低温脂肪酶基因的异源表达
低温脂肪酶基因的异源表达
引言
低温脂肪酶是一种胞外酶，酶的产生要经过异源表达，修饰折叠，最终分泌至细胞外。决定脂肪酶表达的因素是多方面的，如宿主、外源基因、外界环境以及它们之间的相互作用等。低温脂肪酶的异源表达大多选择大肠杆菌做为宿主。
现已发现分子伴侣能识别并调节细胞内多肽的折叠。如果宿主体细胞分子伴侣与外源基因表达所需要的分子伴侣不匹配，外源基因便不能正确表达。革兰氏阳性菌所产脂肪酶首先以“前酶原”的形式表达，酶的前体区域(pre．region)为信号肽，运输酶原至细胞外，酶原在胞外经蛋白酶水解后断裂产生成熟酶。Rosenau将革兰氏阴性菌脂肪酶的分泌机制概括为三种类型。
(1)含有ATP结合盒(ABC)的输出体(ATP-binding cassette exporter)。这种类型适用于N端缺少代表性的信号序列，但c端包含靶信号序列的脂肪酶的分泌。ABC输出体包括三种蛋白质，由内而外依次是ATP酶，弓型的细胞膜融合蛋白(MFP)和外膜蛋白(OMP)。三种蛋白质组合体横跨内外细胞膜，从而在周质中形成通道直接将酶分泌到胞外。
(2)分泌子(secreton)介导的分泌。这种类型主要由xcp基因编码的蛋白质组成，其分布于细胞内外膜，并在外膜形成孔状通道。
(3)自输送体(autotransporter)介导的分泌。通过该途径分泌的脂肪酶尽管分泌到胞外，但仍然与细胞表面密切相连或紧紧固着在细胞表面。脂肪酶包含两个独特的结构域，N端具有催化活性并且暴露在细胞外，c端结构与所谓的自动输送蛋白(autotransporterprotein)类似，通过形成B．折叠结构的分泌通道协助将脂肪酶N端转运出外膜。
Quyen在对脂肪酶异源表达的研究时发现，在分子伴侣的作用下，大肠杆菌中表达的P．cepacia
的脂肪酶可以分泌。但也有学者研究发现，能表达脂肪酶并不意味着能完全分泌至胞外。有一部分菌表达的重组蛋白存在于周质中，只有少部分分泌至胞外。Feller研究发现，莫拉氏菌TA144的脂肪酶在大肠杆菌中表达后，培养物的上清液几乎没有酶活性，而菌悬液有一定的酶活力，说明脂肪酶没有分泌到胞外，而是存在与外周质空间或镶嵌于细胞膜上。迄今为止，已经有多例低温脂肪酶能用基因工程技术成功表达的报告。Choo等将分离自阿拉斯加土壤的适冷的假单胞杆菌的低温脂肪酶基因在大肠杆菌中表达。其最适pH为8．0左右，在45℃时酶活力最高。以对硝基苯月桂酸酯为底物计算酶的活化能为7．7kcal／mol，低于其它南极适冷菌的12~~~~~~~17 kcal／mol，和中温铜绿假单胞菌的25 kcal／mol。Feller_9 报道了一株南极适冷型莫拉氏菌的脂肪酶基因在中温型大肠杆菌中的克隆与表达。结果发现，包含有耐冷型脂肪酶编码基因的克隆只有在生长温度从对应嗜温菌的最适生长温度37℃降至25~C或17℃以后，才表达有酯解活力脂肪酶，从而防止基因产物的热变性，重组酶的最适温度比野生型低了10~C，而且异源表达的脂肪酶比野生型具更明显的热不稳定性。Rashid[1 将深海分离出的假单胞杆菌KB700A脂肪酶基因在大肠杆菌中成功表达。其基因序列与中温菌P． P．fluorescens 的脂肪酶基因的序列同源性可达90％，该脂肪酶只有在Ca 作用下才表现酶活力，另外添加Mn2+ 、Sr2+ 等离子以及去垢剂皆可提高酶活。
迄今为止虽然只有很少几种低温脂肪酶基因得到克隆和测序，但通过表达型质粒将脂肪酶基因克
隆到适合于工业化生产的工程菌中，可使脂肪酶的发酵产率获得极大的提高。
1 实验
1．1 菌株、质粒与培养基
大肠杆菌JM109和BL21(DE3)、克隆／表达载体pET-30a，均为本实验室保存。质粒pUAMT为p13C19上克隆有1．9 kb带有自身信号肽的假单胞杆菌耐酸性高温低温脂肪酶突变基
因amyd(成熟肽134位的L-亮氨酸变为L一精氨酸、320位的L-丝氨酸变为L一丙氨酸，其它序列同假单胞杆菌耐高温低温脂肪酶基因)重组载体，由本实验室构建。菌体培养均用LB液体培养基。筛选培养基是含100 g·mL 卡那霉素的LB 琼脂培养基。
1．2 工具酶和试剂
Taq DNA聚合酶、限制性内切酶、DNA分子量标准、纯化DNA片段的琼脂糖凝胶回收试剂盒，Takara公司；卡那霉素、T4 DNA连接酶、蛋白质分子量标准，上海生物工程有限公司；引物合成由上海Invitrogen生物公司完成。
1．3 DNA的提取及操作
质粒的快速提取、检测及DNA的酶切、连接、大肠杆菌感受态的制备、转化按文献E5]进行。
1．4 PCR扩增及重组质粒构建
根据假单胞杆菌耐酸性高温低温脂肪酶突变基因，去除其自身信号肽，设计引物，利用PCR得到其成熟肽序列，上游引物P1：5 一C TGCCA] GCTG—CAAATCTTAATGGGACGCT-3 (下划线部分为Ⅳc0I酶切位点)，下游引物P2：5 一CCCAA n]_r0叩一GA0G( TG TGACACTT-3 (下划线部分为HindⅢ酶切位点)。以质粒pUAMT 为模板扩增amyd基因。将PCR产物及提取的质粒pET-30a，分别用Nco I 和HindⅢ进行双酶切，酶切产物经纯化回收后，用T4 DNA连接酶于16℃连接过夜，电转化大肠杆菌JMlO9，卡那霉素抗性平板筛选转化子，分别用PCR和双酶切法进行鉴定，并挑取阳性转化子进行测序。再将阳性转化子的质粒转入表达宿主菌BL21(DE3)中诱导表达。
1．5 目的蛋白的诱导表达
将构建好的工程菌株BL21／pET—amyd和对照菌BL21／pET一30a分别接种于2 mL LB液体培养基中，37~C水浴振荡培养过夜，按1％的接种量转接于装有30 mL 培养基的250 mL三角瓶中继续培养3．5 h，加入IPTG(终浓度为1 mmol·L )，30℃诱导表达。4 h后，4000 r·min 冷冻离心收集菌体，将菌体悬于pH值6．0的磷酸缓冲液中，冰浴超声。超声波功率为400 W，超声10次，每次10 S，间隔2 min。
12 000 r·min 离心破碎液，分别取上清液和沉淀用于SDSPAGE(分离胶含量为10％，浓缩胶含量为5 )，检测蛋白的表达情况。
1．6 蛋白含量的测定
采用Folin一酚法：以牛血清白蛋白为标准品作标准曲线，样品适当稀释后在640 nm下得到的吸光度值查标准曲线，得出蛋白含量。
1．7 酶活检测
测定方法和其它溶液的配制参照中华人民共和国行业标准(QB／T 2306—97)“耐高温脂肪酶制剂”。脂肪酶活性单位(U)的定义：在70℃、pH值5．0的条
件下，每分钟液化1 mg可溶性淀粉产生的糊精所需的酶量为一个酶活性单位。酶活按下式计算：X—C×n×16．67
式中：X 为样品的酶活力，U ·mL-1；C为测试酶的浓度，U t mL_。；n为样品的稀释倍数；16．67为换算系数。
1．8 重组酶的分离纯化
1．8．1 盐析
