毕赤酵母表达系统简介

巴斯德毕赤酵母及启动子

1.1 毕赤酵母表达系统简介

随着蛋白异源表达的飞速发展，越来越多的表达系统被建立并得到应用。酵母作为单细胞真核生物，因具有比较完备的基因表达调控机制和对表达产物的加工修饰能力，仍表现出不可比拟的优势。以甲醇营养型酵母（Methylotrophic yeast）-毕赤酵母为代表的第二代酵母表达系统，是近年来被公认的最有效的外源蛋白表达系统之一，已有多种外源蛋白在该宿主系统中获得了成功表达[1]。作为生产外源蛋白的重要宿主菌，依靠其各种不同功能的表达载体，已经得到广泛的应用。表达的蛋白质包括酶、膜蛋白、抗原、抗体和调节蛋白等[2,3]。

毕赤酵母（Pichia pastoris）表达系统是近年来发展迅速、应用广泛的一种真表达系统。它是甲醇营养型酵母菌，有两个乙醇氧化酶（alcohol oxidase，Aox）码基因AOX1和AOX2，两者序列相似，AOX1基因严格受甲醇诱导和调控。当甲醇为唯一碳源时，AOX1启动子可被甲醇诱导，启动乙醇氧化酶的表达，从而用甲醇进行代谢[4]。含AOX1启动子的质粒可用来促进编码外源蛋白的目的因的表达。

随着Invitrogen公司开发的一系列毕赤酵母表达试剂盒的应用，目前用该统已成功表达出了数以千计的来自细菌、真菌、原生动物、植物、无脊椎动物、包括人在内的脊椎动物以及病毒等的具有生物学功能的外源蛋白或蛋白结构[5,6]。1.1.1 P.Pastoris表达载体及其元件

由于毕赤酵母没有稳定的附加质粒，表达载体需与宿主染色体发生同源重组，外源基因表达框架整合于染色体中以实现外源基因的表达整合表达的优点在于保持外源基因稳定性并可产生多拷贝基因。典型的毕赤氏酵母表达载体含有醇氧化酶基因的调控序列，主要的结构包括：5′AOX1启动子片段、多克隆位点(MCS)、转录终止和polyA形成基因序列(TT)、筛选标记(His4或Zeocin)、3′AOX1基因片段，作为一个能在大肠杆菌中繁殖扩增的穿梭质粒，它还有部分pBR322质粒或COLE1序列。如果是分泌型表达载体，在多克隆位点的前面，外源基因的5′端和启动子的3′端之间插人了分泌作用的信号肽序列。在这个分泌信号的引导下，外源蛋白在内质网和高尔基体中经修饰和加工后能够由胞内转移至胞外，将成熟的蛋白质分泌到细胞外。目前所采用的表达体均为穿梭质粒，先在大肠杆菌保存、复制、扩增，然后线性化后被导入宿主母细胞。

常用的表达载体包括胞内表达载体及分泌表达载体如下表：

表1 常用表达载体及其选择标记

表达方式载体名称启动子选择标记

胞内表达pPICZA,B,C AOX1 Zeocin pPIC6A,B,C AOX1 blasticidin PGAPZA,B,C GAP Zeocin

pPIC3.5K AOX1 His4 kanmycin ampicillin PAO815 AOX1 His4 ampicillin

PFLD FLD Zeocin ampicillin

分泌表达pPICZαA,B,C AOX1 Zeocin

pPIC6αA,B,C AOX1 blasticidin

PGAPZαA,B,C GAP Zeocin

pPIC9k AOX1 His4 kanmycin ampicillin pFLDαFLD Zeocin ampicillin

1.1.2 毕赤酵母表达系统的优势

自从1987年Cregg等首次用巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）作为宿主表达外源蛋白以来,作为一种新的高效的表达系统，毕赤酵母越来越引起人们的重视，到1995年，已有四十多种外源蛋白在该宿主菌中获得表达。而最近几年每年报道的在毕赤酵母中表达的外源基因就有几十种，且一年比一年多，它除了具有原核生物易于培养、繁殖快、便于基因工程操作和高密度发酵等特性之外，同酿酒酵母等传统真核表达系统相比，它还具有以下的优势:

（1）含有特有的强有力的AOX（醇氧化酶基因）启动子，用甲醇可严格地调控外源基因的表达；

（2）培养成本低，产物易分离。毕赤酵母所用发酵培养基十分廉价，一般碳源为甘油或葡萄糖及甲醇，其余为无机盐，培养基中不含蛋白，有利于下游产品分离纯化；而酿酒酵母所用诱导物一般为价格较高的半乳糖；

（3）外源蛋白基因遗传稳定。外源基因能以高拷贝数整合到毕赤酵母基因组中，不易丢失并能够到高表达菌株；

（4）作为真核表达系统，毕赤酵母具有真核生物的亚细胞结构，具有糖基化、脂肪酰化、蛋白磷酸化等翻译后修饰加工功能。

1.2 AOX启动子序列分析现状

启动子是基因表达调控的顺式元件，也是基因工程表达载体的一个重要元件。启动子在转录水平上的重要作用，不仅决定了基因的表达水平，也决定了基因表达的时空顺序[7,8]，可以说启动子活性的高低在很大程度上影响着基因表达最终产物的表达水平。所以找到一个转录启动功能较好的启动子，对于外源蛋白高效表达的研究具有重要的意义。目前，已有不少的启动子被克隆和功能鉴定[9]。

新型疫苗主要包括亚单位疫苗、基因缺失疫苗、核算疫苗、重组活载体疫苗等，尽管大多数被认为较为安全，但往往都需要免疫刺激性强的佐剂来提高免疫效果。菌蜕疫苗可通过发酵大量生产且无需加入佐剂即可获得坚强的免疫效果。

目前，毕赤酵母表达系统中较常用的表达载体有两类[10]：种是分泌型表达载体(如pPIC9K) ，另一种是组成型表达载体(如pGAPZB) 。前者(以pPIC9K为例) 含有的醇氧化酶启动子pAOX1，可以在甲醇的诱导下高效表达。该载体自身携带有α 分泌信号肽，可以将外源蛋白直接分泌到胞外。后者(以pGAPZB 为

例) 含有三磷酸甘油醛脱氢酶基因启动子pGAP，可以在多种碳源如葡萄糖、甘油、甲醇或油酸条件下表达外源蛋白，且不需添加诱导物[11]。

在启动子功能的研究中，多数是利用报告基因的表达量来达到功能研究的目的，常用的报告基因有绿色荧光蛋白GFP( green fluorescent protein) 、红色荧光蛋白RFP( red fluorescent protein) β-葡糖醛酸糖苷酶GUS(β-glucuronidase) 和氯霉素乙酰转移酶CA T( chloramphenicolacetyltransferase) 等[12,13]。在前期的工作中，克隆了启动子pScgpd，并在巴斯德毕赤酵母中研究了AOX1 启动子的功能[14]。实验以人血清白蛋白(HSA）作为报告基因，在Pichia pastoris GS115中表达。

