暨南大学分子生物学实验报告
EGFP基因在大肠杆菌DH-5α中表达
[摘要]EGFP是增强绿色荧光蛋白基因，利用质粒pEGFP－N1通过PCR扩增其中的EGFP目的基因，使其与从E.coli DH-5α提取的表达载体pUC18进行双酶切。酶切产物进一步纯化后，将其连接成pUC18- EGFP重组质粒。把重组后的质粒转化进E.coli DH-5α感受态细胞中。通过蓝白斑实验筛选出重组转化子，提取质粒进行EcoRI和BamHI双酶切后的电泳鉴定是否为成功克隆的重组转化子。最后在重组成功的E.coli DH-5α中诱导EGFP表达，并进行Western blotting转膜分析。
[关键词] EGFP ；E.coli DH-5α；pUC18；表达；Western blot ting
目录
1 实验目的与设计原理 (5)
1.1实验目的 (5)
1.2目的基因 (5)
1.3载体 (5)
1.4设计原理 (6)
1.5分步原理 (7)
1.5.1 质粒DNA制备 (7)
1.5.2 琼脂糖凝胶电泳 (8)
1.5.3 聚合酶链式反应 (8)
1.5.4 靶DNA的纯化、靶DNA和载体DNA的酶切插入 (9)
1.5.5 载体pUC18与EGFP基因片段的连接重组DNA的转化 (10)
1.5.6 大肠杆菌感受态细胞制备重组子的筛选与鉴定 (10)
1.5.7 重组DNA的转化 (11)
1.5.8 重组DNA的筛选与鉴定 (11)
1.5.9 Western blotting转膜分析 (12)
2 实验材料与设备 (13)
2.1仪器与器皿 (13)
2.2菌株与质粒 (13)
2.3试剂 (14)
3 实验步骤 (17)
3.1质粒DNA的提取和琼脂糖凝胶电泳法 (17)
3.1.1 质粒DNA的提取 (17)
3.1.2 质粒DNA的琼脂糖凝胶检测 (17)
3.2PCR扩增目的基因EGFP (18)
3.3目的基因的纯化、目的基因和载体的连接 (18)
3.3.1 PCR产物的纯化 (18)
3.3.2 DNA样品的酶切 (19)
3.4酶切产物的纯化及载体P UC18和EGFP基因片段的连接 (20)
3.4.1 酶切产物的纯化 (20)
3.4.2 靶片段和载体片段的连接 (20)
3.5培养基的配制 (20)
3.6感受态细胞的制备和连接液的转化 (21)
3.7重组子的筛选与鉴定 (22)
3.7.1 重组质粒制备 (22)
3.7.2 重组质粒的酶切与检测 (22)
3.7.3 重组菌划平板 (22)
3.8目标蛋白在E.coli中的表达和重组蛋白的Western blotting转膜分析 (23)
3.8.1 EGFP在DH5α宿主中的诱导表达和提取 (23)
3.8.2 SDS－PAGE (23)
4 实验结果 (26)
4.1质粒DNA的提取和琼脂糖凝胶电泳法 (26)
4.2PCR扩增目的基因EGFP (26)
4.3目的基因的纯化、目的基因和载体的连接 (27)
4.4酶切产物的纯化及载体P UC18和EGFP基因片段的连接 (28)
4.5感受态细胞的制备和连接液的转化 (28)
4.6重组子的筛选与鉴定 (29)
4.7目标蛋白在E.coli中的表达和重组蛋白的Western blotting转膜分析 (30)
5 讨论 (32)
5.1质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳 (32)
5.2PCR扩增目的基因EGFP (32)
5.3重组子的筛选与鉴定 (32)
5.4Western blotting转膜分析 (32)
结论 (33)
致谢 (33)
1实验目的与设计原理
1.1实验目的
将质粒pEGFP－N1的绿色荧光蛋白基因EGFP亚克隆到质粒pUC18中，再把重组的pUC18导入大肠杆菌DH-5α中使EGFP进行克隆和表达，由此将分子生物学的一些最基本的实验技术包含在整个实验过程中目的基因。
1.2目的基因
目的基因EGFP为pEGFP－N1中的一段序列，是一段绿色荧光蛋白基因。可通过引物18F－E（sense）和18A－2（anti－sense）扩增pEGFP－N1中的EGFP基因。
上游引物18F－E:5? CGG GAATTC G ATG GTG AGC AAG GGC GAG GAG 3?31mer
EcoRI EGFP基因起始区域
下游引物18A－2:5’TCG GGATCC TTA CTT GTA CAG CTC GTC CAT GC 3’32mer
BamHI EGFP基因终止区域
扩增产物的序列如下所示[蓝色序列分别为EcoRI（G↓AATTC）和BamHI（G↓GATCC）位点，红色序列为EGFP基因的起始和终止密码，带下划线的序列是引物配对区域。]：
5?CGG GAATTC G ATG GTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCC ATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCG AGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCAC CGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTG CAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCG CCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAA CTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATC GAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTG GAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACG GCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCT CGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCC GACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAG CGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCAT GGACGAGCTGTACAAG TAA GGATCC CGA 3?
1.3载体
选择大肠杆菌pUC18作为载体，质粒分子量为2.7Kb。
图1-1 pUC18质粒图谱
质粒主要由Ampr基因、复制起始序列ori和lacZ－α肽基因等序列组成，lacZ－α肽基因的N端含有多克隆位点。外源基因在多克隆位点插入后可用传统的蓝白筛选法识别重组子，靶基因可在lac启动子下表达，插入片段的阅读框与lacZ－α肽基因的阅读框一致时能进行融合表达
图1-2 pUC18多克隆位点
1.4设计原理
用引物18F－E（sense）和18A－2（anti－sense）扩增pEGFP－N1中的EGFP基因，扩增产物纯化后除去引物和Taq等杂物，然后用EcoRI（G↓AATTC）和BamHI（G↓GATCC）双酶切，同时载体pUC18也进行相同的双酶切。载体和靶基因的酶切液分别纯化除去小片段，再进行连接克隆，利用lacZ’的起始密码进行表达，所表达的荧光蛋白的N端有一段由7个氨基酸残基（Thr Met Ile Thr Asn Ser Met—EGFP）组成的融合肽，分子量约28K。
图1-3 重组质粒的构建
1.5分步原理
1.5.1质粒DNA制备
细菌悬浮液暴露在高pH值的强阴离子洗涤剂（如NaOH和SDS）中，会使细胞壁破裂，染色体DNA和蛋白质变性，将质粒DNA释放到上清中。尽管碱性溶剂使碱基配对完全破坏，闭环的质粒DNA双链仍不会彼此分离，这因为他们在拓扑学上是相互缠绕的（超螺环结构）。只要碱处理的强度和时间不要太过，当pH值恢复到中性时，DNA双链就会再次形成。
在裂解过程中，细菌蛋白质、破裂的细胞壁和变性的染色体DNA会相互缠绕成大型复合物，后者被SDS包盖。当用钾离子取代钠离子时，这些复合物会从溶液中有效地沉淀下来。离心除去沉淀，就可以从上清中回收复性的质粒DNA。
在较低pH值和高盐浓度环境下，DNA能与硅胶（Silica gel）可逆结合。DNA双链与硅化材料相互作用的原理普遍认为是DNA分子中磷酸二酯键在较低pH值和高盐浓度环境下脱水，使得暴露的磷酸基团吸附硅胶。双链的DNA分子一旦被硅胶吸附，则以天然状态或部分变性状态存在，不能用洗脱RNA或碳水化合物等生物大分子的溶剂（如70％乙醇）将其洗脱下来。但是，经过水溶性缓冲液（通常为TE或水）重新水化
后，DNA就能从层析柱上定量回收。
1.5.2琼脂糖凝胶电泳
在高于等电点的pH溶液中，DNA分子带负电荷（由于糖一磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷），在电场中向正极移动。在一定的电场强度下，DNA分子在凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应，迁移速度取决于DNA分子本身的大小和构型，与相对分子质量的对数值成反比关系。
质粒有三种构型：①超螺旋的共价闭台环状质粒DNA(covalent closed circular DNA，简称cccDNA)；②开环质粒DNA，即共价闭合环状质粒DNA的一条单链断裂(open circular DNA，简称ocDNA)；③线状质粒DNA，即共价闭合环状质粒DNA 的两条单链均发生断裂(liner DNA，简称lDNA)。这三种构型的质粒DNA分子在凝胶电泳中的迁移率不同。因此电泳后呈3条带，超螺旋质粒DNA泳动最快，其次为线状DNA，最慢的为开环质粒DNA。
