高分辨率溶解曲线和TEAL-TIME PCR

Real-time：是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监控整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。

（二）.两者的采集过程

HRM：高分辨率熔解曲线（HRM）是在PCR反应之后，对PCR产物进行升温变性，采集荧光信号的变化，绘制成不同形状的曲线。Real-time：是在PCR过程中采集荧光信号。

（三）.两者的应用

HRM：筛查未知突变和针对已知位点进行基因分型。基因分型的方法为非标记探针法和小片段法。

Real-time：定量及基因分型。基因分型的方法是：Taqman探针，水解探针等。

（四）.基因分型方法的费用

HRM基因分型方法的费用远低于Taqman探针和水解探针。（五）.两者所用的染料

HRM：LC Green饱和染料，能与DNA双链的碱基紧密结合，不抑制PCR反应，在PCR反应过程中是过饱和的状态。

Real-time：SYBR Green不饱和染料，不能与DNA双链的碱基紧密结合，浓度高时会抑制PCR反应，只能少量加入。

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高分辨熔解曲线

高分辨熔解曲线(high-resolution melt，HRM)分析技术是近几年来在国外兴起的一种用于突变扫描和基因分型的最新遗传学分析方法。它是一种高效稳健的PCR 技术，不受突变碱基位点与类型局限，无需序列特异性探针，在PCR 结束后直接运行高分辨熔解，即可完成对样品突变、单核苷酸多态性-SNP 、甲基化、配型等的分析。因操作简便快速，使用成本低，结果准确，实现了真正的闭管操作，HRM技术受到普遍关注。 HRM 原理 HRM 的主要原理是根据DNA 序列的长度，GC 含量以及碱基互补性差异，应用高分辨率的熔解曲线对样品进行分析，其极高的温度均一性和温度分辨率使分辨精度可以达到对单个碱基差异的区分。同许多荧光 PCR 技术一样，HRM 是利用了特定的染料可以插入DNA 双链中的特性，通过实时监测升温过程中双链DNA 荧光染料与PCR 扩增产物的结合情况记录高分辨率熔解曲线，从而对样品进行检测。如在SNP 的检测中，SNP 位点由于不匹配双链DNA 在升温过程中会先解开，荧光染料从局部解链的DNA 分子上释放，从荧光强度与时间曲线上就可以判断是否存在SNP，而且不同SNP 位点、杂合子与否等都会影响熔解曲线的峰形，因此HRM 分析能够有效区分不同SNP 位点与不同基因型。随着高精度PCR 仪（LightCycler 480 和Rotor-Gene 6000）和饱和性染料（LC Green 、Eva Green 等）的出现为HRM 这一技术的普及使用成为可能。 HRM 特点由于HRM 完全是基于核酸的物理性质进行分析，因而无需序列特异性探针。基于这种检测原理，HRM 检测不受突变碱基位点和种类的局限，既可以对未知突变进行筛查、扫描，又可以对已知突变进行分析，亦可用于短片段重复序列的分析，所需要的只是在常规 PCR 基础上增加一个饱和染料。所以，相比传统的SNP 或突变分析法和定量探针法，简化了操作时间和步骤，大大降低了使用成本，并且实现了闭管操作，使其用于临床常规化检测成为可能。高分辨率熔解曲线分析可以鉴别出PCR 产物中杂合的单碱基突变这种方法比起普通的技术来说有更好的灵敏性和特异性。采用这种方法进行的突变的检测不依赖于突变在片段中所在的位置。当片段的大小在400 bp 或者更小时，灵敏性最高。除了能鉴定出未知的杂合突变，高分辨率熔解曲线还可以被用来鉴定特定位点的突变，在这种情况下，扫描未知突变和进行基因分型可以结合在一起，使得分析更为简单。对于目前绝大多数的突变分析方法来说，都很难鉴定出纯合子序列突变。在一些不同种类的小的扩增片段中，高分辨率熔解曲线则显示出了鉴定纯合子序列突变的能力，这种方法能鉴定出大多数的纯合突变。HRM 技术在遗传学研究方面也带来很大便利，只需在PCR 反应体系中加入双链DNA 饱和荧光染料，在PCR 反应之后再花15 分钟，就可以完成96 或384 个样品的DNA 变异扫描。HRM 在这些方面的优势使其具有极强的可操作性，成为近年来国外新兴的遗传学、方法学研究和应用热点。 HRM 技术优势

