ELISA实验原理
ELISA原理－－操作规则（新手适用）
酶联免疫吸附实验 ELISA
一．实验目的
酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay 简称ELISA）是在免疫酶技术（immunoenzymatic techniques）的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术,ELISA过程包括抗原（抗体）吸附在固相载体上称为包被，加待测抗体（抗原）, 再加相应酶标记抗体（抗原）,生成抗原（抗体）－－待测抗体（抗原）－－酶标记抗体的复合物，再与该酶的底物反应生成有色产物。借助分光光度计的光吸收计算抗体（抗原）的量。待测抗体（抗原）的定量与有色产生成正比。
二．实验原理
用于免疫酶技术的酶有很多，如过氧化物酶，碱性磷酸酯酶，β－Ｄ－半乳糖苷酶，葡萄糖氧化酶，碳酸酐酶，乙酰胆碱酯酶，6－磷酸葡萄糖脱氧酶等。常用于ELISA法的酶有辣根过氧化物酶，碱性磷酸酯酶等，其中尤以辣根过氧化物酶为多。由于酶摧化的是氧化还原反应，在呈色后须立刻测定，否则空气中的氧化作用使颜色加深，无法准确地定量。
辣根过氧化物酶（HRP）是一种糖蛋白，每个分子含有一个氯化血红素（protonhemin）区作辅基。酶的浓度和纯度常以辅基的含量表示。氯化血红素辅基的最大吸收峰是403nm，HRP酶蛋白的最大吸收峰是275nm，所以酶的浓度和纯度计算式是（已知HRP的A（1cm 403nm 1%）＝25，式中1％指HRP百分浓度为100ml含酶蛋白1g，即10mg/ml，所以，酶浓度以 mg/ml 计算是HRP的A （1cm 403nm mg/ml=2.5）HRP纯度（RZ）=A403nm/A275nm纯度RZ（Ｒeinheit Zahl）值越大说明酶内所含杂质越少。高纯度HRP的RZ值在3.0左右，最高可达3.4。用于ELISA检测的HRP的RZ值要求在3.0以上。
ELISA的基本原理有三条：
（1）抗原或抗体能以物理性地吸附于固相载体表面，可能是蛋白和聚苯乙烯表面间的疏水性部分相互吸附，并保持其免疫学活性；
（2）抗原或抗体可通过共价键与酶连接形成酶结合物，而此种酶结合物仍能保持其免疫学和酶学活性；
（3）酶结合物与相应抗原或抗体结合后，可根据加入底物的颜色反应来判定是否有免疫反应的存在，而且颜色反应的深浅是与标本中相应抗原或抗体的量成正比例的，因此，可以按底物显色的程度显示试验结果。
ELISA法是免疫诊断中的一项新技术，现已成功地应用于多种病原微生物所引起的传染病、寄生虫病及非传染病等方面的免疫诊断。也已应用于大分子抗原和小分子抗原的定量测定，根据已经使用的结果，认为ELISA法具有灵敏、特异、简单、快速、稳定及易于自动化操作等特点。不仅适用于临床标本的检查，而且由于一天之内可以检查几百甚至上千份标本,因此，也适合于血清流行病学调查。本法不仅可以用来测定抗体，而且也可用于测定体液中的循环抗原，所以也是一种早期诊断的良好方法。因此ELISA法在生物医学各领域的应用范围日益扩大，可概括四个方面：1、免疫酶染色各种细胞内成份的定位。2、研究抗酶抗体的合成。3、显现微量的免疫沉淀反应。4、定量检测体液中抗原或抗体成份。
基本方法一用于检测未知抗原的双抗体夹心法:
1.包被：用0.05M PH9.牰碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1～10μg／ml。在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml，4℃过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟。（简称洗涤，下同）。
2.加样：加一定稀释的待检样品0.1ml于上述已包被之反应孔中，置37℃孵育1小时。然后洗涤。（同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔）。
3.加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体（经滴定后的稀释度）0.1ml。37℃孵育0.5～1小时，洗涤。
4.加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃10～30
分钟。
5.终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。
6.结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。也可测O·D
值：在ELISA检测仪上，于450nm（若以ABTS显色，则410nm）处，以空白对照孔调零后测各孔O·D值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。
基本方法二用于检测未知抗体的间接法：
用包被缓冲液将已知抗原稀释至1～10μg／ml，每孔加0.1ml，4℃过夜。次日洗涤3次。↓
加一定稀释的待检样品（未知抗体）0.1ml于上述已包被之反应孔中,置37℃孵育1小时,洗涤。（同时做空白、阴性及阳性孔对照）
↓
于反应孔中，加入新鲜稀释的酶标第二抗体（抗抗体）0.1ml，37℃孵育30-60分钟，洗涤,最后一遍用DDW洗涤。
↓
其余步骤同“双抗体夹心法”的4、5、6。
（二）酶与底物
酶结合物是酶与抗体或抗原, 半抗原在交联剂作用下联结的产物。是ELISA 成败的关键试剂，它不仅具有抗体抗原特异的免疫反应，还具有酶促反应，显示出生物放大作用，但不同的酶选用不同的底物。
免疫技术常用的酶及其底物
* 终止剂为2mol/L H2SO4
** 终止剂为2 mol/L柠檬酸，不同的底物有不同的终止剂。
可催化下列反应： HRP+H2O2→复合物复合物+AH2→过氧化物酶+H2O+A AH2 ——为无色底物, 供氢体； A——为有色产物。
（三） ELISA常用的四种方法
1．直接法测定抗原
将抗原吸附在载体表面；
加酶标抗体，形成抗原—抗体复合物；
加底物。底物的降解量＝抗原量。
2．间接法测定抗体
将抗原吸附于固相载体表面；
加抗体, 形成抗原-抗体复合物；
加酶标抗体；
加底物。测定底物的降解量＝抗体量。
3．双抗体夹心法测定抗原
将抗原免疫第一种动物获得的抗体吸附于固相表面;
加抗原，形成抗原-抗体复合物;
加抗原免疫第二种动物获得的抗体，形成抗体抗原抗体复合物;
加酶标抗抗体（第二种动物抗体的抗体）;
加底物。底物的降解量＝抗原量。
4. 竞争法测定抗原
将抗体吸附在固相载体表面;
（1）加入酶标抗原；
（2）,（3）加入酶标抗原和待测抗原；
加底物。对照孔与样品孔底物降解量的差＝未知抗原量。
三．仪器和材料
1. 聚苯乙烯微量细胞培养板（平板, 40, 96孔）。
2. 酶联免疫检测仪