凝胶中DNA的位置可以用低浓度荧光插入染料如溴化乙锭或SYBR Gold染色直接观察到，甚至含量少至20pg的双链DNA在紫外线激发下，也能直接检测到。
电泳条件主要取决于被分离的DNA片段的大小。聚丙烯酰胺凝胶最适合分离小片段DNA(5～500bp)。它的分辨率非常强，长度上相差lbp或质量上相差0.1％的DNA都可以彼此分离。虽然它能很快地进行电泳，并能容纳较大的DNA上样量，但是与琼脂糖凝胶相比在制备和操作上还是更繁琐些。聚丙烯酰胺凝胶电泳是在恒定电场中垂直方位上进行的。
琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳是分子克隆的核心技术之一，它用于分离、鉴定和纯化DNA片段。该技术操作简单而迅速，并且能分离用其他方法如密度梯度离心等不能满意分离的DNA片段。此外，凝胶中DNA的位置可以用低浓度荧光插入染料如溴化乙锭或SYBR Gold染色直接观察到，甚至含量少至20pg的双链DNA在紫外线激发下，也能直接检测到。需要的话，这些分离的DNA条带可以从凝胶中回收，用于各种各样的目的。
1.5.3聚合酶链式反应
PCR（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶链式反应以两种与靶DNA两侧的两条链杂交的寡核苷酸为引物，经酶促合成特异DNA片段，由高温变性，低温退火和适温延伸等几步反应组成一个循环，然后反复进行，使目的的DNA得以迅速扩增，主要过程如。置待扩增DNA于高温下解链成为单链DNA模板；人工合成的两个寡核苷酸引物在低温条件下分别与目的片段两侧的两条链互补结合，在72℃条件下由DNA聚合酶进行聚合反应，将单核苷酸加到引物3'，按碱基配对原则5'→3'方向延伸，合成DNA新链。由于每一循环所产生的DNA均能成为下一次循环的模板，所以PCR产物以指数方式增加，经25—30次周期之后，理论上可增加109倍，实际上可增加107倍。
图1-4 PCR原理
1.5.4靶DNA的纯化、靶DNA和载体DNA的酶切插入
核酸限制性内切酶能够识别和切割DNA双链上特定的碱基顺序，如EcoRⅠ限制酶的识别和切割序列是：
5 ’…G↓A—A—T—T—C…3 ’
3 ’…C—T—T—A—A↑G…5 ’
因此，用EcoRⅠ酶切环状双链DNA分子，所产生DNA片段两端都有突出的5’AATT末端（粘性末端）。
BamHⅠ的识别和切割序列为：G↓GATCC，所产生片段的粘性末端为5?GATC。
限制性内切酶作用于底物DNA时，受到许多要素的制约，主要有以下几个：
1. 底物DNA样品的纯度：在制备DNA样品中，由于各种条件的影响，存在着一些非DNA物质，这些物质有的对酶切反应影响较大，如抽提过程中有机物质的残留成份酚、氯仿、酒精，都会破坏酶的活性，另外未除去的蛋白质，也会干扰酶的反应，残留的染色体DNA则会相对降低酶对底物DNA的浓度。
2. 离子浓度：限制性核酸内切酶的专一性需要镁离子作为辅基，并且要求一定的盐离子浓度。在使用上，通常把限制性核酸内切酶对盐离子的要求分为三类：高盐、中盐和低盐，它们所需的Na+分别为100mmol/L、50mmol/L和0。如果离子浓度使用不当，酶反应不完全或会使酶的识别位点发生改变，例如高盐类的EcoRI酶当Na+离子浓度低
于50mmol/L时，它的专一性就降低。只能识别中间的4个核苷酸序列（此活性记为EcoRI*）
当要进行双酶切时，如果两种酶所需的盐浓度近似，可尝试同时进行酶切，如所需盐浓度差别过大，则先进行低盐酶切，然后在进行高盐酶切。试验表明，本实验可同时进行双酶切。
3. 底物DNA的量：商品限制性内切酶以酶单位计算，一个酶单位的定义是：在规定的温度和缓冲液内，于20微升反应液内1小时完全消化1微克DNA所需要的酶量。所以若果底物DNA的量超过酶的酶单位所规定的消化量，则反应不能完全。不过商品酶多是浓溶液，每微升常含10单位以上，价格昂贵，所以使用时要尽量节省。
4. 酶反应温度与酶反应终止：大部分限制性核酸内切酶最适的反应温度在37℃，极个别在60℃，所以酶反应后要使酶的活性失活时，可把反应液置于65℃内保温10—15分钟，以终止酶反应，但此法对个别酶（最适温度在60℃的酶）不适合。
5. 酶反应时间：酶消化时间通常依酶的浓度，底物的浓度和纯度而定，通常是30分钟到2个小时，甚至更长些，但不能过长。因为商品酶极有可能含有杂酶，时间过久，微量的杂酶的酶反应也会积累到干扰整个酶反应的程度。
PCR产物中，含有Taq DNA多聚酶、大量引物及其它杂物，它们会干扰酶切反应。Taq DNA多聚酶是耐高温的，难以用高温灭活，在酶切体系中将严重干扰酶切反应，如它可补平5’粘性末端等等，因此在酶切反应前一定要将其除去；大量引物的存在可能形成引物二聚体，它们与靶DNA争夺内切酶等，也严重干扰酶切反应。因此，在酶切反应前，一般要纯化PCR产物，将Taq DNA多聚酶和引物及其它杂物除去。
本实验采用试剂盒纯化，然后用EcoRI和BamHI对纯化的PCR产物和pUC18分别进行双酶切。
1.5.5载体pUC18与EGFP基因片段的连接重组DNA的转化
在体外用EcoRI与BamHI两种酶切割pUC18载体与靶DNA，所得片段的两端均含有不同的粘性末端，将载体片段与靶片段混合后，相同的粘性末端之间可以由氢键相连接，但在两个氢键相连的片段之间5，磷酸和3，羟基未能连上，仍有缺口，本实验通过T4DNA连接酶反应，把这些缺口以共价键连接起来，构成完整的嵌合质粒。
T4DNA连接酶：是由T4噬菌体DNA编码的酶，可以连接双链分子中3，羟基和5，磷酸，补上其缺口。它的作用步骤如下：
1. T4DNA连接酶与辅助因子ATP形成酶—AMP复合物（腺苷酰酶）。
2. 酶一AMP复合物再结合到具有5’一磷酸基和3’一羟基切口的DNA上，使
DNA腺苷化。
3. 产生一个新的磷酸二酯键，把缺口封起来
1.5.6大肠杆菌感受态细胞制备重组子的筛选与鉴定
目前对感受态细胞的转化理论尚未有统一结论，但是许多实验室一直进行探索，试图从实验中获得明确回答。有人根据pBR322质粒DNA对E?coli K——12X1776菌株的转化结果，认为：
1. 大肠杆菌受体菌培养时间为OD600=0.3～0.4（5～6 107细胞/毫升）最好；
2. 菌体用预冷的CaCl2洗涤二次，效果较好；
3. 100mmol/LCaCl2处理可获得最高转化率；
4. 菌体在pH为6.0的溶液悬浮时最为适宜。
5. 经CaCl2处理过的细胞对表面活性剂非常敏感，所用的玻璃离心管等用具必须严格清洗。
近来，在许多研究室都发现CaCl2对受体菌处理，可提高转化效率几十倍，通常把细胞悬浮在pH6.0的100mmol/L CaCl2中，在冰浴条件下，放置过夜，转化率转高，但一过24小时，转化率测恢复为原来的水平。
1.5.7重组DNA的转化
实验是把外来重组分子和感受态细胞在低温下混合，使其进入受体细胞。DNA分子转化的原理较复杂：
1.吸附——完整的双链DNA分子吸附在受体菌表面；
2.转入——双链DNA分子解链，单链DNA分子进入受体菌，另一链降解；
3.自稳——外源质粒DNA分子在细胞内又复制成双链环状DNA；
4.表达——供体基因随同复制子同时复制，并被转录和翻译。
pUC18上带有β-半乳糖苷酶基因(lacZ)的调控序列和β-半乳糖苷酶N端146个氨基酸的编码序列。这个编码区中插入了一个多克隆位点,但并没有破坏lacZ的阅读框架,不影响其正常功能。
在各自独立的情况下, pUC18和DH5α编码的β-半乳糖苷酶的片段都没有酶活性，但在pUC18转化进入DH5α后，pUC18和DH5α分别产生的β-半乳糖苷酶的N端片段和C端片段融为一体，可形成具有酶活性的蛋白质，这种lacZ基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的β-半乳糖苷酸阴性突变体之间实现互补的现象叫α-互补。
由α-互补产生的Lac＋细菌较易识别，当培养基中加入适量的生色底物X-gal(5-溴-4氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)和IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)时，IPTG诱导质粒和染色体上的相应的lacZ操纵子，分别表达β-半乳糖苷酶N端多肽和C端多肽，产生有活性的β-半乳糖苷酶，水解X-gal形成蓝色菌落(但本实验所用的受体菌DH5α可能为lacI—，无需IPTG诱导)。当外源片段EGFP插入到pUC18质粒的多克隆位点上后会导致读码框架改变, 表达蛋白失活, 产生的N端多肽失去α-互补能力, 因此在同样条件下含重组质粒的转化子在生色诱导培养基上只能形成白色菌落。由此可将重组质粒与自身环化的载体DNA分开。此为α-互补现象筛选。
因此，外源基因EGFP插入pUC18的多克隆位点的转化子在含有Ap、X－gal和IPTG 的LB平板上形成白色菌落，多克隆位点无外源片段插入的载体所产生的转化子是蓝色的，对Amp敏感的非转化子受体菌在加Ap的皿上不能形成菌落。
1.5.8重组DNA的筛选与鉴定
蓝白斑实验中的白色菌落并不一定就是我们所需的重组克隆。连接反应时，特别是当反应液中未除尽各种含相同末端的小片段时，各种片段之间的连接的可能性相当多，连接液电泳时形成很多条带。所以选择性培养基上长出的白色菌落可以认为是重组转化子，但很可能不是我们所要的重组子，极可能是假阳性菌落。
