第三章、优良菌种的选育
第三章、优良菌种的选育
导言
优良生产菌种应具备的基本特性：
（1）生产菌种应具有在较短的发酵周期内产生大量发酵产物的能力。
（2）在发酵过程中不产生或少产生与目标产品相近似的副产物及其它产物。
（3）生长繁殖能力强，有较快的生长速率，产生孢子的菌种应该具有较强的产生孢子能力。
（4）能高效地将原料转化为产品。
（5）具有利用广泛来源原料的能力，并对发酵原料成分的波动敏感性较小。
（6）对需要添加的前体物质有耐受能力，并且不能将这些前体物质作为一般碳源利用。（前体：）（7）在发酵过程中产生的泡沫要少。
（8）具有抗噬菌体感染的能力。
（9）遗传特性稳定。
3-1自然选育
定义：
自然突变的结果：
自然选育的特点：简单易行，可以纯化菌种，防止菌种退化，稳定产量。但自然选育的效率低，应该经常跟诱变选育交替使用，提高育种效率。
自然选育的一般程序：
3-2诱变选育
导言
3-2-1诱变育种的原理
诱变育种的理论基础是基因突变，突变包括染色体畸变和基因突变两大类。
染色体畸变指的是，染色体或DNA片段发生缺失、易位、逆位、重复等。
基因突变指的是，DNA中的碱基发生变化，即点突变。
过适当的筛选方法获得所需要的高产优质菌种的育种方法。
常用的诱变剂包括物理、化学、生物的三大类。表3-1所示。
3-2-2诱变育种的基本方式
导言
3-2-2-1出发菌株的选择
进行诱变的出发菌株的性能，对提高诱变效果和效率十分重要。
选择出发诱变菌株的注意事项：
诱变育种的程序：
3-2-2-2诱变剂的使用方法
|------单一诱变剂处理：对野生菌株处理有效。
诱变方法|
|------复合诱变剂处理：对经过多次诱变处理的老菌株。
复合诱变剂处理|----同一诱变剂多次处理
|----两种以上诱变剂先后分别处理
|----两种以上诱变剂同时或多次处理
举例：青霉菌的选育。
3-2-2-3诱变剂的剂量选择
诱变剂的剂量与致死率有关，而致死率又与诱变率有关。
因此，可用致死率作为诱变剂剂量的选择依据。
关系：诱变率随诱变剂剂量的增加而提高，但达到一定程度后，反而下降。
近年来处理剂量控制在致死率70-80%。
高剂量诱变的好处：A形成较纯的菌株。(引起一些细胞核变异，同时引起另外一些细胞核被破坏，细胞死亡。)
B促使变异菌株稳定，不易产生回复突变。（高剂量会引起细胞遗传物质发生难以恢复的巨大损伤。）
3-2-3突变菌株的筛选
3-2-3-1营养缺陷型突变菌株的筛选
营养缺陷型突变菌株的诱变育种具有重要的理论研究和工业应用价值。
已经广泛应用在氨基酸、核苷酸生产中。
在营养缺陷型突变菌株中，生物合成途径中的某一步发生了酶缺陷，合成反应不能完成，末端产物不能积累，因此末端产物的反馈调节作用被解除。只要在培养中限量加入所要求的末端产物，克服生长障碍，就能使中间产物积累。
营养缺陷型突变菌株具有明显的遗传标记，在杂交育种中作为出发菌株，有利于杂交重组的分析，也可以作为基因工程中的受菌体，检出克隆基因的表达。
3-2-3-2抗反馈阻遏和抗反馈抑制突变菌株的筛选
抗反馈阻遏和抗反馈抑制突变菌株这2种突变，都是由于代谢失调。
它们的共同表现：细胞中已经有了大量末端产物时，仍然不断合成这一产物。
代谢失调原理不同：
抗反馈阻遏突变菌株：调节基因或操纵基因发生突变，使产生的阻遏蛋白不再能和终产物结合或结合后不能作用于已突变的操纵基因，因此不再起反馈阻遏作用。
抗反馈抑制突变菌株：由于编码酶的结构基因发生突变，使变构酶不再具有结合终产物的能力，但仍具有活性，从而解除了反馈抑制。
通过使用抗结构类似物的方法筛选。
（1）与末端产物有相似的结构，能与阻遏蛋白或变构酶结合，阻止产物的合成，
（3）它们与阻遏蛋白或变构酶的结合是不可逆的。
（1）未突变细胞：抗结构类似物与阻遏蛋白或变构酶结合，引起反馈调节，阻止某种产物的合成。生长受阻，死亡。（2）发生突变细胞：抗结构类似物与阻遏蛋白或变构酶不能结合，因此不能引起反馈调节，无法阻止产物的合成。因此生长不受影响。
3-2-3-3组成型突变株的筛选
在酶制剂的发酵过程中，常采用在发酵过程中分批限量加入诱导物的方法，提高诱导酶的活性。
为了解除对诱导物的依赖，通过诱变改变菌种的遗传特性，筛选组成型突变株。
突变发生位置：突变发生在调节基因或操纵基因，都可获得组成型突变菌株。
优势，或能适当分辨两类菌落的方法，选出组成型突变菌株。
例如，可以在培养基中加入抑制诱导酶合成的物质，使组成型菌株处于选择优势。
3-2-3-4抗性突变株的筛选
包括对抗生素、金属离子、温度、噬菌体等的抗性（或敏感）突变株的筛选，这些突变型常用来提高
某些代谢产物的产量。
A,抗生素抗性突变：
抗生素之所以能治疗疾病，就是因为抗生素有抑制微生物代谢的机制。而各种抗生素抑制微生物代谢的机理各不相同，不同的机制改变微生物代谢，可以使某些产物过量积累。
在抗生素产生菌的选育中，筛选抗生素抗性突变株，可明显地提高抗生素产量。
例解烃棒杆菌产生棒杆菌素，棒杆菌素是氯霉素的类似物，抗氯霉素的解烃棒杆菌突变株比亲株产生的棒杆菌素高出3倍。
