温度、pH、激活剂、抑制剂对酶活性的影响
温度、pH、激活剂、抑制剂对酶活性的影响
（间接碘量法）
（effects of temperature pH activitor and inhibitor to activity of enzyme）
一、目的
1.了解温度、pH、激活剂、抑制剂对酶活性的影响
2.学习酶活性的判定
二、原理
酶活性大小可以用反应速度来表示，即在单位时间内，酶所催化底物的消耗量或产物的生成量来衡量。酶活性大，反应速度就快。反之则慢。酶促反应速度受多种因素的影响。如温度、pH、激活剂、抑制剂等。
本实验是观察在不同温度，pH，以及缺乏激活剂或有抑制剂的条件下唾液淀粉酶的活性大小。借以验证各种因素对酶活性的影响。
唾液中含有唾液淀粉酶，此酶可以使淀粉逐步水解，最后生成麦芽糖。麦芽糖具有还原性。根据淀粉被唾液淀粉酶水解后产物的生成量（即还原性麦芽糖的多少）判定酶活性的大小。用碘的反滴定法测定还原物的量，还原物多，酶活性大。
具体反应如下：
1、试剂成分（S、H、S试剂）：CuSO
4、Na
2
CO
3
、NaHCO
3
、KI、KIO
3
、酒石
酸钾钠、草酸钾。
2、判定酶活性大小的化学反应过程：
Na
2CO
3
＋2H
2
O —→2NaOH ＋ H
2
CO
3
CuSO
4＋2NaOH —→Cu(OH)
2
↓＋ Na
2
SO
4
5KI ＋KIO
3 ＋ 3H
2
SO
4
—→3I2＋3K2SO4 ＋3H2O
酶
淀粉———→麦芽糖麦芽糖＋Cu++—→麦芽糖氧化产物＋Cu+ Cu+＋ I
2
—→Cu++ ＋ 2I-
COO- 草酸钾COO-
Cu++＋|—————→| >Cu
COO- 防止逆反应COO-
剩余I
2 ＋ Na
2
S
2
O
3
—→2I- ＋ Na2S4O6
（与淀粉呈兰色) （与淀粉无色)
3、判定酶活性大小的标志
酶活性大→麦芽糖多→Cu+ 生成量多→I
2
消耗量多→
剩余I
2少→Na
2
S
2
O
3
消耗量少
酶活性越大，Na
2S
2
O
3
消耗量越少。空白实验无酶活性，因此Na
2
S
2
O
3
消耗量最
多。与空白实验进行对比，差值越大，说明此条件下酶活性越大。
三、实验用品：
（一）器材
1.中试管16支。
2.试管架1个。
3.恒温水浴箱1台。
4.温度计1支。
量筒1个。
6.吸管： 1支，1ml 2支，2ml 1支，5ml 1支，10ml 1支。
7. 25ml、100ml烧杯各1个。
8.电炉子一个。
（二）试剂
% 淀粉溶液
NaCl溶液：称取，溶于1000ml水中。
3.磷酸盐缓冲液
甲液：称取Na
2HPO
4
·12H
2
O 溶于1000ml水中，既为M/15 Na
2
HPO
4
溶液，此
溶液pH为。
乙液：称取溶于1000ml水中，既为M/15 KH
2PO
4
溶液，此溶液pH为。
取甲液，乙液，两液混匀后既为pH 磷酸盐缓冲液。
4. 0.01% HgCl
2。
H
2SO
4
溶液：取水约250ml，加入浓H
2
SO
4
28ml，稀释至1000ml。
试剂（S、H、S试剂）
溶液A：结晶硫酸铜（）溶于100ml水中。
溶液B：酒石酸钾钠12g，无水碳酸钠20g，碳酸氢钠25g溶于500ml水中。
溶液C：碘化钾10g，碘酸钾，草酸钾18g溶于300ml水中。
将溶液B倒入溶液A中混匀，再倒入溶液C混匀后定容至1000ml。
7.标准 Na
2S
2
O
3
溶液：取硫代硫酸钠（）25g溶于1000ml水中。此溶液浓度
约为，其准确浓度须用碘酸钾标准方法标定。（方法略）
取已调整至标准Na
2S
2
O
3
溶液50ml稀释至1000ml即为。
四、实验步骤：
1、制备稀释唾液：收集唾液于小烧杯内，吸取下层唾液（要求无气泡）加入量筒内，用蒸馏水稀释至25ml，混匀备用。
2、取中试管8支，标号0—7，0号为空白对照，1-3号为测定温度对酶活性的影响，4-5号为pH对酶活性的影响，6-7号为激活剂和抑制剂对酶活性的影响
按下表操作。加入试剂及唾液后各管充分混匀。