对这些白色菌落，需要提取其质粒、EcoRI和BamHI双酶切质粒、酶切产物再进行凝胶电泳作进一步鉴定，看看电泳图谱是否与预期的图谱相符，即白色菌落如果是成功
克隆的转化子，其电泳图谱中应出现两条带，大小分别为2675bp和727bp。如果与预期相符，则可初步认为新构建的质粒已基本重组成功。普通克隆实验时，一般需通过DNA 测序来进一步确认，并检测重组质粒所表达的蛋白质来最终确认。
1.5.9Western blotting转膜分析
Western blotting一般由凝胶电泳、样品的印迹和固定化、各种灵敏的检测手段如抗体、抗原反应等三大实验部分组成。
第一步：凝胶电泳，通常将蛋白质进行SDS聚丙烯酰胺平板凝胶电泳。蛋白质与SDS结合后，均带有负电荷，在电场下，按相对分子质量大小在板状胶上排列。
第二步：印迹和固定化。把凝胶电泳已分离的分子区带转移并固定到一种特殊的载体上，使之形成稳定的、经得起各种处理并容易检出的，即容易和各自的特异性配体结合的固定化生物大分子。现用得最多的载体材料为硝酸纤维素膜(NC膜)和一种尼龙衬底的膜(ZB膜)，本实验用PVDF（聚偏氟乙烯）膜，它们和生物大分子都是非共价结合。
第三步：特异性谱带的检出。印迹在载体上的特异抗原的检出依赖于抗原、抗体的亲和反应。即将酶、荧光素或同位素标记的特异蛋白分别偶联在特异性抗体的二抗上，再分别用底物直接显色，测荧光，放射自显影等方法检测出我们感兴趣的抗原。如果无合适抗体用来检测抗原时，可用一般的蛋白染料如丽春红、考马斯亮蓝等，检测转移到膜上的蛋白，验证转移是否成功。
2实验材料与设备
2.1仪器与器皿
高速离心机、微量移液器、1.5mL EP管、琼脂糖凝胶电泳系统、凝胶成像仪或紫外检测仪、PRC扩增仪（PE2400）、微量取样器、一次性指形管、玻片等、电子天平、微波炉、恒温水浴器、手术刀、移液枪（20μL、200μL、1000μL）、三角瓶（100mL）、吸管、离心柱、灭菌锅、生化培养箱、冰箱、保温瓶、恒温振荡器、分光光度计、电动沉淀离心机、旋涡混合器、电热恒温水浴锅、恒温摇床、平皿、涂布棒微量取样器、微波炉、试管、刻度离心管、保温瓶、酒精灯、平板电泳槽及配套的玻璃板、胶条和梳子(北京六一仪器厂DYCZ－24)，普通恒压恒流电泳仪、高电流电泳仪（500mA以上），电泳转移槽及转移夹，海棉块，滤纸，水平摇床等。
2.2菌株与质粒
菌株
E.coli DH-5α
质粒
pEGFP－N1
pUC18
工具酶规格公司
TaqDNA多聚酶5U/μL TaKaRa
限制性内切酶TaKaRa
EcoRⅠ酶
BamHⅠ酶
T4DNA连接酶
2.3试剂
1）E.Z.N.A.TM Plasmid Mini Kit(OMEGA)：
①HiBindDNA结合柱
②2mL Microfuge Tube
③Solution Ⅰ／RNaseA混和液（葡萄糖维持渗透压、Tris－HCl维持pH值、EDTA 抑制核酸酶、RNaseA1降解RNA）
④Solution Ⅱ（NaOH裂解细胞与核酸变性、SDS裂解细胞与蛋白质变性）
⑤Solution Ⅲ（乙酸钾置换钠离子、冰乙酸调节pH值）
⑥HB Buffer（乙酸钠洗脱蛋白质、糖类等大分子杂质）
⑦DNA Wash Buffer（70％乙醇洗脱盐离子）
⑧Elution Buffer（TE pH8.5 洗脱质粒DNA）
2）LB完全培养基（1%蛋白胨0.5%酵母粉0.5%NaCl pH7.5）
3）100mg/mL氨苄青霉素溶液
4）电泳缓冲液TAE：0.04mol/L Tris—乙酸（pH8.0）和0.001mol/L EDTA
5）6×加样缓冲液：0.25%溴酚兰和40% w蔗糖
6）溴化乙锭溶液：5mg/mL溴化乙锭（EB）
7）琼脂糖
8）DNA分子量标记
9）10×PCR缓冲液：100 mmol/L Tris-HCl（pH8.3）、500 mmol/L KCl 、15 mmol/L MgCl2
10）dNTP混合液(dATP dGTP dTTP dCTP各2.5mmol/L)
11）无菌水
12）酶切缓冲液：10×K buffer
13）纯化试剂盒(E.Z.N.A. Cycle-Pure Kit)：
a．HiBindTM DNA Mini Columns
b. 2mL Collection Tubes
c. Buffer CP
d．DNA Wash Buffer
e．Elution Buffer
14）10×T4连接缓冲液
15）LB液体培养基（1%蛋白胨0.5%酵母粉1%NaCl pH7.5）
16) 100mmol/ L CaCl2
17) 氨苄青霉素溶液（100毫克/毫升）
18) X-gal储液(20mg/mL): 用二甲基甲酰胺溶解X-gal配制成20mg/mL的储液, 包以铝箔或黑纸以防止受光照被破坏, 储存于-20℃。
19) IPTG储液(20mg/mL,即0.8M): 在800μL蒸馏水中溶解20mg IPTG后,用蒸馏水定容至1mL,用0.22μm滤膜过滤除菌，分装于eppendorf管并储于-20℃.
20) 含X-gal、IPTG和100μg/mL Ap的LB固体培养基4皿。
21) 0.5M IPTG溶液
22) 20%（m）SDS
23）5×SDS-PAGE 电极缓冲液(125mM Tris, 1.25M 甘氨酸, 0.5%SDS)
24）1×SDS-PAGE 电极缓冲液(25mM Tris, 0.25M 甘氨酸, 0.1%SDS)
25）4×分离胶缓冲液
26）4×浓缩胶缓冲液100mL
27）30%丙烯酰胺贮存液100mL
28）1.0M Tris-Cl（pH6.8）
29）1×SDS上样缓冲液[0.05M Tris-Cl（pH6.8），10%甘油，2%SDS，0.25%溴酚蓝] 30）10%（m）过硫酸铵：
31）TEMED：购买，4°C冰箱中避光储存；
32）预染Blue Plus ⅡProtein Marker：购自TRANS。
33）5×Tris-甘氨酸电转缓冲液储存液(125mM Tris, 0.96M甘氨酸，无SDS和甲醇) 34）1×电转缓冲液（25mM Tris,192mM甘氨酸，0.08%SDS, 20%甲醇，用于15-60Kd 蛋白质)。
35）5×PBS (5.5mM NaH2PO4，44.4mM Na2HPO4，4.5%NaCl)
36）10% Tween-20
37）1×PBS-Tween-20洗膜及抗体稀释液[1.1mM NaH2PO4，8.88mM Na2HPO4，0.05%Tween-20
38）抗体稀释液及封闭液
39）兔抗GFP的特异性抗体（一抗）溶液30mL 40）辣根过氧化物酶（HRP）标记羊抗兔二抗溶液41）显色液
3实验步骤
3.1质粒DNA的提取和琼脂糖凝胶电泳法
3.1.1质粒DNA的提取
1.用接种棒取一环保存的含pUC18质粒的大肠杆菌DH-5α在LB完全培养基斜面上（含Amp100μg/mL）接种，37℃培养过夜，活化菌株。
2.在5毫升LB培养液中，用微量进样器加入5微升100mg/mL氨苄青霉素溶液。同时接入已活化的含pUC18质粒的大肠杆菌DH-5α一环，37℃援床培养过夜。
3.取250微升100mg/mL氨苄青霉素溶液于250毫升LB培养液中，然后取2.5毫升过夜培养物转接进去（1%接种量），37℃摇床培养过夜。
4.第二天用1.5mL EP管收集细胞：取菌液1.5 mL于离心管中10,000 rpm离心1min，弃尽上清，重复收集二次（共4.5mL菌液），将管口倒置在纸巾上，轻轻敲击，使上清流出，管壁上不应有残留上清。
5.用手指弹击管底，使菌体松散（加液前一定要使菌体散开，否则加液后很难混匀，影响菌体裂解，降低产量。），然后加入250μL Solution Ⅰ／RNaseA混和液，混匀。
6．往重悬混和液中加入250μL Solution Ⅱ，轻轻颠倒混匀4—6次。此操作避免剧烈混匀裂解液且裂解反应不要超过5 min。
7．加入350μL Solution Ⅲ，温和颠倒数次至形成白色絮状沉淀。
8．室温下，≥10000×g离心l0min。若离心后上清液仍有未离心干净的白色絮状物，可重复离心除去絮状物以提高产品纯度。
9．转移上清液至套有2mL收集管的HiBindDNA结合柱中，室温下，10000×g离心lmin，倒去收集管中的滤液。
10. 把柱子重新装回收集管，加入500μl HB Buffer，按上述条件离心，弃去滤液。
11．把柱子重新装回收集管，加入700μl DNA Wash Buffer，按上述条件离心，弃去滤液。
12.(可选)弃去滤液，重复第11步骤一次。
13．弃去滤液，把柱子重新装回收集管，10000×g离心空柱2min以甩干柱子基质。
14．把柱子装在干净的1.5mL离心管上，加入50μL Elution Buffer(TE buffer 或ddH2O)到柱子基质中，静止1－2分钟，10000×g离心lmin洗脱出DNA。
3.1.2质粒DNA的琼脂糖凝胶检测
1．胶板的准备：取有机玻璃内槽、样品梳子洗净，晾干，用大透明胶布将机玻璃内槽的两端边缘封好（一定封严，不能留缝隙）。
2．将有机玻璃内槽置于水平位置，并放好梳子。
3．0.8%琼脂糖凝胶液配置：称取0.32g琼脂糖,放入三角瓶中，加入40mL TAE电泳缓冲液，置微波炉中加热至完全溶化，取出摇匀，加0.1mL 5mg/mL溴化乙锭。
4．倒胶：将冷却至60℃左右（不烫手即可）的凝胶液慢慢倒入有机玻璃内槽（注意不要有气泡，若有则用吸管吸走）。等胶凝固后，小心取出梳子，取下两侧透明胶布，
放入电泳槽内，加电泳缓冲液至电泳槽中，使液面高于胶面1mm左右。
5．加样: 取前面提取到的质粒DNA样品5μL，加1μL 6×加样缓冲液在蜡膜上混匀，用移液枪将混合液小心加入凝胶上的加液孔。同时取6μL分子量标记点样，作为对照。
