大鼠离体心脏灌流技术
附录三 大鼠离体心脏灌流技术
大鼠离体心脏灌流（Langendorff）是研究离体心脏在人工控制条件下，观察各种因素（药物、缺氧、离子等）对大鼠心脏活动（心脏的收缩功能、舒张功能、冠脉流量、心肌电活动等）的影响的一种可靠方法。
心脏从大鼠体内摘出之后，以一定压力、温度及充氧的生理溶液经主动脉根部流入进行灌流。灌流液经冠状动脉口进入冠状血管营养心脏，维持心脏的节律活动。灌流液经冠状血管进入右心房，然后由腔静脉口和肺动脉口流出，其流出量即为冠状血管的管流量。离体心脏的节律性活动及心肌电活动变化可以通过记录系统进行记录和分析。用Langendorff发灌流心脏，其节律性活动可维持较长的时间（一般可维持3~6h）。
仪器装置：仪器的核心部分是恒温、循环和浴槽三部分组成，一般进口这套设备需人民币十几万元。我们教研室因经费十分紧张又急需这样的设备，针对这种情况，我们自行设计和制作出这套离体心脏灌流设备（见下图）。经过反复的试验，验证了这套灌流装置无论在性能上、稳定性上都达到了要求，而且只用了二千元人民币。
循环装置
恒温装置
离体心脏及浴槽
操作步骤
1．摘取心脏
先准备好手术器械（手术剪1把、无勾镊1把、眼科剪1把、眼科镊1把、止血钳2把、50ml烧杯1个、5ml和20ml注射器各1个、1号缝合线等）和充氧之冷台氏液（4℃左右）。将大鼠麻醉或颈部脱臼后，打开胸腔充分暴露心脏，轻轻提起心脏并迅速摘取心脏。手术过程中注意不要损伤心脏。主动脉根部要保留0.5cm长以备插管用。心脏摘取后立刻置于预先准备好的充氧冷台氏液中，用手指轻压心室将腔内的血液排出，防止血块形成。心脏停跳后迅速剪去心脏周围的组织，操作中注意避免损伤静脉窦。
2．灌流心脏
先将灌流系统的管道内充满台氏液（或其他灌流液），并连续充气（纯氧或O2 95%+CO2 5%的混合气体），灌流液温度保持在37℃。将主动脉套进灌流管末端的动脉套管上并结扎
固定好。套管进入主动脉不易过深，以免损伤主动脉瓣或堵住冠状动脉开口处影响冠状血管的灌流。心脏经充氧的温台氏液灌流后，在1min内即可开始恢复跳动，起初心率较慢，常伴有心律失常，以后心率逐渐加快，心律失常消失，并心跳可稳定在300次/min左右，可维持数小时。
当灌流液充氧不够或酸碱度不适宜时，均可引起心脏机能的降低，主要表现为心率减慢、心室做工能力减弱，甚至出现心脏僵硬导致心脏停跳。为了保证心脏机能维持较长时间的正常活动，实验中必须注意下列事项。
注意事项：
1. 灌流液要保证有足够的氧，灌流压力要保持恒定。在实验过程中如果发现心跳变慢、收缩力减弱时，要立刻检查氧的供应是否充足，灌流的压力是否足够，温度是否适宜。如果发现心室肌发生僵硬，则说明心肌缺氧严重，一般不易恢复应终止实验。
2. 冠状血管要保持通畅。通常引起冠状血管堵塞的主要原因有两个方面：①主动脉套管插的过深，堵塞了冠状动脉入口导致灌流不通畅。导致灌流量明显减少，心率减慢、心缩力减弱。经过及时调整可使心脏活动恢复正常。②冠状血管内有小的栓子堵塞了小冠脉形成栓塞。故在置备离体心脏的过程中，一方面要防止血液凝固，另一方面要把冠脉血管中的血液冲洗干净，最好是在手术前1~3h腹腔或静脉注射（1~2.5mg/kg体重）肝素，可有效防止冠脉内凝血。③灌流液的选择：常用的溶液有Kreb-Hense-Leit氏液、台氏液、洛氏液、修正洛氏液等。修正洛氏液中的NaHCO3的含量为0.15g/L，而洛氏液中的NaHCO3含量为0.67g/L，其他成分相同。用修正洛氏液惊醒离体心脏的灌流，能维持心脏较长时间的正常活动，只充氧不需要加二氧化碳，且充氧之后也不需再测定酸碱度故较简便。
（王跃民、裴建明）
大鼠原代心肌细胞提取方法
大鼠原代心肌细胞提取方法 原代心肌细胞培养是体外研究心血管疾病相关机制的主要手段和基本技术基础实验中，与细胞系相比，原代心肌细胞的形态及电生理方面更接近在体细胞，因此，培养原代心肌细胞的质量直接关系实验的进程及结果。 乳鼠原代心肌细胞分离须注意以下几点： 1. 鼠龄的选择：新生1-3d龄，最好半日龄。 新生大鼠心肌细胞在出生后3 d内具有部分的增殖能力，成年大鼠心肌细胞则为终末分化细胞，不再具有分裂增殖能力。因此，大鼠出生时间越短，其心肌细胞分离后成活率越高，越容易贴壁生长。建议选择1~3 d龄大鼠分离其心肌细胞进行原代培养。 2.消化酶的选择：胰蛋白酶和胶原酶混合使用（0.4%胶原酶:0.05%胰酶=2:1）。 常用的消化酶有2种：胰蛋白酶和胶原酶，胰蛋白酶作用较强，容易造成心肌细胞损坏，胶原酶作用较缓和，能消化细胞间质中的胶原纤维以释放细胞，对细胞损伤小。 3.消化程度的把握：组织由红转白呈半透明状态时，停止消化。 新生大鼠心肌细胞对消化酶极为敏感。消化不足，细胞聚集成团，无法得到单层细胞，不利于观察和后续实验；消化过度可使肌原纤维出现萎缩，细胞死亡率增加或丧失贴壁能力及搏动能力；消化的适宜温度为35~37℃。 4.抑制成纤维细胞生长：加入BrdU，更换小牛血清。 分离出来的心肌细胞会伴有较多成纤维细胞，成纤维细胞具有较强增殖能力会干预心肌细胞的贴壁和增殖，需要尽量去除成纤维细胞。成纤维细胞较心肌细胞更容易贴壁，可以通过差速贴壁去除大部分成纤维细胞，但仍有少量成纤维细胞混杂于心肌细胞之中。溴脱氧尿苷(bromodeoxyuridine, BrdU)可干扰细胞的有丝分裂，故常规使用BrdU抑制成纤维细胞的生长。由于胎牛血清所含的促细胞有丝分裂的因子较多，BrdU很难完全抑制成纤维细胞的生长.改用小牛血清则可克服这种现象的出现，获得高达90％以上的心肌细胞。 5.培养液pH值：pH范围在7.2~7.4之间。 操作过程： 手持大鼠乳鼠（出生24h内），75%乙醇消毒皮肤，剪开胸部皮肤，再消毒1次，更换手术器械，弯镊提取心脏，置于盛有PBS（1:50双抗）的大皿中； 将心脏表面附着的大血管剪去，剪去心房，放入5ml灭菌离心管中充分剪碎成肉泥状； 加3ml左右胶原酶和1.5ml 0.05%胰酶充分吹匀，37℃消化8 min，自然沉淀，弃上清，再加3ml左右胶原酶和1.5ml0.05%胰酶，充分吹匀，37℃消化10min； 取上清，3000 rpm 5min，铺中皿加含有10%胎牛血清的DMEM培养基（记1），剩余沉淀中加入3ml左右胶原酶和1.5ml0.5%胰酶，充分吹匀，37℃消化10min； 重复4的步骤4-5次，直至组织块消化完毕，记（2-5） 放培养箱2到3小时待成纤维细胞贴壁后轻轻吹打培养基，所有的中皿上清移入离心管离心3000 rpm 5min，弃上清，加含有10%小牛血清的DMEM培养基以及Brdu（10mM）（1:80），铺中皿培养。 48h换液后可得心肌细胞。观察心肌细胞形态及搏动状况。