收集工程菌BL21／pET—amyd的超声破碎上清液，分成15份，每份(50 mL)加硫酸铵分别至饱和度为2O 、25％、3O％、35 、40％、45 、50 、55％、60 、65 、70％、75 、80％、85 、90 ，4"C静置过夜，6000 r·min-1离心20 min，蛋白沉淀用适量生理盐水溶解，分别测定沉淀和上清液的酶活，绘制硫酸铵盐析曲线，根据盐析曲线进行硫酸铵分步盐析制备粗酶沉淀。
1．8．2 DEAE—Sepharose Fast Flow(2．4 cm ×30 cm)
离子交换层析
用0．02 mol·L～ Tris—HC1(pH 值7．6)缓冲液平衡层析柱，将盐析脱盐后得到的活性组分用同样的缓冲液溶解，6000 r·min 离心10 min，上样(2 mL)后用同样的缓冲液先洗脱未吸附的蛋白，再用含0．1 mol·L-1 NaC1的0．02 mol·L_。Tris—HC1(pH值7．6)缓冲液梯度洗脱，分步收集，测定A 。。吸光度值和酶活力。
1．8．3 Sephadex G-75(1．6 cm×80 cm)凝胶层析
离子交换得到的活性组分先用含0．15 mol·L NaC1的0．02 mol·L Tris-HCI(pH 值7．6)缓冲液平衡，6000 r·min 离心10 rain，上样(2 mL)后用相同的缓冲液以0．5 mL·rain 的速度洗脱，每管收集2．0 mL，紫外检测器在线检测A 。。，收集活性
2．结束语
综上所述，低温脂肪酶以其独有的优势正越来越成为各国家研究的热点，尽管如今对其性质以及结构等方面有了一定的了解，但都是零星的，还不够全面。相信随着酶学研究的深入，酶工程的发展，低温脂肪酶在生物催化和生物转化中的应用一定将会进一步得到拓展。
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脂肪酶的概述及应用
脂肪酶的概述与应用 一脂肪酶概述、 脂肪酶（Lipase，甘油酯水解酶）隶属于羧基酯水解酶类，能够逐步的将甘油三酯水解成甘油和脂肪酸。脂肪酶存在于含有脂肪的动、植物和微生物（如霉菌、细菌等）组织中。包括磷酸酯酶、固醇酶和羧酸酯酶。脂肪酸广泛的应用于食品、药品、皮革、日用化工等方面脂肪酶广泛的存在于动植物和微生物中。植物中含脂肪酶较多的是油料作物的种子，如蓖麻籽、油菜籽，当油料种子发芽时，脂肪酶能与其他的酶协同发挥作用催化分解油脂类物质生成糖类，提供种子生根发芽所必需的养料和能量；动物体内含脂肪酶较多的是高等动物的胰脏和脂肪组织，在肠液中含有少量的脂肪酶，用于补充胰脂肪酶对脂肪消化的不足，在肉食动物的胃液中含有少量的丁酸甘油酯酶。 脂肪酶是一类具有多种催化能力的酶，可以催化三酰甘油酯及其他一些水不溶性酯类的水解、醇解、酯化、转酯化及酯类的逆向合成反应，除此之外还表现出其他一些酶的活性，如磷脂酶、溶血磷脂酶、胆固醇酯酶、酰肽水解酶活性等（Hara；Schmid）。脂肪酶不同活性的发挥依赖于反应体系的特点，如在油水界面促进酯水解，而在有机相中可以酶促合成和酯交换。 脂肪酶的性质研究主要包括最适温度与pH、温度与pH稳定性、底物特异性等几个方面。迄今，已分离、纯化了大量的微生物脂肪酶，并研究了其性质，它们在分子量、最适pH、最适温度、pH和热稳定性、等电点和其他生化性质方面存在不同（Veeraragavan等）。总体而言，微生物脂肪酶具有比动植物脂肪酶更广的作用pH、作用温度范围，高稳定性和活性，对底物有特异性（Schmid等；Kazlauskas等）。 脂肪酶的催化特性在于：在油水界面上其催化活力最大，早在1958年Sarda和Desnnelv 就发现了这一现象。溶于水的酶作用于不溶于水的底物，反应是在2个彼此分离的完全不同的相的界面上进行。这是脂肪酶区别于酯酶的一个特征。酯酶（E C3.1.1.1）作用的底物是水溶性的，并且其最适底物是由短链脂肪酸（≤C8）形成的酯。 脂肪酶是重要的工业酶制剂品种之一，可以催化解脂、酯交换、酯合成等反应，广泛应用于油脂加工、食品、医药、日化等工业。不同来源的脂肪酶具有不同的催化特点和催化活力。其中用于有机相合成的具有转酯化或酯化功能的脂肪酶的规模化生产对于酶催化合成精细化学品和手性化合物有重要意义。 脂肪酶是一种特殊的酯键水解酶，它可作用于甘油三酯的酯键，使甘油三酯降解为甘油二酯、单甘油酯、甘油和脂肪酸。 酶是一种活性蛋白质。因此，一切对蛋白质活性有影响的因素都影响酶的活性。酶与底物作用的活性，受温度、pH值、酶液浓度、底物浓度、酶的激活剂或抑制剂等许多因素的影响。
脂肪酶综述
脂肪酶综述 摘要：脂肪酶是一类能够催化酯的水解反应以及在非水相体系中催化脂肪酸和醇类发生酯化反应的酶类。随着酶学技术的快速发展，微生物脂肪酶也受到了越来越多的关注作为生物催化剂，脂肪酶一直以来都是生物技术领域中最重要的一类酶。 关键字：脂肪酶，酶活测定，非水相，食品工业应用。 简介：脂肪酶(三酰甘油酯水解酶，EC 3.1.1.3)，是一类广泛存在于多种微生物中的生物催化剂。脂肪酶最早被发现可追溯至1901年，其天然作用底物为三脂酰甘油酯，能够将酯键水解，释放甘油二酯甘油一酯甘油以及游离脂肪酸随着非水酶学的发展，研究者发现，脂肪酶在非水相中能够催化酯化。酯交换以及转酯化反应，并且具有高度的选择性和专一性，已广泛应用于食品、医药、洗涤剂等行业。特别是在食品行业中得到了大量的应用，并逐渐成为食品领域中应用最为广泛的酶类之一。但是，由于目前脂肪酶相对于传统的化学催化剂的生产成本仍然偏高，这是制约脂肪酶工业化应用的主要问题，因此，在了解脂肪酶催化特性的基础上，通过筛选高产菌株，或者改变脂肪酶催化环境等方法提高脂肪酶的产率和利用率，降低利用脂肪酶进行工业化生产的成本是目前急需解决的主要问题。 1、脂肪酶的结构特点 研究表明, 来源不同的脂肪酶,其氨基酸组成数目从270~ 641不等,其分子量为29 000~ 100 000。迄今为止,人们已经对多种脂肪酶进行克隆和表达,并利用X -衍射等手段和定向修饰等技术测定了酶的氨基酸组成、晶体结构、等电点等参数, 确定了组成脂肪酶活性中心的三元组( triad)结构。多数脂肪酶都是单链蛋白, 比如CCL( A) 含有534个氨基酸残基, 其组成3 个小的和11个大的β-折叠及10个α-螺旋。其催化活性三元组由Ser-209、His-449和Glu341组成, Ser-209处于超二级结构折叠-螺旋[β-折叠( 202~208)-α -螺旋( 210~220) ]的转角处。多数成熟的天然蛋白还含有糖类组分, 如CCL( A) 含有4. 2%葡萄糖、甘露糖和木糖等,所以实际测得的分子量比理论分子量偏大[157 223(理论) , 60 000(实测)]。 脂肪酶通过与水/底物界面的相互作用来获得不同的构象状态。在关闭构象状态时“盖子”覆盖在酶的活性位点上。酶难以靠近底物分子而转变到开放构象状态时，催化通道入口打开. 