，内环的基态能量是 Emin=E1cos^2(θ/2)+E2sin^2(θ/2)。实际计算时，通常采用分子动力学（Molecular Dynamics，MD）方法，模拟GFP分子中香豆素色素基团的构象变化。 3.2. 构象与荧光发射内环的构象对GFP的荧光性质影响非常大。例如，在GFP分子中，香豆素基团紧密嵌入蛋白质的肽链中，使其无法自由旋转。因此，荧光发射峰和吸收峰之间的距离很小，即Stokes位移很小。该参数通常用以下公式计算：Stokes Shift = λ_emit - λ_abs，其中λ_emit 是荧光发射峰值波长，λ_abs是吸收峰值波长。 3.3. 荧光效率荧光效率是指荧光发射光子的数量与吸收的光子数量的比值。在GFP中，荧光效率受到自身的荧光猝灭和非辐射转换的影响。因此，正确计算荧光效率需要考虑这些因素。通常采用荧光寿命法（Fluorescence Lifetime，FLT）来测量荧光寿命，然后根据以下公式计算荧光效率：ϕ = FLTk_i / (1 + FLTk_i)，其中k_i是猝灭速率常数。

绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆和表达(新手详细注释版)

绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆和表达背景知识绿色荧光蛋白( green fluorescent protein ， GFP)是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。当受到紫外或蓝光激发时， GFP 发射绿色荧光。它产生荧光无需底物或辅因子。发色团是其蛋白质一级序列固有的。 GFP 由 3 个外显子组成，长 2.6kb ；GFP 是由 238 个氨基酸所组成的单体蛋白 ,相对分子质量为27. 0kMr ，其蛋白性质十分稳定，能耐受 60℃处理。 1996 年 GFP 的晶体结构被解出，蛋白质中央是一个圆柱形水桶样结构，长 420 nm，宽 240 nm，由 11 个围绕中心α螺旋的反平行β 折叠组成，荧光基团的形成就是从这个螺旋开始的，桶的顶部由3 个短的垂直片段覆盖，底部由一个短的垂直片段覆盖，对荧光活性很重要的生色团则位于大空腔内。发色团是由其蛋白质内部第 65-67 位的 Ser-Tyr-Gly 自身环化和氧化形成 . 实验一质粒DNA 的分离与纯化一、实验目的掌握一种最常用的质粒 DNA 提取方法：碱裂解法。该法用于从小量培养物中抽提质粒 DNA ，比较方便、省时，提取的质粒 DNA 质量较高，可用于 DNA 的酶切、 PCR 甚至测序。二、基本原理质粒是一类在细菌细胞内发现的独立于染色体外，能够自主复制的稳定的遗传单位。迄今为止，从细菌中分离得到的质粒都是环型双链 DNA 分子，分子量范围从 1kb 到 200kb 。质粒 DNA 可持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下又会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。在大多数情况下质粒 DNA 复制中的酶体系和细菌染色体复制 10-200 个拷贝。当宿主细胞的蛋白

增强型绿色荧光蛋白

增强型绿色荧光蛋白【摘要】目的：应用增强型绿色荧光蛋白-C1标记骨髓间充质干细胞，以期为MMSCs的体内移植提供示踪方法。方法: 在体外分离培养大鼠MMSCs，流式细胞仪检测细胞表型，以脂质体介导法转染质粒增强型绿色荧光蛋白基因，荧光显微镜观察基因表达。结果在基因转染24 h后开始表达，48～72 h达高峰，12～14 d后有较多的表达。结论: 由脂质体介导的质粒可较为安全、有效地转染MMSCs,是一种较为理想的干细胞示踪方法。【关键词】骨髓间充质干细胞；增强型绿色荧光蛋白；基因转染［Abstract］Objective: To develop an appropriate tracing method for transplanted marrow mesenchymal stem cells (MMSCs) in vivo. Methods: MMSCs of rats were isolated from bone marrow and purified by adherent culture in vitro, and the cell membrane‘s marks were

detected with flow cells were transfected with expressing plamid of transient expression was subsequently observed with fluorescent microscopy. initially found in 24h after the transfection，reached peak in 48～72 h，and remained strong express for 12～14 more days. Conclusion: Lipofectamine mediated transfection can make s safely and effectively, which shows that it is an ideal method for stem cell tracking. ［Key words］ marrow mesenchymal stem cells; enhanced green fluorescent protein; gene transfec- tion 骨髓间充质干细胞成为近年来干细胞研究的热点，其不仅本身可发挥治疗作用，同时也可作为外源基因的载体和表达场所[1]，是基因治疗理想的种子细胞。2007年