离体蛙心灌流实验
实验五离体蛙心灌流实验 一实验目的 1、了解蟾蜍离体心脏的灌流的方法。 2、观察细胞外液钾离子、钙离子浓度变化对心脏活动的影响。 二实验原理 心脏离体后，如用人工灌流的方法，保持其新陈代谢的顺利进行，则心脏仍能有节律的自动收缩和舒张，并可维持较长的时间。离体心脏所需的条件应与动物内环境的理化性质基本相近，因此改变灌流液的理化因素，则可引起心脏活动的变化。 1、任氏液：正常对照 含有NaCl、CaCl2、KCl、NaH2PO4、 Na2HPO4 和蒸馏水，其电解质、晶体渗透压、pH值与蛙的组织液相近。 2、0.65%NaCl灌流： 3、2%CaCl2灌流 4、 1%KCl灌流
5、1:10000 E 灌流 6、1:10000 Ach灌流 7、心得安 β1受体阻断剂，抑制肾上腺素与β1受体结合，使E不能发挥作用。 8.、阿托品 M受体阻断剂，抑制Ach减慢心率，加速房室传导，增加心房收缩力。 三实验器材 微机生物信号处理系统， physiology系统，学校服务器系统，蟾蜍离体蛙心，任氏液，1%KCl，3%CaCl2，65%NaCl，1/10000 E，心得安+1/10000,1/10000 Ach，阿托品+1/10000 Ach。 四实验步骤 1、标本制备（观看视频） 2、仪器及标本的连接 3、具体软件操作： 1）离子试剂：任氏液→0.65%NaCl溶液→任氏液清洗→1%KCl溶液→任氏液清洗→2%CaCl2溶液→任氏液清洗 2）药物试剂：肾上腺素（E）→任氏液清洗→心得安→任氏液清洗→Ach，任氏液清洗→阿托品→任氏液清洗。 五实验结果
图1 离体蛙心灌流
大鼠心肌细胞原代培养
实验二大鼠CM的体外分离、培养及鉴定 1、材料与方法 1.1 材料 1.1.1实验动物新生3天清洁级Wistar大鼠乳鼠（中国医学科学院放射医学研究所实验动物中心，动物许可证号：scxk2005-0001）。 1.1.2主要仪器与试剂 5％CO 2恒温培养箱（model TC2323 CO 2 incubator）；倒 置相差显微镜（XD-101 98010）；PH计（mettler toledo320-s）；立式自动电热压力蒸汽灭菌器（LDZX-40BI），上海申安医疗器械厂；SW-CJ-2FD型单人双面净化工作台；微量移液枪（法国Gilson）；血球记数板（上海市沪江医疗器材经营部）；HH-6数显恒温水浴锅；离心机（LDZ5-2）；75cm2培养瓶、50ml离心管（美国corning公司）；无菌手术器械；磁力搅拌器；电子天平板（BS1101S 德国）；一次性滤器（22μm, GILSON）；DMEM/F12培养基 (美国GIBCO)；特级胎牛血清（FBS， Hyclone）；青、链霉素（Hyclone）；D-Hank’s液（NaCl、KCl、Na2HPO4、KH2PO4、NaOH、NaHCO3，苯酚红,南京化学试剂厂）；心肌肌钙蛋白T(Santa cruz) ;FITC连接的兔抗山羊IgG(Santa cruz);Ⅱ型胶原酶、胰蛋白酶(Sigma)；Triton-X-100(AMRESCO);BrdU(solarbio)。 1.2方法 于无菌操作下开胸取出心脏，仔细去除心脏相连大血管和心房组织（留心尖部），于4℃的D-Hank’S液中漂洗3～4次，以去除残存血液，眼科剪将心尖部组织剪成1 mm3碎块后，加入4 ml的0.0625%胰蛋白酶液，于37℃恒温水浴箱中消化3 min，然后弃上清。于剩余沉淀中加入混合消化液5 ml（0.0625％胰蛋白酶+0.1％Ⅱ型胶原酶），置37℃水浴消化8～10 min，其间振荡2～3次，静置后将上清液移入离心管中，加含10％胎牛血清预冷的DMEM/F12培养液终止消化。 随后用上述方法反复消化7～8次至组织块基本消化完毕。收集各次上清液并终止消化后，200目的尼龙网筛过滤去除残留组织块，以1000 r/min速度离心8 min，将所得的细胞与培养液混悬后，采用差速贴壁分离法去除心肌成纤维细胞每次2 h，将未贴壁的心肌细胞悬液吸出，调整细胞密度接种于培养板中。培养前3 d加入0.1 mmol/LBrdU抑制成纤维细胞生长。48 h首次换液，以后根据情况2～3 d换液。
取小鼠脑组织
丁香园上面总结的方法，排版有点乱。 其实过程与大鼠近似，我的经验是： 1. 材料准备；大剪刀、眼科剪、眼科镊、大镊子、滤纸、竹签等； 2. 步骤：处死小鼠，取头颅； 剪开皮肤，漏出颅骨； 用大尖镊子夹住两侧眼眶，用眼科剪稍剪除颅骨中线； 再用眼科镊夹住颅骨从内向外夹，从下向上逐步去除颅骨； 当全脑露出时，再用眼科镊去除脑膜和血管； 然后用竹签从嗅球处向下取出全脑，即可。 3. 注意事项：用力轻柔，否则容易弄破脑部； 用剪刀剪颅骨时，一定要贴壁向上剪，否则容易剪破脑部； 去除脑膜时，不能硬拉，否则容易弄破大脑； 取出全脑时应把头顶朝下，用竹签轻轻取出，离桌面也不要太远、高； 若留病理，建议一定要取完整无损的大脑。 做免疫组化的话，稍微麻烦一点儿，因为脑组织含水量多，要固定的好，就需要先灌注。