到目前为止，利用AOX启动子表达的蛋白有很多，例如：在AOX1 ( 醇氧化酶) 启动子调控下，类似天然抗菌肽大小的magainin 及cecA-mil 蛋白获得分泌表达[15]；人前列腺特异性抗原的表达[16]；重组木糖异构酶的分泌和表达[17]；人骨唾液酸蛋白的表达等[18]。

毕赤酵母实验操作技巧介绍材料

毕赤酵母表达实验手册大肠杆菌表达系统最突出的优点是工艺简单、产量高、生产成本低。然而，许多蛋白质在翻译后，需经过翻译后的修饰加工，如磷酸化、糖基化、酰胺化及蛋白酶水解等过程才能转化成活性形式。大肠杆菌缺少上述加工机制，不适合用于表达结构复杂的蛋白质。另外，蛋白质的活性还依赖于形成正确的二硫键并折叠成高级结构，在大肠杆菌中表达的蛋白质往往不能进行正确的折叠，是以包含体状态存在。包含体的形成虽然简化了产物的纯化，但不利于产物的活性，为了得到有活性的蛋白，就需要进行变性溶解及复性等操作，这一过程比较繁琐，同时增加了成本。与大肠杆菌相比，酵母是低等真核生物，具有细胞生长快，易于培养，遗传操作简单等原核生物的特点，又具有真核生物时表达的蛋白质进行正确加工，修饰，合理的空间折叠等功能，非常有利于真核基因的表达，能有效克服大肠杆菌系统缺乏蛋白翻泽后加工、修饰的不足。因此酵母表达系统受到越来越多的重视和利用。大肠杆菌是用得最多、研究最成熟的基因工程表达系统，当前已商业化的基因工程产品大多是通过大肠杆菌表达的，其主要优点是成本低、产量高、易于操作。但大肠杆菌是原核生物，不具有真核生物的基因表达调控机制和蛋白质的加工修饰能力，其产物往住形成没有活性的包涵体，需要经过变性、复性等处理，才能应用。近年来，以酵母作为工程菌表达外源蛋白日益引起重视，主更是因为酵母是单细胞真核生物，不但具有大肠杆菌易操作、繁殖快、易于工业化生产的特点，还具有真核生物表达系统基因表达调控和蛋白修饰功能，避免了产物活性低，包涵体变性、复性等等间题［1］。与大肠杆菌相比，酵母是单细胞真核生物，具有比较完备的基因表达调控机制

毕赤酵母表达实验手册

xx酵母表达实验手册（作参考）部分试剂中英文名称：小牛肠碱性磷酸酶（CIP）、AOX1（alcohol oxidase，醇氧化酶） 10*YNB（含有硫酸铵、无氨基酸的 13.4%酵母基础氮源培养基） 500*B（ 0.02%生物素Biotin）、100*H（ 0.4%Histidine组氨酸） 10*D（20%Dextrose葡萄糖）、10*M（5%Methanol甲醇） 10*GY（10%Glycerol甘油）、100*AA（ 0.5% of each Amino Acid，各种氨基酸）、1M磷酸钾溶液（potassium phosphate buffer，pH 6.0） Sorbitol (山梨醇)、磷酸钾溶液（potassium phosphate buffer） YEPDM（Yeast Extract Peptone Dextrose Medium，酵母浸出粉/胰蛋白胨/右旋葡萄糖培养基） Minimal Glycerol Medium（最小甘油培养基） YPD培养基的配制：每（L）液体预混合物（50g/L）终浓度酵母提取物10g250g1%蛋白栋 20g500g2%葡萄糖20g500g2%※注：

配制YPD培养基时，20%（10×）葡萄糖溶液最好采用单独过滤除菌或高压灭菌（在灭菌后再加入到其他各种成分），以免在高压灭菌时培养基变黑并妨碍酵母菌的最佳生长。 ※极限培养基{合成葡萄糖（SD）培养基} 每（L）液体预混合物（50g/L）终浓度YNB-AA/AS 1.7g68g 0.17%（NH 4） 2SO 45g200g 0.5%葡萄糖20g800g2%注：这种极限培养基可以培养没有特殊营养要求的酵母菌，但更多时候这种培养基是作为一种待添加其他成分的极限培养基（见下文提到的CM省却成分培养基）。完全极限（CM）省却成分培养基（每L中含）：省却成分粉剂 1.3g(见表 13.1.1) YNB-AA/AS 1.7g （NH 4）

酵母表达系统使用心得

Pichia酵母表达系统使用心得甲醇酵母表达系统有不少优点，其中以Invitrogen公司的Pichia酵母表达系统最为人熟知，并广泛应用于外源蛋白的表达。虽然说酵母表达操作简单表达量高，但是在实际操作中，并不是每个外源基因都能顺利得到高表达的。不少人在操作中会遇到这样那样的问题，收集了部分用户在使用EasySelect Pichia Expression System这个被誉为最简单的毕赤酵母表达的经典试剂盒过程中的心得体会。其中Xiang Yang是来自美国乔治城大学（Georgetown University）Lombardi癌症中心（Lombardi Cancer Center），部分用户来自国内。甲醇酵母部分优点： 1.属于真核表达系统，具有一定的蛋白质翻译后加工，有利于真核蛋白的表达； 2.AOX强效启动子，外源基因产物表达量高，表达产物可以达到每升数克的水平； 3.酵母培养、转化、高密度发酵等操作接近原核生物，远较真核系统简单，非常适合大规模工业化生产； 4.可以诱导表达，也可以分泌表达，便于产物纯化； 5.可以甲醇代替IPTG作为诱导物，部分甲醇酵母更可以用工业甲醇替代葡萄糖作为碳源，生产成本低。产品性能：优点——使用简单，表达量高，His-tag便于纯化；缺点——酵母表达蛋白有时会出现蛋白切割问题。巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）是一种能高效表达重组蛋白的酵母品种，一方面由于其是属于真核生物，因此表达出来的蛋白可以进行糖基化修饰，另一方面毕赤酵母生长速度快，可以将表达的蛋白分泌到培养基中，方便蛋白纯化。毕赤酵母表达载体pPICZ在多克隆位点（MCR）3'端带有his-tag和c-myc epitopes，这些tag有利于常规检测和纯化，而且在MCR5'端引入了alpha factor（α-factor）用以分泌表达，并且在表达后α-factor可以自动被切除。在进行克隆的时候，如果你选择的是EcoRI，那么只需在目标蛋白中增加两个氨基酸序列即可完成。另外pPICZ系列选用的是Zeocin抗生素作为筛选标记，而诱导表达的载体需要甲醇——甲醇比一般用于大肠杆菌表达诱导使用的IPTG便宜。第一步——构建载体 Xiang Yang：pPICZ系列有许多克隆位点可供选择，同时也有三种读码框以便不用的用户需要。红叶山庄：有关是选择pPIC9K还是pPICZ系列？pPIC9K属于穿梭质粒，也可以在原核表达，而pPICZ系列比较容易操作，大肠和毕赤酵母均用抗Zeocin筛选（PIC9K操作麻烦一点，大肠用amp抗性，而毕赤酵母先用His缺陷筛选阳性克隆，在利用G418筛选多拷贝），而且对于大小合适（30—50KD）的蛋白在产量上是pPIC9K无法比拟的。 leslie：要做毕赤酵母表达实验，首先当然就要了解这个可爱的酵母了（椭圆形，肥嘟嘟的，十分可爱），她和大肠杆菌长得有较大区别（大肠杆菌是杆状的），因此在培养的过程中要区别这两种菌体，除了气味，浓度，颜色以外，也可以取样到显微镜中观测。大家做毕赤表达的时候应该都遇过这种情况吧，表达过程中染菌（我们实验室曾经污染过各种颜色形状的细菌，那真是一段可怕的经历），如果在不知情的情况下继续做下去，那可以就是浪费大把的