实验绿色荧光蛋白

生物技术实验报告姓名：张龙龙学号：2011506066 班级：11级生技02班

前言：绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。当受到紫外或蓝光激发时，GFP 发射绿色荧光。它产生荧光无需底物或辅因子发色团是其蛋白质一级序列固有的。GFP 由3 个外显子组成，长2.6kb；GFP 是由238 个氨基酸所组成的单体蛋白,相对分子质量为27. 0kMr，其蛋白性质十分稳定，能耐受60℃处理。1996 年GFP 的晶体结构被解出，蛋白质中央是一个圆柱形水桶样结构，长420 nm，宽240 nm，由11 个围绕中心α螺旋的反平行β折叠组成，荧光基团的形成就是从这个螺旋开始的，桶的顶部由 3 个短的垂直片段覆盖，底部由一个短的垂直片段覆盖，对荧光活性很重要的生色团则位于大空腔内。发色团是由其蛋白质内部第65-67位的Ser-Tyr-Gly自身环化和氧化形成. 一.实验目的 1、了解表达用基因克隆引物设计的原理和方法。 2、了解利用原核表达系统表达外源基因的原理、流程及方法。 3、掌握PCR、DNA片段的酶切与连接、细菌转化、阳性克隆筛选、质粒提取、DNA样品的纯化、核酸电泳等分子生物学基本技术。二．实验原理基因工程一般包括四个步骤：一是取得符合人们要求的DNA片段，这种DNA片段被称为“目的基因”；二是将目的基因与质粒或病毒DNA连接成重组DNA；三是把重组DNA引入某种细胞；四是把目的基因能表达的受体细胞挑选出来。本实验根据绿色荧光蛋白（GFP）的基因序列设计一对引物，用该引物将GFP基因从含GFP基因的质粒中扩增出来。再利用双酶切切开表达载体pET23b 和目的基因的两端接头，通过T4连接酶GFP基因与表达载体重组。将含GFP 基因的重组表达载体导入宿主菌BL21(DE3),在IPTG的诱导下，使GFP基因表达三.实验材料及仪器 1、实验材料：含有GFP的质粒；DNA Marker；DH5α；BL21； 2、仪器：恒温培养箱、超净工作台、恒温摇床、制冰机、台式离心机、涡旋振荡器、冰箱、电泳仪、透射仪、PCR仪、PCR管、刀片、玻璃涂棒、酒精灯、无菌牙签、吸水纸、微型离心管、台式冷冻离心机、塑料手套、1.5ml离心管。四.实验内容 4.1 质粒的提取、酶切及电泳鉴定： 1)实验试剂：LB培养基；溶液Ⅰ；Tris-HCl（pH=8）；溶液Ⅱ；溶液Ⅲ；酚/氯仿抽提液；无水乙醇；电泳缓冲液；加样缓冲液；GoldView核酸 DNA 染色剂；1%的琼脂糖凝胶；XhoⅠ(10U/μl)；NdeⅠ（10U/μl）；T 4 lisase。 2)实验步骤：质粒的提取与鉴定

荧光蛋白发光原理

荧光蛋白发光原理引言荧光蛋白（Fluorescent Protein，FP）是一类广泛存在于生物界的蛋白质，具有自身特异的发光性质。荧光蛋白最早于1962年被发现，并因其独特的发光性质而受到广泛关注和应用。荧光蛋白不仅可以作为标记物用于生物成像、细胞追踪等领域，还可以通过工程改造应用于药物筛选、基因表达调控等研究领域。荧光蛋白的结构荧光蛋白是一种由238-239个氨基酸残基组成的多肽链，在自然界中存在着多种类型和亚型。其中最常见且最重要的类型是绿色荧光蛋白（Green Fluorescent Protein，GFP），它具有天然的自主发光能力。 GFP由11个β折叠片段（β-strands）和一个α-螺旋（α-helix）组成，这些结构元素通过大量氢键和其他非共价相互作用稳定在一起。其中一个β折叠片段形成了一个具有环状结构的“酚环”（Phenolic Ring），在荧光蛋白的发光过程中起到了关键作用。荧光蛋白的发光原理荧光蛋白的发光原理可以归结为三个基本步骤：吸收、激发和发射。 1. 吸收当荧光蛋白暴露在紫外线或蓝绿光等特定波长的激发光下时，它会吸收能量并将电子从基态（Ground State）激发到高能级的激发态（Excited State）。这个过程是通过吸收激发光波长处于可见或近紫外区域的电子跃迁来实现的。 2. 激发在激发态，荧光蛋白中的某些氨基酸残基（通常是芳香族氨基酸，如苯丙氨酸、色氨酸等）会接受到能量，并将其传递给“酚环”中的一个色氨酸残基。这个色氨酸残基被称为“调节剂”（Chromophore），是荧光产生的关键结构。

