DNA重组实验常见问题分析

Sirtuins as potential targets for metabolic syndrome

Leonard Guarente1

Metabolic syndrome threatens health gains made during the past century. Physiological processes degraded

by this syndrome are often oppositely affected by calorie restriction, which extends lifespan and prevents

disease in rodents. Recent research in the field of ageing has begun to identify important mediators of

calorie restriction, offering the hope of new drugs to improve healthspan. Moreover, if metabolic syndrome

and calorie restriction are opposite extremes of the same metabolic spectrum, calorie restriction mimetics

might provide another therapeutic approach to metabolic syndrome. Sirtuins and other important metabolic

pathways that affect calorie restriction may serve as entry points for drugs to treat metabolic syndrome.

长寿蛋白作为代谢综合症的潜在目标

在二十世纪，代谢综合症威胁着人类的健康。相反地，该综合症导致的生理过

程退化常常受到卡路里限制。卡路里限制会延长寿命，保护啮齿类不生病。在

有关老龄化的领域里，最近有研究开始鉴别卡路里限制的重要中介，这为研制

新的药物提高寿命提供了希望。并且，如果代谢综合症和卡路里限制是同样代

谢光谱的两个相反极端的话，卡路里限制模仿将为治疗代谢综合症提供了新的

途径。长寿蛋白和其他重要的影响卡路里限制的蛋白途径可能作为治疗代谢综

合症药物的入口点。

载体用NotI单酶切，目的片段也用NotI单酶切，并对载体进行去磷酸化，但一直也没连上？

参考见解：

1、用NEB的高效连接酶连看看，用400U或2000U的试试

2、16度过夜连接，或更长

3、单酶切用PCR来鉴定方向方便些

4、去磷酸化后，将去磷酸化酶失活很重要，否则可能根本连不上。

5、失活的方法很多了，可以加热（有的热敏感酶可以），可以直接过胶回收柱子，但比较放心的方法就

是跑胶回收。

PCR扩增到特异性产物后，回收PCR产物，PCR产物用BamHI和EcoRI（NEB公司的酶）在随EcoRI的BUFFER中双酶切8小时，同时，p UC18 同样酶切，连接片段和载体DNA酶切均用QIAGEN quick spin column回收片段，按NEB 连接酶说明过夜连接，连接产物电转化。但是，看转化结果，连接产物转化的平板大部分是蓝斑？什么原因？

参考见解:

1、柱子回收一般没有问题，但会不会存在操作问题，所以回收产物可以跑胶或用紫外分光系统检测一下有没有DNA。

2、PCR产物直接酶切，在设计引物的时候有没有在酶切位点两边加保护碱基？这里pcr产物酶切出问题的可能性很大。

3、酶有没有问题？可以用这两个酶切一些已知的质粒看看能不能得到所要的片断。

4、大部分是蓝斑说明可能是载体酶切不完全，也可能是没有在载体酶切后跑胶回收载体，这样不能完全除去酶切掉的小片断（Qiagen的柱子对小片断的回收比较好），后来连接反应中小片断可能又连上了。

5、大部分是蓝斑，那就是还有白色的。挑了白色的摇了提质粒看看啊，说不定就有阳性的。

6、建议在载体酶切后用碱性磷酸酶进行去磷酸化，这样可以彻底防止载体的自身环化。

酶切目的基因及质粒载体后加Loading buffer终止反应,然后要直接进行连接反应,可以吗?要是不行,还有一种方法就是加热灭活限制酶(用的是Hind3/EcoR1双酶切),多高温度适合啊?

参考见解：

1、一般直接用2倍体积的无水乙醇沉淀目的片段，干燥后直接用水溶解连接即可。比较适用于载体和PCR产物的连接。效果很好。

2、酶切后要胶回收后再连接,另外酶切结束后,直接电泳回收不用加终止液,对连接没有影响.