先麻醉小鼠 剪开胸腔，找到心脏，从心尖入针，剪开右心耳 先用生理盐水灌注直到从心耳流出来的水清亮了 再改用固定液（一般是4%多聚甲醛）灌注至小鼠四肢僵硬 小鼠只需要用注射器就行了，我做的25～35g的小鼠一般用50mLNS+30mL多聚甲醛。具体步骤：常规麻醉小鼠，将其固定，用剪刀剪开胸部皮肤，暴露出皮下组织，剪开时注意钝性分离，以免误伤。然后用镊子提起剑突，用剪刀剪开胸腔，剪断两侧肋骨，暴露整个胸腔，小心误伤肺及心脏、大血管。用镊子撕开心包膜，暴露心脏，用眼科剪剪开右心耳，然后提起心尖将准备好的生理盐水注射器插入左心室，注射，注射时小心针头滑脱。生理盐水灌流至肺和肝的颜色都变成灰白色即可。然后用多聚甲醛灌流，针孔最好是同一个，多聚灌流时小鼠四肢会抽搐，待抽搐结束，小鼠僵硬即可。取下小鼠，用剪刀在颈部离断头颅，用剪刀在小鼠头颅中间皮肤剪一刀，将两边皮肤向下翻用手捏住，暴露整个颅骨，用眼科剪从脊髓端插入椎孔，沿着颅正中线剪开颅骨，注意剪刀向上翘一些，以免误伤脑组织，剪开后用弯眼科镊分离颅骨，小心分离，直至暴露整个大脑，然后用弯镊伸入颅底离断颅底神经，就可以取出整个脑子了。放多聚里固定24h后包埋切片即可。 具体操作如下： 实验操作步骤： 1) 小鼠称重，以每克小鼠0.0025ml 4%戊巴比妥钠剂量的实施腹腔麻醉。也可以用10%的水合氯醛，3-5ul/g腹腔注射麻醉。 2) 将麻醉的小鼠仰放在操作台上，去毛。 3) 解剖小鼠，暴露心脏。 4) 找到心尖部，左手用镊子提起心尖部，右手或左手将灌流针刺破心尖部进针约0.5cm（最好是用小点的针头，用止血钳固定针尖，剪开右心耳。 5) 将灌流器的导管部开口放到生理盐水中里，打开灌流器灌流，直到从右心耳流出的液体为无色，同时小鼠肝脏色淡，肠管肿胀为止，停止灌流。没有灌流器的用注射器或者吊瓶都可以。
大鼠灌注固定的方法
大、小鼠灌注固定的方法 准备物品： 1、灌注针（灌注用的针可以是临床上的静脉套管针，便于穿刺） 2、医用输液器 3、500ml输液用玻璃瓶 4、血管钳 5、剪刀 6、生理盐水 7、4%多聚甲醛（4℃）,0.1M的PB配制 大鼠深度麻醉，迅速打开胸腔，暴露心脏，此时注意用血管钳钝性分离心包及周围软组织以便充分暴露心脏。左手持镊子捏住心脏，右手持套管针从心尖部位插入，向上进针到升主动脉。取出套管针内芯，连接生理盐水，打开输液开关，快速灌注，同时用剪刀在右心耳处剪一小口，待流出的液体无色后（约60ml即可）更换为多聚甲醛。多聚甲醛灌注速度为先快后慢，快速灌注50ml后放慢速度，缓慢滴注维持即可，每只大鼠约需100ml。如果多聚甲醛灌注充分，则动物四肢和全身肌肉会不停抽动。如此灌注约需1小时时间。 充分暴露升主动脉
套管针从心尖部位插入，向上进针到升主动脉 1、暴露心脏时要小心，速度要快，但不可损伤心脏及大血管，如果出现血液凝固或大血管损伤，灌流将失败。 2、最好是剖开右心室，但是因为暴露的问题，有误剪到左心室的可能。相对来说，剪开右心耳更为方便。我们就是这样做的。 3、灌流的效果：PBS或NS灌流时，血流丰富的脏器如肝脾肾等的颜色会迅速转为灰白，此为灌流正常。另外，大鼠耳尖，口唇，四肢掌部也会变苍白。 4、PBS或NS灌流需缓慢而持续，防止血液血管内凝固。有条件的话可加点肝素。 5、先主动脉插管，再右心耳放血，这样插管容易些。先剪右心耳的话，心脏会瘪下去的。小鼠灌注固定方法： 采用水合氯醛麻醉后剪开胸腔，动作要快，经左心室插入头皮针连接的20 mL注射器（头皮针磨钝，从与身体纵轴成45°角的方向进针，针尖插入升主动脉内，可以看见，动作要轻柔），同时剪开右心耳，推入20 mL 生理盐水。推完以后迅速换4 ℃多聚甲醛20 mL，灌完以后取材基本就可以了。
离体蛙心灌流及药物对心脏的影响
离体蛙心灌流及药物对心脏的影响 一、实验目的： 1、学习蛙心灌流方法。 2、了解离体心脏的自律性与环境中各因素变化的关系，观察理化因素 对蛙心活动的影响。 二、实验对象：蟾蜍 三、实验方法： 1、标本制备： 取蟾蜍→破坏CNS→固定→剪皮→打开胸腔（暴露胸骨柄，用镊子把胸骨柄捏起来，用粗剪刀剪断，沿胸骨将锁骨剪断，去除多余的骨头，注意勿将心脏剪破）→用眼科剪小心剪开心包膜→暴露心脏→在主动脉叉下方穿一根丝线备用→用蛙心夹在心舒张期夹住心尖部→在左侧主动脉分叉处2-3mm处剪一剪口→将盛有一定量任氏液的蛙心插管插入到主动脉球→将插入到主动脉球的套管稍向后退，再向左下逆时针旋转90°，插入心室→结扎固定→剪断血管和背面静脉窦以下组织，游离标本 2、连接装置： 蛙心管内保持2ml灌流液，用木夹夹住蛙心套管，蛙心夹的线与张力换能器相连，换能器与电脑的相应通道相连。 3、运行电脑： 打开电脑→Medlab→实验/常用生理实验→离体蛙心灌流 四、实验结果： 分别观察正常心脏活动曲线及加入不同溶液后的心脏活动曲线的变化。 曲线规律：心脏节律； 曲线疏密：心率 曲线基线：心室舒张最大程度 顺序观察项目药量心肌(率、力)变化 正常任氏液灌流正常 1 0.65%NaCl 灌流 1~2d 2 2% CaCl 2 3 1%KCl 1~2d 4 1:10000 NA 1~2d 5 1:100000 ACh 1~2d 6 3% LH 1~2d 2.5% NaHCO3 2~4d 7 1:100000 Isop 1ml +任氏液1ml 8 1:1000 prop 0.2ml+任氏液1.8ml 出现效应后，抽出一半液体后 立即加入Isop1ml
成年大鼠心肌细胞培养方法的建立和形态学观察