3. 辣根过氧化物酶羊抗兔IgG, 工作稀释度1:1000。
4. 包被液:：0.05mol/L pH9.6碳酸缓冲液,4℃，保存, Na2CO3 0.15克, NaHCO3 0.293克,蒸馏水稀释至100 ml。
5. 稀释液：0.01mol/LpH7.4 PBS－－Tween－－20, ４℃，保存. NaCl 8g, KH2PO4 0.2g, Na2HPO4.12H2O 2.9g, Tween—20，0.5ml. 蒸馏水加至1000ml。
6. 洗涤液：同稀释液
7. 封闭液：0.5%鸡卵清蛋白，pH7.4 PBS。
8. 邻苯二胺溶液（底物）：临用前配制 0.1M 柠檬酸（2.1g/100ml）, 6.1ml 0.2M Na2HPO4.12H2O （7.163g/100ml） 6.4ml, 蒸馏水12.5ml, 邻苯二胺10mg, 溶解后, 临用前加30%H2O2 40 微升。
9. 终止液：2mol/LH2SO4。
四. 操作步骤
1. 包被抗原：用包被液将抗原作适当稀释, 一般为1～10微克/孔，每孔加200微升，37℃温育1小时后，4℃冰箱放置16～18小时。
2. 洗涤：倒尽板孔中液体，加满洗涤液，静放三分钟，反复三次，最后将反应板倒置在吸水纸上，使孔中洗涤液流尽。
3. 加封闭液200微升，37℃放置一小时。
4. 洗涤同2。
5. 加被检血清：用稀释液将被检血清作几种稀释,，每孔200微升。同时作稀释液对照。37℃放置2小时。
6. 洗涤同2。
7. 加辣根过氧化物酶羊抗兔IgG, 每孔200微升, 放置37℃ 1小时。
8. 洗涤同2。
9. 加底物：邻苯二胺溶液加200ml，室温暗处10－－15分钟。
10. 加终止液：每孔50微升。
11. 观察结果：用酶联免疫检测仪记录490nm读数。
ELISA的基本原理
ELISA的基本原理[1] ELISA是指以酶作为标记物、以抗原和抗体之间免疫结合反应为基础的固相吸附测定方法。因此，一个ELISA测定试剂，其有机组成部分包括：（1）包被的抗原或抗体的固相支持物，即聚苯乙烯塑料微孔或试管；（2）酶标记的抗体或抗原和（3）酶的反应底物等。抗原或抗体的固相化，并不影响其免疫结合活性，酶标记的抗体或抗原亦是如此，并且标记酶的活性不因标记过程而丧失。整个测定中，抗原与抗体的结合反应在固相支持物上进行，反应结果的判断，以酶与其底物作用后的显色或产生荧光或发光反应为标准，显色或产生荧光或发光的强度，与临床标本中待测物的浓度成正比或反比关系。目前国内的ELISA试剂盒均以酶的显色反应来完成测定。 二、固相上抗原抗体相互作用的免疫化学[2,3] 通常所提到的抗原与抗体的相互作用，一般指的是在液相状态下，而在固相状态下，抗原与抗体的结合反应有其相应的特点，主要表现在以下四个方面。 （一）固相上抗原与抗体结合反应所需要的时间较液相状态下长 通常，固相免疫测定如ELISA中，抗原与抗体结合达到平衡所需要的时间，较液相免疫测定要长，并随液体所占体积与界面抗体或抗原受体所占体积比的增加而增加。当在微孔板孔内进行免疫测定时，界面反应动力学显示其对扩散作用有很强的依赖性，扩散性越强，则反应所需时间越短，结合越充分。这一点可通过旋转振荡来达到，微孔的旋转振荡可促使液体进入到可与抗体或抗原包被的界面接触的较小的区域内。也可在微孔中放一个惰性的塞子以使反应液体成为一个小体积，或使用一个具有大表面的多孔的基质如硝酸纤维素，或使用微颗粒来做到这一点。微颗粒小于1μm时，在测定时即成胶体悬液，而当颗粒或珠较大时，则会在没有振荡时，由于重力的作用而分开。所有上述方法均是通过减少液体所占体积与界面抗体或抗原受体所占体积比，从而减少固相免疫测定的扩散依赖性。 （二）固相上抗原与抗体接触表面的反应体积远小于液相测定 此处的反应体积并非是微孔中的液体体积，而是固相免疫测定中与固相包被的抗体或抗原有接触的部分，这部分体积到底有多少，很难测定，但比反应管中总液体体积要少得多。固相抗原抗体反应发生于液体-固相界面，可能处于一级结合键的引力距离内，小于100?。液相中待测抗原或抗体要进入到这个结合界面，需要经过扩散或质量转移。微颗粒的反应表面区域较微孔要大得多，因而处于抗原抗体结合界面的体积占总反应体积的比例亦高得多。因此，结合反应的效率更高。这也是全自动化免疫测定分析仪均采用微颗粒固相的重要原因之一。可参与结合反应的抗体或抗原的浓度取决于可参与结合的反应体积，无法精确计算这种反应体积，从而难以使用通常的质量作用定律图形来计算Keq。因此，固相上抗原与抗体反应的Keq值与液相抗原与抗体反应的Keq值没有可比性。 （三）固相上抗原和抗体间结合后的离解速率较液相测定低
免疫学--ELISA原理
ELISA原理－－操作规则（新手适用）点击次数：3347 发布时间：2010-7-12 8:45:33 ELISA原理－－操作规则（新手适用） 酶联免疫吸附实验 ELISA 一．实验目的 酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay 简称ELISA）是在免疫酶技术（immunoenzymatic techniques）的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术,ELISA过程包括抗原（抗体）吸附在固相载体上称为包被，加待测抗体（抗原）, 再加相应酶标记抗体（抗原）,生成抗原（抗体）－－待测抗体（抗原）－－酶标记抗体的复合物，再与该酶的底物反应生成有色产物。借助分光光度计的光吸收计算抗体（抗原）的量。待测抗体（抗原）的定量与有色产生成正比。 二．实验原理 用于免疫酶技术的酶有很多，如过氧化物酶，碱性磷酸酯酶，β－Ｄ－半乳糖苷酶，葡萄糖氧化酶，碳酸酐酶，乙酰胆碱酯酶，6－磷酸葡萄糖脱氧酶等。常用于ELISA法的酶有辣根过氧化物酶，碱性磷酸酯酶等，其中尤以辣根过氧化物酶为多。由于酶摧化的是氧化还
原反应，在呈色后须立刻测定，否则空气中的氧化作用使颜色加深，无法准确地定量。 辣根过氧化物酶（HRP）是一种糖蛋白，每个分子含有一个氯化血红素（protonhemin）区作辅基。酶的浓度和纯度常以辅基的含量表示。氯化血红素辅基的最大吸收峰是403nm，HRP酶蛋白的最大吸收峰是275nm，所以酶的浓度和纯度计算式是（已知HRP的A（1cm 403nm 1%）＝25，式中1％指HRP百分浓度为100ml含酶蛋白1g，即10mg/ml，所以，酶浓度以 mg/ml 计算是HRP的A（1cm 403nm mg/ml=2.5）HRP纯度（RZ）=A403nm/A275nm纯度RZ（Ｒeinheit Zahl）值越大说明酶内所含杂质越少。高纯度HRP的RZ值在3.0左右，最高可达3.4。用于ELISA检测的HRP的RZ值要求在3.0以上。 ELISA的基本原理有三条： （1）抗原或抗体能以物理性地吸附于固相载体表面，可能是蛋白和聚苯乙烯表面间的疏水性部分相互吸附，并保持其免疫学活性； （2）抗原或抗体可通过共价键与酶连接形成酶结合物，而此种酶结合物仍能保持其免疫学和酶学活性； （3）酶结合物与相应抗原或抗体结合后，可根据加入底物的颜色反应来判定是否有免疫反应的存在，而且颜色反应的深浅是与标本中相应抗原或抗体的量成正比例的，因此，可以按底物显色的程度显示试验结果。