B,抗噬菌体株的选育：
噬菌体的感染给工业生产带来的危害是巨大的。
细菌对噬菌体的抗性是基因突变的结果，所以，可以采用自然选育和诱发突变选育两种方法。
自发突变是以噬菌体为筛子，在不经任何诱变的敏感菌株中筛选抗性菌株，但抗性突变的频率低。
诱变处理之后，再用高浓度的噬菌体平板筛选抗性菌株，可以提高抗性突变的频率。
C,条件抗性突变：
又称条件致死突变，其中温度敏感突变通常可以提高产物产量。
因为温度敏感型突变，使代谢过程中某一酶的蛋白结构发生改变，在高温情况下失去活力，可能变成营养缺陷型，在特定的培养基中积累产物。
D,敏感突变：
在柠檬酸生产中，采用敏感突变，造成某些酶结构基因的改变，从而抑制顺乌头酸酶的活性，达到提高柠檬酸的产量。
导言：我们上面向大家介绍的自然选育和诱变选育，是工业微生物菌种选育的常用方法，主要是为了达到提高微生物生产产量的目的。
然而，采用合适的筛选方法，诱变育种可以获得高产菌株，但不能达到定向育种的目的。
而且，长期使用诱变剂处理，会使菌种生活能力逐渐下降，比如生长周期延长、代谢减慢等等。因此，有必要进行杂交育种，来提高菌种的生产性能。
3-3杂交育种
定义：一般指两个不同基因型的菌株通过接合或原生质体融合，使遗传物质重新组合，再从中分离和筛选出具有新性状的菌株。
杂交育种适用的微生物：真菌、放线菌、细菌都可以进行杂交育种。
A. 杂交育种具有定向育种的性质。(选用已知性状的供体菌株和受体菌株作为亲本，把不同菌株的优良性状集中于组合体中。)
B. 杂交后的杂种可以克服原有菌种生活力衰退的趋势。
C. 使杂种菌种对诱变剂更加敏感。（因为遗传物质的重组，动摇了菌种遗传基础。）
D. 可以消除某一菌种经长期诱变处理所产生的产量上升缓慢的现象。
E. 可以改变产品质量和产量。
导言：杂交育种主要有常规的杂交育种和原生质体融合这两种方法，近年来，后一种方法较为多见。一些同学手中的教材把原生质体融合技术从杂交育种章节单列出来，作为一个独立的节，不等于它不属于杂交育种范畴。
3-3-1常规的杂交育种
常规的杂交育种不需用脱壁酶处理，就能使细胞结合而发生遗传物质的重新组合。
导言：由于课时的原因，我们不能按照参考教材上那样分别对细菌、放线菌、霉菌的杂交育种分别介绍。从遗传学角度，这几类微生物之间的杂交育种原理有着相似性，所以，我们仅以霉菌中的青霉菌的杂交育种过程，来说明杂交的主要过程。至于涉及到的遗传学相关内容，请同学们课余时间复习微生物遗传学。
青霉菌的杂交过程，实际上是青霉菌的准性生殖过程。
重组。
3-3-1-1遗传标记
杂交育种所用的亲本菌株通常要有一定的遗传标记以便于筛选。
可以作为青霉菌株亲本的遗传标记有许多种，如营养缺陷型、抗药突变型等。其中以营养缺陷型作为遗传标记最为常见。今天给大家介绍的杂交方法就是以营养缺陷型作为遗传标记的。
通常是将两个用来杂交的野生型菌株，经过诱变得到两株不同的营养缺陷型，作为杂交的直接亲本菌株。
3-3-1-2异核体形成
异核体（异核现象）：当两个不同形状的细胞或菌丝，也可以是孢子管与菌丝之间相互连接时，导致在一个细胞或菌丝中存在两个或两个以上不同遗传型的核，这样的细菌或菌丝体称为异核体。这种现象叫异核现象。
。
液体完全培养基
培养1-2天
挑出生长的菌丝体
用液体基本培养基或生理盐水离心洗涤3次
将菌丝取出、撕碎
基础培养基平板
培养7天
菌丝（异核体）
异核体是两个直接亲本菌株经过细胞间的接合而形成的，也就是在一条菌丝里含有两个遗传特性不同的细胞核，共同生活在均一的细胞质里，能够互补营养，因此能在基础培养基上生长。
合细胞核是双倍体。
杂合二倍体是杂交育种的关键。
因为杂合二倍体本身不仅具备了杂种的特性，而且随着其染色体或基因的重组和分离，还能形成更多类型的杂种（重组体分离子），这就为杂交育种提供了丰富的材料。
异核体自发形成杂合二倍体的频率很低，必须人为提高形成杂合二倍体的频率。
常用的方法有：提高异核体的培养温度，用紫外线照射异核体，用樟脑蒸汽熏异核体菌丝等。
3-3-1-4染色体交换和单倍体
杂合二倍体一般是稳定的，但也有极少数杂合二倍体的细胞核在无性繁殖的细胞分裂过程中，偶然发生染色体交换和单倍化，产生很多类似的二倍或单倍分离子。
有诱变剂处理，则分离子的类型会更多。
分离子从表型上可以分为亲本型分离子和重组型分离子。
重组型分离子在二倍体菌落中表现为角变和扇形斑点。
青霉菌杂交的目的就是为了获得重组型分离子。
导言：对微生物来说，有性重组的局限性很大。这是因为至今为止发现有杂交现象的微生物并不多，这就妨碍了基因重组在微生物育种中的应用。
原生质体融合技术，打破了种属间的界限，提供了充分利用遗传重组杂交的方法。
A. 两亲株没有受体和供体之分，有利于不同种属微生物杂交。
B. 重组频率高于其他杂交方法。
C. 遗产物质的传递更加充分、完善，既有核配又有质配。
D. 可以先采用温度、药物、紫外线等处理纯化亲株的一方或双方，然后再融合，筛选再生重组子菌落，提高筛选效率。