高分辨率溶解曲线

北京泰格瑞分子检验有限公司高分辨率熔解曲线高分辨率熔解（High-resolution melting，简称HRM）分析的主要原理是由于DNA序列的片段长短，GC含量、分布以及碱基互补性差异等的不同，在DNA 分子热变性时会使溶解曲线的形状和位置有所不同。同许多荧光PCR技术一样，HRM 利用特定的染料可以插入DNA 双链中的特性，通过实时监测温度变化过程中双链DNA 荧光染料与PCR扩增产物的结合情况记录高分辨率熔解曲线，从而对样品进行检测, 可以迅速的检测出核酸片段中 GC 含量和单碱基的突变。高精度PCR 仪及饱和性染料（LC Green 、Eva Green 等）的出现使HRM得到广泛的普及和应用。项目：已知SNP位点检测；外显子突变位点筛查；物种鉴定、品种鉴定；甲基化研究；法医学鉴定、亲子鉴定。样本要求：新鲜或异硫氰酸胍保存的细胞(﹥5×106)、组织(﹥50mg)、血液(﹥300μl)等样本原材料，或纯化好的DNA(OD260/OD280在 1.7-1.9之间)、总RNA(OD260/OD280在1.9-2.1之间，完整性好)，或反转录好的cDNA不少于30μl(纯度在1.9-2.1之间，及反转录好的cRNA完整性好)。技术优势：高通量：1 次可同时检测多个样本。高敏度：HRM 检测灵敏度达1%-0.1% ，是传统“PCR+ 测序”方法25-250 倍。特异性好：PCR 产物无需后续处理，特异性强。重复性好：样品经PCR 扩增后直接进行HRM，直接在同一个PCR 管内进行分析，实现闭管操作，避免交叉污染。操作简便：只需设计PCR 引物，进行PCR 反应，无需序列特异性探针，无需测序，也不受突变碱基位点与类型的局限。成本低：相比传统的SNP/突变分析法和定量探针法，简化了操作步骤，缩短了实验时间，大大降低了使用成本。

溶解热的测定

实验七溶解热的测定一、实验目的 1.掌握采用电热补偿法测定热效应的基本原理。 2.用电热补偿法测定硝酸钾在水中的积分溶解热，并用作图法求出硝酸钾在水中的微分溶解热、积分稀释热和微分稀释热。 3.掌握溶解热测定仪器的使用。二、实验原理物质溶解过程所产生的热效应称为溶解热，可分为积分溶解热和微分溶解热两种。积分溶解热是指定温定压下把1mol 物质溶解在n 0mol 溶剂中时所产生的热效应。由于在溶解过程中溶液浓度不断改变，因此又称为变浓溶解热，以△sol H 表示。微分溶解热是指在定温定压下把1mol 物质溶解在无限量某一定浓度溶液中所产生的热效应，以表示.在溶解过程中浓度可视为不变，因此又称为定浓度溶解热，以0 ,,)(n p T sol n H ???表示，即定温、定压、定溶剂状态下，由微小的溶质增量所引起的热量变化。稀释热是指溶剂添加到溶液中，使溶液稀释过程中的热效应，又称为冲淡热。它也有积分（变浓）稀释热和微分（定浓）稀释热两种。积分稀释热是指在定温定压下把原为含1mol 溶质和n 01mol 溶剂的溶液冲淡到含n 02mol 溶剂时的热效应，它为两浓度的积分溶解热之差。微分稀释热是指将1mol 溶剂加到某一浓度的无限量溶液中所产生的热效应，以n p T sol n H ,,0 )(???表示，即定温、定压、定溶质状态下，由微小的溶剂增量所引起的热量变化。积分溶解热的大小与浓度有关，但不具有线性关系。通过实验测定，可绘制出一条积分溶解热△sol H 与相对于1mol 溶质的溶剂量n 0之间的关系曲线，如图1所示，其他三种热效应由△sol H~n 0曲线求得。设纯溶剂、纯溶质的摩尔焓分别为H m1和H m2，溶液中溶剂和溶质的偏摩尔焓分别为H 1和H 2，对于由n 1mol 溶剂和n 2mol 溶质组成的体系，在溶质和溶剂未混合前，体系总焓为：图1