鹅干扰素_的毕赤酵母表达及其生物学活性分析_朱永梅

中图分类号：Ｓ　８５２．４２　文献标志码：Ａ　文章编号：１６７３－４６９６（２０１３）０４－０４０１－０６鹅干扰素－α的毕赤酵母表达及其生物学活性分析朱永梅，曹永生，李　鑫，马　波，张文龙，高明春＊，王君伟＊（东北农业大学动物医学院，黑龙江哈尔滨　１５００３０）摘要：为在毕赤酵母表达系统中表达无冗余氨基酸且具有抗病毒活性的鹅干扰素－α（ＩＦＮ－α）蛋白，采用融合ＰＣＲ法扩增获得鹅干扰素－α基因片段，将此片段连入ｐＰＩＣＺαＡ载体，构建重组表达质粒ｐＰＩＣＺαＡ－ＧｏＩＦＮ－α，电击转化毕赤酵母感受态细胞Ｘ３３，挑取阳性重组菌用甲醇进行诱导表达，对表达产物进行Ｗｅｓｔ－ｅｒｎ－ｂｌｏｔ和ＥＬＩＳＡ分析，并测定重组ＩＦＮ－α的生物活性。结果显示，融合基因获得高效表达，表达的蛋白以可溶形式存在，且相对分子质量较理论值稍大。经ＧＥＦ－ＧＰＭＶ系统检测，证实表达的蛋白具有生物学活性，约为６．５５×１０５　Ｕ／ｍＬ，比活力为１．８０×１０５　Ｕ／ｍｇ。结果表明，利用毕赤酵母表达系统规模化生产具有生物学活性的鹅ＩＦＮ－α有广阔的应用前景。关键词：鹅；干扰素－α；巴斯德毕赤酵母；分泌表达；抗病毒活性Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｇｏｏｓｅ　ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ－ａｌｐｈａ　ｉｎ　Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓａｎｄ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｉｔｓ　ａｎｔｉｖｉｒａｌ　ａｃｔｉｖｉｔｙＺＨＵ　Ｙｏｎｇ－ｍｅｉ，ＣＡＯ　Ｙｏｎｇ－ｓｈｅｎｇ，ＬＩ　Ｘｉｎ，ＭＡ　Ｂｏ，ＺＨＡＮＧ　Ｗｅｎ－ｌｏｎｇ，ＧＡＯ　Ｍｉｎｇ－ｃｈｕｎ，ＷＡＮＧ　Ｊｕｎ－ｗｅｉ（Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｎｏｒｔｈｅａｓｔ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈａｒｂｉｎ１５００３０，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｉｎ　ｏｒｄｅｒ　ｔｏ　ｇｅｔ　ａｌｐｈａ－ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ（ＩＦＮ－α）ｗｉｔｈ　ｈｉｇｈ　ｌｅｖｅｌ　ｓｅｃｒｅｔｉｖｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ａｎｄ　ａｎｔｉｖｉｒａｌ　ａｃ－ｔｉｖｉｔｉｅｓ，ｔｈｅ　ｇｏｏｓｅ　ＩＦＮ－αｇｅｎｅ　ａｎｄ　ｔｈｅα－ｆａｃｔｏｒ　ｓｉｇｎａｌ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｏｆ　ｐＰＩＣＺαＡ　ｗｅｒｅ　ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　ｂｙ　ｆｕｓｉｏｎ　ＰＣＲ．Ｔｈｅ　ｔａｒｇｅｔ　ｇｅｎｅ　ａｎｄ　ｐＰＩＣＺαＡ　ｗｅｒｅ　ｄｉｇｅｓｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ＨｉｎｄⅢ＋ＫｐｎⅠａｎｄ　ｔｈｅｎ　ｗｅｒｅ　ｌｉｇａｔｅｄ．Ｔｈｅ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｌａｓｍｉｄ　ｏｆ　ｐＰＩＣＺαＡ－ＧｏＩＦＮ－αｗａｓ　ｌｉｎｅａｒｉｚｅｄ　ｂｙ　ＳａｃⅠａｎｄ　ｅｌｅｃｔｒｏｔｒａｔｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｉｎｔｏ　Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ　Ｘ－３３．ＰＣＲ　ａｓｓａｙ　ｗａｓ　ｕｓｅｄ　ｔｏ　ｉｄｅｎｔｉｆｙ　ｃｏｌｏｎｉｅｓ．Ｔｈｅ　ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｓ　ｗｅｒｅ　ｓｃｒｅｅｎｅｄ　ａｎｄ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｂｙ　ａｄｄｉ－ｔｉｏｎ　ｏｆ　ｍｅｔｈａｎｏｌ．ＧｏＩＦＮ－αｐｒｏｔｅｉｎ　ｗａｓ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ　ｂｙ　ＳＤＳ－ＰＡＧＥ　ａｎｄ　Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔｔｉｎｇ　ａｎａｌｙｓｅｓ．Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓｈｏｗｅｄ　ｔｈｅ　ＩＦＮ－αｐｒｏｔｅｉｎ　ｗｉｔｈ　ａ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｍａｓｓ　ｏｆ　２５－３５ｋｕ　ｗａｓ　ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　ｉｎ　Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ　Ｘ－３３．Ｔｈｅａｎｔｉｖｉｒａｌ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　ＩＦＮ－αａｇａｉｎｓｔ　ＧＰＭＶ　ｗａｓ　ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ　ｏｎ　ｔｈｅ　ＧＥＦ　ｃｅｌｌ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔ　ｉｎｄｉｃａｔｅｄ　ｔｈａｔＩＦＮ－αｃｏｕｌｄ　ｉｎｈｉｂｉｔ　ＧＰＭＶ．Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ｇｏｏｓｅ；ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ－ａｌｐｈａ；Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ；ｓｅｃｒｅｔｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ；ａｎｔｉｖｉｒｕｓ　ａｃｔｉｖｉｔｙ干扰素（ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ，ＩＦＮ）是由特定细胞产生的一类具有调节机体免疫功能、抗病毒、抗肿瘤等多种生物学活性的分泌型糖蛋白，是机体防御系统的重要组成部分［１］。自１９５７年Ｉｓａａｃｓ和Ｌｉｎｄｅｒｍａｎｎ首次发现干扰素以来，它一直是研究最为广泛和透彻的细胞因子之一。目前根据干扰素的基因序列、染色体定位和受体特异性可将其分为三类：Ⅰ型干扰素、Ⅱ型干扰素和Ⅲ型干扰素［２］。ＩＦＮ－α属于Ⅰ型干扰素，是由白细胞产生的。ＩＦＮ－α最重要的生物学活性就是具有广谱的抗病毒活性，不仅可以抑制ＲＮＡ病毒的复制，还可以抑制多种ＤＮＡ病毒的复制［３］。此外，ＩＦＮ－α还具有抑制肿瘤生长和免疫调节功能［４］。虽然ＩＦＮ分子是在鸡胚中发现，但与哺乳动物相比，对禽类ＩＦＮ分子水平的研究起步较晚。Ｓｉｃｋ等［５］首先报道了鸡α型干扰素和鸡β型干扰素基因，并在大肠杆菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）和ＣＯＳ细胞中表收稿日期：２０１２－１２－０９；修回日期：２０１３－０３－１９基金项目：黑龙江省十二五科技攻关项目（ＧＡ０９Ｂ３０２）作者简介：朱永梅（１９８７－），女，黑龙江哈尔滨人，硕士生。＊通信作者，王君伟，Ｅ－ｍａｉｌ：ｊｗｗａｎｇ＠ｎｅａｕ．ｅｄｕ．ｃｎ；高明春，Ｅ－ｍａｉｌ：ｇａｏｍｉｎｇｃｈｕｎ＠１６３．ｃｏｍ中国兽医科学　２０１３，４３（０４）：４０１－４０６Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ　Ｓｃｉｅｎｃｅ