E. 用微生物的原生质体进行诱变，可明显提高诱变频率。
导言：原生质体融合，一般包括标记菌株的筛选、原生质体的制备、原生质体的融合、融合子的选择、实用性菌体的筛选等，我们下面分别向大家介绍各个过程。
3-3-2-1标记菌株的筛选
供融合用的两个亲株，要求性能稳定并带有遗传标记，以利于融合子的选择。
采用的遗传标记一般以营养缺陷型和抗药性等遗传性状为标记。
通过采用多种抗生素及其他药物，以梯度平板法进行粗选，再用具有抗性的抗性生物制备不同浓度的平板，进行较细的筛选。
3-3-2-2原生质体的制备
获得有活力、去壁较完全的原生质体对于随后的原生质体融合和原生质体再生是非常重要的。
对于细菌和放线菌，制备原生质体主采用溶菌酶；
在使用脱壁酶处理菌体前以前，先用某些化合物对菌体进行预处理，有利于原生质体制备。
例如，用EDTA（乙二胺四乙酸）处理细菌，可使菌体的细胞壁对酶的敏感性增加。
B. 菌体的培养时间：
为了使菌体细胞易于原生质体化，一般选择对数生长后期的菌体进行酶处理。
这时的细胞正在生长代谢旺盛期，细胞壁对酶解作用最为敏感。可以提高原生质体形成率和再生率。
C. 酶浓度：
酶浓度增加，原生质体的形成率也增大，超过一定范围，则原生质体形成率提高不大。
酶浓度过低，不利于原生质体形成；酶浓度过高，则导致原生质体再生率降低。
建议：以使原生质体形成率和再生率的乘积达到最大时的酶浓度，为最适酶浓度。
D. 酶解温度：
温度对酶解作用有双重影响，一方面随着温度升高，酶解反应速度加快；另一方面，随着温度升高，酶蛋白变性而使酶失活。
一般酶解温度控制在20-40度。
E. 酶解时间：
充分的酶解时间是保证原生质体化的必要条件。
但是，如果酶解时间过长，则再生率随酶解的时间延长而显著降低。
原因：当酶解达到一定时间，绝大多数菌体均呈原生质体，因此，再继续进行酶解作用，酶便会进一步对原生质体发生作用而使细胞膜受到损失，造成原质体失活。
F. 渗透压稳定剂：
原生质体对溶液和培养剂的渗透压很敏感，必须在高渗透压或等渗透压的溶液和培养剂中才能维持其生存。在低渗透压溶液中，原生质体会破裂死亡。
不同菌种要求渗透压稳定剂是不同的。
细菌和放线菌：蔗糖、丁二酸钠等；
酵母菌：山梨醇、甘露醇等；
霉菌：KCl、NaCl等。
渗透压稳定剂的使用浓度：一般为0.3-0.8mol/L
3-3-2-3原生质体的融合与再生
融合是把两个亲株的原生质体混合在一起，在融合剂PEG（聚乙二醇）和Ca2+作用下发生原生质体的融合。
无性繁殖。
B.菌体的培养时间；
C.融合剂浓度；
D.融合剂作用时间；
A.阳离子浓度；
B.融合的温度；
C.体系的pH值
A. 菌种自身的再生性能；
B. 原生质体制备的条件；
C. 再生培养基成分；
（1）将用酶处理前的菌体经无菌水系列稀释，涂布于完全培养基平板上培养，计出原菌数，设该数值为A。（2）将用酶处理后得到原生质体分别经如下过程处理。
（2-1）用无菌水适当稀释，在完全培养基平板上培养计数，由于原生质体在低渗透压条件下会破裂失活，所以生长出来的菌落数为未形成原生质体的原菌数，设该值为B。
（2-2）用高渗透压适当稀释，在再生培养基平板上培养计数，生长出来的菌落数是原生质体再生的菌数与未形成原生质体的原菌数之和。设该值为C。
那么，计算方式如下：
A-B
原生质体形成率=————*100%
A
C-B
原生质体再生率=————*100%
优良菌种选育
第三章工业微生物优良菌种选育从自然界分离所得的野生菌种，不论在产量上或质量上均不适应微生物工程的要求，因此从自然界存在的产生某种代谢产物的菌种，经筛选分离和优良菌选育，已成为微生物工程菌种管理上的必要程序。故优良菌种的选育是为生产提供各种类型的突变株，大幅度提高菌种产生利用价值代谢产物特别是基因工程，细胞工程和蛋白质工程等较为定向技术的发展，促进菌种选育技术不断更新，进而研制出众多有价值的微生物工程产品。 微生物工程优良菌种的选育方法包含自然选育、诱变选育、抗噬菌体菌种的选育、杂交选育、原生质体融合技术、基因工程技术等等。 微生物工程评价生产菌种优劣的标准和菌种选育工作的研究目标是实现工业化生产。也就是说，选育的菌种特性能否满足工业化生产的实际需要，是否具有工业化生产价值和实际利用价值。因此，一株优良的生产菌种应该具备如下的特性： ①菌种的生长繁殖能力强，具较强的生长速率，产生孢子的菌种应具有较强的产孢子能力。这样有利于缩短发酵培养周期，减少种子罐的级数，最终得以减少设备投资和运转费用。同时，还可以减少菌种在扩大生产过程中可能发生的生产下降，或杂菌污染的可能性。 ②菌种的培养基和发酵原料来源广泛、价格便宜、尤其对发酵原料成分的波动敏感性较小。 ③对需要添加的前体物质具有耐受能力，且不能将这些前体物质作为一般碳源利用。 ④菌种应具有在较短的发酵周期内产生大量发酵产物的能力，高产菌株的应用，可以在不增加投资的情况下，大幅度提高企业的生产能力。 ⑤能高效地将原料转化为产品，这样可以降低生产成本，提高产品的市场竟争力。 ⑥在发酵过程中不产生或少产生与目标产品性质相近的副产物及其它产物，这样不但可以提高营养物质的有效转化率，还会减少分离纯化的难度，降低成本，提高产品质量。 ⑦在发酵过程中产生的泡沫要少，这对提高装料系数，提高单罐产量，降低成本具有重要意义。 ⑧具有抗噬菌体感染的能力。 ⑨菌株遗传特性稳定，以保证发酵能长期、稳定地进行，有利于实施最佳的工艺控制。 ⑩菌种纯粹，不易变异退化，不产生任何有害的生物活性物质和毒素，以保证安全。 这些都是对优良菌株特性的基本要求，也是菌种选育工作研究和需要解决的问题。 微生物菌种改良是微生物资源利用的关键步骤。为生产目的产物，一般对所筛选出来的菌种都要进行菌种改良以提高其产率和改善其工艺性能。推动工业菌株改良的主要动力是经济原因，发酵工程力求采用最经济、最有效的方式来取得最大的效益。 微生物工程菌种选育、改良的目的： ⑴提高产量 对微生物菌种进行选育改良，以过量生产（overproduction）或超量生产（super - production , hyper-production）目的产物。产量效益是一切商业发酵过程所追求的首要目标，经济是菌种选育的主要推动力，是菌种选育不变的目的。 表征菌种经济性能的重要指标包括： ①浓度（concentration) ，指发酵终了产物的浓度，单位是g/L ，得率越高，产品越浓，带来的好处是下游处理也相对容易； ②转化率（yield) ，指每单位质量的底物转化为目的产物的质量数值，单位是g/g ，或者以百分率（%）表示，这一数值越高，表示菌种对原料的利用越有效，底物效率（Substrate efficiency）就越高； ③生产强度（发酵强度、生产率、生产能力，productivity) ，单位是g/(L·h) , 表示每升发酵液中每小时所得产物的质量（g）。生产强度越大，达到相同产量所花费的发酵时间就越短。
微生物菌种的选育方法
微生物菌种的选育方法 菌种选育Loremreferentibus（英语：Strain selection 日语：ひずみの选択法语：la sélection des souches 俄语：Штаммвыбор 德语：Stammselektion ）微生物菌种是决定发酵产品的工业价值以及发酵工程成败的关键，只有具备良好的菌种基础，才能通过改进发酵工艺和设备以获得理想的发酵产品。菌种用途广泛涉及食品、医药、工农业、环保等诸多领域。 自然选育
自然选育的菌种来源于自然界、菌种保藏机构或生产过程，从自然界中选育菌种的过程较为复杂，而从生产过程或菌种保藏机构得到菌种的自然选育过程较为简单。 自然选育的步骤主要是：采样，增长培养，培养分离和筛选等。采样筛选的菌种采集的对象以土壤为主，也可以是植物、腐败物品和某些水域等。土壤是微生物的汇集地，从土壤中几乎可以分离到任何所需的微生物，故土壤往往是首选的采集目标。微生物的营养需求和代谢类型与生长环境有很大关系。富集培养由于采集样品中各种微生物数量有很大差异，若估计到要分离的菌种数量不多时，就要人为增加分离的概率，增加该菌种的数量，称为富集培养。纯种培养尽管通过增长培养的效果很好，但是得到的微生物还是处于混杂状态，因为样品中本身含有许多种类的微生物。所以，为了取得所需的微生物纯种，增殖培养后必须进行分离。平板分离法由接种环以无菌操作沾取少许待分离的材料，在无菌平板表面进行平行划线、扇形划线或其他形式的连续划线，微生物细胞数量将随着划线次数的增加而减少，并逐步分散开来。如果划线适宜的话，微生物能一一分散，经培养后，可在平板表面得到单菌落。分离方法有三种：即划线分离法、稀释法和组织分离法。稀释分离法在溶液中再加入溶剂使溶液的浓度变小。亦指加溶剂于溶液中以减小溶液浓度的过程。浓溶液的质量×浓溶液的质量分数=稀溶液的质量×稀溶液的质量分数生产能力考察初筛一般通过平板稀释法获得单个菌落，然后对各个菌落进行有关性状的初步测定，从中选出具有优良性状的菌落。例如，对抗生素产生
菌种的选育
第一章菌种选育 第一节工业常用微生物及要求 一、常见微生物 （一）细菌（bacteria） 发酵工业中常用的细菌主要是杆菌,主要有： 醋杆菌属（Acetobacter） 乳杆菌属（Lactobacillus） 杆菌属（Bacillus）:α-淀粉酶，蛋白酶，肌苷、鸟苷等核苷。其中最为重要的是枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis） 短杆菌属（Brevibacterium）：谷氨酸 棒杆菌属（Corynebacterium）：谷氨酸 （二）放线菌（actinomyces） 属原核微生物（有菌丝体，无横隔，不具完整的核。）最大的经济价值在于产生多种抗生素（antibiotic）。 链霉菌（Streptomyces）：红，金，土，氯，链霉素 小单孢菌属（Micromonospora）：庆大霉素 （三）霉菌（mould） 亦称丝状真菌（不是分类学上的名词，凡在营养基质上形成绒毛状，网状或絮状菌丝的真菌统称霉菌。） 1.曲霉属（Aspergillus） 黑曲霉（A. niger）产蛋白酶，淀粉酶，果酸酶，变异菌株产柠檬酸 米曲霉（A. oryzae）产淀粉酶，蛋白酶，酿酒的糖化曲和酱油曲 黄曲霉（A. flavus）产黄曲霉毒素 米曲霉和黄曲霉均为半知菌。 2.青霉属（Penicillum）：例如桔子上的绿色斑点 桔青霉（P. citrinum）：产生5’－磷酸二酯酶，降解核糖核酸为四个单核苷酸。 3.根霉属（Rhizopus）接合菌