高分辨率熔解曲线分析法之Snakback基因分型法

高分辨率熔解曲线分析法之Snakback基因分型法背景：DNA的发夹结构作为自身探针扩增用于PCR产物的分子分析。在这之前实体分离或共价修饰的寡核苷酸荧光是必须的。方法：我们用饱和染料LC Green做不对称PCR，40-45个循环，其中1条引物的5’端包括了一条尾巴，这条尾巴和其延伸引物互补，但这尾巴没有任何特别的共价修饰。样品可以在LightsCycler的转子中快速的扩增，可以在96/384 模块加热PCR仪中进行高通量的扩增。除了扩增扩增子的双链，通过引物尾巴的“弹回”及其延伸引物的杂交形成单链发夹结构。在HR-1（毛细管）或Lightscanner（96/384孔板）上运行高分辨率熔解曲线。结果：用弹回引物扩增的PCR产物在低温处显示两个发夹结构熔解峰，在高温处显示全部扩增子的熔解峰。发夹结构的熔解温度与其长度（6-28bp）是线性相关，与环的大小成负相关。我们可以轻松的将杂合突变和纯合突变进行基因分型。用弹回探针对100个未知基因型的临床样本的F5 1691G>A进行基因分型，与之前的分型结果一致。我们用2条弹回引物做不对称PCR，分析CFTR基因外显子10的2个范围，通过稀释产物形成分子内部杂合子进行基因分型，分出7种不同的基因型。结论：弹回引物结合饱和染料基因分型的方法在闭管体系中，只用2条引物便可以提供一条特异的探针，此探针没有特殊的共价修饰。在分子诊断学中，DNA的发夹结构是非常有用的工具，包括stem-loop探针和 self-probing扩增。stem-loop探针通常叫做“分子信标”，是一段共价修饰的核苷酸，一端末尾是荧光基团，另一端末尾是淬火剂。self-probing扩增用于弹回单链构想多态性（SSCP）和蝎子引物。弹回单链构想多态性SSCP逐渐用于在PCR产物中人工引入二级结构进行SSCP分析。依赖于扩增序列，与引物尾巴互补的8-11bp序列弹回至其延伸产物上，形成了单链发夹结构，虽然弹回SSCP的引物没有共价修饰，电泳已经足够分离发夹结构。蝎子引物5’端复杂延伸，包括一个探针元素，一对自己互补的茎干序列，一个荧光基团，一个淬光剂，一个阻止5’端延伸复制的拦截单体。在分子内，蝎子比分子信标有些

高分辨溶解曲线突变检测

高分辨熔解曲线突变检测高分辨熔解曲线（High Resolution Melting）技术是近年来兴起的一种全新的突变扫描和基因分型的遗传分析方法。HRM不受突变碱基位点与类型局限，无需序列特异性探针，在PCR结束后直接运行高分辨熔解，即可完成对样品的分析。该方法与其他遗传分型技术相比具有灵敏度高、特异性好、成本低廉、高通量检测的优点，是进行突变检测的迅速、廉价而有效的方法。 HRM原理 HRM是在PCR基础上通过测定DNA双链熔解曲线变化来检测突变的方法，溶解曲线的变化取决于DNA序列、长度、GC含量，因此，可以通过饱和燃料监控熔解曲线的变化来反映核酸性质的差异，从而对样品进行分析。在双链体的溶解曲线检测时需要添加合适的染料，饱和染料例如SYBR Green 在双链解链过程中会发生重排，无法真实反映DNA熔解情况。不适用于需低温解链的样品而且不能检测异源双链体。因此不能用于熔解曲线的检测。而LC Green (Idaho)是一种与DNA有更强的结合位点，对PCR抑制作用很小的饱和染料，已成功的用于HRM检测中。 HRM操作简便，在PCR结束后添加合适的染料，通过监测升温过程中荧光染料与PCR扩增产物的结合情况来实现的，在Lightscanner仪器（Idaho）升温过程中，双链解开，荧光染料从解链的分子上释放，同时荧光强度降低，所以通过荧光强度和曲线的变化上就可以判断是否存在突变。