近年来发现“盖子”的作用不仅仅是调节底物靠近活性位点的大门。“盖子”是两性分子结构在关闭状态酶的结构是亲水端面对溶剂，疏水端朝向蛋白质的内部，当酶转变到开放状态时疏水端会暴露出来隐藏亲水残基团，在丝氨酸残基周围形成亲电子域引起脂肪酶的构象改变增加了酶与脂类底物的亲和性，并稳定了催化过程中过渡态中间产物。酶分子周围通常保留一定量的水分，从而保证了脂肪酶在油/水界面和脂相中的自体激活。 2、脂肪酶的来源 脂肪酶是一种普遍存在于生物体的酶类，具有重要的生理学意义，同时也具有工业化应用的潜在可能性脂肪酶能够催化三酰甘油酯水解成为甘油和游离脂肪酸，而在有机相中，脂肪酶则催化酯化酯交换以及转酯化反应。在真核生物体内，脂肪酶参与许多类脂化合物的代谢过程，包括脂肪的消化、吸收、利用以及脂蛋白的代谢，在植物中，脂肪酶存在于储存能量的组织中。脂肪酶在微生物界分布很广，大约65 个属微生物可产脂肪酶，其中细菌有28个属、放线菌4个属、酵母菌10个属、其它真菌23个属，但实际上微生物脂肪酶分布远远超过这个数
动物肥胖基因_ob_的研究进展_郭亚宁
第28卷第4期黄牛杂志V o1.28No.4 2002年7月Jo urnal of Yellow Cattle Science July.2002 文章编号:1001-9111(2002)04-0035-04 动物肥胖基因(ob)的研究进展 郭亚宁1,侯水生2,刘小林1 (1.西北农林科技大学动物科技学院,陕西杨凌 712100;2.中国农业科学院畜牧研究所,北京 100094) 摘 要:肥胖基因(ob)是近年来克隆的新基因,该基因产物-Leptin(瘦蛋白)是反映体内脂肪含量和调节体重的信号因子,具有调节摄食行为,减少能量消耗和降低动物采食量的作用。本文对 肥胖基因的研究现状、结构、克隆、表达及影响其表达的因素进行了综述。 关键词 肥胖基因;ob基因;克隆;表达 中图分类号:S823.2 文献标识码:A 肥胖基因(obese g ene,ob)是近年来克隆的新基因。肥胖基因(obese gene)编码的瘦蛋白(Leptin)是脂肪细胞分泌的一种激素[1],具有调节摄食行为,减少能量消耗和降低动物采食的作用。畜禽肥胖基因研究工作主要集中在基因克隆、定位方面。随着畜禽肥胖基因序列的明确,人们将深入分析肥胖基因对于动物生长和脂肪畜积的基因效应,对今后的动物遗传育种工作将起很大的推动作用。 1 ob基因的历史 肥胖基因于1950年首次在小鼠上发现,为常染色体隐性遗传。1994年,Zha ng等[1]通过定位克隆技术(po sitio n cloning technolog y)分离获得了小鼠的肥胖基因及该基因人的同源序列。在研究中发现,遗传型肥胖小鼠肥胖基因有两种形式的突变:一种是在C57BL/6J ob/ob小鼠的肥胖基因中,发现其第105位密码子发生C→T的碱基突变,使编码精氨酸的密码子变为终止密码子,这一无义突变使ob m RN A的表达量提高了20倍,但不能产生正常功能的蛋白质;另一种是在其等位基因,SM/CKC-+Dac o b2J/o b2J小鼠的肥胖基因中,发现了基因外显子2G7RN A缺失,这一突变使肥胖基因m RN A不能产生。肥胖基因的这些突变,可能是导致小鼠肥胖的原因。 2 ob基因的克隆 2.1 ob基因的研究现状 Zhang.Y.Y等[1]首次报道利用定位克隆方法得到小鼠ob基因的cDN A序列。该基因位于小鼠的第6号染色体上,编码了一种由167个氨基酸组成的分泌型蛋白质,其m RN A长约 4.5kb,而且仅在脂肪细胞中表达。同时他们又从人的脂肪细胞组织cDN A文库中克隆了人的ob基因序列,并与小鼠的ob基因序列进行比较,发现编码区的同源性很高,在蛋白质水平上有84%的同源性。 此后,Issen等[2]对人基因组中ob基因进行了克隆与分析。在我国,Da-W ei Gong[3]、马本江等[4],根据文献报道的人的o b基因序列设计引物,经RT-PCR扩增出人的ob基因,定位于7q染色体上,基因转录物为 4.5kb的m RN A,o b基因的翻译产物为一个长约20kb、编码167个氨基酸的球型蛋白质(成熟的ob为16kb)。后来,刘建忠等[5]还建立了人肥胖基因转基因小鼠动物模型,为研究人的肥胖基因提供了便利的途径。 M urakami[6]和Og awa[7]等分别克隆了肥胖大鼠和SD大鼠o b c DN A的核苷酸序列。大鼠ob m RN A长约4.5kb,在氨基酸水平,大鼠肥胖基因与小鼠和人的肥胖基因之间的同源性分别为96%和84%。张铁梅等[8]克隆的大鼠ob基因测序结果表明Wistar大鼠编码区序列为441bp,编码146个氨基酸,不含N端信号肽序列,与前面报道的大鼠ob cDN A编码区序列一致。 2.2 猪ob基因的克隆 对猪ob基因的克隆,国外众多学者如Ra msay 等[9]、B idw ell等[10]已进行了许多研究工作,而且 ⒇收稿日期:2002-04-21 基金项目:国家十五攻关课题“水禽育种与养殖关键技术” 2002BA 514A-9-2. 作者简介:郭亚宁(1970-),女,西北农林科技大学在读硕士生,助理畜牧师.
脂肪酶活检测原理及方法
脂肪酶活检测原理及实际方法：一、 原理以及标准曲线做法 1. 对硝基苯酚酯( 4-Nitrophenyl ester )是 脂肪酶水解活力测定中运用最为广泛的一种底物，脂肪酶水解其产生pNP(对硝基苯酚)在碱性条件下显黄色，在410nm 下有吸光值，且灵敏度很高。 2. 所需试剂有： CAS 碳链长度出货号价格名称830-03- 5C2N8130-1G ￥462 对硝基苯乙酸酯2635-54-9 C4 N9876-1G￥570 对硝基苯丁 酸酯 1956-10-1 C821742-1G-F ￥487 对硝基苯辛酸酯 1956-11-2 C12 61716-1G ￥435 对硝基苯月桂酸酯 1492-30-4 C16 N2752-1G ￥379 对硝基苯棕榈酸酯 14617-86-8C18 N3627-1G￥对硝基苯硬酸脂 全部为色谱纯试剂，购于sigma 公司 3. 标准曲线绘制： a. 标准对硝基苯酚母液(2mM ，2mmol / L): 称取的对硝基苯酚(p-NP)溶于100ml 的溶液B(即不同pH 的缓冲液) ，置于棕色试剂瓶内，4℃冰箱保存。 方法一： b. 标准曲线绘制：分别取，，，，，的对硝基苯酚母液(2mM) ，用溶液B(即不同pH 的缓冲液)稀释至4ml ，分别测定在410nm 处的吸收值。以对硝基苯酚浓度x(对应浓度分别是，，，，，，单位：mM ) 为横坐标，吸光值y 为纵坐标，绘制标准曲线。方法二：全部对硝基苯酚经过与测酶活相同的处理，获得吸光度。 b.标准曲线的绘制： 分别取0、、、、15、、30、45μL的对硝基苯酚分别加入、、、55、、40、、μL的异丙醇和 (全部都是)的溶液B，40℃15min，95%乙醇，10000r / min ，3min ，测出标准曲线。