成年大鼠心肌细胞培养方法 的建立和形态学观察 北京心肺血管疾病研究所细胞免疫室 许秀芳 李温斌3 陈宝田3 吕燕宁 赵莉敏 陈 燕 提要:为探索稳定的成年大鼠心肌细胞的分离和培养方法,应用生物酶(5g/L胰蛋白酶及1g/L胶原酶)灌注法分离成年大鼠心肌细胞,用形态学及台盼蓝染色法鉴定分离的心肌细胞,并在光镜和电镜下观察和摄像记录。结果:心肌细胞的存活率为91.7%;存活的心肌细胞静止地贴在培养板底上,细胞完整,呈杆状,长宽比约为4～6∶1。结果提示:该方法是比较理想的心肌细胞培养法。 关键词:成年大鼠心肌细胞;胰蛋白酶;胶原酶;分离技术 中图分类号:Q253;R322.1+1 自从1953年Durrows和Moscona首次成功地应用生物酶分离出鸡胚心肌细胞后[1],其分离培养技术不断发展,逐渐发展为3种分离方法:离体心脏灌注法、心肌细胞浸泡法和贴块培养法。对动物而言,离体心脏生物酶灌注法分离心肌细胞的质量及数量最佳。成年心肌细胞的分离较幼年及新生动物心肌细胞的分离更为困难,但成年心肌细胞做为一种生物学实验工具是其他心肌细胞不可替代的。国内仅有少数单位分离培养成功成年动物心肌细胞。1992年1月至1998年12月,我们建立了成年大鼠心肌细胞分离培养方法并进行了形态学观察。 1 材料和方法 1.1 材料 实验动物为成年Wistar大鼠,体质量150～200g,由本研究所实验动物室提供。 DM EM培养液、胰蛋白酶均购自美国GIBC公司;胶原酶购自美国Sigma公司;牛血清白蛋白购自美国BM公司;胎牛血清由金华生物制品公司提供;淋巴细胞分离液由中科院血液学研究所出品;安贞Ⅱ号心脏停跳液由本院体外循环组提供。 实验药物及试剂的配制:2%胎牛血清20 mL加DM EM培养液100mL,青霉素100mg/ L,链霉素100万U/L,p H7.2～7.4,过滤除菌。酶消化液:胶原酶0.1g加胰蛋白酶0.5 g、牛血清白蛋白1g,加入DM EM培养液100 mL,于使用前配制。 1.2 方法 采用离体心脏灌注法分离心肌细胞[2,3]。 Wistar大鼠腹腔注射2%戊巴比妥钠麻醉(含1∶200肝素45mg/kg),麻醉满意后胸腹部用75%乙醇消毒,“U”字形切开腹壁,快速剪断左右前腔静脉及后腔静脉,经升主动脉根部灌注4℃高钾安贞Ⅱ号心脏停跳液30mL,待心脏停跳呈灰白色后取下心脏,接在Langendorff 灌注架上,按下列步骤进行实验: 1)清洗心脏:用无Ca2+、Mg2+的D2Hank 液灌洗心脏5min即可;目的是解离桥粒和细胞间连结。由于Ca2+在心肌细胞连结上起重要作用,用无Ca2+的液体灌洗心脏能带走大量的Ca2+,心肌细胞间糖蛋白被破坏,桥粒和连结随之解离。 2)溶解细胞外基质:应用酶消化液37℃灌注,保持灌注压在4.90～7.84kPa(50～80 cmH2O)。 3)心肌细胞的释放:经一定时间(30～90 min)酶消化后,心肌细胞外基质大部分被消化,但细胞间连结如缝隙连结并没有完全断开,心脏仍保持大体形态,松弛状,机械作用才能将细胞分开。见心脏变软、呈暗红色,取下心脏,轻揉搅拌几分钟后剪下心室肌,剪成1mm3大 2000年 6月第21卷 第2期 首都医科大学学报 Journal of Capital University of Medical Sciences J un.2000 Vol.21 No.2 收稿日期:1999203209 3首都医科大学附属北京安贞医院心外科
1、蛙心灌流实验报告
蛙心灌流实验 实验目的 1、学习斯氏或八木氏离体蛙心灌流法。 2、了解心肌的生理特性。 3、观察Na+、K+、Ca2+及肾上腺素（Adr）、乙酰胆碱（Ach）等对离体心脏活动的影响。实验原理 动物的离体心脏，用理化特性类似于其血浆的代体液灌流时，在一定的时间内，仍然保持有节律的舒张活动。改变灌流液的理化特性，这种节律的舒缩活动也随之发生改变，说明内环境理化因素的相对恒定是维持心脏正常节律活动的必要条件。 实验材料与用品 1、材料：蟾蜍、斯氏蛙心套管、套管夹、支架、双凹夹、蛙心夹、蛙板（蜡盘）、常用手术器械、滴管、废液缸、棉线 2、药品：任氏液、0.65%NaCl、2%CaCl2 、1%KCl、0.01% 肾上腺素、0.01%乙酰胆碱 3、仪器：计算机采集系统、张力传感器 实验步骤 1、取一只蟾蜍，用探针破坏其脑脊髓后仰卧固定于蛙板上，剪开胸前区皮肤，剪去胸骨，暴露心脏。用眼科镊提起心包膜，再用眼科剪在心脏收缩时将其剪破，使心脏完全暴露出来。 2、识别心脏的各个部分，包括心房、心室、静脉窦等，并观察心跳。 3、插蛙心插管，制备离体蛙心。在左主动脉下穿一线结扎，靠近动脉窦，接着在左右主动脉下方穿一线，并打一松结留作固定插管用。 4、用手提起结扎线，用眼科剪在左侧主动脉距分叉3mm处向心脏剪一斜口，右手将盛有少量任氏液的蛙心插管由此口插入，先进入动脉圆锥，然后在心室收缩时，向前略向左推动蛙心插管，使之经主动脉瓣插入心室腔内（注意：为了使蛙心插管顺利插入心室，应使心室与动脉圆锥成一条直线）。进入心室的标志是随着心室搏动，均有血液喷入插管，插管的液面随着心搏而升降。结扎插管并将结扎线固定于插管侧面的小钩上，以防止标本滑脱。在蛙心插管插入心室后，用吸管及时吸出管内的血液，更换新鲜任氏液。提起插管，剪断主动脉左、右侧分支，轻轻提起插管和心脏，在静脉窦下方绕一线，将左右肺静脉及前后腔静脉一起结扎（切勿损伤静脉窦），在结扎线下方剪去所有牵连的组织，将心脏摘出。用任氏液反复冲洗（10~25滴/min的速度缓慢点滴）任氏液。至插管内任氏液完全澄清无色为止。以后做实验注意每次换液时，插管内液面应保持相同的高度。
大鼠心肌细胞说明书