HRM的特点和应用 HRM应用： ?检测人类疾病相关基因中常染色体的显隐性和X-连锁

?鉴定人类肿瘤的体细胞突变，肿瘤样品中筛选体细胞突变 ?基因突变扫描：单碱基的改变、插入或缺失 ?特定突变、多态性位点的筛选 ?外显子和短扩增子基因型扫描 HRM特点： ?灵敏度高：杂合子突变体的检测的灵敏度可以达到100%，原则上数据分析时温度升高后纯合子或半合子的突变时检测不到的，但实际上，许多纯合子突变是可以检测到的。如基因突变正好与x连锁，可以在PCR之前加入已知野生型样本来检测半合子或纯合子的突变。 ?特异性好：HRM的特异性可以达到90-100%。短的扩增子特异性要更高 ?不受碱基位点局限，适用范围广 ?在封闭的试管内进行，可降低污染操作简单 ?成本低廉、时间少、误差小、高通量检测 ?检测的样品范围广：HRM检测片段范围在38-1000bp不同来源的样品都可以用于HRM如血粉、口腔细胞、冷冻的肿瘤样品、也可用于酒精固定、福尔马林固定或石蜡包埋的组织等，在人类遗传性疾病的研究中，通常用周边血液淋巴细胞中提取DNA，用于HRM分析。 HRM：实验设计中需要考虑的问题 ?高效的扩增方案的设计对于HRM的成功至关重要。最大的灵敏度和特异性有助于最佳的PCR结果的产生，同时扩增子的溶解特性对于结果也非常重要。这取决于引物的设计和引物的位置。 ?在实验结果中有时会出现假阳性，这时可以通过调整引物或者扩增参数避免出现假阴性的结果。 ?样品的质量对特异性有一定的影响，因此，进行HRM分析时要选用高质量的样品。总结 HRM灵敏度高、特异性好

LightScanner 高分辨溶解曲线分析系统参数

LightScanner 高分辨溶解曲线分析系统技术参数一、功能描述： 1、*不带荧光定量的独立的高分辨溶解曲线分析仪 2、非标记探针法（LunaProbe）进行位点基因分型（Genotyping）功能；小片段扩增+温度内标法（Small Amplicon）进行位点基因分型（Genotyping）功能 3、针对PCR产物的未知基因突变筛查功能二、硬件配置： 1、*标准8行x 12列的96孔板模式，高精度96孔板半导体电加热温控方式，而非空气热循环模式 2、自动侦测、载入样品板装置 3、122阵列光源 4、CCD检测系统 5、cGMP认证并严格按照cGMP标准生产，CE认证三、技术参数：

1、需配备可PCR前加入的LC Green Plus高分辨溶解曲线分析荧光染料 2、控温精度：±0.01℃，温度范围：室温-100 °C 3、高分辨溶解曲线分析要求的缓慢升温方式：0.1℃/秒，降温速率：95°到60 °C (非线性)~ 180 秒（室温25 °C条件下） 4、数据采集密度：100个数据/℃ 5、激发波长：470±20nm，发射波长：510 和600 nm 6、*非标记探针法（LunaProbe）进行位点基因分型（Genotyping）功能，成本小于1.5元人民币/样本；小片段扩增+温度内标法（Small Amplicon）进行位点基因分型（Genotyping）功能。 7、DNA Genotype特异性99.5%（片段大小小于400bp） 8、反应体系5-100ul 9、分析时间：6分钟内完成96孔板（96个样品）的高分辨溶解曲线分析四、数据控制系统及软件： 1、*软件必须具有对PCR产物进行未知突变扫描和针对已知 SNP为点进行非标记探针（LUNA Probe）进行基因型鉴定的功能。 2、*软件必须具有进行低端和高端内标PCR产物进行校正的功能，从而对小片段PCR扩增产物直接进行基因型鉴定（Genotyping）。 3、戴尔台式电脑，奔腾2.0G CPU，1G内存，80G硬盘，1280x1024

高分辨率溶解曲线和TEAL-TIME PCR

目前，有不少人把高分辨率熔解曲线(HRM)和Real-time的熔解曲线混为一谈，只要一听到熔解曲线4个字就和荧光定量联系在一起了，再加上现在市面上有些仪器兼具荧光定量和HRM的功能，使一些同行更加迷惑。今天去给大家讲一下两者之间的区别。（一）.两者的原理HRM：不同核酸分子的片段长短、GC 含量、GC 分布等是不同的，因此任何双链DNA 分子在加热变性时都会有自己熔解曲线的形状和位置。HRM 技术的基本原理就是在PCR反应之前加入饱和染料，在PCR反应之后进行升温变性，采集荧光信号，根据熔解曲线的不同即Tm值的不同来对样品来进行区分。 Real-time：是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监控整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。（二）.两者的采集过程 HRM：高分辨率熔解曲线（HRM）是在PCR反应之后，对PCR产物进行升温变性，采集荧光信号的变化，绘制成不同形状的曲线。Real-time：是在PCR过程中采集荧光信号。（三）.两者的应用 HRM：筛查未知突变和针对已知位点进行基因分型。基因分型的方法为非标记探针法和小片段法。