脂肪酶活力测定方法及其比较
万方数据
苯萃取后进行比色测定．酶的活力单位定义同平板法．酶活计算同铜皂法． １．３．３对硝基苯酚法 对硝基苯酚法是以对硝基苯酚酯作为底物，脂肪酶水解底物产生具有颜色的对硝基苯酚，在４２０ｎｍ波长下测出其吸光光度值，再对照对硝基苯酚吸光度工作曲线得出脂肪酶活力．这样可以使操作更加简单同时可以避免金属离子的干扰［２．１８｜．酶的活力单位定义为检测条件下每分钟产生１ｂｔｍｏｌ对硝基苯酚所需的脂肪酶量，其计算公式为：脂肪酶活力一ＶＮ（Ｃ（样）一Ｃ（空白））／丁／Ｖ（稀释酶液）．式中。Ｖ反应总体积，Ｎ稀释倍数，Ｃ根据吸光度Ａ求出的对硝基苯酚的浓度，ｔ反应时间，ｙ（稀释酶液）稀释酶液的体积． ２３种方法的比较 ２．１实验仪器和操作难易程度的比较 平板法所使用的主要仪器是超净工作台，微量注射器。培养皿，恒温培养箱，价格便宜，操作简单Ｌ２?１３］；滴定法仅需要酸碱滴定管、试管、恒温水浴锅、酸度计、高速组织捣碎机等一些比较常见，操作简单［”］；比色法包括铜皂法、微乳液法和对硝基苯酚法．铜皂法使用的主要仪器是分光光度计。超声波装置，仪器较常见，但操作繁琐［１５］；微乳液法使用的仪器主要是分光光度计，操作简单。精确度高Ｌ１６—１７］；对硝基苯酚法所使用的仪器主要是分光光度计。操作简单［２?１８］（表１）． ２．２实验试剂及精确度的比较 平板法使用的试剂主要有维多利亚蓝、三丁酸甘油脂、罗丹明Ｂ等，该实验反应时间长且精确度差［１１］．滴定法所使用的主要试剂有氢氧化钠、酸碱指示剂、聚乙烯醇、橄榄油等［１３｜．滴定中酸碱指示剂不能很好地指示反应终点，即使用酸度计代替酸碱指示剂控制反应终点，产物中丙酮酸的干扰使实验的结果偏大［１ｌ’１９］．铜皂法中的底物有３种：榄橄油，三油酸甘油脂和三丁酸甘油脂［１５］．其中榄橄油作为底物，精确度不高，当用三油酸甘油脂和三丁酸甘油脂作为底物检测脂肪酶的活性。精确度较高．微乳液法使用的试剂有三油酸甘油脂，吐温一８０和正己烷，实验重复性好，精确度高Ｌ１６。１７｜．对硝基苯酚法使用的试剂主要是对硝基苯酚，稳定性好且非常精确［２．１８］（表１）． ２．３各种方法的适用范围 平板法所使用的仪器十分常见、所使用的试剂也比较便宜，但该种方法的误差较大同时需要的时间很长．因此该种方法主要应用于产脂肪酶菌种的筛选及批量酶样品的快速测定［１１］；滴定法所使用的仪器常见、操作简单，所使用的试剂比较便宜，精确度较高，适合于学生实验和具备简单仪器的实验室测定脂肪酶的活性［２］；铜皂法所使用的仪器较常见、操作繁琐、稳定性不高。但实验精确度高且试剂较便宜，大部分实验室和生物技术公司用该种方法测定脂肪酶的活性［１５］；微乳液法所使用的仪器常见、操作简单，重复性好，但试剂价格偏高，主要适用于实验室和生物技术公司对酶活性的精确测定［１６－１７］；对硝基苯酚法所使用的仪器常见，但试剂对硝基苯酚价格昂贵且有毒，主要适用于实验室对酶活性的精确测定［２．１８］（表１）． 表Ｉ平板法、滴定法及比色法的比较 ３结论 在脂肪酶活性检测时，可根据实验目的、实验设施及节约成本的原则选择适宜的方法和底物来检测脂肪酶活性．在活性检测过程中，酶活力单位的计算尽量在最适温度、最适ｐＨ、酶浓度以及适宜的底物浓度下进行。从而使测定的脂肪酶活性达到最大值，使结果更加准确和可信．另外，由于酶的活力单位可以根据计算和记录的方便而自行定义。给交流和工业生产造成麻烦，建议在测定脂肪酶的活力时，尽量使用国际单位来计算?４４?酶活． 致谢本文受到贵州省教育厅重点扶持学科基金和凯里学院植物学重点学科基金资助． 参考文献： ［１］ＧＵＰＴＡＲ，ＧｕｐｔａＮＲａｔｈｉＰ．Ｂａｃｔｅｒｉａｌｌｉｐａｓｅｓ：ａｎｏ’ｖｅｒｖｉｅｗｏｆｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ［Ｊ］．ＡｐｐｌｉｅｄＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙａｎｄＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏ—ｇＹ。２００４，６４（６）：７６３—７８１． 万方数据
第五章 肥胖症
第五章肥胖症 肥胖症(obesity)指体内脂肪堆积过多和(或)分布异常、体重增加，是包括遗传和环境因素在内的多种因素相互作用所引起的慢性代谢性疾病。超重和肥胖症在一些发达国家和地区人群中的患病情说已达到流行程度。据估计，在西方国家成年人中，约有半数人超重和肥胖。我国肥胖症患病率也迅速上升，据《中国居民营养与健康现状(2004年)》中报道，我国成人超重率为22.8%，肥胖率为7.1%，估计一患病人数分别为2.0亿和6000多万。肥胖症作为代谢综合征的主要组分之一，与多种疾病如2型糖尿病、血脂异常、高血压、冠心病、卒中和某些癌症密切相关。肥胖症及其相关疾病可损害患者身心健康，使生活质量下降，预期寿命缩短，成为重要的世界性健康问题之一。我国卫生部疾病控制司已于2003年制订了《中国成人超重和肥胖症预防控制指南(试用)》。肥胖可作为某些疾病的临床表现之一，称为继发性肥胖症，约占肥胖症的1%。 [病因和发病机制] (一)能量平衡和体重调节 体内存在一套精细的监测及调控系统以维持体重稳定，称为“调定点(Set-Point)”。由于体重调定点的存在，短期体重增加或减少将自动代偿，体重倾向于恢复到调定点水平。 体重受神经系统和内分泌系统双重调节，最终影响能量摄取和消耗的效应器官而发挥作用。中枢神经系统控制饥饿感和食欲、影响能量消耗速率、调节与能量贮存有关激素的分泌，在能量内环境稳定及
体重调节中发挥重要作用。下丘脑是控制能量代谢最重要部位，影响下丘脑食欲中枢的信号包括传人神经信号(以迷走神经最为重要，传入同样来自内脏的信息，如胃肠膨胀程度等)、激素信号(如瘦素、胰岛素、各种肠肽等)以及代谢产物(如葡萄糖)等。上述信号传人中枢神经系统，经过整合后通过神经-体液途径传出信号到靶器官，以保持个体近期或长期能量平衡。 体内参与调节摄食行为的活性物质包括：①减少摄食的因子：β-肾上腺素能受体、多巴胺、血清素、胰升糖素样多肽-1(GLP-1)和瘦素等。②增加摄食的因子：α一去甲肾上腺素能受体、神经肽Y、胃生长激素释放激素(ghrohn)、增食因子(orexin)、甘丙肤(galanin)等。③代谢产物如血糖水平等。内源性大麻素(endocannabinoid,CB)系统由内源性大麻素及其受体组成，可调节摄食行为，激活后引起摄食增加。 机体能量消耗包括基础代谢、食物生热作用、体力活动的能量消耗以及适应性生热作用等。人体脂肪组织分为两种，白色脂肪组织的主要功能是贮存脂肪，而棕色脂肪组织的主要功能是能量消耗。交感神经兴奋作用于棕色脂肪组织，通过β-肾上腺素能受体引起脂肪分解及促使产生热量。 (二)肥胖症的病因和发病机制 肥胖症是一组异质性疾病，病因未明，被认为是包括遗传和环境因素在内的多种因素相互作用的结果。脂肪的积聚总是由于摄入的能量超过消耗的能量，即无论多食或消耗减少，或两者兼有，均可引起肥胖，但这一能量平衡紊乱的原因尚未阐明，肥胖者这些因素与正常