6．电泳:接通电泳仪电源（点样孔端要在负极），DNA的迁移速度与电压成正比，最高电压不超过5 V／cm，直至溴酚蓝染料带拉开一定距离时，停止电泳。
7．观察:将凝胶放在凝胶成像仪，观察所抽提到的质粒DNA的纯度和浓度，拍摄照片保存。
8．取2μl样品用MillQ水稀释至50μl后测定DNA的浓度（约0.15μg/μL）及纯度。
3.2PCR扩增目的基因EGFP
1按顺序在200L指形管中加入以下试剂与样品：
配方
1）水14μL
2）Premix Taq 25μL
3）上游引物（10μM) 5μL
4）下游引物（10μM) 5μL
5）模板pEGFP-N1 1μL（100ng）
总体积50μL
2在PCR扩增仪上按以下反应条件编入程序：
1．预变性95℃5分种
2．变性94℃60秒
3．复性55℃60秒
4．延伸72℃60秒
5．Go to step2 for 29 times
72℃7分钟
6．延长延
伸
7．停止反应4℃forever
8．end
编完反应程序，将反应管盖紧，置于PCR扩增仪的反应孔中，开动机器，扩增循环反应开始。
3.PCR扩增完毕，配2%琼脂糖凝胶，取5μL反应液及相适应的DNA分子量标记分别点样，电泳。
4.凝胶成像仪或紫外灯下观察实验结果。
3.3目的基因的纯化、目的基因和载体的连接
3.3.1PCR产物的纯化
1）将3.2所得的两管PCR产物合并，取60μl于1.5mL管中加入300μl(5倍体积) Buffer CP，混匀。
2）DNA与柱子的结合：将混合液转入带有2.0 mL收集管的柱子（HiBindTM DNA Mini Columns）中，室温下10000×g离心1 min；弃废液后将柱子放回收集管中。
3）洗脱杂质：在柱子中加入700μl 已加入无水乙醇的DNA Wash Buffer（如储于4℃，必须先升温至室温），室温下10000×g离心1 min，弃废液后将柱子放回收集管中。
4）重复步骤3）一次。
5）除去残留乙醇：室温下10000×g离心空柱2 min，干燥柱子的基质膜。
6）DNA的洗脱：将柱子转移到新的1.5 mL EP管中，直接向柱子底部的基质膜中央加入30μl MillQ水，室温下放置2min，室温下10000×g离心1 min洗脱DNA片段，收集洗脱液。
7）重复洗脱：再加入30μl MillQ水，室温下放置2min，室温下10000×g离心1 min 一次，将两次洗脱液收集于同一EP管中。
8）取2μl样品用MillQ水稀释至50μl后测定DNA的浓度（约0.07μg/μL）及纯度。
3.3.2DNA样品的酶切
1
2
使反应液甩入管底。
3）将各管置于塑料泡沫上，在37℃恒温水浴锅中，保温1小时。
4）将各管反应液置于65℃水浴中，保温15分钟，终止酶反应。
3.3.3 酶切液的琼脂糖凝胶电泳
1）制备电泳凝胶。
2）各酶切管分别取9μL酶切液，与1μL 10×加样缓冲液混匀后点样，同时点加③1kb ladder（10μL）、④PCR产物和⑤pUC18作为对照（PCR产物和pUC18分别取
0.5μgDNA与1μL 10×加样缓冲液及适量电泳缓冲液，使总体积为10μL，混匀）。
3）进行凝胶电泳。
3.4酶切产物的纯化及载体pUC18和EGFP基因片段的连接
3.4.1酶切产物的纯化
1）在3.3所得的两个酶切管①和②中（各含约50μL酶切液即2.5μgDNA）分别加入250μL(5倍体积) Buffer CP，混匀。
2）DNA与柱子的结合：将混合液分别转入带有2.0 mL收集管的柱子（HiBindTM DNA Mini Columns）中，室温下10000×g离心1 min；弃废液后将柱子放回收集管中。
3）洗脱杂质：在每个柱子中加入700μl 已加入无水乙醇的DNA Wash Buffer（如储于4℃，必须先升温至室温），室温下10000×g离心1 min，弃废液后将柱子放回收集管中。
4）重复步骤3）一次。
5）除去残留乙醇：室温下10000×g离心空柱2 min，干燥柱子的基质膜。
6）DNA的洗脱：将柱子分别转移到新的1.5 mL EP管中，直接向柱子底部的基质膜中央加入40μl MillQ水，室温下放置2min，室温下10000×g离心1 min洗脱DNA片段，收集洗脱液。
7）分别取2μl样品用MillQ水稀释至50μl后测定DNA的浓度（约50ng/μL）及纯度。
3.4.2靶片段和载体片段的连接
1）用微量进样器依次吸取下述试剂，混合于一个Eppendorf小管内：
①10×T4 连接缓冲液1微升
②EGFPEcoRI-BamHI DNA 片段（50 ng/μL）1微升（50ng约0.1pmol）
③pUC18EcoRI-BamHI载体（50 ng/μL） 3.13微升（125ng约0.072pmol）
④ddH2O 4.47微升
⑤T4连接酶0.4微升（28U）
总体积10微升
2）混匀后将小管置于台式离心机上离心2秒钟，使管壁上的试剂全部甩向底部，混合好。
3）将小管置于恒温器中，13℃保温过夜。
3.5培养基的配制
1. LB液体200mL
在150mL dH2O 中加入：蛋白胨2g
酵母粉1g
NaCl 2g
搅拌溶解，然后用5M NaOH调pH至7.2，再定容到200mL，并分装于：
①5支试管，每管5mL；
②1瓶250mL三角瓶：装110mL，加2.2g琼脂。
③1瓶150mL三角瓶：装40mL。
2. 150mL三角瓶空瓶1瓶,包装灭菌
分子生物学考研真题汇编
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分子生物学实验指导(精)
分子生物学实验指导 生物技术教学室编 宁夏大学生命科学学院 2008年8月
实验一分子生物学实验技术多媒体演示 [目的要求] 通过多媒体试验录像进一步掌握分子生物学基本操作技术。 [教学方式] 多媒体光盘演示。 [实验内容] 基本的分子生物学实验操作技术包括核酸凝胶电泳技术；质粒提取；转化；重组体的筛选；PCR技术等。
实验二琼脂糖凝胶电泳检测DNA [目的要求] 通过本实验学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术 [实验原理] 琼脂糖凝胶电泳是分离鉴定和纯化DNA片段的常用方法。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应，DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。由于糖磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正极方向移动。不同浓度琼脂糖凝胶可以分离从200bp至50 kb的DNA片段。在琼脂糖溶液中加入低浓度的溴化乙锭（Ethidum bromide ,EB），在紫外光下可以检出 10ng的DNA条带，在电场中，pH8.0条件下，凝胶中带负电荷的DNA向阳极迁移。 琼脂糖凝胶有如下特点： (1) DNA的分子大小在凝胶基质中其迁移速率与碱基对数目的常用对数值成反比，分子越大迁移得越慢。 (2) 琼脂糖浓度一个特定大小的线形DNA分子,其迁移速度在不同浓度的琼脂糖凝胶中各不相同。DNA电泳迁移率(u)的对数与凝胶浓度(t)成线性关系。 (3) 电压低电压时，线状DNA片段迁移速率与所加电压成正比。但是随着电场强度的增加，不同分子量DNA片段的迁移率将以不同的幅度增长，随着电压的增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。要使大于2kb的DNA片段的分辨率达到最大，所加电压不得超过5v/cm。 (4) 电泳温度DNA在琼脂糖凝胶电泳中的电泳行为受电泳时的温度影响不明显，不同大小的DNA片段其相对迁移速率在4℃与30℃之间不发生明显改变，但浓度低于0.5%的凝胶或低熔点凝胶较为脆弱，最好在4℃条件下电泳。 (5) 嵌入染料荧光染料溴化乙锭用于检测琼脂糖凝胶中的DNA，染料嵌入到堆积的碱基对间并拉长线状和带缺口的环状DNA,使其刚性更强,还会使线状迁移率降低15%。 (6) 离子强度电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNA电泳迁移率。在没有离子存在时（如误用蒸馏水配制凝胶，电导率最小，DNA几乎不移动，在高离子强度的缓冲液中（如误加10×电泳缓冲液），则电导很高并明显产热，严重时会引起凝胶熔化。
氨基酸纸上层析实验报告
竭诚为您提供优质文档/双击可除氨基酸纸上层析实验报告 篇一：实验六氨基酸的纸层析法 氨基酸的纸层析法 一．目的 了解并掌握氨基酸纸层析的原理和方法。 二、原理 以滤纸为支持物的层析法，称为纸层析法。纸层析所用展层剂大多由水和有机溶剂组成。展层时，水为静止相，他与滤纸纤维亲和力强；有机溶剂为流动相，它与滤纸纤维亲和力弱。有机溶剂在滤纸上又下向上移动的，称为上行法；有上向下移动的，称为下行法。将样品在滤纸上确定的原点处展层，由于样品中各种氨基酸在两相中不断进行分配，且他们的分离系数各不相同，所以不同的氨基酸随流动相移动的速率也不相同，于是各种氨基酸在滤纸上就相互分离出来，形成距原点不等的层析点。 在一定条件下（室温、展层剂的组成、滤纸的质量、ph 值等不变），不同的氨基酸有固定的移动速率（Rf值）Rf=