ELISA检测方法
ELISA（酶联免疫吸附测定，enzyme linked immunosorbent assay）指将可溶性的抗原或抗体结合到聚苯乙烯等固相载体上，利用抗原抗体结合专一性进行免疫反应的定性和定量检测方法。 基本原理： ①使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。 ②使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。 ③在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。 ④加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅有无定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，故可极大地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度。 双抗夹心法 夹心法常用于检测大分子抗原，一般的操作步骤为: ①将具有专一性的抗体固著于塑胶孔盘上，完成后洗去多余抗体； ②加入待测检体，检体中若含有待测的抗原，则其会与塑胶孔盘上的抗体进行专一性键结； ③洗去多余待测检体，加入另一种对抗原专一的一次抗体，与待测抗原进行键结； ④洗去多余未键结一次抗体，加入带有酶的二次抗体，与一次抗体键结； ⑤洗去多余未键结二次抗体，加入酶底物使酵素呈色，以肉眼或仪器读取呈色结果。 间接法 间接法常用于检测抗体，一般的操作步骤为： ①将已知的抗原固著于塑胶孔盘上，完成后洗去多余的抗原。
②加入待测检体，检体中若含有待测的一次抗体，则其会与塑胶孔盘上的抗原进行专一性键结。 ③洗去多余待测检体，加入带有酶的二次抗体，与待测的一次抗体键结。 ④洗去多余未键结二次抗体，加入酶底物使酶呈色，藉仪器（ELISA reader）测定塑胶盘中的吸光值（OD值），以评估有色终产物的含量即可测量待测抗体的含量。 竞争法 竞争法是一种较少用到的ELISA检测机制，一般用于检测小分子抗原，其操作步骤为： ①将具有专一性的抗体固著于塑胶孔盘上，完成后洗去多余抗体； ②加入待测检体，使检体中的待测抗原与塑胶孔盘上的抗体进行专一性键结； ③加入带有酶的抗原，此抗原也可与塑胶孔盘上的抗体进行专一性键结，由于塑胶孔盘上固著的抗体数量有限，因此当检体中抗原的量越多，则带有酶的抗原可键结的固著抗体就越少，亦即，两种抗原皆竞相与塑胶孔盘上抗体键结，即所谓竞争法之由来。 ④洗去检体与带有酶的抗原，加入酶底物使酶呈色，当检体中抗原量越多，代表塑胶孔盘内留下之带有酶的抗原越少，显色也就越浅。 注：当需要侦测无法获得两种以上单一性抗体的抗原，或是不易得到足够的纯化抗体以固著于孔盘上时，一般会考虑使用竞争法ELISA。
ELISA原理及步骤
ELISA原理－－操作规则（新手适用） 点击次数：3347 发布时间：2010-7-12 8:45:33 ELISA原理－－操作规则（新手适用） 酶联免疫吸附实验 ELISA ELISA法是免疫诊断中的一项新技术，现已成功地应用于多种病原微生物所引起的传染病、寄生虫病及非传染病等方面的免疫诊断。也已应用于大分子抗原和小分子抗原的定量测定，根据已经使用的结果，认为ELISA法具有灵敏、特异、简单、快速、稳定及易于自动化操作等特点。不仅适用于临床标本的检查，而且由于一天之内可以检查几百甚至上千份标本,因此，也适合于血清流行病学调查。本法不仅可以用来测定抗体，而且也可用于测定体液中的循环抗原，所以也是一种早期诊断的良好方法。因此ELISA法在生物医学各领域的应用范围日益扩大，可概括四个方面：1、免疫酶染色各种细胞内成份的定位。2、研究抗酶抗体的合成。3、显现微量的免疫沉淀反应。4、定量检测体液中抗原或抗体成份。一．实验目的 酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay 简称ELISA）是在免疫酶技术（immunoenzymatic techniques）的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术,ELISA过程包括抗原（抗体）吸附在固相载体上称为包被，加待测抗体（抗原）, 再加相应酶标记抗体（抗原）,生成抗原（抗体）－－待测抗体（抗原）－－酶标记抗体的复合物，再与该酶的底物反应生成有色产物。借助分光光度计的光吸收计算抗体（抗原）的量。待测抗体（抗原）的定量与有色产生成正比。 二．实验原理
用于免疫酶技术的酶有很多，如过氧化物酶，碱性磷酸酯酶，β－Ｄ－半乳糖苷酶，葡萄糖氧化酶，碳酸酐酶，乙酰胆碱酯酶，6－磷酸葡萄糖脱氧酶等。常用于ELISA法的酶有辣根过氧化物酶，碱性磷酸酯酶等，其中尤以辣根过氧化物酶为多。由于酶摧化的是氧化还原反应，在呈色后须立刻测定，否则空气中的氧化作用使颜色加深，无法准确地定量。 辣根过氧化物酶（HRP）是一种糖蛋白，每个分子含有一个氯化血红素（protonhemin）区作辅基。酶的浓度和纯度常以辅基的含量表示。氯化血红素辅基的最大吸收峰是403nm，HRP酶蛋白的最大吸收峰是275nm，所以酶的浓度和纯度计算式是（已知HRP的A（1cm 403nm 1%）＝25，式中1％指HRP百分浓度为100ml含酶蛋白1g，即10mg/ml，所以，酶浓度以mg/ml 计算是HRP 的A（1cm 403nm mg/ml=）HRP纯度（RZ）=A403nm/A275nm纯度RZ（Ｒeinheit Zahl）值越大说明酶内所含杂质越少。高纯度HRP的RZ值在左右，最高可达。用于ELISA检测的HRP的RZ值要求在以上。 ELISA的基本原理有三条： （1）抗原或抗体能以物理性地吸附于固相载体表面，可能是蛋白和聚苯乙烯表面间的疏水性部分相互吸附，并保持其免疫学活性； （2）抗原或抗体可通过共价键与酶连接形成酶结合物，而此种酶结合物仍能保持其免疫学和酶学活性； （3）酶结合物与相应抗原或抗体结合后，可根据加入底物的颜色反应来判定是否有免疫反应的存在，而且颜色反应的深浅是与标本中相应抗原或抗体的量成正比例的，因此，可以按底物显色的程度显示试验结果。 三、实验方法 基本方法一用于检测未知抗原的双抗体夹心法:
(完整版)Elisa常见类型及实验标准操作方法与常见问题