毕赤酵母表达系统研究进展

毕赤酵母表达系统研究进展作者：齐连权，陈薇，来大志，于长明，王海涛作者单位：军事医学科学院微生物学流行病学研究所,北京,100071 刊名：中国生物工程杂志英文刊名：JOURNAL OF CHINESE BIOTECHNOLOGY 年，卷(期)：2002,22(6) 被引用次数：11次参考文献(21条) 1.Trinh L;Noronha S B;Fannon M Recovery of mouse endostatin producedby Pichia pastoris using expanded bed adsorption[外文期刊] 2000(04) 2.查看详情 3.Barr KA;Hopkins S A;Sreekrishna K Protocol for efficient secretion of HSA developed from Pichia pastoris 1992 4.Cereghino J L;Cregg J M Heterologous protein expression in the methylotrophic yeast Pichia pastoris[外文期刊] 2000(1) 5.Kjeldsen T;Pettersson A F;Hach M Secretory expression and characterization of insulin in Pichia pastoris[外文期刊] 1999(29) 6.Bewley M C;Tam B M;Grewal J X ray crystallography and massspectroscopy reveal that the N lobe of human transferrin expressed in Pichia pastorisis folded correctly but is glycosylated on serine 32 [外文期刊] 1999(08) 7.Kalidas C;Joshi L;Batt C Characterization of glycosylated variantsof beta lactoglobulin expressed in Pichia pastoris[外文期刊] 2001(03) 8.Briand L;Perez V;Huet J C Optimization of the production ofa honeybee odorant binding protein by Pichia pastoris[外文期刊] 1999(03) 9.Rydberg E H;Sidhu G;Vo H C Cloning mutagenesis and structural analysis of human pancreatic alpha amylase expressed in Pichia pastoris[外文期刊] 1999(03) 10.Guo R T;Chou L J;Chen Y C Expression in Pichia pastoris andcharacterization by circular dichroism and NMR of rhodostomin[外文期刊] 2001(04) 11.Zani M;Brillard Bourdet M;Lazure C Purification and characterization of active recombinant rat kallikrein rK9[外文期刊] 2001(02) 12.ChirulovaV;Cregg J M;Meagher M M Recombinant protein production in an alcohol oxidase defective strain of Pichia pastoris in fed batch fermentations[外文期刊] 1997 13.Hasslacher M;Schall M;Hayn M High level intracellular expression of hydroxynitrile lyase from the tropical rubber tree Hevea brasiliensis in microbial hosts[外文期刊] 1997(1) 14.Takahashi K;Takai T;Yasuhara T Effects of site directed mutagenesis in the cysteine residues and the N glycosylation motif in recombinant Der f 1on secretion and protease activity[外文期刊] 2001(04) 15.Boado R J;Ji A;Pardridge W M Cloning and expression in Pichia pastoris of a genetically engineered single chain antibody against the rat transferrin receptor[外文期刊] 2000(06)

毕赤酵母发酵手册

毕赤酵母发酵手册总览简介：毕赤酵母和酿酒酵母很相似，都非常适合发酵生长。毕赤酵母在有可能提高总体的蛋白质产量的发酵中能够达到非常高的细胞浓度，我们建议只有那些有过发酵经验或者能得到有经验的人的指导的人参与发酵。因为发酵的类型很多，所以我们很难为您的个人案例提高详细的过程。下面所给出的指导是基于Mut+和Mut s两种基因型的毕赤酵母菌株在15L的台式玻璃发酵罐中发酵而成。请在您的发酵开始前先阅读操作员手册。下面所给出的表就发酵参数：在整个发酵过程中监测和调控下列参数非常重要。下面的表格描述了这些参