影响因素管号淀粉 NaCl 缓冲溶液 H2O 温度稀释温度
（ml）（ml） pH ml ml 时间唾液时间
空白 0 37℃ 10ˊ -- 37℃20ˊ
温度的 1 37℃ 10ˊ 37℃20ˊ
影响 2 10℃ 10ˊ 10 ℃20ˊ
3 80 ℃10ˊ 80℃20ˊ
pH值的 4 37℃ 10ˊ 37℃20ˊ
影响 5 37℃ 10ˊ 37℃20ˊ
激活剂 6 — 6 .6 37 ℃10ˊ 37℃20ˊ
抑制剂 7 HgCL2 6 .6 37 ℃10ˊ 37℃20ˊ
的影响（2ml）
3、充分混匀后开始保温，保温后立即由各管吸取2ml分别加入已预先加入2ml S、H、S试剂相应号码的试管中，并充分混匀。
4、各管放入沸水中加热8分钟。
5、向各管加入1N H
2SO
4
2ml，轻轻摇动至不产生气泡为止。
6、以 Na
2S
2
O
3
滴定各管，至蓝色消退为止。并记录结果。
7、由零号试管消耗Na
2S
2
O
3
ml数分别减去其余各管所消耗ml数，以此结果
判定各种因素对酶活性的影响。
五、实验结果与分析（略）
思考题：
1.本实验判定酶活性大小的化学反应过程是什么？为什么酶的活性越大，消
耗Na
2S
2
O
3
越少？
3.加入H
2SO
4
的作用是什么？
3.根据实验结果分析温度、pH、激活剂、抑制剂对酶活性的影响。
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温度PH激活剂和抑制剂对酶活性的影响
（一）、温度、PH对酶活性的影响 一、实验目的 了解温度对酶活性的影响。了解酶活性的最适PH及掌握一种检测最适PH的方法。 二、实验原理 三、实验步骤 1、温度对酶活性的影响 取3支试管，编号后按下表加入试剂 试管编号 试剂 1 2 3 0.2%淀粉溶液 1.5 1.5 1.5 无 稀释唾液/ml 1 1 煮沸过的稀释唾液/ml 无无 1 摇匀后，将1、3号两试管放入37摄氏度恒温水浴中，2号试管放入冰水中。10min后取出，将2号试管内的液体分为两半，用碘化钾-碘溶液来检验1、2、3号试管内淀粉被唾液淀粉酶水解的程度。将2号试管剩下的一半溶液放入37摄氏度水浴中继续保温10min后，再用碘液检验，结果如何？记录并解释结果。 注意事项： 1、唾液制备时，先用蒸馏水漱口，以清除食物残渣，再含一小口蒸馏水，0.5~1min 后，使其流入量筒，并稀释到50ml。 2、PH对酶活性的影响 取4个标有号码的20ml试管。用吸管按下表添加0.2mol/L磷酸氢二钠溶液和 0.1mol/L柠檬酸溶液以制备PH=5.0~8.0的4种缓冲液。 试管编号 试剂 1 2 3 4 0.2mol/L磷酸氢二钠/ml 5.15 6.05 7.72 9.72 0.1mol/L柠檬酸/ml 4.85 3.95 2.28 0.28 PH 5 5.8 6.8 8 从4个试管中各取缓冲液3ml，分别注入到4支带有号码的试管中，随后于每个试管中添加0.5%淀粉溶液2ml和稀释唾液2ml。向各试管中加入稀释唾液的时间间隔分别为1min。将各试管内容物混匀，并依次置于37摄氏度恒温水浴中保温。 第四管加入唾液2min后，每隔1min由第二管取出一滴混合液，置于白瓷板上，加1滴碘化钾-碘溶液，检验淀粉的水解程度。待混合液变为棕黄色时，向所有试管中依次添加1或2滴碘化钾-碘溶液。添加碘化钾-碘溶液的时间间隔从第一管起，均为1min。 观察各试管内容物呈现的颜色，分析PH对唾液淀粉酶活性的影响。 注意事项： 1、从第三管中取混合液，是因为它的PH接近唾液淀粉酶的最适PH。
实验六淀粉酶的专一性和温度pH激动剂抑制剂对酶活性的影响