脂肪酶活检测原理及实际方法：
脂肪酶活检测原理及实际方法： 一、原理以及标准曲线做法 1.对硝基苯酚酯（4-Nitrophenyl ester）是脂肪酶水解活力测定中运用最为广泛的一种 底物，脂肪酶水解其产生pNP（对硝基苯酚）在碱性条件下显黄色，在410nm下有吸光值，且灵敏度很高。 2.所需试剂有： CAS 碳链长度出货号价格名称 830-03-5 C2 N8130-1G ￥462 对硝基苯乙酸酯2635-54-9 C4 N9876-1G ￥570 对硝基苯丁酸酯1956-10-1 C8 21742-1G-F ￥487 对硝基苯辛酸酯1956-11-2 C12 61716-1G ￥435 对硝基苯月桂酸酯1492-30-4 C16 N2752-1G ￥379 对硝基苯棕榈酸酯14617-86-8 C18 N3627-1G ￥2621.97 对硝基苯硬酸脂 全部为色谱纯试剂，购于sigma公司 3.标准曲线绘制： a.标准对硝基苯酚母液(2mM，2mmol / L): 称取0.02789g的对硝基苯酚(p-NP)溶于100ml的溶液B（即不同pH的缓冲液），置于棕色试剂瓶内，4℃冰箱保存。 方法一： b.标准曲线绘制： 分别取0.02，0.04，0.06，0.08，0.12，0.16ml的对硝基苯酚母液(2mM)，用溶液B（即不同pH的缓冲液）稀释至4ml，分别测定在410nm处的吸收值。以对硝基苯酚浓度x（对应浓度分别是0.01，0.02，0.03，0.04，0.06，0.08，单位：mM）为横坐标，吸光值y为纵坐标，绘制标准曲线。 方法二：全部对硝基苯酚经过与测酶活相同的处理，获得吸光度。 b.标准曲线的绘制： 分别取0、1.875、3.75、7.5、15、22.5、30、45μL的对硝基苯酚分别加入62.5、60.625、58.75、55、47.5、40、32.5、17.5μL的异丙醇和（全部都是）562.5的溶液B，40℃15min，95%乙醇，10000r / min，3min，测出标准曲线。
微生物学[第九章微生物基因表达的调控]山东大学期末考试知识点复习
第九章微生物基因表达的调控 一、要点提示 1．基因表达是遗传信息表现为生物性状的过程，这一过程是通过基因产物的生物学功能来完成的。微生物在长期的进化中，已经形成了两种主要的代谢调节方式，即酶活性的调节和酶量的调节，酶活性的调节是酶蛋白合成之后即翻译后的调节，是酶化学水平上的调节。而酶量的调节是转录水平或翻译水平的调节。原核生物基因表达的调控主要在转录水平上，这是一种最经济的调控方式。但也有转录后的“微调”，使基因的表达更适应本身的需求和外界条件的变化。 2．原核生物细胞中，功能相关的基因组成操纵子结构，由操纵区同一个或几个结构基因联合起来，形成一个在结构上、功能上协同作用的整体——操纵子，即作为表达的协同单位。操纵子转录调控是原核生物的主要调控机制，受同一调节基因和启动区的调控，并分为负转录调控和正转录调控，在负转录调控系统中，调节基因的产物是阻遏蛋白，在正转录调控系统中，调节基因的产物是激活蛋白，阻遏蛋白或激活蛋白与DNA分子的相互作用和特异性结合，从而控制结构基因的功能。启动子是RNA聚合酶和CAP蛋白的结合位点，控制着转录的起始。这样，这些基因形成了一整套调节控制机制，才使生命系统在功能上是有序和开放的。 3．分解代谢物阻遏又被称为葡萄糖效应，这是因为葡萄糖是首先被发现具有这种阻遏效应的物质。当培养基含有多种能源物质时，微生物首先利用更易于分解利用的能源物质，而首先被利用的这种物质的分解对利用其他能源性物质的酶的产生有阻遏作用，其原因是：分解代谢物阻遏中，只有当分解物激活蛋白(CAP)与cAMP结合后构象发生变化，这时才能结合到启动子上游，并促进RNA 聚合酶与启动基因结合，而葡萄糖能抑制cAMP形成，并促进cAMP分泌到胞外，胞内的cAMP水平下降，RNA聚合酶不能与启动子结合，因此，分解代谢物阻遏实际上是cAMP缺少的结果。 4．转录后调控主要包括如下几方面：(1)翻译起始的调控。(2)mRNA的稳定
低温脂肪酶基因的异源表达
低温脂肪酶基因的异源表达 引言 低温脂肪酶是一种胞外酶，酶的产生要经过异源表达，修饰折叠，最终分泌至细胞外。决定脂肪酶表达的因素是多方面的，如宿主、外源基因、外界环境以及它们之间的相互作用等。低温脂肪酶的异源表达大多选择大肠杆菌做为宿主。 现已发现分子伴侣能识别并调节细胞内多肽的折叠。如果宿主体细胞分子伴侣与外源基因表达所需要的分子伴侣不匹配，外源基因便不能正确表达。革兰氏阳性菌所产脂肪酶首先以“前酶原”的形式表达，酶的前体区域(pre．region)为信号肽，运输酶原至细胞外，酶原在胞外经蛋白酶水解后断裂产生成熟酶。Rosenau将革兰氏阴性菌脂肪酶的分泌机制概括为三种类型。 (1)含有ATP结合盒(ABC)的输出体(ATP-binding cassette exporter)。这种类型适用于N端缺少代表性的信号序列，但c端包含靶信号序列的脂肪酶的分泌。ABC输出体包括三种蛋白质，由内而外依次是ATP酶，弓型的细胞膜融合蛋白(MFP)和外膜蛋白(OMP)。三种蛋白质组合体横跨内外细胞膜，从而在周质中形成通道直接将酶分泌到胞外。 (2)分泌子(secreton)介导的分泌。这种类型主要由xcp基因编码的蛋白质组成，其分布于细胞内外膜，并在外膜形成孔状通道。 (3)自输送体(autotransporter)介导的分泌。通过该途径分泌的脂肪酶尽管分泌到胞外，但仍然与细胞表面密切相连或紧紧固着在细胞表面。脂肪酶包含两个独特的结构域，N端具有催化活性并且暴露在细胞外，c端结构与所谓的自动输送蛋白(autotransporterprotein)类似，通过形成B．折叠结构的分泌通道协助将脂肪酶N端转运出外膜。 Quyen在对脂肪酶异源表达的研究时发现，在分子伴侣的作用下，大肠杆菌中表达的P．cepacia 的脂肪酶可以分泌。但也有学者研究发现，能表达脂肪酶并不意味着能完全分泌至胞外。有一部分菌表达的重组蛋白存在于周质中，只有少部分分泌至胞外。Feller研究发现，莫拉氏菌TA144的脂肪酶在大肠杆菌中表达后，培养物的上清液几乎没有酶活性，而菌悬液有一定的酶活力，说明脂肪酶没有分泌到胞外，而是存在与外周质空间或镶嵌于细胞膜上。迄今为止，已经有多例低温脂肪酶能用基因工程技术成功表达的报告。Choo等将分离自阿拉斯加土壤的适冷的假单胞杆菌的低温脂肪酶基因在大肠杆菌中表达。其最适pH为8．0左右，在45℃时酶活力最高。以对硝基苯月桂酸酯为底物计算酶的活化能为7．7kcal／mol，低于其它南极适冷菌的12~~~~~~~17 kcal／mol，和中温铜绿假单胞菌的25 kcal／mol。Feller_9 报道了一株南极适冷型莫拉氏菌的脂肪酶基因在中温型大肠杆菌中的克隆与表达。结果发现，包含有耐冷型脂肪酶编码基因的克隆只有在生长温度从对应嗜温菌的最适生长温度37℃降至25~C或17℃以后，才表达有酯解活力脂肪酶，从而防止基因产物的热变性，重组酶的最适温度比野生型低了10~C，而且异源表达的脂肪酶比野生型具更明显的热不稳定性。Rashid[1 将深海分离出的假单胞杆菌KB700A脂肪酶基因在大肠杆菌中成功表达。其基因序列与中温菌P． P．fluorescens 的脂肪酶基因的序列同源性可达90％，该脂肪酶只有在Ca 作用下才表现酶活力，另外添加Mn2+ 、Sr2+ 等离子以及去垢剂皆可提高酶活。