当调节剂接受到能量后，它会发生构象改变，从最初的非发光构象转变为一个高度扭曲的发光构象。这个过程被称为“内转换”（Internal Conversion），是荧光蛋白发光的第一个关键步骤。 3. 发射在内转换之后，调节剂会再次发生构象改变，并释放出一部分能量。这个能量以荧光的形式从荧光蛋白中释放出来，形成可见光谱范围内的荧光信号。这个过程被称为“外转换”（External Conversion），是荧光蛋白发光的第二个关键步骤。荧光蛋白的颜色不同类型的荧光蛋白具有不同的颜色，这是由于其结构中调节剂残基的差异所致。例如，GFP中调节剂残基是苯丙氨酸（Tyr66）和三甲基氨基苯酚（Tyr67），使其产生绿色荧光。而其他类型的荧光蛋白则具有不同类型和数量的调节剂残基，导致了不同颜色的发射。荧光蛋白的应用荧光蛋白由于其独特的发光性质，在生物学和医学领域得到了广泛的应用。以下是一些常见的应用领域： 1. 生物成像荧光蛋白可以作为标记物用于生物成像，如细胞内部结构和功能的研究、动物体内器官和组织的观察等。通过将荧光蛋白基因导入到目标细胞或组织中，可以实现对其进行实时、非侵入性的观察。 2. 细胞追踪通过将荧光蛋白基因导入到不同类型或不同状态的细胞中，可以实现对这些细胞在体内或培养皿中的追踪。这种方法被广泛应用于研究细胞分化、迁移、增殖等过程。 3. 药物筛选利用荧光蛋白作为报告基因，可以构建荧光检测系统来筛选新型药物。例如，通过将荧光蛋白与目标分子（如酶）相连，当目标分子与特定化合物相互作用时，可以观察到荧光信号的变化，从而筛选出具有特定效应的化合物。

绿色荧光蛋白结构

专业文献综述题目: 姓名: 学院: 专业: 班级: 学号: 指导教师: 2012 年6 月15 日南京农业大学教务处制

绿色荧光蛋白GFP的结构以及发光特性摘要：Osamu Shimomura和Frank Johnson首次从水母Aequorea victoria中分离出依赖钙离子的生物发光蛋白，命名为aequorin。在分离过程中，还发现第二种蛋白，它缺乏发射蓝光的生物发光成分，但是在紫外光照射时可以发出绿色荧光，故命名为绿色荧光蛋白（GFP）。在随后的20年里，研究者测定aequorin和绿色荧光蛋白在水母体内共同作用，将依赖钙离子的生物发光信号转换为发绿色荧光特性。本文综述了GFP 的结构和发光特性以及展望GFP的发展前景。关键词：GFP、荧光、展望 The Structure of Green Gluorescent Protein and Luminescent Lroperties Abstract: Osamu Shimomura and Frank Johnson for the first time separated from the jellyfish Aequorea victoria, a calcium-dependent bioluminescent protein, named aequorin. During the separation process, also found a second protein, which lacks the blue light emitting bioluminescence ingredients, but the green fluorescence under UV irradiation, so named for the green fluorescent protein (GFP). In the next 20 years, the researchers determined that aequorin and green fluorescent protein in jellyfish together will depend on the bioluminescence of the calcium signal is converted into green fluorescence properties. This paper reviews the development prospects of the GFP structure and luminescence properties, as well as the outlook of the GFP.Key words: GFP, fluorescence, Outlook 1.GFP的发现简介绿色荧光蛋白（GFP）是一种能够发出绿色荧光的蛋白质，它存在于维多利亚多管水母体内。1955年，Davenport[1]等发现维多利亚多管水母(A. victoria)可以发出蓝绿色的光。Shimomura[2]等在1962年研究，他们从维多利亚多管水母(A. victoria)中分离纯化出水母素，同时还发现了维多利亚多管水母(A. victoria)体内有绿色荧光蛋白存在。在1963年, 他们发现钙离子可以增强水母素的发光[3]1974年，Morise[4]等在进一步的研究中从维多利亚多管水母(A. victoria)分离纯化出GFP的晶体。而且还发现在没有GFP存在时，水母素能够发出很弱的蓝色荧光，波长为470 nm；钙离子和水母素结合后，将能量传递给GFP，导致GFP在紫外光下发出绿色荧光，波长为509 nm。 2.荧光蛋白结构以及发光特性 2.1GFP结构一级结构：GFP的生色团位于64至69的六肽内，更准确的说是65至67残基（野生型GFP中是Ser-Try-Gly)生成的4-（对-羟基苯亚甲基）咪唑-5-啉酮。图一为生色集团形成机制[5]