原点到层析点中心的距离/原点到溶剂前沿的距离。用混合氨基酸做样品时，如果只用一种溶剂展层，由于某些氨基酸的移动速率相同或相近，就不能将它们分开，为此，当用一种溶剂展层后，可将滤纸旋转90度，以第一次所的层析点为原点，在用另一溶剂展层，从而达到分离的目的。这种方法称为双向层析法。 本试验主要介绍的是单向层析法。其中混合氨基酸有精氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸组成。 三、实验仪器 1、新华滤纸 2、层析缸 3、细线 4、点样管 5、橡皮筋 6、电吹风 7、喷雾器 四、实验试剂 1、混合氨基酸（精氨酸，酪氨酸，苯丙氨酸） 2、展层剂：正丁醇：12%氨水：95%乙醇：蒸馏水=13：3：3：1（v:v） 3、0.5%茚三酮—无水丙酮溶液：0.5g茚三酮溶于100ml 无水丙酮，贮于棕色瓶中
分子生物学复习题参考解答阅读版
暨南大学2005 分子生物学复习题及参考解答 暨南大学 2005生物化学与分子生物学专业 2005年12月22日
2005年分子生物学硕士生复习题 1.举例解释蛋白质二级结构、超二级结构（MOTIF）、三级结构、DOMAIN和四级结构。 2.定义chaperone，并解释其功能。 3.分析你所认识的RNA分子二级结构。 4.解释DNA聚合酶I的三种酶活性。 5.解释DNA聚合酶III各亚基的功能。 6.生物如何控制一个世代只复制一次？ 7.阐明Rolling Circle Replication。 8.阐明端粒结构与端粒酶的功能。 9.描述The Nucleotide Excision Repair pathway。 10.解释recA, recB, recC，recD，RuvA，RuvB，RuvC genes 所编码蛋白和Chi sites 在重组中的 作用。 11.原核生物启动子所组成的保守序列和终止子特异序列是什么？ 12.RNA聚合酶I识别的启动子包含有哪两个部分？分别有什么蛋白因子识别？ 13.RNA聚合酶III识别的启动子有哪几类？其定位因子是什么？ 14.RNA聚合酶II识别的启动子含有多种顺式作用因子，请举4例。 15.列出能在真核生物细胞中表达载体的构件名称，并作出解释。 16.请阐述ALTERNATIVE SPLICING的生理学意义。 17.请阐述RIBOZYME的应用。 18.请阐述RNA分子功能的研究进展。 19.请阐述Aminoacyl tRNA synthetases 在蛋白质翻译中的作用。 20.阐述IF1、IF2 、IF3、EF-Tu、EF-Ts、EF-G、RF1、RF2、RF3、RRF的功能。 21.原核生物如何Rescuing synthesis on "broken" mRNA from ribosome。 22.解释真核生物翻译SCANNING模型。 23.解释大肠杆菌乳糖操纵子的正负调控机制。 24.解释大肠杆菌半乳糖操纵子的两启动子调控机制。 25.解释大肠杆菌阿拉伯糖操纵子的C蛋白正负调控机制。 26.解释大肠杆菌衰减子（Attenuator）调控机制。 27.请围绕你的导师科研课题阐述其分子生物学问题并作一定的解答。
最新分子生物学实验指导
分子生物学实验指导
分子生物学实验指导 （补充讲义） 南方医科大学生物化学与分子生物学实验教学中心 二OO九年十二月 目录 实验总RNA的提取、定量与RT-PCR……………………………………………… 1 实验质粒DNA的提取、定量与酶切鉴定 (7) 实验蛋白质聚丙烯酰胺凝胶电泳 (13) 附录Ⅰ相关试剂盒说明书 (19) 附录Ⅱ相关仪器使用说明书 (19) 实验九总RNA的提取、定量与RT-PCR 一、总RNA的提取与定量 目的： 从细胞中分离RNA是分子生物学实验经常进行的操作之一，所提取RNA的质量是进行其它实验的基础，如Northern杂交，目的基因cDNA的克隆，荧光定量，文库构建等。 原理：
在哺乳动物中，平均每个细胞内大约含有10-5μg RNA，其中rRNA占总量的80%-85%，tRNA和核内小分子RNA占10-15%，而mRNA只占1-5%。rRNA由28S、18S、5S等几类组成，这些RNA分子根据密度和分子大小，通过密度梯度离心、凝胶电泳、离子交换层析进行分离。mRNA分子种类繁多，分子量大小不均一，在细胞中含量少，绝大多数mRNA分子（除血红蛋白、有些组蛋白mRNA以外），在3’端存在20-250个多聚腺苷酸(polyA)。利用此特点，用 oligo(dT)亲和层析柱分离mRNA。 RNA分离的方法有：异硫氰酸胍氯化铯超速离心法，盐酸胍-有机溶剂法，氯化锂-尿素法，蛋白酶K-细胞质RNA提取法等、异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法等。目前常用的是Trizol法。 Trizol试剂适用于从细胞和组织中快速分离RNA。TRIzol的主要成分是异硫氰酸胍和酚。异硫氰酸胍属于解偶剂，是一类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质主要作用是裂解细胞，使细胞中的蛋白，核酸物质解聚得到释放。酚虽可有效的变性蛋白质，但是它不能完全抑制RNA酶活性，因此Trizol中还加入了8－羟基喹啉、β-巯基乙醇等来抑制内源和外源RNase。在加入氯仿离心后，溶液分为水相和有机相，RNA选择性地进入无DNA和蛋白质的水相中。取出水相用异丙醇沉淀可回收RNA；用乙醇沉淀中间层可回收DNA；用异丙醇沉淀有机相可回收蛋白质。 Trizol试剂可用于小量样品（50~100mg组织、5×106细胞）也适用于大量样品（≥1g组织、>107细胞）。对人，动物，植物组织，细菌均适用，整个提取过程在一小时内即可完成。分离的总RNA无蛋白质和DNA污染，可用于Northern blot，dot blot，ployA筛选，体外翻译，RNase保护分析和分子克隆。在用于RT-
数据结构实验7实验报告
暨南大学本科实验报告专用纸 课程名称数据结构实验成绩评定 实验项目名称习题6.51 指导教师孙世良 实验项目编号实验7 实验项目类型实验地点实验楼三楼机房学生姓名林炜哲学号2013053005 学院电气信息学院系专业软件工程 实验时间年月日午～月日午温度℃湿度(一)实验目的 熟悉和理解二叉树的结构特性； 熟悉二叉树的各种存储结构的特点及适用范围； 掌握遍历二叉树的各种操作及其实现方式。 (二)实验内容和要求 编写一个算法，输出以二叉树表示的算术表达式，若该表达式中含有括号，则应该在输出时添上。 (三)主要仪器设备 实验环境：Microsoft Visual Studio 2012 (四)源程序 #include
if(t==' ') T=NULL; else{ if( !( T=(bitnode*)malloc(sizeof(bitnode)) ) ) exit(0); T->data=t; create(T->lchild); create(T->rchild); } } void middle_order(bitree &Node){ if(Node != NULL){ if((Node->data=='*'||Node->data=='/')&&(Node->lchild->data=='+'|| Node->lchild->data=='-')) printf("( "); middle_order(Node->lchild); if((Node->data=='*'||Node->data=='/')&&(Node->lchild->data=='+'|| Node->lchild->data=='-')) printf(") "); printf("%c ", Node->data); if((Node->data=='*'||Node->data=='/')&&(Node->rchild->data=='+'|| Node->rchild->data=='-')) printf("( "); middle_order(Node->rchild); if((Node->data=='*'||Node->data=='/')&&(Node->rchild->data=='+'|| Node->rchild->data=='-')) printf(") "); } } int main() { bitree y; printf("以先序遍历的方式输入二叉树："); create(y); printf("输出表达式："); middle_order(y); return 0; } (五)数据调试
《分子生物学》实验指导(2015-2016)
《分子生物学》实验指导 实验1 总DNA提取 生物总DNA的提取是分子生物学实验的一个重要内容。由于不同的生物材料细胞壁的结构和组成不同，而细胞壁结构的破坏是提取总DNA的关键步骤。同时细胞内的物质也根据生物种类的不同而有差异，因此不同生物采用的提取方法也不同，一般要根据具体的情况来设计实验方法。本实验介绍采用CTAB法提取植物总DNA的技术。 [实验目的] 学习和掌握学习CTAB法提取植物总DNA的基本原理和实验技术。学习和掌握紫外光吸收法鉴定DNA的纯度和浓度。 [实验原理] 植物叶片经液氮研磨，可使细胞壁破裂，加入去污剂（如CTAB），可使核蛋白体解析，然后使蛋白和多糖杂质沉淀，DNA进入水相，再用酚、氯仿抽提纯化。本实验采用CTAB法，其主要作用是破膜。CTAB 是一种非离子去污剂，能溶解膜蛋白与脂肪，也可解聚核蛋白。植物材料在CTAB的处理下，结合65℃水浴使细胞裂解、蛋白质变性、DNA 被释放出来。CTAB与核酸形成复合物，此复合物在高盐（>0.7mM）浓度下可溶，并稳定存在，但在低盐浓度（0.1-0.5mM NaCl）下CTAB-核酸复合物就因溶解度降低而沉淀，而大部分的蛋白质及多糖等仍溶解于溶液中。经过氯仿/ 异戊醇(24:1) 抽提去除蛋白质、多糖、色素等来纯化DNA，最后经异丙醇或乙醇等沉淀剂将DNA沉淀分离出来。 由于核酸、蛋白质、多糖在特定的紫外波长都有特征吸收。核酸及其衍生物的紫外吸收高峰在260nm。纯的DNA样品A260/280≈1.8，纯的RNA样品A260/280≈2.0，并且1μg/ml DNA 溶液A260=0.020。 [实验器材] 1、高压灭菌锅 2、冰箱 3、恒温水浴锅 4、高速冷冻离心机 5、紫外分光光度计 6、剪刀 7、陶瓷研钵和杵子 8、磨口锥形瓶（50ml） 9、滴管10、细玻棒11、小烧杯（50ml）12、离心管（50ml）13、植物材料 [实验试剂] 1、3×CTAB buffer（pH8.0） 100mM Tris 25mM EDTA 1.5M NaCl 3% CTAB 2% β-巯基乙醇 2、TE缓冲液（pH8.0） 10mmol/L Tris·HCl 1mmol/L EDTA 3、氯仿-异戊醇混合液（24：1，V/V） 4、95％乙醇 5、液氮 [实验步骤] 1、称取2g新鲜的植物叶片，用蒸馏水冲洗叶面，滤纸吸干水分。 2、将叶片剪成1cm长，置预冷的研钵中，倒入液氮，尽快研磨成粉末。 3、待液氮蒸发完后，加入15mL预热（60℃）的CTAB提取缓冲液，转入一磨口锥形瓶中，