设备推荐：下面是所推荐设备的清单： ·发酵罐的夹套需要在发酵过程中给酵母菌降温，尤其是在甲醇流加过程中。你需要一个固定的来源来提供冷却水（5-10℃）。这可能意味着你需要一个冷冻装置来保持水的冷却。 ·一个泡沫探针就像消泡剂一样不可或缺。 ·一个氧气的来源——空气（不锈钢的发酵罐需要1-2vvm）或者纯氧（玻璃发酵罐需要0.1-0.3vvm）。 ·添加甘油和甲醇的补料泵。 ·pH的自动控制。培养基的准备：你需要准确配置下列溶液： ·发酵所需的基本盐类（第11页） ·PTM1补充盐类（第11页） ·75ml的50％的甘油每升初始发酵液，12ml的PTM1补充盐每升甘油。 ·740ml的100％的甲醇每升初始发酵液，12ml的PTM1补充盐每升甲醇。毕赤酵母生长的测定：在不同的时间点通过测OD600的吸光值和湿细胞的重量来检测毕赤酵母的生长。培养的代谢速率通过通过观察溶氧浓度对应于有效碳源来测定。

溶氧的测定：简介：溶解氧的浓度时指氧气在培养基中的相关比例，溶氧100％是指培养基中氧达到饱和。毕赤酵母的生长需要消耗氧气，减少溶解氧的满度。毕赤酵母在生长时会消耗氧气，减少溶氧的程度。然而，因为代谢甲醇的最初阶段需要氧气，所以将溶氧浓度维持在一个适当的水平（＞20％）来确保毕赤酵母在甲醇上的生长就至关重要。准确测定和监测培养中的溶氧浓度将会为您提供关于培养状态和健康程度之类的重要信息。因此，精确校正您的发酵设备非常重要，请查阅您的操作手册。溶氧浓度的维持： 1、很难依靠发酵罐的氧气转换速率（OTR）将溶氧浓度维持在20％，特别是在小型的玻璃罐中。在玻璃发酵罐中，通气一般约为0.1-0.3vvm（1L发酵液每分钟1L氧气）来提供氧气使DO保持在20％。氧气消耗的变化依赖于所添加的甲醇的总量和蛋白质的表达。 2、在通气为0.1-0.3vvm时，氧气可达到足够的水平，这在许多玻璃发酵罐中可以通过通入无菌空气来实现。在不锈钢发酵罐中，压力可增加OTR（与K L a 有关）。 3、如果一个发酵罐不能提供足够水平的氧气，甲醇的添加需要因此适当降低。请注意降低甲醇的总量可能导致蛋白质表达水平的降低。 4、为了使蛋白质表达水平达到最大，发酵时间应被分割来以较低的流加速度添加相似水平的甲醇。对许多重组蛋白质来说，可以观察到甲醇消耗的总量和蛋白质产生的总量有直接的关系。 DO测量的用处：在毕赤酵母生长阶段，消耗氧气而使DO浓度维持在较低水平。请注意不管是在甘油或甲醇中生长，都要消耗氧气。DO浓度可用来衡量代谢速率和碳源是否受抑制，代谢速率则是培养健康程度的一个指标。如果你希望能够完全的诱导AOX1启动子，确定碳源是否受抑制就非常重要。例如：DO浓度的改变可让你确定是否在添加甲醇前所有的甘油都已耗尽，其次还可以确定甲醇流加的速率是否超过消耗的速率。过多的甲醇（＞1-2％vvm）可能会产生毒害。 DO的调控：如果碳源受到抑制，关闭碳源的添加将会导致培养理工甲醇的速率降低，DO值会上升。终止碳源的添加，观察在碳源的流加关闭后需要多长时间来使DO值上升10％。如果延迟时间很短（＜1min），说明碳源受抑制。

毕赤酵母手册

毕赤酵母表达实验手册作者：Jnuxz 来源：丁香园时间：2007-9-5 大肠杆菌表达系统最突出的优点是工艺简单、产量高、周期短、生产成本低。然而，许多蛋白质在翻译后，需经过翻译后的修饰加工，如磷酸化、糖基化、酰胺化及蛋白酶水解等过程才能转化成活性形式。大肠杆菌缺少上述加工机制，不适合用于表达结构复杂的蛋白质。另外，蛋白质的活性还依赖于形成正确的二硫键并折叠成高级结构，在大肠杆菌中表达的蛋白质往往不能进行正确的折叠，是以包含体状态存在。包含体的形成虽然简化了产物的纯化，但不利于产物的活性，为了得到有活性的蛋白，就需要进行变性溶解及复性等操作，这一过程比较繁琐，同时增加了成本。大肠杆菌是用得最多、研究最成熟的基因工程表达系统，当前已商业化的基因工程产品大多是通过大肠杆菌表达的，其主要优点是成本低、产量高、易于操作。但大肠杆菌是原核生物，不具有真核生物的基因表达调控机制和蛋白质的加工修饰能力，其产物往住形成没有活性的包涵体，需要经过变性、复性等处理，才能应用。近年来，以酵母作为工程菌表达外源蛋白日益引起重视，原因是与大肠杆菌相比，酵母是低等真核生物，除了具有细胞生长快，易于培养，遗传操作简单等原核生物的特点外，又具有真核生物时表达的蛋白质进行正确加工，修饰，合理的空间折叠等功能，非常有利于真核基因的表达，能有效克服大肠杆菌系统缺乏蛋白翻译后加工、修饰的不足。因此酵母表达系统受到越来越多的重视和利用。［1］。同时与大肠杆菌相比，作为单细胞真核生物的酵母菌具有比较完备的基因表达调控机制和对表达产物的加工修饰能力。酿酒酵母（Saccharomyces.Cerevisiae）在分子遗传学方面被人们的认识最早，也是最先作为外源基因表达的酵母宿主。1981年酿酒酵母表达了第一个外源基因----干扰素基因［2］，随后又有一系列外源基因在该系统得到表达［3、4、5、6］。干扰素和胰岛素虽然已经利用酿酒酵母大量生产并被广泛应用，当利用酿酒酵母制备时，实验室的结果很令人鼓舞，但由实验室扩展到工业规模时，其产量迅速下降。原因是培养基中维特质粒高拷贝数的选择压力消失［7、8］，质粒变得不稳定，拷贝数下降。拷贝数是高效表达的必备因素，因此拷贝数下降，也直接导致外源基因表达量的下降。同时，实验室用培养基成分复杂且昂贵，当采用工业规模能够接受的培养基时，导致了产量的下降［9］。为克服酿酒酵母的局限，1983年美国Wegner等人最先发展了以甲基营养型酵母（methylotrophic yeast）为代表的第二代酵母表达系统［10］。甲基营养型酵母包括：Pichia、Candida等．以Pichia.pastoris（毕赤巴斯德酵母）为宿主