米根霉（R. oryzae） 华根霉（R. chinensis） 酒药和酒曲中含有米根霉或华根霉。 4.红曲霉属（Monascus） 淀粉酶，麦芽糖酶，蛋白酶，柠檬酸等。可生产食用红色素。 （四）酵母（yeast） 单细胞真核微生物，低等真菌。 ①酵母属（Saccharomyces） 啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiae） ②假丝酵母属（Candida） 产朊假丝酵母（Candida utilis）生产饲料酵母，其蛋白质和维生素含量都比啤酒酵母高。可利用糖蜜，土豆淀粉废液生产人畜可食用蛋白质。 ③毕赤酵母属（Pichia） 产膜酵母，在液面形成白膜，是酿造物和酒类饮料的污染菌。 （五）其它微生物 1.担子菌（basidiomycetes） 即菇类（mushroom）担子菌资源的利用已经引起人们的重视。可用于多糖及抗癌药物开发。 2. 藻类（alga）是分布极广的一类自养微生物资源，许多国家把它用作人类保健 食品和饲料。从蛋白质产率看，螺旋藻是大豆的 28倍，每公顷珊列藻所得蛋白质是小麦的20～35倍。 （六）噬菌体（phage）凡用细菌和放线菌为生长菌株的发酵工业，均存在噬菌体的危害问题。噬菌体在自然界分布极为广泛。其三大特点是： ①体积比细菌小的多，可以通过细菌滤器。 ②没有细胞结构，由核酸的蛋白质构成。 ③营专性活物寄生，即只能在特异性寄主细胞中增殖。 烈性噬菌体——引起寄主细胞迅速裂解。受感染的细菌称敏感性细菌。 温和噬菌体——随寄主细胞的繁殖而繁殖。含温和噬菌体的细菌称溶原性细菌。
优良菌种的选育
优良菌种的选育 一、填空题在下面各句中用适当的词或词组填空。 １、研究证明，遗传物质的载体是，在病毒中，也可作为遗传物质的载体，它们通过指导的合成来实现性状的表达。 ２、所有细胞生物的遗传物质都是，按其在细胞中存在形式可分成①和②。②在原核细胞中是指，在真核细胞中是指。３、一个含氮碱基被另一个不同碱基置换的突变称为。 ４、在实验室中研究者们对微生物使用诱变剂所产生的突变称为。常用的物理诱变剂主要有、和。常用的化学诱变剂主要有、和。 ５、受体菌从周围环境中吸收ＤＮＡ片段并与其发生遗传物质交换，这一过程称为。６、能从周围环境中吸收ＤＮＡ片段的那些细菌被认为是处于。 ７、细菌染色体上的任一片段被病毒包裹和携带进入受体菌的转导类型称为。８、广义的突变是指染色体、及等遗传物质发生多种变化的现象，包括和等，它可导致后代形态、功能的改变。 ９、通过人工方法用诱变剂处理微生物，使其突变率显著提高，并运用简便、快速和高效的筛选方法，把适合人类需要的优良菌株选育出来的过程，叫做。 10、基因工程是指用人工的方法，通过和的作用，使新构建的遗传物质组合进新个体，并在新个体中得以稳定地遗传和表达的过程。 二、选择题选出一个最合适的答案。 １、当细菌发生突变时，突变效应能在（）中体现。 Ａ、ＡＴＰ利用的速率Ｂ、营养物质消化速率 Ｃ、蛋白质合成Ｄ、ＡＴＰ吸收进细胞 ２、缺失突变发生（）。 Ａ、染色体一个区域整体丢失Ｂ、新的核苷酸序列加到染色体上 Ｃ、ＤＮＡ片段位置颠倒Ｄ、一个质粒结合到染色体上 ３、细菌中紫外线引起的突变是（）。 Ａ、由于染色体断裂Ｂ、由于引起移码突变 Ｃ、由于相邻胸腺嘧啶碱基结合在一起Ｄ、由于ＤＮＡ的一个片段颠倒 ４、细菌重组过程常指（）。 Ａ、物理因素影响而改变基因特性Ｂ、微生物的回复突变 Ｃ、细胞中的基因缺失Ｄ、从供体细胞获得ＤＮＡ ５、细菌转化过程不需要（）。 Ａ、受体细胞处于感受态Ｂ、裂解的供体细胞Ｃ、病毒Ｄ、一系列酶 ６、所有下述特征皆适合质粒，除了（）之外。 Ａ、它们是自我复制的ＤＮＡ环Ｂ、它们有１０――５０个基因 Ｃ、它们是细菌存活所必须的成分Ｄ、它们是接合所必须的成分 ７、基因突变不包括（）。 Ａ、碱基置换Ｂ、缺失或插入Ｃ、移码突变Ｄ、易位 ８、（）是细菌接合过程所必须的。 Ａ、一个活的受体细胞和一个死的受体细胞Ｂ、高浓度的葡萄糖分子 Ｃ、细菌中增殖的病毒Ｄ、两个活的细胞 ９、Hfr 是（）的一种菌株。 Ａ、含有许多不寻常的质粒Ｂ、从受体细菌获得染色体物质 Ｃ、一个宿主染色体上整合有质粒Ｄ、有转导能力
微生物菌种选育方式(一)