Elisa常见类型及实验标准操作方法与常见问题 酶联免疫吸附试验（ELISA）是一种实验室常用的检测方法，广泛应用于测量溶液中的分析物（抗体或抗原）的浓度。与其他基于抗体的检测方法不同的是，酶联免疫吸附试验或酶免疫测定（EIA）通过与固相支持物的结合和系列洗涤步骤，实现特异性和非特异性相互作用的分离，并可通过最终有色产物的形成，定量分析原始样品中分析物的含量。 ELISA 实验通常以细胞培养上清液、血清、血浆以及组织裂解物等为样品。该实验必备三种试剂：固相的抗原或抗体；酶标记的抗原或抗体；酶作用的底物。根据样品的性质、检测的实验条件、试剂的来源，可设计出不同类型的ELISA 检测方法。 该实验可迅速分析大量平行样品，在基础研究和临床诊断实践中广泛使用。 一、直接ELISA 原理：将抗原与固相载体连接，洗涤除去未结合的抗原及杂质。加酶标抗体进行孵育。固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。此时固相上带有的酶量与标本中受检抗原的量相关。加底物反应。直接法主要用于测定抗原。 优点：操作流程简短，实验步骤少；无需使用二抗，避免了交叉反应；实验步骤少，操作不易出错。 缺点：实验中的一抗需要直接用酶标记，成本相对较高。 二、间接法ELISA
原理：将抗原与固相载体相连结，形成固相抗原。洗涤除去未结合的抗原及杂质。加入特异性一抗与固相抗原相结合，形成固相抗原抗体复合物。经洗涤后，加酶标二抗。固相免疫复合物中的抗体与酶标二抗结合，从而间接地标记上酶。洗涤后，加底物显色。 优点：酶标二抗可加强信号，提高灵敏度；灵活性更大，同一酶标二抗可应用于多种不同的一抗；不直标一抗，可保留更多的免疫反应性；成本更低，使用标记抗体更少。 缺点：交叉反应几率升高。 三、双抗夹心法ELISA 原理：双抗体夹心法适用于测定二价或二价以上的大分子，但不适用于小分子抗原。将特异性抗体（捕获抗体）与固相载体连接，形成固相抗体。洗涤除去未结合的抗体及杂质。加入待检样品，保温孵育。样品中的特异性抗原与固相抗体结合，形成固相抗原抗体复合物。洗涤除去其他未结合物质。加酶标抗体（检测抗体）保温孵育。固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。加底物反应。 双抗原夹心法测抗体的反应模式与测抗原相似，用特异性抗原进行包被和制备酶结合物，以检测相应的抗体。
ELISA试验方法的基本原理.docx
1971年Engvall和Perlmann发表了酶联免疫吸附测定（enzymelinkedimmunosorbentassay, ELISA）用于IgG定量测定的文章，使得1966年用于抗原定位的酶标抗体技术发展成液体标本中微量物质的测定方法。 ELISA的原理 ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。 进行检测时，样品中的受检物质（抗原或抗体）与固定的抗体或抗原结合。通过洗板除去非结合物，再加入酶标记的抗原或抗体，此时，能固定下来的酶量与样品中被检物质的量相关。通过加入与酶反应的底物后显色，根据颜色的深浅可以判断样品中物质的含量，进行定性或定量的分析。 由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的灵敏度。 ELISA的基本类型 ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。这种测定方法中有3种必要的试剂： 1. 固相的抗原或抗体； 2. 酶标记的抗原或抗体； 3. 酶作用的底物。 根据试剂的来源和标本的性状及检测的具备条件，可设计出各种不同类型的检测方法。 1. 双抗体夹心法测抗原 针对抗原分子上两个不同抗原决定簇的单克隆抗体分别作为固相抗体和酶标抗体。适用于测定二价或二价以上的大分子抗原，不适用于测定半抗原及小分子单价抗原，因其不能形成两位点夹心。
2. 竞争法测抗原 首先将特异性抗体包被于固相载体表面，经洗涤后分成两组：一组加酶标记抗原和被测抗原的混合液，另一组只加酶标记抗原，经孵育洗涤后加底物显色，这两组底物降解量之差，即为所要测定的未知抗原的量。此方法测定的抗原只要有一个结合部位即可，对小分子抗原如激素和药物类的测定常用此法。优点是快，缺点是需要较多量的酶标记抗原。 3. 免疫抑制法测抗原
清华大学Elisa实验报告
Elisa实验报告 实验名称： 酶联免疫吸附剂测定 实验原理： 酶联免疫吸附测定是一种免疫测定技术。测定中，先使抗原吸附在固相载体上，然后加待测的抗体，再用某种酶标记抗体，形成抗原-抗体-酶标记抗体的“双抗体夹心”，此时酶仍保有活性，同时标记抗体亦有免疫活性。之后再加入酶的底物，在酶的催化下产生反应并产生有色物，颜色深浅与待测物质的量直接相关。至此，酶的催化放大作用与免疫反应的特异性相完美结合，提高了测定的准确性与灵敏度。 实验材料与试剂： 1．聚苯乙烯微量细胞培养板(平板, 96孔)。 2．酶联免疫检测仪。 3．辣根过氧化物酶羊抗兔IgG。 4．包被液：0.05 mol/L 碳酸缓冲液（pH 9.6）： Na2CO3 0.15g, NaHCO3 0.293g， 蒸馏水稀释至100 ml。 5．稀释液（PBS-Tween）： NaCl 8g, KCl 0.2g， KH2PO4 0.2g, Na2HPO4·12H2O 2.9g, Tween-20，0.5ml， 蒸馏水加至1000ml。 6．洗涤液：同稀释液。 7．封闭液：0.5 % （质量分数）BSA（用PBS配制）。 8．邻苯二胺溶液(底物)： 配制： 0.1 mol/L 柠檬酸(2.1g/100ml), 取6.1ml， 0.2 mol/L Na2HPO4·12H2O (7.163g/100ml),取6.4ml, 加蒸馏水12.5ml, 取邻苯二胺8mg（溶解）； 临用前加30 % （体积分数）H2O2 40μl。 9．终止液：2 mol/L H2SO4。 实验步骤：
１．包被抗原：用包被液将抗原作适当稀释, 一般为1~10μg/孔，每孔加200μl, 37 ℃温育30min。 ２．洗涤：倒尽板孔中液体，加200μl洗涤液，反复三次，最后将反应板倒置在吸水纸上，使孔中洗涤液流尽。 ３．加封闭液200μl，37 ℃温育30min。 ４．洗涤同2。 ５．加被检血清：用稀释液将被检血清作几种稀释，每孔200μl。同时作稀释液对照。37 ℃温育30min。 ６．洗涤同2。 ７．加辣根过氧化物酶羊抗兔IgG, 每孔200μl, 37 ℃温育30min。 ８．洗涤同2。 ９．加底物：邻苯二胺溶液加200μl，室温暗处5min。 １０．加终止液：每孔50μl。 １１．观察结果：用酶联免疫检测仪记录OD490nm读数。 实验结果 数据如下： P.S:紫色数据表示异常 实验讨论： 1无一抗（10）数据值存在异常。理论上应趋近于零。可能是由于受污染所致
ELISA实验原理