最新脂肪酶酶活测定方法
脂肪酶是一种特殊的水解酶，广泛地存在于动物组织、植物种子和微生物体中，是能水解甘油三酯或脂肪酸酯产生单或双甘油酯和游离脂肪酸，将天然油脂水解为脂肪酸及甘油，同时也能催化酯合成和酯交换的酶。其在轻工、化工、医药、食品等行业有广泛的用途。近年来，随着非水酶学和界面酶学的不断深入，脂肪酶应用也不断地扩展，被广泛应用于酯合成、手性化合物的拆分、化工合成中间体的选择性基团保护、高聚物的合成、肽合成等方面，应用前景广阔。脂肪酶在微生物中有广泛的分布。脂肪酶催化的反应是:甘油三酸酯+水→甘油二酸酯+游离脂肪酸→甘油酸酯+游离脂肪酸→甘油+游离脂肪酸。脂肪酶只能在异相系统，即在油-水界面上作用，对水溶性底物无作用，这一点在有机合成中合成手性中间体方面具有很多的优越性。 1 滴定法（参照国家标准，适用于脂肪酶制剂） 1.1 脂肪酶活力定义 为1g固体酶粉（或1mL液体酶），在一定温度的pH条件下，1min水解底物产生1μmol的可滴定的脂肪酸，即为一个酶活力单位，以u/g（u/mL）表示。 1.2 测定原理 脂肪酶在一定条件下，能使甘油三酯水解成脂肪酸、甘油二酯、甘油单酯和甘油，所释放的脂肪酸可用标准碱溶液进行中和滴定，用pH计或酚酞指示反应终点，根据消耗的减量，计算其酶活力。反应式为：RCOOH+NaOH→RCOONa+H2O。 1.3 仪器设备 恒温水浴箱，移液枪，高速匀浆机，pH计，电磁搅拌器 1.4 试剂溶液 95％酒精 4%聚乙烯醇（PVA，聚合度1750±50）：称取4g PVA，加蒸馏水80mL，沸水中加热，并不断搅拌，使其完全溶解，慢速搅拌，以免产生过多气泡，冷却后定容至100mL，用双层纱布过滤后备用。 橄榄油(分析纯) 底物溶液：按4%聚乙烯醇：橄榄油=3:1比例混合，用高速匀浆机处理6min（分两次处理，间隔5min，每次处理3min）。 pH7.5磷酸缓冲液：称取十二水磷酸氢二钠39.62g，磷酸二氢钾1.96g，用水溶解并定容至500mL，调节溶液的pH 到7.5±0.05。 0.05mol/L氢氧化钠按GB/T601配制与标定。使用时稀释10倍。 10g/L酚酞指示液：GB/T603配制。 1.5 待测酶液的制备
六种肥胖类型经典分析
六种肥胖类型经典分析 研究发现，亚洲人受到肥胖基因影响所产生的肥胖类型主要有6种，分别是脂质型肥胖、代谢型肥胖、淀粉性肥胖、脏器型肥胖、单纯性肥胖和顽固性肥胖。 1.脂质型肥胖 这是肥胖基因群表现出“脂质”代谢异常造成的肥胖类型，饮食上如果吃得口味比较重，很容易出现下半身水肿的状况。脂质型肥胖常常会伴随着血脂异常，进而容易引发心脑血管疾病的发生。 2.代谢型肥胖 这是肥胖基因群表现出“脂肪燃烧”代谢异常造成的肥胖类型。这种类型的肥胖即通常所指的中心型肥胖。代谢型肥胖的人按其身高及体重标准虽未达到肥胖，但其体内脂肪代谢异常，常常是新陈代谢减缓，血脂升高，其腰腹部的脂肪堆积明显。有易患||型糖尿病、冠心病、高血压的倾向，常并发高胰岛素血症、胰岛素抵抗及高脂血症等。 3.淀粉性肥胖 这是肥胖基因群表现出“淀粉”代谢异常造成的肥胖类型。这种类型的肥胖容易在男性腹部、女性下腹部、臀部及大腿堆积脂肪，形成中广型下半身肥胖症。淀粉性肥胖者由于摄入淀粉食物比例较高，则最容易患上糖尿病等慢性疾病。 4.脏器型肥胖 这是肥胖基因群表现出“内脏脂质”代谢异常造成的肥胖类型。这种肥胖类型容易在腰部、腹部囤积脂肪。又称苹果型肥胖、腹部型肥胖、向心性肥胖、男性型肥胖、内脏型肥胖。这类人脂肪主要沉积在腹部的皮下及腹腔内。聚集在内脏的过多的脂肪是导致内脏中毒并降低其机能的罪魁祸首。脏器性肥胖还容易引发代谢综合征，导致高血压、中风、糖尿病、血脂异常等。 5.单纯性肥胖 这是肥胖基因群是各种肥胖中常见的一种，约占肥胖人群的95%左右，简而言之就是非疾病引起的肥胖。这类人全身的脂肪分布比较均匀，没有内分泌紊乱现象，也无代谢障碍性疾病，其家族往往有肥胖史。单纯性肥胖又分为体制性肥胖和过食性肥胖两种。体制性肥胖是由于遗传性机体脂肪细胞数目较多造成的。过食性肥胖也成获得性肥胖，是有意识或者无意识的过度饮食造成的，单纯性肥胖会导致肥胖患者沉重的精神压力、心理冲突和对自信心的打击，对他们的个性、气质、潜能发育以及日后各种能力的发展、人际交往等都会有永久的影响。 6.顽固性肥胖 这是肥胖基因群又称西洋梨型肥胖，是通过食物及药物治疗，体重仍无明显下降者。此类肥胖患者由于腹部、腰、大腿、臀部的皮下脂肪的积蓄造成上半身不胖下半身胖，状似梨形。顽固性肥胖会降低患者的生活质量，影响劳动力，并容易遭受外伤，易患皮炎，易患静脉曲张等，严重者行走困难，劳动力丧失;还会导致身体器官负荷加重，而导致身体器官衰竭。
脂肪酶
脂肪酶的应用进展综述 09生物技术0902021040 陈莹莹 摘要：脂肪酶被认为是工业中很重要的一利酶。本文概述了当前研究中广泛使用的脂肪酶及其固定化产品的应用途径, 包括在食品加工、饲料、纺织、医药、生物柴油和传感器等领域中的应用。脂肪酶应用的主要障碍是其成本高。但技术进步尤其是基因技术的发展有望使成本降低, 脂肪酶在药物合成中的应用在本文中也作了展望。 关键词：脂肪酶；性质；生产；来源，应用 脂肪酶（Triacylglycerol lipase E C3.1.1.3）是广泛存在的一种酶，在脂质代谢中发挥重要的作用。在油水界面上，脂肪酶催化三酰甘油的酯键水解，释放更少酯键的甘油酯或甘油及脂肪酸。脂肪酶反应条件温和，具有优良的立体选择性，并且不会造成环境污染，因此，在食品、皮革、医药、饲料和洗涤剂等许多工业领域中均有广泛的应用。 一、脂肪酶的来源 脂肪酶广泛的存在于动植物和微生物中。植物中含脂肪酶较多的是油料作物的种子，如蓖麻籽、油菜籽，当油料种子发芽时，脂肪酶能与其他的酶协同发挥作用催化分解油脂类物质生成糖类，提供种子生根发芽所必需的养料和能量；动物体内含脂肪酶较多的是高等动物的胰脏和脂肪组织，在肠液中含有少量的脂肪酶，用于补充胰脂肪酶对脂肪消化的不足，在肉食动物的胃液中含有少量的丁酸甘油酯酶。