微生物菌种选育方式(一) 关键词：地衣芽孢杆菌诺卡氏菌 ATCC 北京标准物质网 微生物菌种选育技术在现代生物技术中具有十分重要的地位，经历了自然选育、诱变育种、杂交育种、代谢控制育种和基因工程育种五个阶段，各个阶段并不孤立存在，而是相互交叉，相互联系的。新的育种技术的发展和应用促进了生产的发展。 1．自然选育 随着微生物学的发展，特别是在发明微生物的纯培养技术之后，出现了微生物纯种的自然选育。以基因自发突变为基础选育优良性状菌株的这种方法，是最早应用微生物遗传学原理．进行育种实践的一个实例。由于微生物体内存在光复活、切补修复、重组修复、紧急呼救修复等修复机制以及DNA聚合酶的校正作用，使得自发突变几率极低，一般为10-6～10-10这样低的突变率导致自然选育耗时长、工作量大，影响了育种工作效率。在这种情况下，就出现了诱变育种技术。 2．诱变育种 1927年，Miller发现X射线能诱发果蝇基因突变。之后，人们发现其他一些因素也能诱发基因突变，并逐渐弄清了一些诱变发生的机理，为工业微生物诱变育种提供了前提条件。1941年，Beadle 和 Tatum 采用X射线和紫外线诱变红色面包霉，得到了各种代谢障碍的突变株。在这之后，诱变育种得到了极大发展。 诱变育种是以诱变剂诱发微生物基因突变，通过筛选突变体，寻找正向突变菌株的一种诱变方法。诱变剂包括物理诱变剂、化学诱变剂和生物诱变剂。其中，物理诱变剂包括紫外线、X射线、射线、快中子等；化学诱变剂包括烷化剂(如甲基磺酸乙酯、硫酸二乙酯、亚硝基胍、亚硝基乙基脲、乙烯亚胺及氮芥等)、天然碱基类似物、脱氨剂(如亚硝酸)、移码诱变剂、羟化剂和金属盐类(如氯化锂及硫酸锰等)；生物诱变剂包括噬菌体等。物理诱变剂因其价格经济，操作方便，所以应用最为广泛；化学诱变剂多是致癌剂，对人体及环境均有危害，使用时须谨慎；生物诱变剂应用面窄，其应用也受到限制。 现今，诱变育种已取得了显著的成果，如青霉素生产菌的青霉素产量在40年内增加了近万倍，达到lO万u／ml左右；谷氨酸产生菌经紫外诱变处理，产酸率提高了3l％；用亚硝酸钠、紫外线等物化方法诱变产碱性蛋白酶的地衣芽
食用菌菌种选育的一般方法
食用菌菌种选育的一般方法 导言 3-1自然选育 定义： 自然突变的结果： 自然选育的特点：简单易行，可以纯化菌种，防止菌种退化，稳定产量。但自然选育的效率低，应该经常跟诱变选育交替使用，提高育种效率。 自然选育的一般程序： 3-2诱变选育 导言 3-2-1诱变育种的原理 诱变育种的理论基础是基因突变，突变包括染色体畸变和基因突变两大类。 染色体畸变指的是，染色体或DNA片段发生缺失、易位、逆位、重复等。 基因突变指的是，DNA中的碱基发生变化，即点突变。 过适当的筛选方法获得所需要的高产优质菌种的育种方法。 常用的诱变剂包括物理、化学、生物的三大类。表3-1所示。 3-2-2诱变育种的基本方式 导言 3-2-2-1出发菌株的选择 进行诱变的出发菌株的性能，对提高诱变效果和效率十分重要。 选择出发诱变菌株的注意事项： 诱变育种的程序： 3-2-2-2诱变剂的使用方法 |------单一诱变剂处理：对野生菌株处理有效。 诱变方法| |------复合诱变剂处理：对经过多次诱变处理的老菌株。 复合诱变剂处理|----同一诱变剂多次处理 |----两种以上诱变剂先后分别处理 |----两种以上诱变剂同时或多次处理 举例：青霉菌的选育。 3-2-2-3诱变剂的剂量选择 诱变剂的剂量与致死率有关，而致死率又与诱变率有关。 因此，可用致死率作为诱变剂剂量的选择依据。 关系：诱变率随诱变剂剂量的增加而提高，但达到一定程度后，反而下降。 近年来处理剂量控制在致死率70-80%。 高剂量诱变的好处：A形成较纯的菌株。(引起一些细胞核变异，同时引起另外一些细胞核被破坏，细胞死亡。) B促使变异菌株稳定，不易产生回复突变。（高剂量会引起细胞遗传物质发生难以恢复的巨大损伤。） 3-2-3突变菌株的筛选 3-2-3-1营养缺陷型突变菌株的筛选 营养缺陷型突变菌株的诱变育种具有重要的理论研究和工业应用价值。
菌种选育与培养
第三章菌种选育与培养 教学目的：1、熟悉工业发酵常用微生物种类；2、掌握菌种分离、筛选和选育的方法；3、掌握种子扩大培养方法和质量控制方法；4、掌握常规的菌种保藏方法。 教学方法：讲授 教学手段：使用多媒体课件 教学内容： 第一节重要工业微生物的分离及菌种要求 1、微生物资源非常丰富，广泛分布于土壤、水和空气中，尤以土壤中最多。 2、有的微生物从自然界中分离出来就能被利用，有的需要对分离到的野生菌株进行人工诱变，得到突变株才能被利用。 3、当前发酵工业所用的菌种总趋势是从野生菌转向变异菌，自然选育转向代谢育种，从诱发基因突变转向基因重组的定向育种。 4、由于生物工业本身的发展以及遗传工程的介入，藻类、病毒等也正在逐步变为工业生产用的微生物。 一、工业生产常用的微生物 1、细菌（bacteria）：枯草芽胞杆菌、醋酸杆菌、棒状杆菌、短杆菌等，用于生产淀粉酶、乳酸、醋酸、氨基酸和肌苷酸等； 2、酵母菌（yeast）：啤酒酵母、假丝酵母、类酵母等，用于酿酒、制造面包、生产脂肪酶以及可食用、药用和饲料用酵母菌体蛋白等； 3、霉菌（mould）：根霉、毛霉、犁头霉、红曲霉、曲霉、青霉等，用于生产多种酶制剂、抗生素、有机酸及甾体激素等； 4、放线菌（actinomycetes）：链霉素、红霉素、金霉素、庆大霉素等，常用菌种来自链霉菌属、小单孢菌属和诺卡氏菌属等； 5、担子菌（basidiomycetes）：通常所说菇类（mushroom）微生物，用于多糖、橡胶物质和抗癌药物的开发； 6、藻类（algae）：用作人类保健食品和饲料，如螺旋藻、栅列藻；可通过藻类将CO2转变为石油，或获取氢能。 