一．ELISA实验原理： ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。在测定时，受检标本（测定其中的抗体或抗原）与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。 再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。 二．实验材料与试剂配制： 1.仪器与材料：酶标仪（使用前预热30分钟），微量加液器、吸头、蒸馏水或去离子水， 滤纸。 2. 洗液的配制：按1:30的比例配制洗液备用。 三．样品收集、处理及保存 1）.细胞培养上清： 适用于检测体外培养的细胞分泌性成份。用无菌管收集细胞上清液，以1000×g离心15分钟，收集上清。 2）细胞： 用PBS反复洗涤细胞3次，调整细胞浓度达到104-106/ml 左右，通过反复冻融，使细胞破坏并放出细胞内成份，或者细胞超声粉碎，离心取上清液检测。 3）血清： 在室温下，血液自然凝固，以1000×g离心15分钟，取上清待测。 4）血浆： 应根据标本的要求选择EDTA 或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合后静置10-20 分钟后，以1000×g离心15分钟，收集上清。 5）体液： 包括胸腹水、脑脊液，分泌物等。使用不含热原和内毒素的离心管收集，以1000×g离心15分钟，收集上清。 6.）组织标本： 切取组织标本，称取重量0.5mg，加入500ul 的PBS，用手工或匀浆器，或超声破碎仪将标本匀浆，以2000-3000 rmp离心20 分钟，收集上清进行检测。 样品中不能含有NaN3，因NaN3 抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。 7）保存： 如果样品不能立即检测，应将其分装，-70 ℃保存，避免反复冷冻。保存过程中如出现沉淀，应再次离心。血液标本尽可能的不要使用溶血或高血脂血。如果血清中含大量颗粒，检测前先离心或过滤。不要在37℃或更高的温度加热解冻。应在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。 四．操作步骤： 1）取出试剂盒，室温（20-25℃）放置30分钟。 2）分组：取出96孔板，根据待测样品数量加上标准品的数量决定所需的板条数，把剩余的板条继续冷藏处理。分别设标准品组（6个浓度）、空白孔、待测样品组。 3）标准品的稀释：准备小试管6 只，依次编好号码，先在各小试管中加入标准品稀释液100ul，然后取原浓度标准品100ul加入一只已编好号的试管中，充分混匀;再在该试管中取100ul 加入第二支试管中，充分混匀；再在该试管中取100ul加入第三只试管
ELISA方法的基本原理和操作步骤
ELISA方法的基本原理和操作步骤 基本原理 1971年Engvall和Perlmann发表了酶联免疫吸附剂测定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）用于IgG定量测定的文章，使得1966年开始用于抗原定位的酶标抗体技术发展成液体标本中微量物质的测定方法。这一方法的基本原理是：①使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。②使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅刊物定性或定量分析。由于酶的催化频率很高，故可极大地地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度。 方法类型和操作步骤 ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方法中有3种必要的试剂：①固相的抗原或抗体，②酶标记的抗原或抗体，③酶作用的底物。根据试剂的来源和标本的性状以及检测的具备条件，可设计出各种不同类型的检测方法。 （一）双抗体夹心法 双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法，操作步骤如下：
（1）将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体：洗涤除去未结合的抗体及杂质。 （2）加受检标本：使之与固相抗体接触反应一段时间，让标本中的抗原与固相载体上的抗体结合，形成固相抗原复合物。洗涤除去其他未结合的物质。 （3）加酶标抗体：使固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检物质的量正相关。 （4）加底物：夹心式复合物中的酶催化底物成为有色产物。根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量。 根据同样原理，将大分子抗原分别制备固相抗原和酶标抗原结合物，即可用双抗原夹心法测定标本中的抗体。 （二）双位点一步法 在双抗体夹心法测定抗原时，如应用针对抗原分子上两个不同抗原决定簇的单克隆抗体分别作为固相抗体和酶标抗体，则在测定时可使标本的加入和酶标抗体的加入两步并作一步（图15-5）。这种双位点一步不但简化了操作，缩短了反应时间，如应用高亲和力的单克隆抗体，测定的敏感性和特异性也显著提高。单克隆抗体的应用使测定抗原的ELIS 在一步法测定中，应注意钩状效应（hookeffect），类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象。当标本中待测抗原浓度相当高时，过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合，而不再形成夹心复合物，所得结果将低于实际含量。钩状效应严重时甚至可出现假阴性结果。 （三）间接法测抗体
elisa原理和分类附图解
一、ELISA的原理 ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。在测定时，受检标本（测定其中的抗体或抗原）与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度。 二、ELISA的类型 ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方法中有三个必要的试剂： （1）固相的抗原或抗体，即"免疫吸附剂"（immunosorbent）； （2）酶标记的抗原或抗体，称为“酶联物”、“结合物”（conjugate）；（3）酶反应的底物。根据试剂的来源和标本的情况以及检测的具体条件，可设计出各种不同类型的检测方法。用于临床检验的ELISA主要有以下几种类型： （一）双抗体夹心法测抗原 双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法，操作步骤如下： （1）将特异性抗体与固相载体联结，形成固相抗体。洗涤除去未结合的抗体