在动物体内，各类脂肪酶控制着消化、吸收、脂肪重建和脂蛋白代谢等过程；细菌、真菌和酵母中的脂肪酶含量更为丰富(Pandey等)。由于微生物种类多、繁殖快、易发生遗传变异，具有比动植物更广的作用p H、作用温度范围以及底物专一性，且微生物来源的脂肪酶一般都是分泌性的胞外酶，适合于工业化大生产和获得高纯度样品，因此微生物脂肪酶是工业用脂肪酶的重要来源，并且在理论研究方面也具有重要的意义。 二、脂肪酶的性质 脂肪酶是一类具有多种催化能力的酶，可以催化三酰甘油酯及其他一些水不溶性酯类的水解、醇解、酯化、转酯化及酯类的逆向合成反应，除此之外还表现出其他一些酶的活性，如磷脂酶、溶血磷脂酶、胆固醇酯酶、酰肽水解酶活性等(Hara；Schmid)。脂肪酶不同活性的发挥依赖于反应体系的特点，如在油水界面促进酯水解，而在有机相中可以酶促合成和酯交换。 脂肪酶的性质研究主要包括最适温度与pH、温度与pH稳定性、底物特异性等几个方面。迄今，已分离、纯化了大量的微生物脂肪酶，并研究了其性质，它们在分子量、最适pH、最适温度、pH和热稳定性、等电点和其他生化性质方面存在不同(V eeraragavan等)。总
肥胖症的诊断和治疗
肥胖症的诊断和治疗 全网发布：2011-06-23 20:24 发表者：孙聪 (访问人次：2064) 肥胖症指体内脂肪堆积过多和（或）分布异常、体重增加，是遗传因素和环境因素共同作用的结果。WHO早就将肥胖症定为一种疾病。肥胖症常与2型糖尿病、高血压、血脂异常等集结出现。1997年世界卫生组织(WHO) 肥胖顾问委员会召开了第一次肥胖咨询会议, 不仅重申肥胖是一类疾病, 并指出肥胖是当今全球侵蚀人类健康的流行病之一, 是一个主要的 公共卫生问题。1999年WH0将中心性肥胖症定为代谢综合征的成分之一。肥胖症也可作为某些疾病【如下丘脑、垂体的炎症、肿瘤、创伤，库欣综合征，甲状腺功能减退症（甲减），性腺功能减退症)】的临床表现之一，称为继发性肥胖症。20年来，肥胖症的患病率上升很快。据美国疾病控制与预防中心2004 年报告示,30 %以上成年人是肥胖患者,且年致死人数超过40 万,并将成为未来的首位致死病因[1 ]. 在中国,近10 年间肥胖人数增加了1 亿人, 截止2002 年我国肥胖人数达到2.6 亿人[2 ] . 肥胖这一严峻的公共卫生问题已不仅仅是发达国家的社会问题,而且亦开始影响发中国家,在中国肥胖已对公共健康形成了威胁. 故研究肥胖症及其相关疾病的病因及防治措施已成为紧迫的课题。肥胖症已逐渐成为重要的世界性健康问题。 一.肥胖症的病因和发病机制 在日常生活中，机体靠食物供给能量，若能量摄入与消耗之间通过中枢神经的调节网络取得精确的平衡，则体重维持在一定的正常范围。任何能量摄入增加和（或）消耗减少均引起能量正平衡，过剩的能量便以脂肪的形式逐渐积存于体内。因此，肥胖症是慢性能量平衡失调的结果。与肥胖症发生、发展的相关因素很多，主要由遗传因素或 主要由环境因素共同作用的结果。目前已知有24种以肥胖为主要临床表现之一的孟德尔遗传病，其中，常染色体显性或隐性遗传分别有9种和10种。用分子生物学手段确认了6种单基因突变引起的肥胖症，但这些病例很少。在普通人群的肥胖症患者中，节俭基因型是主要的遗传基础，是人类在漫长的进化过程中自然选择的结果。在环境因素方面，有下列几种：①生活方式，包括膳食方面高热量、高脂肪饮食，进食次数；缺乏体力活动，工作和生活当中越来越广泛地应用节省体力的设备；②社会因素，城市化、移民、身心问题等；此外，某些药物，例如精神病治疗药、肾上腺糖皮质激素（激素）等可使体重增加。 1. 肥胖症营养相关因素及其代谢 肥胖症主要有碳水化合物和脂肪代谢的异常, 因代谢紊乱导致体内的某些内分泌激素、细胞及脏器发生变化而致病。 碳水化合物肥胖症与长期较大量摄入高碳水化合物密切相关。过多的碳水化合物, 除少量以糖原的形式储存外, 大多数最终变为脂肪在体内堆积。同时, 肥胖症的血浆胰岛素浓度处于较高水平, 在摄取过量的碳水化合物后, 血浆胰岛素则继续升高, 而在血糖恢复正常后, 血浆胰岛素水平仍在较高基础水平。长期的高碳水化合物摄入最终导致胰岛功能衰竭, 出现糖代谢异常。肥胖症起因于长期的能量入超, 故需长期控制能量的摄入和增加能量的消耗, 才能予以纠正。碳水化合物是主要能源物质之一, 用以维持人体器官的正常能量代谢。膳食碳水化合物供给要合理, 如量过多或过少, 都将影响机体能量
肥胖易感基因FTO
肥胖易感基因FTO 摘要：现今，大量实验研究已经证实，FTO基因是一个与肥胖有关的基因，并且已经成为研究肥胖问题以及解决肥胖问题的热点领域。FTO 于人体的各组织中全都有表达，且在下丘脑、骨骼肌、胰腺、肝脏等组织表达有较多的表达，其与人的肥胖指数密切相关。FTO还能诱导2型糖尿病等相关疾病的产生。 关键词：FTO基因，肥胖，2型糖尿病 现今，肥胖问题困扰着大家，并在全球范围内引起了广泛的影响，肥胖会给生活造成诸多不便利以及诱发各种各样对生活造成影响的 疾病。肥胖发生原因包括环境因素和遗传因素，其中大部分与遗传基因有关[1]。 1.FTO 基因的发现 FTO基因的首次发现是利用高通量全基因组扫描技术寻找2型糖 尿病的过程中发现的，也属于一次以外的发现。2007年，Frayling 等[2]确认发现了该基因,研究表明，携带FTO的基因可使体重增加，FTO 基因参与肥胖的发生、发展有着密切的关系[3]。在研究中发现，FTO 基因与体质指数（BMI）和肥胖的关系已经确立。Dina[4]等几乎在同时发现FTO基因可能与欧洲人的早发育及肥胖症有关，并可能参与了
小部分欧洲人群普通型肥胖症的发病过程[5]。 2.FTO 基因和蛋白特点 FTO 基因具有相当古老的历史，FTO基因普遍存在于脊椎动物中，但是在其他非脊椎生物中却没有发现这个基因，FTO基因位于第16号染色体(16q12.2)，含有9个外显子，基因长度为410.50 kb，广泛表达于人体组织的各发育阶段，且在下丘脑、骨骼肌及脂肪等组织中高表达[6]。 3.FTO基因与肥胖症的关系 FTO基因和肥胖的关系在各个种族及性别中的表现并不相同。对于白种人，rs9939609A等位基因对体质指数影响最大[7]；而对于中国人，这些等位基因比较少，但是一旦携带了这个基因，那么他发生肥胖的概率会很高，所以中国人要尤其注意这个基因的携带[8]。 携带FTO基因变者较容易发生肥胖，其可能是通过增加饮食欲望，使人选择高热量食物比如薯条，炸鸡等，从而提高能量和蛋白质的摄入。通过研究对1～18岁儿童和青少年发现，由于rs9939609基因可引起BMI值增加。英国伦敦大学学院研究人员对8岁至11岁的儿童进行调查，发现携带FTO基因的儿童很难产生饱腹感，使儿童很能吃，而且感觉吃不饱[9]。 研究证明，FTO基因使人缺乏对食物欲望的控制。正常的饮食规律无法消除FTO基因携带者的饥饿感，使他们不停进食，并导致肥胖。 Chang等[10]发现中国人群中FTO 风险基因出现概率比欧洲人群要