二、微生物工业对菌种的要求 目前，随着微生物工业原料的转换和新产品的不断出现，势必要求开拓更多新品种。尽管微生物工业用的菌种多种多样，但作为大规模生产，对菌种有下列要求： 1、原料廉价、生产迅速、目的产物产量高； 2、易于控制培养条件，酶活性高，发酵周期较短； 3、抗杂菌和噬菌体的能力强； 4、菌种遗传性能稳定，不易变异和退化，不产生任何有害的生物活性物质和毒素，保证安全生产。 三、重要工业微生物的分离 分离是指从含微生物的样品（如土壤、水等）中获得纯的或混合的培养物，是筛选具有潜在工业应用价值的微生物的第一个阶段，接着才能从以上分离物中筛选出那些能产生所需产物或具有某种生化反应的菌种。
菌种诱变方法
介绍了几种常用的物理诱变和化学诱变育种方法的原理、特点以及成功案例等,为微生物诱变育种提供了一个总体的方法框架。 诱变; 微生物育种 微生物与酿造工业、食品工业、生物制品工业等的关系非常密切，其菌株的优良与否直接关系到多种工业产品的好坏，甚至影响人们的日常生活质量，所以选育优质、高产的微生物菌株十分重要。微生物育种的目的就是要把生物合成的代谢途径朝人们所希望的方向加以引导，或者促使细胞内发生基因的重新组合优化遗传性状，人为地使某些代谢产物过量积累，获得所需要的高产、优质和低耗的菌种。作为育种途径之一的诱变育种一直被广泛应用。目前，国内微生物育种界主要采用的仍是常规的物理及化学因子等诱变方法。 1 1.1 紫外线照射是常用的物理诱变方法之一，是诱发微生物突变的一种非常有用的工具。DNA和RNA的嘌呤和嘧啶最大的吸收峰260nm，因此在260nm的紫外辐射是最有效的致死剂。紫外辐射的作用已有多种解释，但比较确定的作用是使DNA分子形成嘧啶二聚体[1]。二聚体的形成会阻碍碱基间正常配对，所以可能导致突变甚至死亡[2]。 马晓燕[3]等以紫外诱变原生质选育法筛选发酵乳清高产酒精菌株马克斯克鲁维酵母菌株ZR-20，比优化前的酒精产率提高10.5%，较出发菌株提高了68%。顾蕾[4]等通过紫外诱变红酵母ns-1原生质体，获得类胡萝卜素产量明显提高的突变株，其生物量、色素产量分别为6.15g/L、6.41mg/L，分别比原始菌株提高了67.6%、54.1%。 紫外照射诱变操作简单，经济实惠，一般实验室条件都可以达到，且出现正突变的几率较高，酵母菌株的诱变大多采用这种方法。 1.2 γ-射线是电离生物学上应用最广泛的电离射线之一，具有很高的能量，能产生电离作用，可直接或间接地改变DNA结构。其直接效应是可以氧化脱氧核糖的碱基，或者脱氧核糖的化学键和糖-磷酸相连接的化学键。其间接效应是能使
第三章、优良菌种的选育
第三章、优良菌种的选育 导言 优良生产菌种应具备的基本特性： （1）生产菌种应具有在较短的发酵周期内产生大量发酵产物的能力。 （2）在发酵过程中不产生或少产生与目标产品相近似的副产物及其它产物。 （3）生长繁殖能力强，有较快的生长速率，产生孢子的菌种应该具有较强的产生孢子能力。 （4）能高效地将原料转化为产品。 （5）具有利用广泛来源原料的能力，并对发酵原料成分的波动敏感性较小。 （6）对需要添加的前体物质有耐受能力，并且不能将这些前体物质作为一般碳源利用。（前体：）（7）在发酵过程中产生的泡沫要少。 （8）具有抗噬菌体感染的能力。 （9）遗传特性稳定。 3-1自然选育 定义： 自然突变的结果： 自然选育的特点：简单易行，可以纯化菌种，防止菌种退化，稳定产量。但自然选育的效率低，应该经常跟诱变选育交替使用，提高育种效率。 自然选育的一般程序： 3-2诱变选育 导言 3-2-1诱变育种的原理 诱变育种的理论基础是基因突变，突变包括染色体畸变和基因突变两大类。 染色体畸变指的是，染色体或DNA片段发生缺失、易位、逆位、重复等。 基因突变指的是，DNA中的碱基发生变化，即点突变。 过适当的筛选方法获得所需要的高产优质菌种的育种方法。 常用的诱变剂包括物理、化学、生物的三大类。表3-1所示。 3-2-2诱变育种的基本方式 导言 3-2-2-1出发菌株的选择 进行诱变的出发菌株的性能，对提高诱变效果和效率十分重要。 选择出发诱变菌株的注意事项： 诱变育种的程序： 3-2-2-2诱变剂的使用方法 |------单一诱变剂处理：对野生菌株处理有效。 诱变方法| |------复合诱变剂处理：对经过多次诱变处理的老菌株。 复合诱变剂处理|----同一诱变剂多次处理 |----两种以上诱变剂先后分别处理 |----两种以上诱变剂同时或多次处理 举例：青霉菌的选育。 3-2-2-3诱变剂的剂量选择
菌种选育