3、有的公司的限制酶（如NEB）是不需要热灭活的，而有的公司的限制酶（如MBI）则需要热灭活，一帮是65摄氏度，10分钟。然后经凝胶回收后再作连接，目的片段与质粒的摩尔比在3～10：1的范围内连接效果都不错。

4、通常随酶附送的loading buffer是含有SDS起到灭活的作用，但在上样时会产生很多泡沫。

一个质粒的双酶切，两种酶buffer一样，同时切胶。跑胶时，一个小片段看不到，大概600bp，怎么办？根据Marker把需要的4900bp的片段进行胶回收，效果特别差。用乙醇沉淀法回收，然后跑胶，回收，效果也不好。现在要做连接，可双酶切后质粒的回收不好，用于连接的质粒双酶切后怎么处理？把乙醇沉淀回收的双酶切质粒直接用于连接，这样可以吗？

参考见解：

1、做双酶切的时候用的buffer都是根据公司提供的双酶切最适buffer，每个公司应该都提供双酶切使用的buffer列表。

2、酶切后电泳条带比较好，切胶回收的效果不好，可能是回收过程中操作出现问题，或者是回收试剂盒有问题。可以尝试更换试剂盒做回收试试，或者看看酶切电泳后目的条带有没有弥散，如果有，切胶回收得不到好的效果。

3、用于连接的的片段应是单一的，如果将双酶切的质粒直接用于连接，即使得到了转化子，鉴定也比较麻烦，自己都不知道连上的到底是目的片段还是非目的片断。最好用回收产物做连接。

4、酶切时如果质粒很大>7kb那么希望得到的600bp亮度相对vector太暗了，可能看不到，如果600的带看不到，可以试试加大酶切的质粒的量。相同mol数600 和4900的带亮度差别会很大。

5、如果酶没有问题那就要确定双酶切是否已经切开了，已经切开了，只是600bp比较弱的话，可以尝试加大酶切体系（如增大酶切体系为原来的两倍或三倍），酶切后乙醇沉淀富集酶切片断后用小体积TE 溶解后电泳，效果可能有所改善。如果根本就没有切开的话，那就要考虑是否是酶的问题，buffer的问题或质粒的问题。

将载体和目的片段（PCR扩增产物，约500bp,两端设有酶切位点）分别用EcoR1和BamH1双酶切后，定向连接。但载体上该双酶切位点间有一个800bp的片段，酶切后电泳可见这一片段，表明酶切成功，胶回收了大片段。连接转化成功后，挑选的单菌落提质粒，PCR鉴定表明有目的片段，约500bp，但双酶切却仍然是800bp的原片段长度。目的片段不含有双酶切位点。请问连接是否成功？若成功了，为何会出现这种奇怪的现象？

参考见解：如果pCR没有污染

1、假设挑选的是单菌落，则有可能是因为自己引物非特异扩增。PCR比酶切更易出问题，相信酶切结果，没连上。

2、假如PCR没有问题，最可能是菌被污染，连上了，但有污染。这种可能性大。假阳性产生的可能性极大。

3、最好重新挑科隆，摇菌。如果不行再用通用引物确定是否没有连上。

4、应该使用载体引物来作PCR鉴定，因为自己的引物作很有可能出现假阳性。

5、片断是500bp的，而载体切下来的片断中含有800bp，是否是因为重组质粒的浓度太低，使得800bp的片断可以见到，而没有办法看见500bp的，所以建议将重组质粒酶切量增加，电泳时上样量增加。

6、可以看到800bp的片断，应该是载体自连接，因为插入片断后载体的酶切位点移位，应该没有办法再次切下800bp的片断，所以建议重新挑菌再作。

7、如果您能通过PCR检测出您提取的质粒中含有目的片断,而双酶切时却只能显示应该切除的片断,说明可能出现的情况是:您的连接成功,但是您挑取的菌落并不是单克隆,而是包含有假阳性(也就是自连接的质粒菌落)的混合菌落,而且假阳性菌落比例高于需要的阳性菌落,导致在进行摇菌扩增质粒时,同时大量扩增了假阳性质粒,从而出现上面描述的情况.