实验六淀粉酶的专一性和温度、pH、激活剂 及抑制剂对酶活性的影响 实验类型：验证型 目的和要求 1.通过本实验观察、验证酶的专一性和温度、pH、激动剂及抑制剂对酶活性的影响。 2.熟悉淀粉及其酶解产物的特殊显色方法；电热恒温水浴的使用。 3.了解唾液淀粉酶的收集与预处理。 原理 酶具有高度专一性，一种酶只能催化一种或一类底物发生反应，如淀粉酶只能水解淀 粉，不能水解蔗糖。当淀粉被淀粉酶彻底水解为还原性麦芽糖和葡萄糖时，能使班氏试剂 的Cu2+还原成Cu1+，生成砖红色Cu2O沉淀。淀粉酶的活性受温度、pH、激动剂及抑制剂、 酶浓度以及作用时间等多种因素影响，因而水解淀粉生成一系列分子大小不同的糊精。不 同程度的水解糊精可与碘反应生成紫色、棕色或红色络合物。通过上述特征性反应，并以 蔗糖等作对照，便可观察、验证淀粉酶是否具有专一性以及它的催化活性是否受到影响。 操作方法 一、唾液淀粉酶的收集与处理 1.制备唾液 实验者先将痰咳尽，用自来水漱口，以清除口腔内食物残渣，再在口腔内含蒸馏水约15ml，并作咀嚼咕漱运动，3分钟后吐入垫有两层经润湿处理的脱脂纱布的漏斗内，过滤于小烧杯 中备用，为与下面稀释唾液相区别，此称制备唾液。 2.煮沸唾液 取上述唾液约2ml，盛入1中号试管中,置沸水浴煮沸5分钟备用。 3.稀释唾液 调整唾液淀粉酶活性，使之在pH6.8、37℃和既无激动剂又无抑制剂条件下，作用5min，水解淀粉至红色糊精为宜。具体做法是取12凹白瓷反应板一块，按下列步骤操作： ①第1排每凹各加1滴制备唾液，12、13、14凹分别加生理盐水1、2、3滴，用滴管采用抽吸法，由稀到浓（14→１2）小心混匀各凹，勿使溅入相邻凹中。每混匀一凹便取其1滴放入同列的2排凹中，剩余稀释唾液应全部放回原凹中。 ②在盛有不同稀释度唾液的第2排各凹中，均加入4滴缓冲液（pH6.8），2滴1%的淀粉液和2滴蒸馏水，用①混匀法充分混匀，置37℃下5min。 ③在第2排各凹中加I液一滴，混匀，观察比较各凹颜色，以浅棕-红色对应的稀释倍数， 用生理盐水稀释3ml制备唾液备用。 二、唾液淀粉酶的专一性以及温度、pH、激活剂和抑制剂对唾液淀粉酶活性影响的观察
实验二_温度、PH、激活剂和抑制剂对酶活性的影响_预习
实验二温度、pH、激活剂和抑制剂对酶活性的影响 温度、p H对酶活性的影响 一、实验目的 了解温度对酶活性的影响。了解酶活性的最适pH及掌握一种检测最适pH的方法。 二、实验原理（请同学们自已补充） 三、实验步骤 1、温度对酶活性的影响 取3支试管，编号后按下表加入试剂 试管编号 试剂 1 2 3 0.2%淀粉溶液（d） 1.5 1.5 1.5 稀释唾液/ml 1 1 无 煮沸过的稀释唾液/ml 无无 1 摇匀后，将1、3号两试管放入37摄氏度恒温水浴中，2号试管放入冰水中。10min后取出，将2号试管内的液体分为两半，用碘化钾-碘溶液来检验1、2、3
号试管内淀粉被唾液淀粉酶水解的程度。将2号试管剩下的一半溶液放入37摄氏度水浴中继续保温10min后，再用碘液检验，结果如何？记录并解释结果。 注意事项： 唾液制备时，先用蒸馏水漱口，以清除食物残渣，再含一小口蒸馏水，0.5~1min后，使其流入量筒，并稀释到50ml。 2、pH对酶活性的影响 取4个标有号码的20ml试管。用吸管按下表添加0.2mol/L磷酸氢二钠溶液和0.1mol/L柠檬酸溶液以制备pH=5.0~8.0的4种缓冲液。 试剂 试管编号 1 2 3 4 0.2mol/L磷酸氢二钠/ml 5.1 5 6.0 5 7.7 2 9.7 2 0.1mol/L柠檬酸/ml 4.8 5 3.9 5 2.2 8 0.2 8 pH 5 5.8 6.8 8 从4个试管中各取缓冲液3ml，分别注入到4支带有号码的试管中，随后于每个试管中添加0.5%淀粉溶液2ml和稀释唾液2ml。向各试管中加入稀释唾液的时间间隔分别为1min。将各试管内容物混匀，并依次置于37摄氏度恒温水浴中保温。 第4管加入唾液2min后，每隔1min由第2管取出一滴混合液，置于白瓷板上，加1滴碘化钾-碘溶液，检验淀粉的水解程度。待混合液变为棕黄色时，向所有试管中依次添加1或2滴碘化钾-碘溶液。添加碘化钾-碘溶液的时间间隔从第1管起，均为1min。 观察各试管内容物呈现的颜色，分析pH对唾液淀粉酶活性的影响。 注意事项：
温度、pH、激活剂、抑制剂对酶活性的影响