作业课题：菌种选育有哪些技术？ 菌种选育 菌种选育是一门应用科学技术，其理论基础是微生物遗传学、生物化学等，而其研究目的是微生物产品的高产优质和发展新品种为生产不断地提供优良菌种，从而促进生产发展。 所以，育种工作者要充分掌握微生物学、生物化学、遗传学的基本原理和国内外有关的先进科学技术，灵活而巧妙地将其运用到育种中去，使菌种选育技术不断更新和发展。 目前菌种选育常采用自然选育和诱变育种等方法，带有一定的盲目性，尚属于经典育种的范畴。随着微生物学、生化遗传学的发展，出现了转化、转导、原生质体融合、代谢调控和基因工程等较为定向的育种方法。 經過本人搜尋網絡資源，得出下面4方面的育種方法： （1）自然选育 在生产过程中，不经过人工处理，利用菌种的自然突变而进行菌种筛选的过程叫做自然选育。 所谓自然突变就是指某些微生物在没有人工参与下所发生的那些突变。一般认为引起自然突变有两个原因：即多因素低剂量的诱变效应和互变异构效应。所谓多因素低剂量的诱变效应，是指自然突变实质上是由一些原因不详的低剂量诱变因素引起的长期综合效应。所谓互变异构效应是指四种碱基的第六位上的酮基和氨基，胸腺嘧啶（T）和鸟嘌呤（G）可以酮式或烯醇式出现，胞嘧啶（C）和腺嘌呤（A）可以氨基式或亚氨基式出现。平衡一般倾向于酮式和氨基式。碱基对发生自然突变的机率约为10－8一10－9。 自然选育是一种简单易行的选育方法，它可以达到纯化菌种，防止菌种衰退、稳定生产、提高产量的目的。但是自然选育的最大缺点是效率低、进展慢。因此，经常把自然选育和诱变育种交替使用，这样可以收到良好的效果。 自然选育（自然分离）的一般程序，是把菌种制备成单孢子悬浮液，经过适当的稀释以后，在固体平板上进行分离，挑取部分单菌落进行生产能力的测定，经反复筛选，以确定生产能力更高的菌株代替原来的菌株。 （2）诱变育种的基本原理 诱变育种的理论基础是基因突变，所谓突变是指由于染色体和基因本身的变化而产生的遗传性状的变异。突变主要包括染色体畸变和基因突变二大类。 染色体畸变是指染色体或DNA片断的缺失、易位、逆位、重复等。基因突变是指DNA分子结构中的某一部位发生变化（又称点突变）。根据突变发生的原因又可分为自然突变和诱发突变。 自然突变是指在自然条件下出现的基因突变。 诱发突变是指用各种物理、化学因素人工诱发的基因突变。诱变因素的种类很多，有物理的、化学的和生物的三大类，见表6－1。经诱变处理后，微生物的遗传物质、DNA和RNA 的化学结构发生改变，从而引起微生物的遗传变异。 诱发突变敏感菌株先经诱变因素处理，然后将处理过的孢子液分离在含有高浓度的噬菌体的平板培养基上，经诱变后的存活孢子中，如存在抗性变异菌株就能在此平板上生长。这种菌落生长的速度一般与正常菌落的生长速度相近，诱变可以提高抗性菌株的频率。 除上述方法外，还可将敏感菌孢子经诱变后接入种子培养基，待菌丝长浓后加入高浓度的噬菌体再继续培养几天，再加入噬菌体反复感染，使敏感菌被噬菌体所裂解，最后取再生菌丝进行平板分离，从中筛选抗性菌株。 （3）杂交育种 发酵工业的优良菌种的选育主要采用诱变育种方法。但是，一个菌种长期使用诱变剂处
第3章 菌种选育理论与技术
第3章菌种选育理论与技术 本章主讲内容 1. 概述 2. 微生物发酵工业用菌种 3. 育种技术 §3-1 概述 菌种选育是一门应用科学技术,其理论基础是微生物遗传学、生物化学等,而其研究目的是微生物产品的高产优质和发展新品种为生产不断地提供优良菌种,从而促进生产发展。 一、菌种选育的目的 (一)生产 1. 提高发酵产量 2. 改进菌种的性能 3. 产生新的发酵产物 4. 去除多余的组分 (二)科研 1. 了解菌种遗传背景 2. 提供分子遗传学研究材料 3. 获得带遗传标记的菌株 4. 生物合成途径的研究 5. 生物合成机制的研究 二、菌种选育的基本理论 1. 遗传与变异
2. 遗传与变异的物质基础 3. 基因突变的本质和遗传变异的类型 4. 突变的过程 5. 突变后的表型变化 6. 表型延迟 §3-2微生物发酵工业用菌种 一、微生物发酵工业用菌种的特点及要求 微生物发酵工业用菌种因不同的发酵对其要求各异，就是同一种产品的发酵生产，其菌种的特点和要求因不同的原料和生产设备的不同也有很大差异，例如：GA 的发酵： 以淀粉质为原料：要求V H-, 以糖蜜为原料：因为糖蜜本身含有非常丰富的V H…… 但是作为工业微生物发酵使用的菌种，通常有下列特点： 1.具有稳定的遗传学特性 这对于工业化生产是很重要的，通常工业化生产整个周期很长，在一个发周期中，菌体至少应该增殖一次，在增殖过程中，菌体应该保证原菌的遗传学特征，（尽管菌体生长的环境改变了，压力、基质、溶氧等） 2.微生物生长和产物的合成对于基质没有严格的要求 换言之，可以广泛的使用各种原料作为生产用的底物，某些微生物对于底物有着严格的要求，对于碳源要求单一，这对于微生物的发酵工业提出了严格的要求，增加了生产成本。 3.生长条件易于满足 在微生物的工业化生产过程中，某些环境条件很难实现。氧的传递和供给就是一个很难完全满足的条件，特别是对于高粘度、高浓度的发酵体系。