暨南大学分子生物学考研复习题.doc
2008年分子生物学硕士生复习题这是我整理的，一些还不全面 1.@阐述基因概念和你对基因定义的了解。 基因这一概念在过去几年中有很人的变化，根据3前所掌握的知识，从分子生物学的角度，可以把基因定义为“能够表达出一个有功能的多肽链或功能RNA分子的核酸序列”。这里,“RNA分子”是指rRNA 和tRNA。“核酸序列”主要指DNA，对于RNA摘毐来说则指染色体RNA。这个定义较确切地表述了基因的本质和功能，已经被绝大多数学者所接受。 基因（g（mc）足约翰逊在1909年提fli來的。他川基因这一名词來表示遗传的独立单位，相当于孟德尔在豌豆试验中提出的遗传因子。这只是提出了遗传因子的符号，没有提出基因的物质概念。摩尔根对果蝇的研宂结果农明，1条染色体上有很多基因，一些性状的遗传行为之所以不符合孟徳尔的独立分配定律，就是因为代表这些性状的基因位于同一条染色体上，彼此连锁而不易分离。这样，代表特定性状的特定基因与某一条特定染色体上的特定位罝联系起來。基因不再是抽象的符号，而是在染色体上占冇一定空间的实体，从而赋予基因以物质的内涵。早期的基因概念足把基因作为决定性状的最小单位、突变的最小单位和重组的最小单位，后来，这种“三位一体”的概念不断受到新发现的挑战。1953年在沃森和兑里兑提出DNA的双螺旋结构以后，人们普遍认为棊因是DNA的片段，确定了基因的化学木质。1957年，木泽尔以T4噬蘭体为材料，在DNA分子水平上研究基因内部的精细结构，提出了顺反子概念。顺反子是1个遗传功能单位，1 个顺反子决定1条多肽链，顺反子此时也就是基因的同义词。 现代对基因的理解表现在如下方面： （1）操纵子从分子水平来看，基因就是DNA分子上的一个个片段，经过转录和翻译能合成1条完幣的多肽链。可是近年來的研宂，认为这个结论并不全而，因为有些基因，如rRNA和tRNA基因只有转录功能而没宥翻译功能。另外，还宥一类基因，K本身并不进行转录，但可以对邻近的结构基因的表达起控制作用，如启动基因和操纵基因。从功能上讲，能编码多肽链的S因称力结构基因；启动基因、操纵基因和编码阻遏蛋白、激活蛋白的调节基因属于调控基因。操纵基因与其控制下的-?系列结构基因组成1个功能单位，称为操纵子。 （2）移动基因移动基因指DNA能在有机体的染色体组内从1个地方跳到另一个地方，它们能从1 个位点切除，然后插入同一或不同染色体上的另一个位置。基因的跳动能够产生突变和染色体熏排，进而影响其他基因的表达。移动基因的发现动摇了基因在染色体上冇一阆定位罝的传统观念。 （3）断裂基因过去人们一直认力，基因的遗传密码子是连续不断地并列在一起，形成1条没冇间隔的完狹基因实体。但后来通过对真核蛋白质编码基因结构的分析发现，在仑们的核杆酸序列中间插入有与编码无关的DNA间隔区，使1个基因分隔成不连续的若千区段。这种编码序列不连续的闽断基因被称为断裂基因。断裂基因先转录为核内不均一RNA，然后经过删除和连接，除去无关的DNA间隔序列的转录物，便形成丫成熟的inRNA 分子。 （4）假基因这足一种核苷酸序列同其相应的正常功能基因基木相同，但却不能合成出功能蛋白质的失活基因。 （5）熏叠基因长期以来，在人们的观念中-直认为同一段DNA序列内，是不可能存在東叠的读码结构的。但是，随着DNA核苷酸序列测定技术的发展，人们己经在一些噬菌体和动物病毐屮发现，不同基因的核苷酸序列冇时是讨以共川的。也就是说，它们的核苷酸汴列是彼此巫叠的，这样的2个基因被称为ffi 叠蕋因。它修正了关于各个基因的多核苷酸链是彼此分立、互不重脅的传统观念。 （6）染色体外基因这类基因存在于染色体外，它们的传递不符合孟德尔的分离和自由组合定律，如线粒体基因、叶绿体基因等。它们的基因编码细胞其专一的蛋白质并自我父制。 由此可见，随着生物科学的不断发展，人们对基因概念的理解也不断深入。在世界科学技术日新月异的今天，生物科学将会冇更多新的突破性进展，基因的概念不可避免的将会被赋予新的内容。 2.举例解释蛋白质二级结构、超二级结构（MOTIF）、三级结构、DOMAIN和叫级结
DSS实验报告例子
本科实验报告 课程名称：决策支持系统 课程编号：07010192 学生姓名： 学号： 学院：信息科学技术学院 系：数学系 专业：信息管理与信息系统 指导教师：谭满春 教师单位：数学系 开课时间：2014 ~ 2015学年度第1学期 暨南大学教务处 2014 年12 月1 日
《决策支持系统》课程实验项目目录 *实验项目类型：演示性、验证性、综合性、设计性实验。 *此表由学生按顺序填写。
暨南大学本科实验报告专用纸 课程名称决策支持系统成绩评定 实验项目名称基金的使用模型与计划指导教师谭满春 实验项目编号0701*******实验项目类型验证性实验地点南海楼209 学生姓名学号 学院信息科学技术学院系数学系专业信息管理与信息系统 实验时间2014 年11 月3日上午～11月3日下午温度℃湿度【实验目的】 1.介绍与线性方程组有关的基本概念。 2.了解线性方程组的消去法、迭代法等基本求解方法。 3.学习MA TLAB软件中有关线性方程组运算的命令。 【实验内容】 某校基金会有一笔数额为M元的基金，打算将其存入银行，当前银行存款及各期的利率见下表，取款政策参考银行的现行政策。 校基金会计划在n年内每年用部分本息奖励优秀师生，要求每年的奖金额大致相同，且在n年末仍保留原基金数额。校基金会希望获得最佳的基金使用计划，以提高每年的奖金额。请你帮助校基金会在上述情况下设计基金存款使用方案，并对M=5000万元，n=10年给出具体结果。 【实验方法与步骤】 1．问题的分析 问题本身含有一些不确定的因素，比如说基金到位的时间，每年奖学金发放的日期，银行利率的变动情况等。为使问题简化，先做如下假设： 假设1：该笔资金于年底一次性到位，自下年起每年年底一次性发放的奖金，每年发放的奖金额尽可能的相同; 假设2: 银行存款利率执行现行利率标准，且在n年内不发生变化。 M i 为用作奖学金的钱，这些钱经过存入银行加息的将总额M分成11份，(1,2,,10) i 过程，到第i年取出用作第i年的奖学金钱；M11为用作奖池的钱，即经过10年的银行加
2019暨南大学考研分子生物学考试大纲
暨南大学2018年再生医学专业硕士研究生初试科目考试大纲 分子生物学考试大纲考试代码:836 分子生物学是暨南大学再生医学专业硕士研究生入学考试的科目之一，主要体现生物学、基础医学及临床医学知识群的交叉在再生医学领域的应用。为使考生明确考试内容和知识要点，把握考试的范围和要求，特编写此考试大纲作为参考。它的评价标准是高等学校优秀本科毕业生能达到的及格或及格以上水平，以保证被录取者具有基本的分子生物学知识而有利于我校在录取时择优选拔。 一、考试要求 1、要求掌握分子生物学的基本概念； 2、要求掌握分子生物学的基本原理； 3、要求系统的掌握分子生物学的常用技术和方法，能够就某一问题设计出实验方案。 二、试卷结构 基础知识占40%，综合、分析题占40%，创造性思维题占20%。试卷主要由名词解释、简答题、综合分析题等组成。 三、考试方式和时间限制 考试方式为笔试，时间三小时。 四、考查要点 （一）DNA 1、DNA的结构 DNA的构成，DNA的一级结构、二级结构、高级结构 2、DNA的复制 DNA的半保留复制，复制起点、方向和速度，复制的几种主要方式 3、原核生物和真核生物DNA复制特点 原核生物DNA复制特点，真核生物DNA复制特点，DNA的复制调控4、DNA的修复
四种修复方式 5、DNA的转座 转座子的分类和结构特征，转座机制，转座作用的遗传学效应，真核生物的转座子 （二）生物信息的传递（上）——从DNA到RNA 1、RNA的转录 转录的基本过程，转录机器的主要成分 2、启动子与转录起始 启动子的基本结构，启动子的识别，酶与启动子的结合，-10区和-35区的最佳间距，增强子及其功能，真核生物启动子对转录的影响 3、原核生物与真核生物mRNA的特征比较 原核生物mRNA的特征，真核生物mRNA的特征 4、终止和抗终止 不依赖于ρ因子的终止，依赖于ρ因子的终止，抗终止 5、内含子的剪接、编辑及化学修饰 RNA中的内含子，RNA的剪接，RNA的编辑和化学修饰 （三）生物信息的传递（下）——从DNA到蛋白质 1、遗传密码 三联子密码及其破译，遗传密码的性质 2、tRNA tRNA的结构、功能及种类，氨酰-tRNA合成酶 3、核糖体 核糖体的结构，rRNA，核糖体的功能 4、蛋白质合成的生物学机制 氨基酸的活化，肽链的起始、延伸和终止，蛋白质前体的加工，蛋白质合成抑制剂，RNA分子在生物进化中的地位 5、蛋白质运转机制 翻译-运转同步机制，翻译后的运转机制，核定位蛋白的运转机制，蛋白质的降解