及杂质。 （2）加受检标本，保温反应。标本中的抗原与固相抗体结合，形成固相抗原抗体复合物。洗涤除去其他未结合物质。 （3）加酶标抗体，保温反应。固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检抗原的量相关。 （4）加底物显色。固相上的酶催化底物成为有色产物。通过比色，测知标本中抗原的量。 在临床检验中，此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原，例如HBsAg、HBeAg、AFP、hCG等。只要获得针对受检抗原的异性抗体，就可用于包被固相载体和制备酶结合物而建立此法。如抗体的来源为抗血清，包被和酶标用的抗体最好分别取自不同种属的动物。如应用单克隆抗体，一般选择两个针对抗原上不同决定簇的单抗，分别用于包被固相载体和制备酶结合物。这种双位点夹心法具有很高的特异性，而且可以将受检标本和酶标抗体一起保温反应，作一步法检测。 在一步法测定中，当标本中受检抗原的含量很高时，过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合，而不再形成"夹心复合物"。类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象，此时反应后显色的吸光值（位于抗原过剩带上）与标准曲线（位于抗体过剩带上）某一抗原浓度的吸光值相同，如按常法测读，所得结果将低于实际的含量，这种现象被称为钩状效应（hook effect），因为标准曲线到达高峰后呈钩状弯落。钩状效应严重时，反应甚至可不显色而出现假阴性结果。因此在使用一步法试剂测定标本中含量可异常增高的物质（例如血清中HBsAg、AFP和尿液hCG等）时，应注意可测范围的最高值。用高亲和力的单克隆抗体制
实用文档之elisa的检测原理及步骤
实用文档之"Elisa Kit使用方法" 检测原理: 本实验采用双抗体夹心ELISA法。抗人IL-4单抗包被于酶标板上，标本和标准品中的IL-4会与单抗结合，游离的成分被洗去。加入生物素化的抗人IL-4抗体和辣根过氧化物酶标记的亲和素。生物素与亲和素特异性结合；抗人IL-4抗体与结合在单抗上的人IL-4结合而形成免疫复合物，游离的成分被洗去。加入显色底物，若反应孔中有IL-4，辣根过氧化物酶会使无色的显色剂现蓝色，加终止液变黄。在450nm处测OD值，IL-4浓度与OD450值之间呈正比，可通过绘制标准曲线求出标本中IL-4的浓度。 试剂盒组成： 1．抗体预包被酶标板（8×12 或8×6） 2．冻干标准品（2 / 1 支；0.5ng/支） 3．标准品和标本稀释液（橙盖瓶）（1 瓶；20ml/12ml） 4．浓缩生物素化抗体（紫盖瓶）（1 支） 5．生物素化抗体稀释液（蓝盖瓶）（1 瓶；16ml/10ml） 6．浓缩酶结合物（棕盖瓶）（1 支） 7．酶结合物稀释液（紫盖瓶）（1 瓶；16ml/10ml） 8．浓缩洗涤液20×（白盖瓶）（1 瓶；50ml/25ml） 9．显色底物（TMB）（棕盖瓶）（1 瓶；12ml/6ml） 10．反应终止液（红盖瓶）（1 瓶；12ml/6ml） 11．封板胶纸（6/3 张） 12．产品说明书（1 份） 标本收集: 1. 收集血液的试管应为一次性的无热原，无内毒素试管。 2. 血浆抗凝剂推荐使用EDTA。避免使用溶血，高血脂标本。 3. 标本应清澈透明，悬浮物应离心去除。 4. 标本收集后若不及时检测，请按一次使用量分装，冻存于-20℃，-70℃电冰箱内，避免反复冻融，3-6月内检测。 5. 如果您的样本中检测物浓度高于标准品最高值，请根据实际情况，做适当倍数稀释(建议做预实验，以确定稀释倍数)。 注意事项: 1. 试剂盒使用前请保存在2-8℃。复溶后的标准品应分装后，将其放在-20～-70℃贮存。 2. 浓缩生物素化抗体，浓缩酶结合物体积小，运输中颠簸和可能的倒置，会使液体沾到管壁或瓶盖。因此使用前请用手甩几下或1000转/分离心1分钟，以使附着管壁或瓶盖的液体沉积到管底。取用前，请用移液器小心吹打4-5次使溶液混匀。
ELISA方法及基本原理
ELISA的概念、原理、操作步骤 ELISA是酶联接免疫吸附剂测定( Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay )的简称。它是继 免疫荧光和放射免疫技术之后发展起来的一种免疫酶技术。此项技术自70年代初问世以来，发展十分迅速，目前已被广泛用于生物学和医学科学的许多领域。 (一)原理 ELISA是以免疫学反应为基础，将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作 用相结合起来的一种敏感性很高的试验技术。 由于抗原、抗体的反应在一种固相载体──聚苯乙烯微量滴定板的孔中进行，每加入一种试剂孵育后，可通过洗涤除去多余的游离反应物，从而保证试验结果的特异性与稳定性。在实际应用中，通过不同的设计，具体的方法步骤可有多种。即：用于检测抗体的间接法(图a) 、用于检测抗原的双抗体夹心法(图b)以及用于检测小分子抗原或半抗原的抗原竞争法等等。比较常用的是ELISA双抗体夹心法及ELISA间接法。 (二) 操作步骤 方法一：用于检测未知抗原的双抗体夹心法: 1.包被：用0.05M PH9.牰碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1～10μg／ml。在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml，4℃过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟。(简称洗涤，下同)。 2. 加样：加一定稀释的待检样品0.1ml于上述已包被之反应孔中，置37℃孵育1小时。然后洗涤。(同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔)。 3.加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体(经滴定后的稀释度)0.1ml。37℃孵育0.5～1小时，洗涤。