脂肪酶特性与应用
饲料研究FEED RESEARCH NO .6,2011 5 脂肪酶特性与应用 陈倩婷广州博仕奥集团 饲料资源不足一直是我国养殖业面临的一个大问题，在耕地和水资源严重紧缺的情况下，粮食产量很难提高。我国动物生产中饲料转化率低，猪、鸡和奶牛等的饲料转化率均比国际先进水平低0.3 %~0.6 %，使饲料资源不足的问题更加严峻。饲料用酶制剂的开发和应用极大的缓解了饲料资源的不足，酶制剂在饲料工业中的有效应用使得饲料工业和养殖业安全、高效、环保和可持续发展成为可能。 目前研究较多的饲用酶制剂有蛋白酶、甘露聚糖酶、β-葡聚糖酶、木聚糖酶、纤维素酶及植酸酶等。脂肪酶也是一种重要的酶制剂，它能够水解脂肪（三脂酰甘油或三酰甘油）为一酰甘油、二酰甘油和游离脂肪酸，最终产物是甘油和脂肪酸。 产物脂肪酸为动物体生长和繁殖提供能量，部分中链脂肪酸能抑制肠道有害微生物，改善肠道菌落环境，从而促进消化，起到类似抗生素的作用，脂肪酶在常温常压下反应，反应条件温和，转化率高，具有优良的立体选择性，不易产生副产物，避免因化学催化法而带来的有害物质，不会造成环境污染，因此，在食品、皮革、医药、饲料和洗涤剂等许多工业领域中均有广泛的应用。 1 脂肪酶的特性 1.1 脂肪酶的来源 脂肪酶按其来源主要分为3类：1）动物源性脂肪酶，如：猪和牛等胰脂肪酶提取物；2）植物源脂肪酶，如：蓖麻籽和油菜等；3）微生物源性脂肪酶。由于微生物种类多、繁殖快且易发生遗传变异，具有比动植物更广的作用pH、作用温度范围及底物专一性，且微生物来源的脂肪酶一般都是分泌性的胞外酶，所以，微生物脂肪酶是主要的研究对象。产微生物脂肪酶菌种的研究主要集中在真 菌包括，根霉、黑曲霉、镰孢霉、红曲霉、黄曲霉、毛霉、犁头霉、须霉、白地霉、核盘菌、青霉和木霉；其次是细菌，如：假单胞菌、枯草芽抱杆菌、大肠杆菌工程菌、无色杆菌、小球菌、发光杆菌、黏质赛氏杆菌、无色杆菌、非极端细菌和洋葱伯克霍尔德菌等；另外还有解酯假丝酵母和放线菌。1.2 特性1.2.1 催化特性 脂肪酶不同活性的发挥依赖于反应体系的特点，在油水界面促进酯水解，而在有机相中可以酶促合成和酯交换。其催化特性在于：在油水界面上其催化活力最大，溶于水的酶作用于不溶于水的底物，对均匀分散的或水溶性底物不作用，反应在2个彼此分离的完全不同的相的界面上进行。Macrae 等研究表明：在油水界面上油脂量决定脂肪酶活性，增加乳化剂量，可提高油水界面饱和度，从而提高脂肪酶活性，增加油水界面面积，可承载更多脂肪酶分子，也可增加催化反应速率。而在水体系中，大多数脂肪酶活性很低或没有活性。 由于脂肪酶在非均相体系中表现出的高催化活性，且在酶催化反应中不需要辅酶，所以可利用非水相中的脂肪酶催化完成各种有机合成及油脂改性反应，如：酯化、酸解、醇解、转酯、羟基化、甲基化、环氧化、氨解、酰基化、开环反应和聚合等反应。 1.2.2 底物特异性 不同来源脂肪酶对底物不同碳链长度和饱和度脂肪酸表现出不同反应性，圆弧青霉和金黄色葡萄球菌脂肪酶水解短链(低于C 8)脂肪酸所形成的三脂酰甘油，黑曲霉和根霉对中等长链(C 8~C 12)脂肪酸形成的三脂酰甘油有强烈特异性，猪葡萄球菌脂肪酶偏爱磷脂为底物，也可以水解脂肪酸链长短不一的各种油脂。解脂无色杆菌对饱和脂肪酸表现出 收稿日期：2011 - 05 - 09
10 第十章 蛋白质的生物合成及基因调控 华中农业大学微生物考研生物化学
第十章蛋白质的生物合成及基因调控 本章应着重掌握基因表达的概念、蛋白质生物合成体系中mRNA、tRNA及核蛋白体(核糖体)在蛋白生物合成中的作用、遗传密码及其特点、蛋白质生物合成的主要步骤及主要的酶和蛋白质因子的作用、基因表达调控中的操纵子调控系统和真核生物基因表达调控的特点，熟悉癌基因和抑癌基因的概念以及癌基因异常激活的机理，了解蛋白质生物合成与医学的关系。 一、习题 (一)选择题 1．下列有关mRNA的论述，哪一项是正确的? a．mRNA是基因表达的最终产物 b．mRNA遗传密码的方向是3'→5' c. mRNA遗传密码的方向是5'→3' d．mRNA密码子与tRNA反密码子通过A-T，G-C配对结合 e．每分子mRNA有3个终止密码子 2. 密码子UAC与下列哪个反密码子配对结合? a．AUG b．AUI c．IUA d．IAU e．CUA 3. 反密码子UGA能与下列哪个密码子配对结合? a. UCA b．CALU c．A(CU d．ACT e．CUA 4. 下列何处是氨酰tRNA的结合部位? a. 核蛋白体小亚基 b．核蛋白体的P位 c．核蛋白体的D位 d．核蛋白体的A位 e. 转肽酶所在的部位 5. 下列有关原核生物肽链合成的论述，哪一项是正确的? a．只需ATP提供能量 b. 只需GTP提供能量 c. 同时需ATP和GTP提供能量 d．40S亚基与mRNA结合 e．最后是60S亚基结合 6．下列有关真核生物肽链合成启动的论述，哪一项是正确的? a．只需ATP提供能量 b．只需GTP提供能量 c. 同时需ATP和GTP提供能量
d．30S亚基与mRNA结合 e．50S亚基与30S亚基结合 7．下列参与原核生物肽链延伸的因子是 a．IF—1 b．IF—2 c．IF—3 d. EF—Tu e．RF—1 8．下列参与真核生物肽链延伸的因子是 a. eEF—10 b．eRF c．eIF—1 d．EF—Tu e．EF—Ts 9. 有关操纵子学说的论述，下列哪一项是正确的? a．操纵子调控系统是真核生物基因调控的主要方式 b. 操纵子调控系统是原核生物基因调控的主要方式 c．操纵子调控系统由结构基因、启动子和操纵基因组成 d．诱导物与操纵基因结合启动转录 e．诱导物与启动子结合而启动转录 10. 下列有关阻遏物的论述，哪一项是正确的? a．阻遏物是代谢的终产物 b. 阻遏物是阻遏基因的产物 c．阻遏物与启动子结合而阻碍转录的启动 d．阻遏物与RNA聚合酶结合而抑制转录 e．阻遏物妨碍RNA聚合酶与启动子结合 11. 下列有关乳糖操纵子调控系统的论述，哪一项是错误的? a．乳糖操纵子是第一个发现的操纵子 b．乳糖操作子由三个结构基因及基上游的启动子和操纵基因组成 c．乳糖操纵子的调控因子有阻遏蛋白、cAMP和诱导物等 e. 乳糖操纵子调控系统的诱导物是乳糖 12. 下列属于顺式作用元件的是： a. 启动子b．结构基因c．RNA聚合酶 d．转录因子Ⅰe．转录因子Ⅱ 13. 下列属于反式作用因子的是： a．启动子b．增强子c．终止子 d. 转录因子 e. RNA聚合酶 14. 识别启动子TATA盒的转录因子是： a．TFⅡA b．TFlib C. TFⅡD d．TFⅡE e．TFⅠF 15. 促进RNA聚合酶Ⅱ与启动子结合的转录因子是； a．TFⅡA B. TFⅡB c．TFⅡD d．TFⅡE e．TFⅡF 16. 下列有关癌基因的论述，哪一项是正确的?