暨南大学本科报告专用纸
暨南大学本科实验报告专用纸 课程名称操作系统程序设计成绩评定 实验项目名称进程调度试验指导教师郝振明 实验项目编号003 实验项目类型设计性实验地点宿舍 学生姓名刘永均学号2004051082 学院信息科学技术学院系计算机科学与技术专业软件工程 实验时间06年11月4日午～11月15日午温度29 ℃湿度40％进程调度模拟实验 1.实验目的 通过对进程调度算法的模拟加深对进程概念和进程调度过程的理解。 2.实验内容 用C语言、Pascal语言或其他开发工具实现对N（N=5）个进程的调度模拟，要求至少采用两种不同的调度算法（如简单轮转法Round Robin和优先权高者优先算法Highest Priority First），分别进行模拟调度。 每个用来标识进程的进程控制块PCB用结构（记录）来描述，根据需要，它包括以下字段： 进程标识数ID。 进程优先数Priority，并规定优先数越大的进程，其优先权越高。采用简单轮转法时该字段无用。 进程已经占用的CPU时间CPUTIME（以时间片为单位，下同）。 进程还需占用的CPU时间ALLTIME。当进程运行完毕时，ALLTIME变为0。 进程的阻塞时间STARTBLOCK，表示当进程再运行STARTBLOCK个时间片后，进程将进入阻塞状态。 进程被阻塞的时间BLOCKTIME，表示已经阻塞的进程再等待BLOCKTIME个时间片后，将转换成就绪状态。 进程状态STATE。 队列指针NEXT，用来将PCB排成队列。 优先数改变的原则（采用简单轮转法时该字段无用）： 进程在就绪队列中等待一个时间片，优先数增加1； 进程每运行一个时间片，优先数减3。 假设在进行调度前，系统中有5个进程，它们的初始状态可以编程输入（更具有灵活性），也可以初始化为如下内容： ID PRIORITY CPUTIME ALLTIME STARTBLOCK BLOCKTIME STA TE 0 9 0 3 2 3 READY 1 38 0 3 -1 0 READY 2 30 0 6 -1 0 READY 3 29 0 3 -1 0 READY 4 0 0 4 -1 0 READY 为了清楚地观察诸进程的调度过程，程序应该将每个时间片内各进程的情况显示出来并暂停，参考格式如下： 运行/Running：I 就绪队列/Ready Queue：Idi，Idj，…
实验报告纸格式
实验报告纸格式
肇庆学院 肇庆学院学院电子电工课实验报告 12 年级机械4 班组实验日期 姓名老师评定 ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ 实验题目实验二射极跟随器 一、实验目的 1、掌握射极跟随器的特性及测试方法 2、进一步学习放大器各项参数测试方法 二、实验原理 射极跟随器的原理图如图5－1所示。它是一个电压串联负反馈放大电路，它具有输入电阻高，输出电阻低，电压放大倍数接近于1，输出电压能够在较大范围内跟随 输入电压作线性变化以及输入、输出信号同相等特点。 图5－1 射极跟随器 射极跟随器的输出取自发射极，故称其为射极输出器。 1、输入电阻R i 图5－1电路 R i ＝r be ＋(1＋β)R E 如考虑偏置电阻R B 和负载R L 的影响，则 R i ＝R B ∥[r be ＋(1＋β)(R E ∥R L )] 由上式可知射极跟随器的输入电阻R i 比共射极单管放大器的输入电阻R i ＝R B ∥r be 要高得多，但由于偏置电阻R B 的分流作用，输入电阻难以进一步提高。
输入电阻的测试方法同单管放大器，实验线路如图5－2所示。 图5－2 射极跟随器实验电路 R U U U I U R i s i i i i -== 即只要测得A 、B 两点的对地电位即可计算出R i 。 2、输出电阻R O 图5－1电路 β r R ∥βr R be E be O ≈= 如考虑信号源内阻R S ，则 β ) R ∥(R r R ∥β)R ∥(R r R B S be E B S be O +≈+= 由上式可知射极跟随器的输出电阻R 0比共射极单管放大器的输出电阻R O ≈R C 低得多。三极管的β愈高，输出电阻愈小。 输出电阻R O 的测试方法亦同单管放大器，即先测出空载输出电压U O ，再测接入负载R L 后的输出电压U L ，根据 O L O L L U R R R U += 即可求出 R O L L O O 1)R U U ( R -= 3、电压放大倍数 图5－1电路
2014-2020年暨南大学836分子生物学考研真题考研试题
2014年招收攻读硕士学位研究生入学考试试题 ******************************************************************************************** 招生专业与代码：0710J5再生医学 考试科目名称及代码：836 分子生物学 考生注意：所有答案必须写在答题纸（卷）上，写在本试题上一律不给分。 一、名词解释（每题5分，共30分） RNA干扰；基因芯片技术；DNA半保留复制；操纵子；转录因子；启动子 二、简答题（任选3题回答，每题20分，共60分） 1）什么是蛋白质组学？如何理解高等生物细胞中一个基因组可以产生多个蛋白质。2）基因重组及相应的核心技术。 3）什么是DNA损伤？说明触发DNA损伤的因素及DNA修复机制对生物体稳定性的意义。 4）什么是基因表达？请描述其主要步骤。 三、综合论述题（任选2题回答，每题30分，共60分） 1）如果要特异性扩增某个基因，请谈谈相应的方法及该方法的原理及主要步骤。2）列举3个分子生物学技术，阐述其原理、主要步骤及其在生物医学领域的应用。3）什么是蛋白质免疫印迹？阐述其作用原理及操作步骤。 考试科目：共页，第 页
年招收攻读硕士学位研究生入学考试试题 ******************************************************************************************** 学科、专业名称：生物学再生医学 研究方向： 考试科目名称：836分子生物学 考生注意：所有答案必须写在答题纸（卷）上，写在本试题上一律不给分。 一、名词解释（请从下列10题中选择6题作答，每题5分，总计30分） RNA编辑、组蛋白修饰、核酶、转座子、移码突变、上游启动子元件、聚合酶链式反应、DNA芯片、分子生物学、分子伴侣 二、简答题（请从下面5题中选择3题作答，每题15分，总计45分） 1. 简述真核生物转录水平的调控机制？ 2. DNA如何在复制中保持准确性？ 3. 说出5种RNA的结构及其功能。 4. 蛋白质合成后的加工修饰有哪些内容? 5. 简述原核生物与真核生物启动子的主要差别？ 三、综合分析题（第1题为必答题，后两题任选1题作答，总分75分） 1. （必答题）生命科学的研究已进入后基因组时代,试从“分子生物学”的角度从基因功能研究及应用的角度来阐述你对后基因组时代的认识,并预测后基因组时代里“分子生物学”发展的未来（不少于800字）。（40分） 2. 在你的研究中发现，A蛋白能够下调蛋白B的表达，对此你比较感兴趣，请详述你将通过哪一些实验来进行下一步研究，对采用方法的原理进行说明，并对结果进行判定。（35分） 3.人的基因组大概有2.5~3万个基因,但它们构成的生物体蛋白质种类却有20多万种。人的基因组是怎样以有限的基因形成如此多的蛋白质的? （35分） 考试科目：836分子生物学共 1 页，第 1 页
分子生物学实验心得体会
关于分子生物学实验的体会 梁慧媛（生技01 级） 不知不觉间，一年的时间就这样流逝了，与分子生物实验相伴，对我而言，的确不同寻常。并不仅仅是学习生物学实验技术和方法的宝贵经历，它意味着更多。 首先是实验条件、实验过程、实验设计的完备性，从这里可以初步感受到生物学研究的科学性与严肃性，自己可以得到宝贵的机会，亲身体会生物学研究的苦辣酸甜。一直一直喜欢，得到正确实验结果时刻的畅快感，那是无法言明的欣慰感，一次身心彻底地放松，可以将所有一整天来积累的疲劳抛之身后，即使仅仅是小小的成功，也会让我们兴奋不已。在整理资料，将一年来保存的记录一遍一遍的翻看，重温其中的特别滋味，我，轻轻地笑了。我，喜欢这里，喜欢生物学。 失误是常有的，经历过吃惊、后悔、无奈，检讨分析，最后重新开始。一波三折的记忆清晰的印在脑海中，这种深深的挫折感，再试一次的勇气，我会一生记取的。一年间，随着对生物学实验知识和技能的进一步学习，我更坚定了自己学习生物学的志向，感谢分子生物学实验的"试炼" 。 分子生物学实验心得体会 刘东强（生科01 级） 分子生物学实验室本科生第一次接触到了真正培养实验能力的实验课，它不同于我们在大二开的植物、动物、微生物等实验课。在这些课上，主要以制备样品并观察样品的形态、结构特征为主，这是由于我们当时正值大二，专业知识还远不够。 随着以后理论课学习的深入，我们开始了分子生物学实验的学习，这无疑对于深刻巩固我们理论课上学到的知识是有帮助的，也进一步加深了对原有知识的理解，如启动子的概念、类型、PCR的原理等。另外，在实验课中，我们掌握并学会如何运用分子生物学研究中的一些基本实验技术，如质粒的提取、总RNA 的制备、PCR 技术等。 我们的实验动手能力通过亲身接触实验过程并亲自设计一些实验得到了提高，使我们不再象刚开始做分子生物学实验的时候照搬实验指导上的实验步骤，而是通过我们自己的思考，根据现有的实验条件，对原有的步骤作必要的改进。 此外，通过这门实验课的学习，我们形成了严谨的态度，如有时得出的实验结果与理论不符，我们渐渐养成了仔细分析实验结果的习惯，查找在实验设计或操作过程中出现的问题，同时对理论知识认识得更清楚。 总之，我认为，分子生物学实验课，是称得上实用、精彩、有意思的好实验，对于今后我的研究或工作很有价值 刘佳凝（生技01 级） 一学期的分子生物学实验对我来说很重要，同时通过一学期的实践让我给分子生物学有了较深入地体会： 1、很感谢由我系生化组老师们编写的这本实验指导。里面的实验原理与操作步骤都清晰易懂，有助于我