大鼠心肌细胞说明书 一．产品简介 1、产品名称：大鼠心肌细胞Rat myocardial cells 2、组织来源：大鼠胚胎心室肌组织 3、产品规格：25cm2培养瓶 4、细胞简介： 大鼠心肌细胞分离自大鼠胚胎心脏组织，细胞呈多边形等不规则形状，2天以后大部分伸出伪足称巴掌状部分心肌细胞会出现搏动，成熟的心肌细胞增值缓慢或不增值。体外培养的人心肌细胞对于研究其生理功能、药物作用以及各种致病因素作用下的病理生理改变具重要意义。 本公司生产的人心肌细胞采用混合酶解法制备而来，细胞总量约为5×105个/支，细胞纯度可达85%以上，且不含有HIV-1、 HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。 5、培养基信息： 1）、培养基类型：DMEM/F12培养基 2）、添加因子：FBS, Penicillin, Streptomycin等 二.使用方法 客户收到细胞后，请按照以下方法进行操作。 1、取出25cm2培养瓶，75%酒精消毒，拆下封口膜，放入37℃，5%CO2细胞培养箱中静置2-3h，以稳定细胞状态； 2、待细胞达到80%汇合时准备进行传代培养； 3、细胞传代 1）吸出25cm2培养瓶中的培养基,用PBS清洗细胞一次； 2）添加0.25%胰蛋白酶消化液约1ml至培养瓶中，37℃温浴3min左右；倒置显微镜下观察，待细胞回缩变圆后吸弃消化液，再加入完全培养液终止消化； 3）用吸管轻轻吹打混匀，按1:2适当的比例进行接种传代，然后补充新鲜的完全培养基至5ml，放入37℃，5%CO2细胞培养箱中培养； 4）待细胞完全贴壁后，培养观察。之后每隔2-3天更换新鲜的完全培养基。 三．注意事项 1、培养基于4℃条件下可保存3-6个月；
大鼠心肌梗死模型图解
大鼠心肌梗死模型制作图解 庄瑜制作 南京市第一医院 南京医科大学附属南京第一医院南京市心血管病医院心胸外科 https://www.360docs.net/doc/d214269448.html,/
制作前准备 1．器械：动物呼吸机，开胸制作心梗模型，维持呼吸至关重要。虽然据说某些牛人可以不用呼吸机，但是我想这是经验积累的结果，开始时必然要用；况且需要看此说明的人应该没有牛到这个程度。当然，如果你经费异常充足，不在乎死亡成千上万的大鼠也可以。 显微器械，最主要的是针持，大鼠胸腔、心脏均很小，常规器械无法进入胸腔缝扎。其他手术器械以眼科器械为主。 2．动物：应选择成年健康大鼠，耐受性较好。最重要的是要充分利用每一只动物，包括死亡的大鼠。许多人都知道制作大鼠模型需要多练习，但是练习不是买一大批大鼠，不停地缝扎，然后不停地扔掉死的大鼠；当然，制作心梗模型死亡一些大鼠是很正常的事情。练习的前提是对大鼠解剖及操作过程的熟悉，如果可能的话，最好先找一份大鼠的解剖图谱，熟悉手术区域的解剖结构；同时研究实验流程，熟悉每一个实验步骤。大鼠死亡后，不要急着扔掉，利用它练习每一个你不熟悉的操作步骤，直到熟练为止。 3．实验者：实验者必须具有一种平和的、耐得住寂寞的心态，制作模型需要时间，尤其是早期，需要耐心、仔细的摸索；必须对每一个步骤进行认真地研究。最熟练的制作者做一只大鼠模型也需要30到40分钟的时间，加上准备及扫尾的时间，制作十只模型就需要一天的时间，如果你废寝忘食多用用功也可能做到15只左右，这样一天下来腰酸背痛是必然的，你能坚持多久？不熟练的话，一只就要两、三个小时；同时还要看着大鼠在你的手中死亡，这是很揪心的事情。因此，实验者必须具备良好的心态，急于求成、难耐寂寞者不适合做此实验。 本人系气管切开插管，缝扎LAD制作模型。亦有人经口插管，液氮冷冻制作模型；不在本人讨论范围之内，哪位有经验的话可以传上来，一起讨论。最后祝各位早日成功！！
灌流取脑
大鼠灌注固定取脑 准备物品： 37℃的温生理盐水500ml、10%的中性甲醛或4%的多聚甲醛固定液500 ml、500 ml的输液瓶2个、输液管2副、三通1个,镊子、剪刀、止血钳各2把、灌注针(将12号注射用针头的针尖掐断磨钝圆、光滑即可)1个、麻醉剂、步骤 1)将两个输液瓶中分别装满生理盐水和固定液并将输液管安装在生理盐水瓶上并调整好,使管内没有气泡。 2)将动物麻醉,数分钟后,待动物前后肢放松,即可准备灌注。 3)将已麻醉的动物仰卧在解剖台上,固定四肢,用左手持镊子夹起腹部皮肤,右手持剪刀自腹部剪一小口,由此沿腹中线和胸骨剑突中线向上将皮肤剪至下颌,分离皮下组织,将皮肤翻向两侧,再沿腹中线和胸骨中线向上剪开胸骨,沿膈肌向两侧剪开,并用止血钳将胸骨和胸部的皮肤钳紧,将止血钳翻向外侧以充分暴露心脏。小心用镊子将心包打开,滴一些生理盐水保持湿润。 4)分离出主动脉,穿一根丝线,准备结扎灌针。 5)将左心室尖用眼科剪刀剪开一小口,将灌注针插入心室并送至主动脉内,用丝线结扎牢固,使之不能退出,打调节阀,灌注生理盐水,灌注时的灌流量约20 ml/分钟。时,剪开右心耳,使血液排出。观察肝脏逐渐变为白色为止 6)旋转三通使之对准灌注液,开始灌注固定液。固定液进大鼠血管后,逐渐出现四肢抽动,表明灌注液进入大鼠大脑,待抽动完全停止,全身组织器官变硬后即可取材。 7)取脑：枕骨大孔处用剪刀横断，小心地于枕骨大孔斜插入剪刀剪开顶骨，用止血钳掰断两边地顶骨，注意嗅球上地顶骨也要仔细去掉，用剪刀于一侧剪断视神经并探到颅底，就可以将整块的脑组织翘起。取出的脑在同样固定液中4℃再固定4-6小时。 8)保存或切片注意事项： 1、将灌注针插入主动脉内是灌注固定的关键,也是难点。首先准确找到主动脉,这是此步骤的要点。可用温生理盐水将胸腔内的血液冲洗干净,用眼科镊子轻轻夹住心外膜(夹的越少越好,以免影响取材)将心脏向左上方提起,即可看清主动脉,又可使灌注针很容易地插入主动脉内。插入时动作要慢,针尖方向不要偏向右侧,以免刺入右心房,如果感到有阻力,则将针退后、调整方向重新进针,直到进入主动脉,灌注针进入主动脉后可在心脏的上方看到其位置,灌注针进入主动脉的长度最好为3~5毫米,然后用丝线扎紧。切勿将灌注针放在左心室内,这样由于主动脉瓣的关闭,灌注液很难进入主动脉,而是沿着心室的切口流出,致使灌注失败。另外,灌注针插入成功后,一定要用剪刀剪开右心耳而不是右心室,这是灌流液的出口。剪开心尖的位置一定要掌握好,不能偏右使灌注针插入右心室。 2、配4％多聚甲醛PBS缓冲液：称取40g PFA溶于装有500ml DEPC水的玻璃容器（烧杯或烧瓶）中，持续加热磁力搅拌至60～65℃，使成乳白色悬液。用1.0mol/L的NaOH直至7.0，使呈清亮状（滴加），再加入约500ml PBS，充分混匀（在冰浴或冷水浴中），可再检测一下pH，过滤后定容至1000ml，室温或4℃保存备用。 加热至60～65℃固然融解的快，只需要15分钟左右，不过容易挥发，气味难闻，需配置的量比较大的时候是较合适的方法。如果有通风厨的可在通风厨内配置，就基本没有气味散发的问题。在通风较好的地方配置也可以，但配置的时候配溶液的人一定要注意自我防护，味道确实很刺激！。如果不着急，可先配好pbs，称好相应的多聚甲醛，37℃水浴或温箱密