8、如果打算从新开始酶切,连接,转化的话,建议加大酶切时酶的使用量，在酶切片断回收时尽量不要切下杂带，这样可以尽量减少自连假阳性的可能性。

9、如果不打算从新做过，建议在原来已经铺好细菌的LB固体培养基上，再挑取一些菌落，可以一次性多挑几个单克隆（记住，一定要是单克隆，否则很难处理），中心的和周边的，大的和小的，都挑一些，然后用国产质粒提取试剂盒进行小量提取，并且酶切鉴定，这样可以节省大量的时间，并且取的不错的效果，在用试剂盒提取之前每个菌落保留1~2ml菌液，冻存，并标记好对应的试管，如果之后发现那个菌落是阳性克隆的话，回过头来就可以使用冻存的菌液大量提取了。

TaKaRa的内切酶和NEB的内切酶哪个更好一些？

参考见解：TaKaRa的内切酶、NEB的内切酶两个公司的酶的品质都非常好。NEB公司的酶的活性很

高，切出两条小带可能是因为出现星活性，可以试试把酶量减半。NEB的酶很多都是克隆的，所以纯度比较高。

应用磁性微球提取人全血基因组DNA，将提取出的DNA直接用于限制性酶切反应，应用Taq1酶，但发现酶切后产生的是smier片断，即切碎的状态。不知原因是什么？在做这类实验时，一般是将PCR产物进行酶切，这与实验结果有联系吗？是不是直接提取出的DNA必须要做PCR扩增，才能应用酶切？

参考见解：

1. 为建立基因组文库时一般才用限制性内切酶酶切人基因组DNA.目的是为获得含有人全部DNA的随机片段的总和.然后再用载体和宿主细胞构建克隆.关于文库建立园内资料很多.lyz703lyz战友感兴趣的话可以自己搜索下.

2. 电泳图,酶切后是一片弥散的带,是因为基因组中存在大量Taq1酶的酶切位点,由于操作属于随机酶切,所以得到的DNA也是随机的,而不是大量均一的.那么电泳后的出现这样的结果也很容易解释.

3. 一般在PCR后采用酶切是由于酶切模板数目巨大且均一,在了解了被切DNA上有关限制性内切酶位点的信息后,我们就可以根据自己的目的来选择合适的内切酶进行酶切.

做抑制差减杂交,需要回收细菌基因组酶切(Alu1酶)后的全部片段,要求回收后至少是6微升,浓度要有0.3微克\微升,按照抑制差减杂交说明书,采用酚仿抽提和无水乙醇沉淀法,只要酶切2微克基因组就能满足条件,可已经把酶切量扩大到10多微克了,回收还是达不到浓度(大约只有0.06微克\微升),又不敢切胶回收,怕EB对后续反应造成影响。请教该怎么办？

参考见解：回收酶切产物浓度低的原因可能是：苯酚/氯仿抽提时损失太多。说明书上说苯酚/氯仿/异戊醇和氯仿各抽提两次，这样经过四次抽提DNA损失得非常多，解决办法是将50?l酶切产物加等体积的灭菌去离子水，然后再抽提，损失会减少很多；另外乙醇沉淀时可以延长，低温沉淀会提高得率；还有用80％乙醇洗涤沉淀弃上清时，要轻轻用移液枪吸出，防止将沉淀随上清倒出。注意这几点应该可以回收到理想浓度的DNA了。

做PCR将分别将50和300bp片段扩出后，将两个片段连接到一起为550bp，要将550bp片段连到载体上，但550bp片段中间产生了新的酶切位点跟设计的酶切位点AseI一样，想通过部分酶切方法得到550的片段，如果完全酶切就分成原来的两个片段，求教部分酶切的详细方法？

参考见解：可以选择那个和设计不相同的那一端的酶切位点先做连接，之后再进行平化连接，这样就可以避免所设计中的有重复酶切位点的问题了。部分酶切关键是酶切时间，可以先摸索一下酶切的时间。在一个大一点的体系中（比如50微升体系），37度酶切，然后每隔一段时间取出一部分（比如5微升或10微升），然后一起进行核酸电泳，摸索一下合适的酶切时间。部分酶切的话，时间应该不能太长，可以每间隔5分钟或10分钟左右就取一次。