4.加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃10～30分钟。 5. 终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。 6.结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。也可测OD值：在ELISA 检测仪上，于450nm(若以ABTS显色，则410nm)处，以空白对照孔调零后测各孔OD值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。 方法二：用于检测未知抗体的间接法：用包被缓冲液将已知抗原稀释至1～10μg／ml，每孔加0.1ml，4℃过夜。次日洗涤3次。加一定稀释的待检样品(未知抗体)0.1ml于上述已包被之反应孔中,置37℃孵育1小时,洗涤。(同时做空白、阴性及阳性孔对照)于反应孔中，加入新鲜稀释的酶标第二抗体(抗抗体)0.1ml，37℃孵育30-60分钟，洗涤,最后一遍用DDW 洗涤。 其余步骤同“双抗体夹心法”的4、5、6。 (三) 试剂器材 1. 试剂： (1) 包被缓冲液(PH9.6 0.05M碳酸盐缓冲液): NaCO31.59g, NaHCO32.93g加蒸馏水至1000ml； (2) 洗涤缓冲液(PH7.4 PBS)：0.15M KH2PO4 0.2g, Na2HPO4·12H2O 2.9g, NaCl 8.0g, KCl 0.2g Tween-20 0.05％0.5ml 加蒸馏水至1000ml (3) 稀释液:牛血清白蛋白(BSA) 0.1g 加洗涤缓冲液至100ml 或以羊血清、兔血清等血清与洗涤液配成5～10％使用。 (4) 终止液(2M H2SO4）：蒸馏水178.3ml，逐滴加入浓硫酸(98％)21.7ml。 (5) 底物缓冲液(PH5.0磷酸棗柠檬酸):0.2M Na2HPO4(28.4克／L) 25.7ml 0.1M 柠檬酸
ELISA实验原理
ELISA原理－－操作规则（新手适用） 酶联免疫吸附实验 ELISA 一．实验目的 酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay 简称ELISA）是在免疫酶技术（immunoenzymatic techniques）的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术,ELISA过程包括抗原（抗体）吸附在固相载体上称为包被，加待测抗体（抗原）, 再加相应酶标记抗体（抗原）,生成抗原（抗体）－－待测抗体（抗原）－－酶标记抗体的复合物，再与该酶的底物反应生成有色产物。借助分光光度计的光吸收计算抗体（抗原）的量。待测抗体（抗原）的定量与有色产生成正比。 二．实验原理 用于免疫酶技术的酶有很多，如过氧化物酶，碱性磷酸酯酶，β－Ｄ－半乳糖苷酶，葡萄糖氧化酶，碳酸酐酶，乙酰胆碱酯酶，6－磷酸葡萄糖脱氧酶等。常用于ELISA法的酶有辣根过氧化物酶，碱性磷酸酯酶等，其中尤以辣根过氧化物酶为多。由于酶摧化的是氧化还原反应，在呈色后须立刻测定，否则空气中的氧化作用使颜色加深，无法准确地定量。 辣根过氧化物酶（HRP）是一种糖蛋白，每个分子含有一个氯化血红素（protonhemin）区作辅基。酶的浓度和纯度常以辅基的含量表示。氯化血红素辅基的最大吸收峰是403nm，HRP酶蛋白的最大吸收峰是275nm，所以酶的浓度和纯度计算式是（已知HRP的A（1cm 403nm 1%）＝25，式中1％指HRP百分浓度为100ml含酶蛋白1g，即10mg/ml，所以，酶浓度以 mg/ml 计算是HRP的A （1cm 403nm mg/ml=2.5）HRP纯度（RZ）=A403nm/A275nm纯度RZ（Ｒeinheit Zahl）值越大说明酶内所含杂质越少。高纯度HRP的RZ值在3.0左右，最高可达3.4。用于ELISA检测的HRP的RZ值要求在3.0以上。
elisa的检测原理及步骤
Elisa Kit使用方法 检测原理: 本实验采用双抗体夹心ELISA法。抗人IL-4单抗包被于酶标板上，标本和标准品中的IL-4会与单抗结合，游离的成分被洗去。加入生物素化的抗人IL-4抗体和辣根过氧化物酶标记的亲和素。生物素与亲和素特异性结合；抗人IL-4抗体与结合在单抗上的人IL-4结合而形成免疫复合物，游离的成分被洗去。加入显色底物，若反应孔中有IL-4，辣根过氧化物酶会使无色的显色剂现蓝色，加终 止液变黄。在450nm处测OD值，IL-4浓度与OD450值之间呈正比，可通过绘制标准曲线求出标本中IL-4的浓度。 试剂盒组成： 1．抗体预包被酶标板（8×12 或8×6） 2．冻干标准品（2 / 1 支；0.5ng/支） 3．标准品和标本稀释液（橙盖瓶）（1 瓶；20ml/12ml） 4．浓缩生物素化抗体（紫盖瓶）（1 支） 5．生物素化抗体稀释液（蓝盖瓶）（1 瓶；16ml/10ml） 6．浓缩酶结合物（棕盖瓶）（1 支） 7．酶结合物稀释液（紫盖瓶）（1 瓶；16ml/10ml） 8．浓缩洗涤液20×（白盖瓶）（1 瓶；50ml/25ml） 9．显色底物（TMB）（棕盖瓶）（1 瓶；12ml/6ml） 10．反应终止液（红盖瓶）（1 瓶；12ml/6ml） 11．封板胶纸（6/3 张） 12．产品说明书（1 份） 标本收集: 1. 收集血液的试管应为一次性的无热原，无内毒素试管。 2. 血浆抗凝剂推荐使用EDTA。避免使用溶血，高血脂标本。 3. 标本应清澈透明，悬浮物应离心去除。 4. 标本收集后若不及时检测，请按一次使用量分装，冻存于-20℃，-70℃电冰 箱内，避免反复冻融，3-6月内检测。 5. 如果您的样本中检测物浓度高于标准品最高值，请根据实际情况，做适当倍 数稀释(建议做预实验，以确定稀释倍数)。 注意事项: 1. 试剂盒使用前请保存在2-8℃。复溶后的标准品应分装后，将其放在-20～-70℃贮存。 2. 浓缩生物素化抗体，浓缩酶结合物体积小，运输中颠簸和可能的倒置，会使 液体沾到管壁或瓶盖。因此使用前请用手甩几下或1000转/分离心1分钟，以使附着管壁或瓶盖的液体沉积到管底。取用前，请用移液器小心吹打4-5次使溶液混匀。 3. 从冰箱中取出的浓缩洗涤液可能有结晶,属于正常现象，微加热至40℃使结晶完全溶解后再配制洗涤液。（加热温度不要超过50℃）使用时洗涤液应为室温。 4. 若需要分次使用标准品应按照每一次用量分装，将其放在-20～-70℃贮存。 避免反复冻融。 5. 不同批号的试剂盒组份不能混用（洗涤液和反应终止液除外）。
elisa的检测原理及步骤说课材料
e l i s a的检测原理及 步骤
Elisa Kit使用方法 检测原理: 本实验采用双抗体夹心ELISA法。抗人IL-4单抗包被于酶标板上，标本和标准品中的IL-4会与单抗结合，游离的成分被洗去。加入生物素化的抗人IL-4抗体和辣根过氧化物酶标记的亲和素。生物素与亲和素特异性结合；抗人IL-4抗体与结合在单抗上的人IL-4结合而形成免疫复合物，游离的成分被洗去。加入显色底物，若反应孔中有IL-4，辣根过氧化物酶会使无色的显色剂现蓝色，加终止液变黄。在450nm处测OD值，IL-4浓度与OD450值之间呈正比，可通过绘制标准曲线求出标本中IL-4的浓度。 试剂盒组成： 1．抗体预包被酶标板（8×12 或 8×6） 2．冻干标准品（2 / 1 支；0.5ng/支） 3．标准品和标本稀释液（橙盖瓶）（1 瓶；20ml/12ml） 4．浓缩生物素化抗体（紫盖瓶）（1 支） 5．生物素化抗体稀释液（蓝盖瓶）（1 瓶；16ml/10ml） 6．浓缩酶结合物（棕盖瓶）（1 支） 7．酶结合物稀释液（紫盖瓶）（1 瓶；16ml/10ml） 8．浓缩洗涤液 20×（白盖瓶）（1 瓶；50ml/25ml） 9．显色底物（TMB）（棕盖瓶）（1 瓶；12ml/6ml） 10．反应终止液（红盖瓶）（1 瓶；12ml/6ml） 11．封板胶纸（6/3 张） 12．产品说明书（1 份）