蛙心灌流实验报告
实验二离体蛙心灌流实验 专业：学号：姓名： 一、实验目的 1.学习离体器官（蛙心）灌流的方法。 2.观察理化因素对蛙心活动的影响。 二、实验原理 蛙心的灌流:蛙心无营养性血管，离体之后采用人工灌流的方法，仍可保持其新陈代谢，心脏仍能有节律的自动收缩、舒张，并维持较长时间，心肌的营养是通过心脏内膜液体的直接渗透而得。 心肌： 1. 含有NaCl、CaCl 2、KCl、NaH 2 PO 4 、 Na 2 HPO 4 和蒸馏水，其电解质、晶体渗透压、pH值与蛙的组织液相近。灌流： %CaCl 2 灌流： %KCl灌流： :10000 E 灌流 :10000 Ach灌流 7.心得安 β 1受体阻断剂，抑制肾上腺素与β 1 受体结合，使E不能发挥作用。 8.阿托品 M受体阻断剂，抑制Ach减慢心率，加速房室传导，增加心房收缩力。 三、实验器材 离体蛙心 任氏液、l％KCl溶液、2％CaC1 2 溶液、%NaCl溶液、1:10000 肾上腺素、1:10000乙酰胆碱、心得安、阿托品 四、实验步骤
五、 结果与分析 心率：34次/min 最大收缩力： 最小收缩力： 图1 正常脉搏曲线 心率：35次/min 最大收缩力： 最小收缩力： 图2 %NaCl 灌流脉搏曲线 分析：细胞外液中Ca 2+浓度降低，2期Ca 2+内流减少，胞浆中Ca 2+减少，心肌收缩力降低。 任氏剂 %NaCl 任氏液清洗 2%CaCl 2 任氏液清洗 1%KCl 任氏液 2.药物试剂 E 任氏液清洗 心得安+E 任氏液清洗 Ach 任氏液清洗 阿托品+Ach 任氏液 1.离子试剂
心率：38次/min 最大收缩力： 最小收缩力： 图3 2%CaCl 灌流脉搏曲线 2 分析：心肌的舒缩活动与心肌肌浆中的钙离子浓度的高低有关。心肌肌浆网不发达，储钙能力差，易受细胞外钙离子浓度高低影响。细胞外液中Na+与Ca2+有竞争性抑制，细胞外液Ca2+浓度升高，细胞兴奋时内流Ca2+增加，心肌收缩力增强。慢反应细胞4期去极速度加快，心率增快。 心率：21次/min 最大收缩力： 最小收缩力： 图4 1%KCl灌流脉搏曲线 分析： K+与Ca2+在细胞膜上有竞争性抑制，细胞外液中K+浓度升高，K+抑制细胞膜对Ca2+转运，因此进入细胞内Ca2+降低，心肌的兴奋—收缩耦联作用减小，心肌收缩力减弱。 心率：35次/min 最大收缩力： 最小收缩力： 图5 肾上腺素灌流脉搏曲线 分析：肾上腺素与心肌细胞膜上的β 受体结合，心肌细胞和肌浆网膜Ca2+通透 1 性增强，肌浆中Ca2+浓度升高，心肌收缩力增强。而且肾上腺素使肌钙蛋白与钙离子亲和力下降，肌钙蛋白对钙离子的释放增强，肌浆网膜摄取钙离子的速度加快，钠-钙离子的交换增加，复极期向细胞外排出钙离子增多，心肌舒张速度增快，整个舒张过程明显加强。
新生大鼠心肌细胞培养技术
基金项目:新疆石河子大学科学技术研究发展计划项目(ZRK X2006 Q04) 新生大鼠心肌细胞培养技术 新疆石河子大学医学院(832002) 李润琴 慕晓玲 摘 要 目的 探讨新生大鼠心肌细胞的分离、培养方法。方法 取1~3d 龄新生大鼠的心室肌细胞,用胶原酶!分离心肌细胞,离心收集心肌细胞,差速贴壁法纯化后培养于DM EM 培养基。显微镜下鉴定心肌细胞的纯度和形态结构,锥虫蓝染色检查心肌细胞成活率。结果 心肌细胞纯度为96%,平均成活率95 43%,并出现同簇细胞的同步跳动。结论 该方法简单有效,为研究心肌细胞的人员提供了一种实验手段。 关键词 细胞培养技术; 心肌; 大鼠 Culture method of the myocardial cell in Neonate Rats LI Run qin,M U X iao lin.M edical College of Shi hez i Uni versity ,X inj iang 832002,China Abstract Objective T o find an easy way to separ ate and cultur e myocardial cells of neonate rats.Methods T o obtain ventr icular myocardium of neonate rats about 1~3years o ld.We separate myo cardial cell w ith collag enase I,and collect myocar dial cell w ith centrifug alization.M yocar dial cell was cultur ed in DM EM and was separated by the t ime of adherence.W e observed the structure of myocar dial cell from lig ht microscope and stained living my ocardial cell with trypan blue.Results W e find 96percent cells ar e myocardial cells and 95.43percent ar e alive.A ll the myocardial cells were jumping synchronously.C onclusion T his is an effective w ay to study myocardial cells. Key words Cell culture techniques; M yocardial; Rats 原代培养心肌细胞作为一种主要的研究模型, 被广泛地应用于心血管疾病的研究中。