暨南大学本科实习报告
本科实习报告 实习名称：毕业实习 实习性质：教学实习 实习时间： 实习地点：会计师事务所 学生姓名： 学号： 学院：管理学院 学系：会计系 专业： 指导教师： 教师单位：暨南大学管理学院会计学系 暨南大学教务处 年月日
填写说明 1.暨南大学本科实习报告适用于本校全日制本科生的各类实习教学活动。 2.实习名称应严格按照本科实习教学计划、实习教学大纲填写。 3.实习性质是指：认识实习（社会调查）、教学（生产、临床、劳动）实习、毕业（综合）实习、金工和电子电工实习及其它（请具体说明）。 4.实习时间是指实习的起止日期。 5.实习报告正文内容由各系按照专业特点和实习教学大纲的要求确定。 6.暨南大学本科实习报告册的装订顺序为：封面、填写说明、实习报告正文等。
寒假实习是暨南大学会计系学生重要的一门必修课，会计师事务所的工作具有非常高的季节性，我在大二暑假去过我家附近的会计师事务所实习，可是作为事务所的淡季，实习生基本上都很清闲，最后也没有从中掌握到什么实际技能。作为一个会计系的学生，我明白课堂上老师教的只能是理论，无论我对那些知识掌握得有多好，知道每一个会计科目的意思，明白每一张报表的格式排列，都只是理论而已。所以一开始我就对本次寒假实习抱有相当大的期望，希望通过忙碌的实习掌握有用的技能。当我实际接触到真实的会计账目的时候，我发现数字远远重要得多，不仅要探究数字是否正确，还要去追溯这个数字背后的意义。 由于要实习，我们的期末考试在年底全部结束，至于实习地点我们采取了抽签，我们学校的的待遇还是很不错的，供选的事务所都是广州有名的事务所。我抽取的是广州市大公会计师事务所。我的实习期由1月7日开始，第一天到事务所里报到了之后，我们被告知了作为实习生的一些规矩之后就被分配到了不同的部门。我被分配到了审计二部，换言之我这个寒假实习的职位就是审计员。第二天开始我就开始出外勤了，就是到各个企业去搜集出具审计报告所需要的各种审计证据。不得不说，多亏了整个实习期的外勤，也多亏了带领我的项目经理桃姐耐心详细地教会我日常需要做的，而且还详细解释了这样做的原因，这使我对审计的理解有了更深的层次，而不只是书本上那些非常抽象的理论。虽然自己也是会计专业，但缺少实践经验，而且有一些就算是在学校也学不到的。 实习本来就是大学里边必须经历一个阶段，但是在实习期间我们以什么心态对待确实很重要，首先我们要面对的真实的社会，工作是辛苦的，其次是我们的工资很低，且在不同事务所待遇不同，尽管做了同样的工作甚至更累，但却拿更低的工资。所以我们必须抱着一种学习的心态，公司赚钱，我们学东西。再加上社会本来就那样，劳动与报酬
分子生物学常用实验指南
生命科学系 2011-2012学年度分子生物学实验 （0801班）
2011-2012学年度分子生物学实验指导 实验一大肠杆菌感受态细胞的制备 (3) 实验二质粒DNA的转化 (4) 实验三质粒DNA的提取 (5) 实验四琼脂糖凝胶电泳检测DNA (7) 实验五PCR基因扩增 (9) 实验六DNA重组 (10) 实验七蓝白斑筛选实验 (11) 实验八DNA酶切技术 (13)
实验一大肠杆菌感受态细胞的制备 一、实验目的：掌握大肠杆菌感受态细胞的制备技术 二、实验原理：感受态——细菌处在容易吸收外源DNA的状态。 我们选用经过基因改造的生物工程菌株——大肠杆菌top10菌株为材料，在0℃、CaCl2低渗溶液处理，细胞壁破坏，细胞成为球型原生质体。因而具备了吸收外源DNA的能力。 三、仪器：1.超净工作台 2.低温离心机 3.恒温摇床 4.紫外分光光度仪 四、材料与试剂： 1.大肠杆菌top10菌株 2. 0.1mol/L CaCl2溶液500mL、 0.2mol/L CaCl2溶液50mL 3..LB液体及固体培养基 4.50%甘油500mL（灭菌） 五、实验操作步骤： 1.从大肠杆菌top10菌株平板上挑取一个单菌落，接种于3mL LB液体培养基中， 37℃振荡（200r/min）培养过夜。 2.次日早上取0.4mL菌液转接到40mL LB液体培养基中，37℃震荡培养2～3h.(A600 应在0.4～0.5之间) 3.将菌液置冰浴中10min。（同时将0.1mol/L CaCl2溶液、50%甘油预冷） 4.取菌液1.5mL，4℃离心2min（3500r/min）.弃上清，再加菌液1.5mL，4℃再离 心一次，弃上清，倒置以便使培养液流尽。 5.用冰冷的0.1mol/L CaCl2溶液1mL悬浮细胞（轻轻涡旋使悬浮），立即置冰浴保 温30min。 6.4℃离心2min（3500r/min），弃上清，加入100μL冰冷的0.2mol/L CaCl2溶液、 100μL50%甘油轻轻手摇悬浮，置冰浴上，接着进行质粒DNA转化，或-70℃保存。
自动控制原理实验报告
暨南大学本科实验报告专用纸 课程名称自动控制原理成绩评定 实验项目名称典型环节的电路模拟指导教师 实验项目编号0806105701实验项目类型设计实验地点 学生姓名学号 学院电气信息学院专业自动化 实验时间2014年3月24 日下午 一、实验目的 1．熟悉THBDC-1型控制理论·计算机控制技术实验平台及“THBDC-1”软件的使用； 2．熟悉各典型环节的阶跃响应特性及其电路模拟； 3．测量各典型环节的阶跃响应曲线，并了解参数变化对其动态特性的影响。 4．观测二阶系统的阻尼比分别在0<ζ<1，ζ =1和ζ>1三种情况下的单位阶跃响应曲线；二、实验环境 1．THBDC-1型控制理论·计算机控制技术实验平台； 2．PC机一台(含“THBDC-1”软件)、USB数据采集卡、37针通信线1根、16芯数据排线、USB接口线。 三、实验报告要求 1．画出各典型环节的实验电路图，并注明参数。 2．写出各典型环节的传递函数。 3．根据测得的典型环节单位阶跃响应曲线，分析参数变化对动态特性的影响。 4．画出二阶系统线性定常系统的实验电路，并写出闭环传递函数，表明电路中的各参数； 5．根据测得系统的单位阶跃响应曲线，分析开环增益K和时间常数T对系统的动态性能的影响。 四、实验内容 1：比例环节 根据比例环节的方框图，设计并组建相应的模拟电路，
图中后一个单元为反相器，R0=200K,传递函数：G(s)=Uo（s）/Ui（s）=K。 当比例系数K=1时，电路中的参数取：R1=100K，R2=100K。 实验结果如下图： 当比例系数K=2时，因为K=R2/R1，所以R2=200K，R1=100K，结果如下：
分子生物学实验指导-3
北京化工大学分子生物学实验指导
实验一 少量质粒DNA的制备 一、实验目的 （1）了解质粒的特性及其在分子生物学研究中的作用。 （2）掌握质粒DNA分离、纯化的原理。 （3）学习碱裂解法分离质粒DNA的方法。 二、实验原理 质粒（plasmid）是一种双链的共价闭环状的DNA分子，它是染色体外能够稳定遗传得因子。质粒具有复制和控制机构，能够在细胞质中独立自主地进行自身复制，并使子代细胞保持它们恒定的拷贝数。从细胞生存来看，没有质粒存在，基本上不妨碍细胞的存活，因此质粒是寄生性的复制子。根据质粒的这种特性，通常采用DNA体外重组技术和微生物转化等基因工程的技术和方法，使重组到质粒的某种基因（如干扰素基因）带进受体细胞（如具有一定特性的大肠杆菌细胞等）表达它的遗传性质，改变或修饰寄主细胞原有的代谢产物，或产生新的物质（如干扰素）。目前，质粒已广泛地用作基因工程中的DNA分子无性繁殖的运载体，同时它也是研究DNA结构与功能的较好模型。 在细菌细胞中，质粒DNA通常为染色体DNA的2%左右，但是细菌质粒DNA的含量与其复制类型有关。质粒在细胞内的复制，一般分为两种类型：严密控制（stringent control）复制型和松弛控制型（relaxed control）复制型。严密控制复制型的质粒只在细胞周期的一定阶段进行复制，染色体不复制时，质粒也不复制。每个细胞内只含1个或几个质粒分子（即有1个或几个拷贝）。松弛控制复制型的质粒在整个细胞周期中随时可以复制，当染色体复制已经停止时，该质粒仍然能够继续复制。该质粒在一个细胞内有许多拷贝，一般在20个以上，例如col E1 质粒（含有产生大肠杆菌素E1 基因）及其衍生质粒，在每个细胞内约有20多个拷贝。 所有分离质粒DNA的方法都包括3个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离和纯化质粒DNA。目前应用于质体DNA的纯化或抽取的方法众多，例如碱溶裂法（alkaline lysis）、热裂解法（boiling method）、氯化铯（CsCl）纯化法，及市售柱层析套管法等。最常用的碱裂解法具效率高、价廉、简单易学等优点。其原理是利用碱处理质粒DNA及染色体DNA，使两者双股打开呈单股状态，再加酸中和，使单股回复为双股DNA，同时在急速中和反应中，染色体DNA因分子过于庞大以致于碱基匆忙配对，形成杂乱无序的巨大分子，对水的相对溶解度低而易被沉淀下来。相反，质粒DNA因分子小，两单股DNA恢复原碱基配对快而易溶于水中，所以只要经过离心，即可将染色体DNA与质体DNA分离。本实验所使用的pUC19含有β-lactamase基因，会产生peripasmic酶，进行蓝白斑筛选，抗氨苄青霉基因ampicillin (Amp)两种抗性筛选标记。 碱裂解法：本实验是以alkaline lysis的方法进行，其原理是将大肠杆菌以NaOH及SDS分解，并使蛋白质及DNA变性，然后以酸中和。小分子质粒DNA在中和后可恢复原状，但大部