绿色荧光蛋白和PCR技术

绿色萤光蛋白（green fluorescent protein）»简称GFP,这种蛋白质最早是由下村修等人在1962年在一种学名Aequorea victoria的水母中发现。其基因所产生的蛋白质，在蓝色波长范用的光线激发下，会发出绿色萤在「这个发光的过程中还需要冷光蛋白质Aequorin的帮助，且这个冷光蛋白质与钙离子（Ca2+）可产生交互作用。由水母Aequorea victoria中发现的野生型绿色萤光蛋白，395nm和475nm 分别是最大和次大的激发波长，它的发射波长的峰点是在509nm,在可见光绿光的范围下是较弱的位置。由海肾（sea pansy）所得的绿色萤光蛋白，仅有在498nm有一个较高的激发峰点。在细胞生物学与分子生物学领域中,绿色萤光蛋白基因常被用作为一个报导基因（reporter gene）o一些经修饰过的型式可作为生物探针，绿色萤光蛋白基因也可以克隆到脊椎动物（例如：兔子上进行表现，并拿来映证某种假设的实验方法。 2008年10月8日，日本科学家下村修（伍兹霍尔海洋生物学研究所）、＜国科学家马丁・査尔菲（哥伦比亚大学）和钱永健（加利福尼亚大学圣迭戈分校）因为发现和改造绿色荧光蛋白而获得了当年（2008）的诺贝尔化学奖。 GFP的性质 GFP荧光极其稳立，在激发光照射下，GFP抗光漂白（Photobleaching）能力比荧光素（fluorescein）强，特别在450〜490nm 蓝光波长下更稳定。 GFP需要在氧化状态下产生荧光,强还原剂能使GFP转变为非荧光形式，但一旦重新暴露在空气或氧气中，GFP荧光便立即得到恢复。而一些弱还原剂并不影响GFP荧光。中度氧化剂对GFP荧光影响也不大，如生物材料的固定、脱水剂戊二酸或甲醛等。 GFP融合蛋白的荧光灵敏度远比荧光素标记的荧光抗体高，抗光漂白能力强, 因此更适用于左疑测左与分析。但因为GFP不是酚，荧光信号没有酚学放大效果，因此GFP灵敏度可能低于某些酶类报告蛋白。由于GFP荧光是生物细胞的自主功能，荧光的产生不需要任何外源反应底物, 因此GFP 作为一种广泛应用的活体报告蛋白，其作用是任何其它酶类报告蛋白无法比拟的。 GFP在肿瘤发病机制研究中的应用 GFP是一个分子量较小的蛋白，易与其他一些目的基因形成融合蛋白且不影响自身的目的基因产物的空间构象和功能。GFP与目的基因融合，将目的基因标记为绿色，即可圧疑分析目的基因的表达水平，显示其在肿瘤细胞内的表达位巻和量的变化，为探讨该基因在肿瘤发生、发展中的作用及其分子机制提供便利条件。在肿瘤的形成过程中，增殖和凋亡是一对相互矛盾的统一体。若肿瘤细胞凋亡占优势，肿瘤组织将长期处于休眠状态或自行消亡。肿瘤细胞的凋亡受凋亡相关基因调控。用GFP转染肿瘤细胞凋亡相关基因，并与正常组织进行比较，则大致可判断此基因为抑制肿瘤细胞凋亡的基因；反之，为促进肿瘤细胞凋亡的基因。肿瘤细胞浸润是肿瘤细胞粘连、酶降解、移动和基质内增殖等一系列过程的表现，苴根本原因在于肿瘤细胞内某些基因表达异常。利用GFP的示踪特性，研究肿瘤细胞内某些基因异常表达与肿瘤细胞浸润的关系，即可揭示肿瘤细胞浸润的某些机制。

荧光蛋白--(整理)