我们经过长期摸索总结出一套简便、有效的大鼠心肌细胞的培养技术,为研究心肌细胞的人员提供一种实验手段[1]。1 材料和方法 1 1 主要试剂和仪器 1 1 1 试剂:小牛血清:购自Sigma 公司。DM EM (Dulbcc co ?s M odified Eagle M edium)合成培养基:购自Sigma 公司,含10%的小牛血清,100万U 青霉素,100万U 链霉素。胶原酶!0 8g/L:购自Sig ma 公司(现用现配)。磷酸盐缓冲溶液(phosphate buffered saline,PBS ):购自Sigma 公司。锥虫蓝:购自G ibco 公司,加无菌三蒸水配成浓度0 04%备用。 1 1 2 仪器:超净工作台,CO 2培养箱,倒置相差显微镜,离心机等。所有手术器械高压灭菌。玻璃品均强酸浸泡过夜,流水冲洗20遍,蒸馏水冲洗3遍,烤干后高压灭菌备用。 1 2 实验动物 Wistar 大鼠,1~3d 龄,新生大鼠心肌细胞在出生后3d 内具有部分增殖能力,大鼠出生时间越短,其心肌细胞分离后成活率越高,越容易贴壁生长。1 3 心肌细胞的制备和培养 取一窝1~3d 龄新生大鼠,不用麻醉和处死,用手固定住四肢,75%的酒精消毒皮肤,无菌眼科剪在剑突上一肋处入剪(注意避免剪破消化道预防污染)。开口0 5cm,心脏自然跳出,将心尖部组织剪下迅速置于预冷的不含Ca 2+、M g 2+的PBS 中,反复冲洗3遍,洗去残留的血细胞,将其剪成0 5~1mm 3大小的组织块,放入锥形瓶中[2],加入8mL 0 8g/L 的胶原酶!,在37#水浴,磁力搅拌器转速为100r/min,消化10min 。将黏附在搅拌子上的心肌组织吹散,当组织液由红转白呈半透明状态时,应停止消化。用吸管吸取第一次消化后的上清液弃去,再次以同上的方法消化3次,收集以后每次的消化后的上清液,加适量含10%的小牛血清的DM EM 培养基,终止胶原酶!对心肌细胞的继续作用。将收集到的上清液在500r/min 的离心机上离心10min,弃去上清液,用PBS 吹散沉淀细胞,同条件下再次离心,弃上清,然后加含10%的小牛血清,100万U 青霉素,100万U 链霉素,p H =7 2的DM EM 培养基制成细胞悬液接种于培养瓶中,放入37#,5%CO 2培养箱中静置培养90min 后,轻轻振摇后倾出尚未贴壁的心肌细胞,重新接种。将纯化的心肌细胞以1 5?106/mL 接种于预先用50mg /L 多聚赖氨酸涂布的25mL 培养瓶中,每瓶3mL ,放入37#,5%CO 2培养箱中培养,每48h 更换1次培养基,取培养72h 的单层细胞进行实验。1 4 心肌细胞质量评价 1 4 1 心肌细胞纯度鉴定[3]:显微镜下观察、计数纯化后的细胞,心肌细胞成圆型,成纤维细胞成梭形,计算心肌细胞纯度=心肌细胞数/(心肌细胞数+成纤维细胞数)?100%。
大鼠原代心肌细胞培养实验
相关记录：年月日星期天气： 实验内容：C57小鼠心肌细胞培养 参加人员：王朗郭源源 一、培养前准备： 1 器械： 取心脏：wpi剪2把、显微镊弯2把、眼科镊1把 取心脏后：显微剪1把、持针器2把、吉利刀片2片、眼科镊2把、 400目细胞滤网 2 器皿： 外：烧杯1个100ml 内：盛酒精小烧杯、棉签2包，鼠板盛小鼠尸体，玻璃皿100mm 2， 碎冰盆底加两个冰袋，离心管架1，6孔板，EP管，15ml离心管，50ml 离心管 3 试剂及配制 1.培养基：DMEM/F12，添加15%FBS 2.提前融化：BrdU溴脱氧尿苷100X储备液(10 mM)，小牛血清、II型 胶原酶（10mg/ml储备液）、0.25%胰酶提前融化 3.D-Hanks液： 4.酶消化液：酶终浓度：2型胶原酶0.5mg/ml，胰酶0.15mg/ml 40ml：胰酶1.2ml，胶原酶2ml，D-HANKS 36.8ml 二方法 1 心脏取出 1. 加10ml和6ml未加血清的DMEM/F12到2个100mm皿中，平皿 放入冰盆预冷。 2. 将20只小鼠婴放入100mm玻璃平皿，镊取小鼠放入75%酒精中浸 泡数秒，对其颈部以下消毒，抓取小鼠，固定住上肢与下肢，从颈部 剪下头部，剪刀由颈部伸入胸腔沿胸骨左侧剪开，轻轻挤压胸廓，让 心脏跳出，迅速用镊子取下心脏，放入盛有10ml DMEM/F12的玻璃 平皿中。 3. 轻柔清洗心脏的血液后转入另一个盛有10ml DMEM/F12液的 10cm培养皿中，用显微剪将心脏剪成1-2mm的碎片。 4. 以上过程应在冰上30min之内完成。 2 消化细胞 1. 将剪碎的组织转入15ml离心管，吸去DMEM/F12，加入酶消化液 4ml。 2. 37度水浴中轻摇，消化10min，静止数秒钟，吸取上清液，弃去。 此时消化下的细胞为不需要的红细胞、细胞碎片以及心内膜和心外膜 细胞。
大鼠灌注取脑
大鼠灌注取脑 用途： 1.用于常规HE染色，免疫组化分析。 2.冰冻切片可以不做脑组织固定。 3.不可用于western blot和PCR。 4.如果观察脑组织的缺血、损伤或其它病变时，不作灌注固定，而是在取出脑组织后作固定，将大大影响效果。 原理： 心脏灌流术能够快速冲净血液并在动物死亡前进行组织的前固定,避免了组织的自溶现象,是脑组织切片观察的常用方法。多聚甲醛使组织蛋白发生交联，以保持蛋白的原位和表面结构不变，从而能使其对应的抗体准确检测其表达位置和量。 必要性： 1.脑组织较软，且细胞成分不易保留，脑组织是较易软化的组织之一，血供也较为丰富，所以最好是在取脑组织前用4％多聚甲醛灌注固。 2.经前固定后，取脑操作时，可减少脑组织损伤。 3.脑内血液都在，HE染色后，可去除红细胞背景影响。 大鼠灌注取脑标准操作规程(SOP)： 流程： 1)麻醉2)开胸3)心脏左心室穿针,剪开右心耳4)生理盐水冲水5)4%多基甲醛固定6)取 脑7)保存或切片.