要将PCR片段连入表达载体中,选的是TaKaRa的BamH I和Hind III,请问这个双酶切是在37度反应还是30度,要酶切多长时间?PCR片段比较难切吗,引物两端都各加了3个保护碱基？

参考见解：一般37度2小时就行，在酶切时，由于你所选用的酶都是效率比较高的，酶切一个小时就已

经足够了。不过若不放心，过夜也没问题。buffer需要共用buffer(比如Y buffer)。PCR片段的酶切效率与引物两端所加保护碱基有很大关系。如果保护碱基加的恰当，酶切应该不成问题。PCR产物，由于浓度较低，并不难切，只是在连接转化时难以成功。BamH I一般加CGGGATCCCG的酶切效率高达90%。其它酶的具体情况可以查NEW ENGLAND BioLabs的目录。按new england biolab 的介绍，hindIII切割的时间较长，如果，直接切pcr产物再连接有时效率不高，导致转化效率低。如果有条件的话，可以先做at克隆，再酶切。TaKaRa的产品目录的A部分里有关于双酶切所用buffer 的详细说明，最好依照执行。

PCR反应后，是否可以直接用来酶切，而不需要从凝胶上回收后再酶切！酶切后直接在4％琼脂糖凝胶上电泳分型，有四种片段91，83，72，48BP，想用凝胶电泳对其六种表现型分型，不知可行否？

参考见解：理论上是可行的但是主要取决于PCR产物与酶切产物的大小差距，差距太小不容易获得很纯的片断，为什么不在酶切后连在载体质粒上呢，再筛选阳性克隆，是否作表达？至于看六种表型建议用PAGE胶电泳做SSCP，用银染分辨率高，可能能解决问题。

PCR产物经过酶切连接到载体上，所用酶切位点是（BamHI,EcoRI）均有8个保护碱基。但是无论怎么切，总是连接不上？什么原因？

参考见解：

1、PCR产物是否经过纯化了？PCR产物中有较高的离子强度，会影响酶切，如果不经过纯化，则酶切体系中的PCR产物应该适当减少。

2、vector是T-vector还是其他的,如果是其他的话,那要考虑vector在酶切时,是否是切完全了的,将PCR产物测序,看是否有要的酶切site.

3、虽说有这么多的保护碱基，假设它们对酶切足够的，但也要遵循其它的条件，如这两个酶在做双酶切时，是否用了它们能通用的缓冲液？也就是说这两种在这种缓冲液中必须要有足够的酶切效率。有两种方法可以上试：（1）分两次酶切。即先用一种酶切，胶回收后再用另一种酶切。这种方法保证了在各自的酶切缓冲液中都得到了最大的酶切效率。（2）克隆到T载体中。不知道加的是什么保护碱基，是不是有足够的保护作用？克隆到T载体中，则不要考虑受这个条件的限制。

4、按照NEB公司推荐的保护碱基经验，BamH1和EcoRI前加CG就够了，用不着加那么多。当然，加那么多不大会是试验失败的原因。

5、BamH1和EcoRI都是甘油浓度敏感型的，就是说酶量加的太多了会引起Star活性。不知你的酶切体系如何设定的。

6、先检查设计引物设计中酶切位点是否正确，然后再重复一次。当然先连到T载体是万无一失，但是克隆周期也延长了。

加了保护碱基，却切不动？

参考见解：

1、酶切缓冲液。每种酶都有公司提供的最佳缓冲液，它们的差别只是离子浓度与体系的不同，如Na、k、Mg等，还有PH值及缓冲体系（一般Tris-HCl），另外酶加甘油和DTT作为保护剂。在双酶切的时候常会遇到两种酶有各自的缓冲液，要达到高酶切效率，选择是个问题，如果酶切时间和量足够，解决

的方法：

1) 使用其中一个酶的缓冲液，但要考虑到另一酶的反应效率，反应效率如何，可以查查酶在不同buffer 里的效率参数，具体见公司网站，如NEB提供了很好的buffer参数:

2) 使用它们的通用的缓冲液，使两种酶在同一缓冲液里达到也足够的酶切效率；没有通用的BUFFER 怎么办呢？分两次酶切。即先用一种酶切，胶回收后再用另一种酶切。一般先低盐后高盐，这种方法保证了在各自的酶切缓冲液中都得到最大的酶切效率，但缺点是要回收，损失大；

3) 克隆到T载体中，值得推荐的方法，克隆到T载体中，不须要考虑受这个条件的限制，酶切位点也可以用T载体上自带的。

2、酶切温度。酶切温度也很重要，一般的酶切最适温度为37度，有些特殊的酶的反应温度不同，如Sma Ⅰ为30度。双酶切时这种情况下最好分开切，先低温后高温。

3、酶切时间。酶切时间直接影响到酶切是否完全，一般为1-3h，这个时间已经足够，对于一些活性较好的酶，30min就可以酶切完全，建议在酶切1h后取5ul跑电泳以鉴定酶切效率；PCR产物的酶切时间较长，一般过夜。

4、酶失活。如果使用酶解冻后放置太久，可能导致酶失活。这种情况较少见，只能换新酶。如果拿了不同公司的酶，buffer也不一样，怎么办？放心，可以用不同公司的酶进行双酶切，一般不会有问题的。可以先查查NEB的酶在不同缓冲液中的活性百分比，选择它们都有适中活性的buffer，每个公司生产的酶反应缓冲液针对特定内切酶是最合适的！

5、酶切体系。选用多大的酶切体系取决于你的样品浓度，在双酶切的时候为了得到质量高的电泳图，尤其插入的是小片段DNA，酶切后产物量较少，可以增加酶切重组DNA的量和增加上样量，建议酶切前测定一下DNA浓度或跑电泳看看DNA有多浓，做到心中有数。

要将目的片段插进载体，选择的酶切位点是Xho1和EcoR1,但是这两个位点共用一个碱基G，即CTCGAGAATTC。还有一对位点是Xba1和Sal1，中间没有空，即TCTAGAGTCGAG。请问这两种情况能不能切开，或是只能通过单酶切来实现？

参考见解：

1、还是有可能切开的，双酶切不行就分开切试试。再不行，又实在想用这个载体的话，可以变通一下。设计一个短片段DNA，两头带EcoR I的粘性末端，与EcoR I酶切后的载体连接，获得新的载体，以后再做就不会遇到这个问题了。

2、可以先接上一个片段，再做两次单酶切。例如：载体用BamH I切开，连上两端都是BamH I末端的一个片段------->用EcoR I酶切，回收后再用BamH I切。

3、先用BamH I和EcoR I同时双酶切试试。不行的话，就先用BamH I酶切再用EcoR I酶切。

怎么才能鉴定质粒有没有被双酶切？

参考见解：酶切后作个质粒自连实验，在感受态、连接酶等没问题的情况下，如果没有菌落长出，说明双酶切是成功的。当然，如果只长了很少的菌落，也是可以的。如果长了很多的菌落，那说明酶切不完全，这时候就只有一个酶切位点切开了，质粒发生了自连。

目的片段连pET32a ，16度过夜，酶连体系为目的片段5μl,载体3μl,T4连接酶1μl，10*Buffer1μl.

转化后涂LB－AMP平板，过夜平板长有菌落，但菌落不大，都很孤立，挑取菌落于LB-AMP液体摇菌过夜，试剂盒提取质粒后电泳一片弥散，无目的条带，这是哪个步骤出问题了？

参考见解：

1、觉得是连接体系可能有问题，目的基因并没有跟载体连上，之所以长菌是由于AMP抗性的筛选压力不够，长了杂菌。

2、连接体系可能还需要再考虑，首先是目的片断与载体应该是摩尔数之比为3：1～6：1；其次转化是否也存在问题？即使是空质粒也是有条带的。还有可以在转化质粒时，以空质粒为对照这样来比较。

电泳了纯化后的目的片段和载体都有，但载体没目的片段亮，酶连时是不是需要测核酸浓度后再算体积比？

参考见解：必须计算浓度来估计：

质粒加DNA浓度计算：

质粒PCR产物

电泳后浓度（OD值） A(18) B(14)