标本收集: 1. 收集血液的试管应为一次性的无热原，无内毒素试管。 2. 血浆抗凝剂推荐使用EDTA。避免使用溶血，高血脂标本。 3. 标本应清澈透明，悬浮物应离心去除。 4. 标本收集后若不及时检测，请按一次使用量分装，冻存于-20℃，-70℃电冰箱内，避免反复冻融，3-6月内检测。 5. 如果您的样本中检测物浓度高于标准品最高值，请根据实际情况，做适当倍数稀释(建议做预实验，以确定稀释倍数)。 注意事项: 1. 试剂盒使用前请保存在2-8℃。复溶后的标准品应分装后，将其放在-20～-70℃贮存。 2. 浓缩生物素化抗体，浓缩酶结合物体积小，运输中颠簸和可能的倒置，会使液体沾到管壁或瓶盖。因此使用前请用手甩几下或1000转/分离心1分钟，以使附着管壁或瓶盖的液体沉积到管底。取用前，请用移液器小心吹打4-5次使溶液混匀。 3. 从冰箱中取出的浓缩洗涤液可能有结晶,属于正常现象，微加热至40℃使结晶完全溶解后再配制洗涤液。（加热温度不要超过50℃）使用时洗涤液应为室温。 4. 若需要分次使用标准品应按照每一次用量分装，将其放在-20～-70℃贮存。避免反复冻融。 5. 不同批号的试剂盒组份不能混用（洗涤液和反应终止液除外）。
2021年elisa的检测原理及步骤
Elisa Kit使用方法 欧阳光明（2021.03.07） 检测原理: 本实验采用双抗体夹心ELISA法。抗人IL-4单抗包被于酶标板上，标本和标准品中的IL-4会与单抗结合，游离的成分被洗去。加入生物素化的抗人IL-4抗体和辣根过氧化物酶标记的亲和素。生物素与亲和素特异性结合；抗人IL-4抗体与结合在单抗上的人IL-4结合而形成免疫复合物，游离的成分被洗去。加入显色底物，若反应孔中有IL-4，辣根过氧化物酶会使无色的显色剂现蓝色，加终止液变黄。在450nm处测OD值，IL-4浓度与OD450值之间呈正比，可通过绘制标准曲线求出标本中IL-4的浓度。 试剂盒组成： 1．抗体预包被酶标板（8×12 或 8×6） 2．冻干标准品（2 / 1 支；0.5ng/支） 3．标准品和标本稀释液（橙盖瓶）（1 瓶；20ml/12ml） 4．浓缩生物素化抗体（紫盖瓶）（1 支） 5．生物素化抗体稀释液（蓝盖瓶）（1 瓶；16ml/10ml） 6．浓缩酶结合物（棕盖瓶）（1 支） 7．酶结合物稀释液（紫盖瓶）（1 瓶；16ml/10ml） 8．浓缩洗涤液 20×（白盖瓶）（1 瓶；50ml/25ml） 9．显色底物（TMB）（棕盖瓶）（1 瓶；12ml/6ml） 10．反应终止液（红盖瓶）（1 瓶；12ml/6ml）
11．封板胶纸（6/3 张） 12．产品说明书（1 份） 标本收集: 1. 收集血液的试管应为一次性的无热原，无内毒素试管。 2. 血浆抗凝剂推荐使用EDTA。避免使用溶血，高血脂标本。 3. 标本应清澈透明，悬浮物应离心去除。 4. 标本收集后若不及时检测，请按一次使用量分装，冻存于-20℃，-70℃电冰箱内，避免反复冻融，3-6月内检测。 5. 如果您的样本中检测物浓度高于标准品最高值，请根据实际情况，做适当倍数稀释(建议做预实验，以确定稀释倍数)。 注意事项: 1. 试剂盒使用前请保存在2-8℃。复溶后的标准品应分装后，将其放在-20～-70℃贮存。 2. 浓缩生物素化抗体，浓缩酶结合物体积小，运输中颠簸和可能的倒置，会使液体沾到管壁或瓶盖。因此使用前请用手甩几下或1000转/分离心1分钟，以使附着管壁或瓶盖的液体沉积到管底。取用前，请用移液器小心吹打4-5次使溶液混匀。 3. 从冰箱中取出的浓缩洗涤液可能有结晶,属于正常现象，微加热至40℃使结晶完全溶解后再配制洗涤液。（加热温度不要超过50℃）使用时洗涤液应为室温。 4. 若需要分次使用标准品应按照每一次用量分装，将其放在-20～-70℃贮存。避免反复冻融。 5. 不同批号的试剂盒组份不能混用（洗涤液和反应终止液除外）。
elisa酶联免疫吸附实验报告
elisa酶联免疫吸附实验报告 一．实验目的 酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay 简称ELISA）是在免疫酶技术（immunoenzymatic techniques）的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术,ELISA过程包括抗原（抗体）吸附在固相载体上称为包被，加待测抗体（抗原）, 再加相应酶标记抗体（抗原）,生成抗原（抗体）－－待测抗体（抗原）－－酶标记抗体的复合物，再与该酶的底物反应生成有色产物。借助分光光度计的光吸收计算抗体（抗原）的量。待测抗体（抗原）的定量与有色产生成正比。 二．实验原理 用于免疫酶技术的酶有很多，如过氧化物酶，碱性磷酸酯酶，β－Ｄ－半乳糖苷酶，葡萄糖氧化酶，碳酸酐酶，乙酰胆碱酯酶，6－磷酸葡萄糖脱氧酶等。常用于ELISA法的酶有辣根过氧化物酶，碱性磷酸酯酶等，其中尤以辣根过氧化物酶为多。由于酶摧化的是氧化还原反应，在呈色后须立刻测定，否则空气中的氧化作用使颜色加深，无法准确地定量。
辣根过氧化物酶（HRP）是一种糖蛋白，每个分子含有一个氯化血红素（protonhemin）区作辅基。酶的浓度和纯度常以辅基的含量表示。氯化血红素辅基的最大吸收峰是403nm，HRP酶蛋白的最大吸收峰是275nm，所以酶的浓度和纯度计算式是（已知HRP的A（1cm 403nm 1%）＝25，式中1％指HRP百分浓度为100ml 含酶蛋白1g，即10mg/ml，所以，酶浓度以mg/ml 计算是HRP的A（1cm 403nm mg/ml=2.5）HRP纯度（RZ）=A403nm/A275nm纯度RZ（Ｒeinheit Zahl）值越大说明酶内所含杂质越少。高纯度HRP的RZ值在3.0左右，最高可达3.4。用于ELISA检测的HRP的RZ值要求在3.0以上。 ELISA的基本原理有三条： （1）抗原或抗体能以物理性地吸附于固相载体表面，可能是蛋白和聚苯乙烯表面间的疏水性部分相互吸附，并保持其免疫学活性； （2）抗原或抗体可通过共价键与酶连接形成酶结合物，而此种酶结合物仍能保持其免疫学和酶学活性；（3）酶结合物与相应抗原或抗体结合后，可根据加入底物的颜色反应来判定是否有免疫反应的存在，而且颜色反应的深浅是与标本中相应抗原或抗体的量成正比例的，因此，可以按底物显色的程度显示试验结果。ELISA法是免疫诊断中的一项新技术，现已成功地应用于多种病原微生物所引起的传染病、寄生虫病及非传染病等方面的免疫诊断。也已应用于大分子抗原和小分子抗原的定量测定，根据已经使用的结果，认为