酵母表达体系

毕赤酵母是甲醇营养型，甲醇代谢的第一步是：醇氧化酶利用氧分子将甲醇氧化为甲醛和过氧化氢。为避免过氧化氢的毒性，甲醛代谢主要在过氧化物酶体里进行，使得有毒的副产物远离细胞其余组分。由于醇氧化酶与O2 的结合率较低，因而毕赤酵母代偿性地产生大量的酶。而调控产生醇氧化物酶的启动子也正是驱动外源基因在毕赤酵母中表达的启动子。毕赤酵母含有两种醇氧化物酶，AOX1 AOX2。细胞中大多数的醇氧化酶是AOX1 基因产物。甲醇可紧密调节、诱导 AOX1 基因的高水平表达，为Mut+菌株，可占可溶性蛋白的 30%以上。AOX2 基因与 AOX1 基因有 97%的同源性，但在甲醇中带 AOX2 基因的菌株比带 AOX1 基因菌株慢得多，通过这种甲醇利用缓慢表型可分离 Muts 菌株。毕赤酵母表达外源蛋白：分泌型和胞内表达。利用含有α因子序列的分泌型载体即可。翻译后修饰：酿酒酵母与毕赤酵母大多数为 N-连接糖基化高甘露糖型，毕赤酵母中蛋白转录后所增加的寡糖链长度（平均每个支链 8-14 个甘露糖残基）比酿酒酵母中的（50-150 个甘露糖残基）短得多。菌株：GS115 （ Mut+， Muts）和 KM71（Muts）分泌型载体: pPICZα A,B,and C (5’AOX1启动子，紧密型调节，甲醇诱导表达，α分泌信号介导的分泌表达，Zeocin抗性基因，C端含有6XHis标签) 胞内表达型载体： pPICZ A,B,and C，

一：分子克隆 1.设计引物分泌型载体图谱：见酵母表达说明书（p13-pPICZ A，p14-pPICZ B,p15-pPICZ C） 2.PCR扩增基因 PCR反应体系（50μl）模板DNA 1μl Forward Primer（10μM）1μl Reverse Primer（10μM）1μl dNTP Mixture(各2mM): 4μl 5×PrimerSTAR buffer（Mg2+ plus）10μl PrimerSTAR DNA Polymerase 0.5μl ddH O up to 50μl 2 PCR 反应流程预变性98℃ 2min 变性98℃ 10sec 退火56℃ 10sec 30个循环延伸72℃ 30sec 完全延伸72℃ 10min 保存4℃ 3.双酶切及其回收双酶切反应体系（40μl） DNA(空载体或目的基因) 30μl BamHⅠ 1.5μl XholⅠ 1.5μl 10×Buffer K 4.0μl 4.酶连接首先利用1%的琼脂糖电泳将双酶切后的PCR产物和载体进行分离,并通过胶回收试剂盒回收，按照目的基因和空载体的碱基摩尔比在1:3--1:9之间，一共吸取目的基因和空载体的总体积为5μl，在加入等量的5μl DNA快速连接试剂盒SolutionⅠ，16℃连接4-6h。转化到克隆型感受态（DH5α和Top10），使用低盐LB培养基，加入25 μg/ml

毕赤酵母表达手册

版权声明：本站几乎所有资源均搜集于网络，仅供学习参考，不得进行任何商业用途，否则产生的一切后果将由使用者本人承担！本站仅仅提供一个观摩学习与交流的平台，将不保证所提供资源的完整性，也不对任何资源负法律责任。所有资源请在下载后 24 小时内删除。如果您觉得满意，请购买正版，以便更好支持您所喜欢的软件或书籍！ ☆☆☆☆☆生物秀[https://www.360docs.net/doc/d03975528.html,] ☆☆☆☆☆中国生物科学论坛[https://www.360docs.net/doc/d03975528.html,/bbs/] ☆☆☆☆☆生物秀下载频道[https://www.360docs.net/doc/d03975528.html,/Soft/] 生物秀——倾力打造最大最专业的生物资源下载平台！ ■■■ 选择生物秀，我秀我精彩！！■■■ 欢迎到生物秀论坛（中国生物科学论坛）的相关资源、软件版块参与讨论，共享您的资源，获取更多资源或帮助。

毕赤酵母多拷贝表达载体试剂盒用于在含多拷贝基因的毕赤酵母菌中表达并分离重组蛋白综述：基本特征：作为真核生物，毕赤酵母具有高等真核表达系统的许多优点：如蛋白加工、折叠、翻译后修饰等。不仅如此，操作时与E.coli及酿酒酵母同样简单。它比杆状病毒或哺乳动物组织培养等其它真核表达系统更快捷、简单、廉价，且表达水平更高。同为酵母，毕赤酵母具有与酿酒酵母相似的分子及遗传操作优点，且它的外源蛋白表达水平是后者的十倍以至百倍。这些使得毕赤酵母成为非常有用的蛋白表达系统。与酿酒酵母相似技术：许多技术可以通用：互补转化基因置换基因破坏另外，在酿酒酵母中应用的术语也可用于毕赤酵母。例如：HIS4基因都编码组氨酸脱氢酶；两者中基因产物有交叉互补；酿酒酵母中的一些野生型基因与毕赤酵母中的突变基因相互补，如HIS4、LEU2、ARG4、TR11、URA3等基因在毕赤酵母中都有各自相互补的突变基因。毕赤酵母是甲醇营养型酵母：毕赤酵母是甲醇营养型酵母，可利用甲醇作为其唯一碳源。甲醇代谢的第一步是：醇氧化酶利用氧分子将甲醇氧化为甲醛，还有过氧化氢。为避免过氧化氢的毒性，甲醛代谢主要在一个特殊的细胞器－过氧化物酶体－里进行，使得有毒的副产物远离细胞其余组分。由于醇氧化酶与O2的结合率较低，因而毕赤酵母代偿性地产生大量的酶。而调控产生醇过氧化物酶的启动子也正是驱动外源基因在毕赤酵母中表达的启动子。两种醇氧化酶蛋白：毕赤酵母中有两个基因编码醇氧化酶－AOX1及AOX2。细胞中大多数的醇氧化酶是AOX1基因产物。甲醇可紧密调节、诱导AOX1基因的高水平表达，较典型的是占可溶性蛋白的30%以上。AOX1基因已被分离，含AOX1启动子的质粒可用来促进编码外源蛋白的目的基因的表达。AOX2基因与AOX1基因有97%的同源性，但在甲醇中带AOX2基因的菌株比带AOX1基因菌株慢得多，通过这种甲醇利用缓慢表型可分离Muts菌株。表达： AOX1基因的表达在转录水平受调控。在甲醇中生长的细胞大约有5%的polyA+ RNA 来自AOX1基因。AOX1基因调控分两步：抑制/去抑制机制加诱导机制。简单来说，在含葡萄糖的培养基中，即使加入诱导物甲醇转录仍受抑制。为此，用甲醇进行优化诱导时，推荐在甘油培养基中培养。注意即使在甘油中生长（去抑制）时，仍不足以使AOX1基因达到最低水平的表达，诱导物甲醇是AOX1基因可辨表达水平所必需的。 AOX1突变表型：缺失AOX1基因，会丧失大部分的醇氧化酶活性，产生一种表型为Muts的突变株（methanol utilization slow），过去称为Mut，而Muts可更精确地描述突变子的表型。结果细胞代谢甲醇的能力下降，因而在甲醇培养基中生长缓慢。Mut+（methanol utilization plus）指利用甲醇为唯一碳源的野生型菌株。这两种表型用来检测外源基因在毕赤酵母转化子中的整合方式。蛋白胞内及分泌表达：外源蛋白可在毕赤酵母胞内表达或分泌至胞外。分泌表达需要蛋白上的信号肽序列，将外源蛋白靶向分泌通路。几种不同的分泌信号序列已被成功应用，包括几种外源蛋白本身分制作者：陈苗商汉桥