相对分子量 C（7300） D(100)

摩尔浓度 A/C B/D

体积比 x y

x.a/c/(y.b/d)=1/3=>x/y=bc/3ad(x+y=12Ul,水为12ul)

x/y=16/1,x+y=12

x=16ul,y=1ul

hPer11μl1μl

PGBKT7 16μl16μl

T4 ligase????1μl 混匀

10*t4 ligase 2ul

水 12ul

载体用CIAP,37度处理30分钟后,用连接酶自连,转化一个克隆没有,同时用处理过的载体与100bp的外源片段连接,转化后也一个克隆都不长.载体和目的片段的摩尔比在1:10。阳性对照长的也很好,该怎么办？

参考见解：

1、片断回收后电泳验证；如果外源片断是切胶回收，一定要在长波下操作

2、载体与目的片段的摩尔比应该是1:1,质量比可以在1:3-10,多做几个梯度,不可能什么都不长的。

3、插入片断要求酶切好,很多时候是酶切不完全而根本不能连接。比例是载体：目的片段＝1：2到1：3之间。很容易连上。

需要做PCR-based siRNA，其中的质粒模板不够，所以做转化扩增后再抽提质粒。做了3次转化都出不来，总结问题如下：

1.质粒是以前抽提过的，浓度很大，但没有做过电泳，直接加1ul转的

2.感受态制备好的，在冰上直接化开作的。

3.直接用分子克隆上的方法，100ul感受态+1ul 质粒冰上30min,42度热激90se c, 冰上2min,加LB 复苏150rpm 45min,涂Amp板100ul, 16h，但是只有第3次长了1各菌落，怀疑没有转好长得杂菌。

请问这里有什么问题，有哪些要改进的？

参考见解：

感受态保存时间不要太长，最好3个月以内，保存负70度，时间长效率会降低的。

如果合适，可以用蓝白筛选阳性菌落，X-GAL和IPTG是40：7，兰色为阴性，白色阳性

保存正确的温度最少是-20℃,一般长期保存需要放置-70℃.就算是-70℃保存,一般经过3个月以上后,质粒会降解非常大.在做转化之前一定是先要鉴定质粒的浓度和质量的.如果有条件可以利用仪器测试浓度,简单的办法就是取一定量(根据质粒浓度决定)进行电泳,然后和marker比较,来测定浓度。

转化过程中的温度非常重要,特别是42℃这步,都精确到考虑Ep管管壁厚薄的影响.

关于只有第3次长了1各菌落，怀疑没有转好长得杂菌。”首先,16h是不够的,最少也要观察48h,因为转化了质粒的细菌不比正常细菌,受了伤长得很慢而且数量不会很多,有5~6个菌落就是非常好的现象.就算长了一个菌落可以挑出来摇摇看,也许就是需要的。

底物DNA没有被所用限制酶切断，怎么办？

参考见解：

底物DNA没有被所用限制酶切断，可以考虑以下几种情况：

1、底物DNA上没有该限制酶的识别、切断位点。特别是一些经过重组等处理的DNA，碱基易发生缺失、变化等。

2、限制酶识别位点上的A或C被甲基化。部分限制酶对识别位点中的碱基是否被甲基化比较敏感，从而无法切断该位点。有关甲基化对限制酶的酶切反应的影响，

3、底物不纯。如果底物DNA中含有限制酶阻害物质，会影响限制酶的酶切作用。在此种情况下，底物DNA须重新进行纯化。

4、限制酶的识别、切断位点在底物DNA的高级构造中所处的位置，对酶切反应也有一定的影响。

5、测定Sac?II酶是否失活，可用确定带该酶的一个底物，做个酶切验证就行。

请问感受态细胞里自身没有质粒吗？感受态细胞里自身染色体上有转座子对导入的ＤＮＡ有影响吗？

参考见解：

1、感受态细胞自身有没有质粒同制备感受态之前的细胞有关，在制备感受态细胞的过程中，不会对细胞自身的质粒造成什么影响。

2、感受态细胞里自身染色体上有转座子对导入的ＤＮＡ不会有影响，转座子也会插入到导入的质粒上，可能因为发生的频率比较低，所以不考虑。

实验需用PZero T载体,该载体需用高转化效率的感受态细胞(>=1*10^8cfu/ug DNA)进行转化反应,请问哪种感受态细胞是高转化效率的感受态细胞?