温度、pH、激活剂、抑制剂对酶活性的影响 （间接碘量法） （effects of temperature pH activitor and inhibitor to activity of enzyme） 一、目的 1.了解温度、pH、激活剂、抑制剂对酶活性的影响 2.学习酶活性的判定 二、原理 酶活性大小可以用反应速度来表示，即在单位时间内，酶所催化底物的消耗量或产物的生成量来衡量。酶活性大，反应速度就快。反之则慢。酶促反应速度受多种因素的影响。如温度、pH、激活剂、抑制剂等。 本实验是观察在不同温度，pH，以及缺乏激活剂或有抑制剂的条件下唾液淀粉酶的活性大小。借以验证各种因素对酶活性的影响。 唾液中含有唾液淀粉酶，此酶可以使淀粉逐步水解，最后生成麦芽糖。麦芽糖具有还原性。根据淀粉被唾液淀粉酶水解后产物的生成量（即还原性麦芽糖的多少）判定酶活性的大小。用碘的反滴定法测定还原物的量，还原物多，酶活性大。 具体反应如下： 1、试剂成分（S、H、S试剂）：CuSO 4、Na 2 CO 3 、NaHCO 3 、KI、KIO 3 、酒石 酸钾钠、草酸钾。 2、判定酶活性大小的化学反应过程： Na 2CO 3 ＋2H 2 O —→2NaOH ＋ H 2 CO 3 CuSO 4＋2NaOH —→Cu(OH) 2 ↓＋ Na 2 SO 4 5KI ＋KIO 3 ＋ 3H 2 SO 4 —→3I2＋3K2SO4 ＋3H2O 酶 淀粉———→麦芽糖麦芽糖＋Cu++—→麦芽糖氧化产物＋Cu+ Cu+＋ I 2 —→Cu++ ＋ 2I- COO- 草酸钾COO- Cu++＋|—————→| >Cu COO- 防止逆反应COO- 剩余I 2 ＋ Na 2 S 2 O 3 —→2I- ＋ Na2S4O6 （与淀粉呈兰色) （与淀粉无色) 3、判定酶活性大小的标志 酶活性大→麦芽糖多→Cu+ 生成量多→I 2 消耗量多→ 剩余I 2少→Na 2 S 2 O 3 消耗量少 酶活性越大，Na 2S 2 O 3 消耗量越少。空白实验无酶活性，因此Na 2 S 2 O 3 消耗量最 多。与空白实验进行对比，差值越大，说明此条件下酶活性越大。
生物化学实验四：酶的激活和抑制作用
生物化学实验四：酶的激活和抑制作用 指导教师：张继红 一、目的和要求： ①让学生初步认识酶的性质，了解酶促反应的激活剂与抑制剂； ②学习检定激活剂和抑制影响酶反应的方法和原理； 二、实验原理： 酶是具有高效专一催化活性的蛋白质，其活性常受温度PH及些物质的影响。某些物质可以增加其活性，称为激活剂；某些物质能降低其活性，称为抑制剂。很少量的激活剂或抑制剂就会影响酶的活性，而且这种作用常常具有特异性。但要注意的是激活剂和抑制不是绝对的，有些物质在低浓度时为某种酶的激活剂时却为另一种酶的抑制剂，而在高浓度时则为该酶的激活剂（如NaCl）。 三、实验材料及用具 1、1%淀粉溶液 2、1%氯化钠溶液 3、碘化钾-碘溶液：将碘化钾20g和碘10g溶解在100ml水中，使用前稀释10倍。 4、稀释100倍~200倍的新鲜唾液 5、0.1%硫酸铜溶液 6、0.1%Na2SO4溶液 四、主要步骤： 激活剂和抑制的认识：取4支试管，按下表加试剂： 管号 1 2 3 4 0.1%淀粉（ml） 1.5 1.5 1.5 1.5 1%CuSO4（ml）0.5 / / / 1%NaCl（ml）/ 0.5 / / 1%Na2SO4（ml）/ / 0.5 / 水/ / / 0.5 稀淀粉酶（ml）0.5 0.5 0.5 0.5 保温（37℃）10分钟后 KI-I22-3d 2-3d 2-3d 2-3d 现象 五、注意事项： 1、激活剂抑制剂实验中淀粉酶要最后加（为什么？）
2、加入淀粉时要小心，不要沾到试管壁；另外，摇匀时也不宜用力过猛， 使淀粉溶液或淀粉粒过多地沾在试管壁上，这样会影响结果的观察，误差较大。 六、作业： 1、试说明本实验第3号管的意义，并推出Cl-和Cu2+各是唾液酶的激活剂还是抑制剂？举例说明抑制与变性剂有何异同？ 2、为什么温度对酶的活性具有双重影响？