CHO细胞表达系统与酵母细胞表达系统比较

CHO细胞表达系统与酵母细胞表达系统比较 CHO细胞表达系统与毕赤酵母表达系统是当前发展前景看好的两个表达系统，为了能够更加直观地对两个表达系统有一定的认识，特意在此篇中对两个表达系统作一定的比较，从而能够更进一步的对两个表达系统有更深的了解 1．CHO细胞表达系统（1）优点 CHO细胞属于成纤维细胞，既可以贴壁生长。也可以悬浮生长。目前常用的CHO细胞包括原始CHO和二氢叶酸还原酶双倍体基因缺失型(DHFR-)突变株CHO。近年来，为降低生产成本和减少血制品带来的潜在危害性，动物细胞生产开始使用无血清培养基(SFM)，但SFM往往导致细胞活力差，贴壁性差，分泌外源蛋白的能力差等缺点。另有研究者尝试将类胰岛素生长因子IGF基因和转铁蛋白基因转入CHO细胞获得能自身分泌必需蛋白的“超级CHO”，无需在培养基中转铁蛋白和胰岛素，细胞可在SFM 中生长良好。与其他表达系统相比，CHO表达系统具有以下的优点： (1)具有准确的转录后修饰功能，表达的蛋白在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近于天然蛋白分子； (2)既可贴壁生长，又可以悬浮培养，且有较高的耐受剪切力和渗透压能力； (3)具有重组基因的高效扩增和表达能力，外源蛋白的整合稳定； (4)具有产物胞外分泌功能，并且很少分泌自身的内源蛋白，便于下游产物分离纯化； (5)能以悬浮培养方式或在无血清培养基中达到高密度培养。且培养体积能达到1000L以上，可以大规模生产。（2）存在的问题在过去的几十年里，人类对动物细胞的培养技术进行了大量的研究开发，取得了很大进展，但是利用CHO细胞表达外源基因的技术水平尚不能满足生物药品的开发和生产的要求，目前上游工作中主要存在以下问题： ①构建的重组CHO细胞生产效率低，产物浓度亦低； ②某些糖基化表达产物不稳定，不易纯化； ③重组CHO细胞上游构建与下游分离纯化脱节，主要表现在上游构建时着重考虑它的高效表达，而对高教表达的产物是否能有效地提取出来，即分离纯化过程考虑较少； ④重组细胞培养费用昂贵，自动化水平低下。 2．毕赤酵母细胞表达系统（1）特点自1987年Gregg等首次在毕赤酵母中表达乙型肝炎表面抗原(HBsAg)到1995年，已有四十多种外源蛋白在毕赤酵母宿主菌中获得表达。而最近几年每年报道的在毕赤酵母中表达的外源基因就有几十种，且一年比一年多，与其它表达系统相比，毕赤酵母表达系统具有以下优势： 1）含有特有的强有力的AOX（醇氧化酶基因）启动子，用甲醇可严格地调控外源基因的表达； 2）表达水平高，即可在胞内表达，又可分泌型表达。毕赤酵母中，报道的最高表达量为破伤风毒素C为12g/l，一般大于1g/l。绝大多数外源基因比在细菌、酿酒酵母、动物细胞中表达水平高。一般毕赤酵母中外源基因都带有指导分泌的信号肽序列，使表达的外源目的蛋白分泌到发酵液中，有利于分离纯化； 3）发酵工艺成熟，易放大。已经有大规模工业化高密度生产的发酵工艺，且细胞干重达100g/l 以上，表达重组蛋白时，已成功放大到10000升； 4）培养成本低，产物易分离。毕赤酵母所用发酵培养基十分廉价，一般碳源为甘油或葡萄糖及甲

毕赤酵母表达操作手册(精译版)