Real-time：定量及基因分型。基因分型的方法是：Taqman探针，水解探针等。（四）.基因分型方法的费用 HRM基因分型方法的费用远低于Taqman探针和水解探针。（五）.两者所用的染料 HRM：LC Green饱和染料，能与DNA双链的碱基紧密结合，不抑制PCR反应，在PCR反应过程中是过饱和的状态。 Real-time：SYBR Green不饱和染料，不能与DNA双链的碱基紧密结合，浓度高时会抑制PCR反应，只能少量加入。广州誉维生物科技仪器有限公司上传

HRM实验指导

高分辨熔解曲线分析技术高分辨熔解曲线分析技术，high resolution melting，简称HRM，是近几年来在国内外兴起的一种用于突变扫描和基因分型的最新遗传学分析方法。它是一种高效稳健的PCR 技术，不受突变碱基位点与类型局限，无需序列特异性探针，在PCR 结束后直接运行高分辨熔解，即可完成对样品突变、单核苷酸多态性-SNP、甲基化、基因分型等分析。 HRM 的主要原理是根据DNA 序列的长度，GC 含量以及碱基互补性差异，应用高分辨率的熔解曲线对样品进行分析，其极高的温度均一性和温度分辨率使分辨精度可以达到对单个碱基差异的区分。同许多荧光PCR 技术一样，HRM 是利用了特定的染料可以插入DNA 双链中的特性，通过实时监测升温过程中双链DNA 荧光染料与PCR 扩增产物的结合情况记录高分辨率熔解曲线，从而对样品进行检测。实验前准备在实验开始前，先准备好本次实验所需的各种试剂，如：PCR检测用到的罗氏的LightCycler? 480 Control Kit和High Resolution Melting Master等。High Resolution Melting Master中含有2× Master Mix(包含热启动Taq DNA Polymerase 反应缓冲液，dNTP mix，高分辨率染料),25mM MgCl2，PCR级别的H2O，用于调整反应的最终体系。本次实验所涉及到的仪器和耗材有：赛默飞公司提供的单道移液器、QSP 盒装吸头、冰盒，罗氏的LightCycler? 480，还有常规的离心机、水浴锅等。 HRM 体系配制实验中用到的HRM试剂盒需要对MgCl2溶液进行最近的浓度确认，以一管DNA样品为例展开实验。先加入1号管的2× Master Mix 165μl，再加入9号管的primer mix 33μl，最后加8号管的mutation突变体33μl，混匀，瞬时离心，分装到相对应的管中。分装好做mutation样品的Mg2+浓度，以第1第2管来演示配制3.3倍体积加样。在1管中加入4μl MgCl2，再加入16μl水。同样地，在2管中加入5.3μl MgCl2 和14.5μl水，其他管按照对应的体积配制即可。同时根据说明书配制好WT野

【CN110106236A】利用高分辨率熔解曲线法检测左乙拉西坦用药相关基因SCN1A多态性的试剂盒

(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910371645.9 (22)申请日 2019.05.06 (71)申请人上海派森诺生物科技股份有限公司地址 200030 上海市徐汇区银都路218号2 号楼1、2层 (72)发明人何小明　钱怡　孙子奎　 (74)专利代理机构上海天翔知识产权代理有限公司 31224 代理人吕伴 (51)Int.Cl. C12Q 1/6858(2018.01) (54)发明名称利用高分辨率熔解曲线法检测左乙拉西坦用药相关基因SCN1A多态性的试剂盒及其方法 (57)摘要本发明公开了一种利用高分辨率熔解曲线法检测左乙拉西坦用药相关基因SCN1A多态性的试剂盒，其特征在于，包括所述SCN1A基因的多态性位点rs2298771的检测引物，所述引物的核苷酸序列如下所示：SCN1A上游引物：5′-CAA GAA AGA CAG TTG TAT GTC CAA TC -3′；SCN1A下游引物：5′-ACA CTG CTG CCA GTT CCT ATA CC -3′；其他部分为HRM分析试剂盒的常规试剂。本发明还公开了一种利用高分辨率熔解曲线法检测左乙拉西坦用药相关基因SCN1A多态性的试剂盒的检测方法。本发明的试剂盒适用于对左乙拉西坦个体化用药基因进行快速检测，可广泛应用于临床上左乙拉西坦个体化用药方案制定的基因检测。权利要求书1页说明书8页序列表2页附图1页CN 110106236 A 2019.08.09 C N 110106236 A