荧光一、定义荧光〔fluorescence〕又作“萤光〞，是指一种光致发光的冷发光现象。当某种常温物质经某种波长的入射光〔通常是紫外线或X射线〕照射，吸收光能后进入激发态，并且立即退激发并发出比入射光的的波长长的出射光〔通常波长在可见光波段〕；而且一旦停止入射光，发光现象也随之立即消失。具有这种性质的出射光就被称之为荧光。二、原理光照射到某些原子时，光的能量使原子核周围的一些电子由原来的轨道跃迁到了能量更高的轨道，即从基态跃迁到第一激发单线态或第二激发单线态等。第一激发单线态或第二激发单线态等是不稳定的，所以会恢复基态，当电子由第一激发单线态恢复到基态时，能量会以光的形式释放，所以产生荧光。荧光是物质吸收光照或者其他电磁辐射后发出的光。大多数情况下，发光波长比吸收波长较长，能量更低。但是，当吸收强度较大时，可能发生双光子吸收现象，导致辐射波长短于吸收波长的情况发射。当辐射波长与吸收波长相等时，既是共振荧光。荧光强度：荧光强度与该种物质的荧光量子产率、消光系数以与含量等因素有关。荧光量子产率Q：量子产率表示物质将吸收的光能转化为荧光的本领，是荧光物质发出光子数与吸收光子数的比值。荧光蛋白分子的亮度由其量子产率与消光系数的乘积决定，与成像检测灵敏度密切相关。三、荧光蛋白

1、绿色荧光蛋白〔green fluorescent protein,GFP〕在光谱的绿光区〔500nm-525nm〕已经发现了多种荧光蛋白，而且来源广泛，包括不同种属的Aequorea 、桡足类动物、XX鱼以与珊瑚。然而多数有齐聚反应，即使最好的荧光蛋白与EGFP相比，也没有明显的优点。或许目前活细胞成像最好的选择是GFP衍生的Emerald〔祖母绿〕，它与EGFP的特性相似。Emerald包含F64L 和S65T突变，另外还有四个点突变从而改进了折叠、37℃时的突变率以与亮度。虽然Emerald比EGFP更有效，但含有快速光漂白成分，可能在某些环境下其定量成像会受到影响。下面主要介绍GFP与其衍生型荧光蛋白：〔1〕来源绿色荧光蛋白最早由美籍日裔科学家下村修于1962年在水母中发现。这种蛋白质在蓝色波长X围的光照激发下发出绿色荧光，其发光过程需要冷光蛋白质Aequorin的帮助，而且，这个冷光蛋白质可与钙离子〔Ca2+〕相互作用。在水母中发现的野生型绿色荧光蛋白的分子量较小，仅为27~30kDa，而编码GFP的基因序列也很短，为2.6kb。〔2〕性质 GFP由238个氨基酸残基组成。GFP序列中的65-67位残基〔Ser65-Tyr66-Gly67〕可自发形成荧光发色基团——对羟基苯咪唑啉酮GFP的激发光谱在400nm附近有一个主激发峰，在470nm附近有一个次激发峰。发射光谱在505nm附近有一尖锐的主发射峰，在540nm附近有一肩峰GFP的化学性质相当稳定，无光漂白现象〔Photobleaching〕，用甲醛固定和石蜡包埋亦不影响其荧光性质。在细胞生物学与分子生物学领域中，绿色荧光蛋白基因常被用作报告基因。〔3〕野生型野生型GFP〔wild type GFP, wtGFP〕从一开始就引起了人们极大的兴趣，而且被用作新型的简单报告基因与体内标记，但GFP在异源生物体中的表达并非那么简单。例如，研究人员很早就发现需要在较高的温度下孵育才能在细胞或生物体中表达GFP，并且wtGFP在37℃的热稳定性差。这些都阻碍了它在转基因中的应用。这些难题促使人们进一步筛选分离wtGFP的变体。现在，人们已经找到了荧光强度更强且更耐热的变体。这些变体多数为经突变的脱辅基蛋白，它们可防止高温导致的错误折叠。近年来出现的新型wtGFP基因突变体的激发和发射谱发生了改变，热稳定性和荧光强度得到了提高，GFP报告基因在小鼠中的应用就是以这些变体作为基础的。〔4〕增强型绿色荧光蛋白〔EGFP〕现在，应用最为广泛的是红移变体增强型GFP〔EGFP〕。诸如EGFP这些红移变体的最大激发峰发生红向移动，大约为490nm，这一波长也恰好是多数分光设备、流式细胞仪与共聚焦显微镜的常用波长。EGFP有两个氨基酸突变，当被蓝光激发时，它发出的荧光要比wtGFP亮30-40倍。wtGFP和包括EGFP在内的多数变体半衰期长，所以不适合精确追踪表达的减少或损耗。〔5〕不稳定增强型绿色荧光蛋白〔dEGFP〕为克服这一问题，人们在1998年构建了不稳定增强型绿色荧光蛋白〔dEGFP〕。原理就是将EGFP的cDNA融合到小鼠鸟氨酸脱羧酶〔Ornithine decarboxylase, ODC〕基因的C-末端。ODC含有一个PEST序列，这个序列可促进该蛋白在细胞内