参考见解：其实ＤＨ１０Ｂ，ＤＨ５ａ，ＴＯＰ１０都可以，关键不是看用什么细胞，而是用什么方法制备感受态细胞，一般电转化都轻松可以达到５*10^９cfu/ug DNA以上．ＣaCL2处理一般都是５*10^6cfu/ug DNA-５*10^7cfu/ug 。

买回来的菌种均为感受态细胞，能否将它们象菌种一样制备感受态细胞，有没有影响？

参考见解：

1、保存这样的菌种，不如将质粒转化进去后，再保留有重组质粒的细菌，加入等量的30%甘油后，可以长期保存。如果直接将感受态细菌接种，肯定丧失了摄取外源基因的能力，但可以用来重新制备感受态细胞。如果加入甘油后保存在-70度冰箱内，可以长期使用，但想当作菌种是不行的。其实制备感受态细胞的方法很简单，除了冰，只要氯化钙,大约一个多小时就可以搞定，所以需要时，可以随时制备，也可以制备一批，加入甘油后在-70度保存。

2、利用感受态细胞再来制作感受态，行肯定行，但转化效率不会很高，制备高效率的感受态细胞，其中

关键的步骤是一定要细菌生长状态好。而人工制备的感受态细胞经过低温，高浓度离子，相当于细菌受过一次“伤”。因此用来做菌种保存不是太适合。

“感受态”以及“感受态细胞”的概念？

参考见解：“感受态”是细胞处于易于接纳外源性目的基因进入细胞的一种状态。“感受态细胞”是指处于感受态的细胞。一般情况下，外源性基因很难进入到细胞内只有当细胞处于感受态时，外源性基因才能较容易的进入细胞。制作感受态细胞的方法有很多。

在加Cacl2 步骤换成了加Cacl2-Mgcl2为什么？这样做效果好么？怎么简便的观察感受态细胞的效果？

参考见解：Mg可以提高感受态效率。其实可以试试TSS一步法：

TSS液：10% PEG，5%DMSO，20-50mmol/lMg 2+的LB，PH：6.5 ；摇菌DD600=0.3-0.4，（其实不必要侧，菌液有絮状浑浊就可以了）离心集菌，悬于少量TSS液中，加入质粒混匀，置于4C冰箱中5-60min，加SOC或LB,培养1小时即可铺板。比CaCl法更简单，效果也还可以。

失败的原因只有一个：混进水去了。?混进水指的是收集细菌时残留的LB过多，要把管壁的残液尽量控净或擦净，当然制备好的TSS中混进水去更不行。TSS液越老越好，TSS制备时LB多点少点问题不大，制备完后，静置时间越长，制备感受态效果越好，但制备后再混进水或LB，能使感受效率降低到刚制备的状态。转化时间不宜过长，TSS不光可以做感受态，还可抑制细菌生长。

用于制备感受态细胞的氯化钙可以高压灭菌吗?

参考见解：可以高压灭菌，高压时旋松些瓶盖，防止爆裂。当压好后，立即旋紧4度保存，使用时按无菌原则。但最好不要高压灭菌cacl2的浓度直接影响着感受态的转化效率cacl2浓度要控制在0.1mol/L 所以可以先过滤Imol/L母液用0.22um滤器过滤除菌4度保存使用时在超菌台再用双蒸水稀释10倍使用。

感受态细胞是否可以转变成为正常的菌种？

参考见解：将感受态细胞用无抗生素的LB稀释10000-100000倍后，再涂布到无抗生素的LB琼脂平板上，可以保存或用于进一步制备感受态细胞。或者做转导之前的感受太细胞融化后析出1ul放到不含抗生素的LB肉汤里摇菌，然后再保存菌种。需要时再复苏，按照常规作感受态的方法作。

感受态细胞可以作为菌株来源并再制作感受态细胞吗？