2020年毕赤酵母表达系统资料整理

作者：非成败作品编号：92032155GZ5702241547853215475102 时间：2020.12.13 毕赤酵母表达系统 Mut+和Muts 毕赤酵母中有两个基因编码醇氧化酶——AOX1及AOX2，细胞中大多数的醇氧化酶是AOX1基因产物，甲醇可紧密调节、诱导AOX1基因的高水平表达，较典型的是占可溶性蛋白的30%以上。AOX1基因调控分两步：抑制/去抑制机制加诱导机制。简单来说，在含葡萄糖的培养基中，即使加入诱导物甲醇转录仍受抑制。为此，用甲醇进行优化诱导时，推荐在甘油培养基中培养。注意即使在甘油中生长(去抑制)时，仍不足以使AOX1基因达到最低水平的表达，诱导物甲醇是AOX1基因可辨表达水平所必需的。AOX1基因已被分离，含AOX1启动子的质粒可用来促进编码外源蛋白的目的基因的表达。AOX2基因与AOX1基因有97%的同源性，但在甲醇中带AOX2基因的菌株比带AOX1基因菌株慢得多，通过这种甲醇利用缓慢表型可分离Muts菌株。在YPD(酵母膏、蛋白胨、葡萄糖)培养基中，不论是Mut+还是Muts其在对数期增殖一倍的时间大约为2h。Mut+和Muts菌株在没有甲醇存在的情况下生长速率是一样的，存在甲醇的情况下，Mut+在对数期增殖一倍的时间大约为4至6个小时，Muts在对数期增殖一倍的时间大约为18个小时。菌株GS115、X-33、KM71和SMD1168的区别 GS115、KM71和SMD1168等是用于表达外源蛋白的毕赤酵母受体菌，与酿酒酵母相比，毕赤酵母不会使蛋白过糖基化，糖基化后有利于蛋白的溶解或形成正确的折叠结构。GS115、KM71、SMD1168在组氨酸脱氢酶位点(His4)有突变，是组氨酸缺陷型，如果表达载体上携带有组氨酸基因，可补偿宿主菌的组氨酸缺陷，因此可以在不含组氨酸的培养基上筛选转化子。这些受体菌自发突变为组氨酸野生型的概率一般低于10-8。GS115表型为Mut+，重组表达载体转化GS115后，长出的转化子可能是Mut+，也可能是Muts(载体取代AXO1基因)，可以在MM和MD培养基上鉴定表型。SMD1168和GS115类似，但SMD1168基因组中的Pep4基因发生突变，是蛋白酶缺陷型，可降低蛋白酶对外源蛋白的降解作用。其中X-33由于是野生型，因此耐受性比较好，如果担心转化率的话可以考虑这种酵母菌，而X33与GS115一样都是属于MUT＋表现型，也就是说可以在含甲醇的培养基中快速生长，但是据说会对外源基因表达有影响， KM71的亲本菌在精氨酸琥珀酸裂解酶基因(arg4)有突变，在不含精氨酸的培养基中不能生长。用野生型ARG4基因(约2kb)插入到克隆的野生型AOX1基因的BamHI(AOX1基因15/16密码子)及SalI(AOX1基因227/228密码子)位点，取代了AOX1基因16-227密码子，此结构转化至KM71亲本菌(arg4his4)中，分离产生KM71 MutsArg+His-菌株，Arg+转化子遗传分析显示野生型AOX1被aox1::ARG4结构所取代，所以KM71所有转化子都是Muts 表型。AOX1位点没有被完全缺失，理论上可用你的目的结构通过基因取代方法替换

毕赤酵母表达经验总结

毕赤酵母表达经验总结甲醇酵母表达系统有不少优点，其中以Invitrogen公司的Pichia酵母表达系统最为人熟知，并广泛应用于外源蛋白的表达。虽然说酵母表达操作简单表达量高，但是在实际操作中，并不是每个外源基因都能顺利得到高表达的。不少人在操作中会遇到这样那样的问题，生物通编者特地收集了部分用户在使用EasySelect Pichia Expression System这个被誉为最简单的毕赤酵母表达的经典试剂盒过程中的心得体会。其中Xiang Yang是来自美国乔治城大学（Georgetown University）Lombardi癌症中心（Lombardi Cancer Center），部分用户来自国内。甲基酵母部分优点与其他真核表达系统比较与原核表达系统比较 1.属于真核表达系统，具有一定的蛋白质翻译后加工，有利于真核蛋白的表达优点-+ 2.AOX强效启动子，外源基因产物表达量高，可以达到每升数克表达产物的水平++++ 3.酵母培养、转化、高密度发酵等操作接近原核生物，远较真核系统简单，非常适合大规模工业化生产。+++= 4.可以诱导表达，也可以分泌表达，便于产物纯化。=+ 5.可以甲醇代替IPTG作为诱导物，部分甲醇酵母更可以甲醇等工业产物替代葡萄糖作为碳源，生产成本低++++ + 表示优胜于；- 表示不如；= 表示差不多 EasySelect Pichia Expression System 产品性能：优点——使用简单，表达量高，His-tag便于纯化缺点——酵母表达蛋白有时会出现蛋白切割问题全面产品报告及心得体会：巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）是一种能高效表达重组蛋白的酵母品种，一方面由于其是属于真核生物，因此表达出来的蛋白可以进行糖基化修饰，另一方面毕赤酵母生长速度快，可以将表达的蛋白分泌到培养基中，方便蛋白纯化。毕赤酵母表达载体pPICZ在多克隆位点（MCR）3'端带有his-tag和c-myc epitopes，这些tag有利于常规检测和纯化，而且在MCR5'端引入了alpha factor（α-factor）用以增加表达，并且在表达后α-factor 可以自动被切除。在进行克隆的时候，如果你选择的是EcoRI，那么只需在目标蛋白中增加两个氨基酸序列即可完成。另外pPICZ系列选用的是Zeocin抗生素作为筛选标记，而诱导表达的载体需要甲醇——甲醇比一般用于大肠杆菌表达诱导使用的IPTG便宜。第一步——构建载体 Xiang Yang：pPICZ系列有许多克隆位点可供选择，同时也有三种读码框以便不用的用户需要。红叶山庄：有关是选择pPIC9K还是pPICZ系列？pPIC9K属于穿梭质粒，也可以在原核表达，而pPICZ系列比较容易操作，大肠和毕赤酵母均用抗Zeocin筛选（PIC9K操作麻烦一点，大肠用amp抗性，而毕赤酵母先用His缺陷筛选阳性克隆，在利用G418筛选多拷贝），而且对于大小合适（30—50KD）的蛋白在产量上是pPIC9K无法比拟的。leslie：要做毕赤酵母表达实验，首先当然就要了解这个可爱的酵母了（椭圆形，肥嘟嘟的，十分可爱），她和大肠杆菌长得有较大区别（大肠杆菌是杆状的），因此在培养的过程中要区别这两种菌体，除了气味，浓度，颜色以外，也可以取样到显微镜中观测。大家做毕赤表达的时候应该都遇过这种情况吧，表达过程中染菌（我们实验室曾经污染过各种颜色形状的细菌，那真是一段可怕的经历），如果在不知情的情况下继续做下去，那可以就是浪费大把的时间了。基本熟悉了毕赤酵母，了解了她生长的喜好（多糖偏酸环境），生长的周期等等情况后，当然更多的精力还是应该花在表达的目的蛋白上，我的表达蛋白有些恐怖，有100KD，本来当然应该放在大肠杆菌中表达，但是为了分泌表达（其实后来发现大肠杆菌pET系列分泌表达系列也不错）和糖基化修饰（主要是这个方面，因为我的蛋白是人源的，表达出来用于酵母双杂，因此需要有完备的糖基化修饰）。这样我的DNA片段由于较长，所以在做克隆的时候也要非常小心，需要注意的是： ①酶切位点不能出现在目的DNA片段中——如果片段长无法避免，可以采用平末端连接； ②虽然α-factor可以自动切除，但是在设计表达的时候，如果在N端不能出现任何多余的aa（比如药物蛋白表达），需要特别留意（说明书上有详细说明：P13）； ③有三种不同的读码框（对于pPICZα系列来说就是对上α-factor序列），在设计克隆的时候要反复确