具体过程： 大鼠经深度麻醉后，固定于自制的手术木板上,置于解剖盘中,开胸暴露并游离出心脏,经左心室插入灌流针并固定, 切开右心耳,先灌注冰冻无菌生理盐水(4℃)XmL，直到肝和肺脏颜色转白及右心房流出液澄清,后再灌注冰冻(4℃)4%多聚甲醛XmL,断头取脑,多聚甲醛浸泡固定24小时。 Tips： 1.多聚甲醛的配置： 一般方法为：4％多聚甲醛PBS缓冲液配法：称取40g PFA溶于装有500mlDEPC水的玻璃容器（烧杯或烧瓶）中，持续加热磁力搅拌至60～65℃，使成乳白色悬液。用1.0mol/L 的NaOH值至7.4，使呈清亮状（滴加），再加入约500ml PBS，充分混匀（在冰浴或冷水浴中），可再检测一下pH，过滤后定容至1000ml，室温或4℃保存备用。 简便方法：先配好PBS，称好相应的多聚甲醛，37℃水浴或温箱密封放置2天，就能全溶。若是很急，55℃水浴一天，期间不时震荡。注意，4%的多聚甲醛需临用前配制,配制后需过滤去除小的杂质,避免心脏灌流时造成栓塞影响灌流效果。 2.制作灌注装置，用两瓶塑料包装的输液瓶装灌注液。同时配好输液器备用。 3.10％水合氯醛按4mL/100g的剂量腹腔注射麻醉动物。 4.沿两侧肋弓剪开皮肤，打开腹腔，用一血管钳夹持剑突并向上提拉，用弯剪在膈肌与胸骨柄相连处剪一小口，造成人工气胸，然后向两侧顺延，剪断膈肌及肋骨，夹持剑突的血管钳将剑突连带胸廓上翻固定，充分暴露心脏，直视下穿刺针左心室心尖处，用血管钳固定。 5.快速滴注生理盐水(室温)，同时剪开右心耳。约注入100~150mL，至流出液体血色较浅基本澄清，停止灌注。肝脏、眼珠、爪子迅速变白是排出血液的有效观察指标。
离体蛙心灌流实验方法的比较研究
万方数据
?１４５６? 间上比双管法短（Ｐ＜０．０５）；双管法的心脏离体后存活时间明显长于单管法（Ｐ＜０．０５）；单管法对动脉瓣的损伤率、心律失常的发生率明显较双管法高（Ｐ＜０．０５）。实验结果见表１。 Ｆｉｇ１Ｄｉａｇｒａｍｏｆｏｎｅ—ｅａｎｕｌａｐｅｒｆｕｓｉｏｎｄｅｖｉｃｅ 图１单管灌流装置模式图 Ｆｉｇ２Ｄｉａｇｒａｍｏｆｔｗｏ—ｅａｎｕｌａｐｅｒｆｕｓｉｏｎｄｅｖｉｃｅ． 图２双管灌流装置模式图 表１两种方法优缺点比较 Ｆｉｇ１Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆａｄｖａｎｔａｇｅ矗ｄｄｉｓａｄｖａｎｔａｇｅｗｉｔｈｔｗｏｐｅｒｆｕｓｉｏｎｍｅｔｈｏｄｓ（互±Ｓ．ｎ＝１２） Ｏｎｅ——ｅａｎｕｌａＴｗｏ——ｃａｎｌｌｌａ Ｔｉｍｅｏｆｅａｎｎｕｌａｔｉｏｎ（ｍｉｎ）４８．３５±７．２８５９．９５±２１．２３。 Ｔｉｍｅｏｆｉｓｏｌａｔｅｄｈｅａｒｔ（ｍｉｎ）６４．３０±２１．１８６０．１０±１８．４８ Ｈｅａｒｔｓｕｒｖｉｖａｌｔｉｍｅ（ｈ）１．７１±１．４０２．５７±０．５９＋ Ｄａｍａｇｅｏｆａｏｒｔｉｃｖａｌｖｅ（％）５８．３０。 Ａｒｒｈｙｔｈｍｉａ（％）６６．７２５．０。 ＲｅｃｏｒｄｉｎｇａｎｄａｎａｌｙｓｉｓｓｙｓｔｅｍＳａｍｅＳａｍｅ ＣｏｓｔｏｆｄｅｖｉｃｅＬｏｗｅｒＨｉｇｈｅｒ。Ｐ＜０．０５ｍｏｎｅ—ｅａｎｕｌａｍｅｔｈｏｄ． 讨论 离体心脏灌流是研究心脏功能的重要手段之一，广泛应用于医学、生物学、药学等教学和科研工作中。采用离体心脏灌流系统可以直观地观察心脏的活动，研究心脏舒缩功能，心率和节律变化，前后负荷及各种体液因素等对心脏功能的影响【５Ｊ。采用蛙心脏进行离体心脏灌流是较为常用的一种模型，因其稳定，经济，一直被人们广泛采用。进行离体心脏灌流实验，首先需要保证心脏在体外较长时间存活，然后根据实验目的进行灌流和施加实验因素。无论是心脏离体前的插管、血流冲洗等操作，还是心脏离体后用人工溶液代替血液进行灌流，均使心脏脱离了生理性神经体液环境。因此，使离体心脏较长时问存活，并维持良好的状态对于完成实验和取得可靠实验数据极为重要。本研究比较了当前应用较为普遍的两种方法，并探讨了它们各自的优缺点。 本研究结果表明，单管法插管数量少，操作相对简单，缩短离体前等血管分离和插管等所需时间，可为完成各实验项目赢得足够在体外存活时间。其缺点是需将套管从主动脉经过动脉瓣插入心室，血液在心室收缩时射入动脉和插管内，而舒张时返流回心室，这样不仅打破了心脏单方向泵血的生理特征，而且，由于易发生心脏瓣膜及心肌损伤，使心律失常发生率增高，导致实验失败。常常影响实验结果的客观性及实验的顺利进行。离体心脏在体外的存活时间也较双管法短。双管法虽然需要对腔静脉和主动脉进行分别插管（双管），插管所需时问较管法要长，但因其不通过主动脉瓣，对主动脉瓣及心室肌的损伤机会大大减小，灌流液从静脉插管进入心脏，从动脉插管流出，使心脏血液单方向流动，符合心脏工作的生理特征。因此，心脏在体外存活时间反而较单管法长，而且一旦插管成功，各实验项目应能够得以顺利进行。采用双管法主要缺点除插管操作时间比单管法长外，因其灌流装置略复杂，需要特殊定制，费用较单管法实验装置高。从用途方面分析，双管灌流法还可用于研究心输出量，以及前、后负荷对心脏功能的影响等。如在双管法中改变Ｂ管中的液体量即容量负荷，改变Ａ管的口径（即后负荷）；而单管法的输入和输出均在同一管中，不适用于此项研究。 作者认为在离体蟾蜍心脏灌流实验中，采用双管法能使心脏瓣膜完好无损，保证血液单一方向流动，心脏存活时间长，能观察和记录心肌收缩力和心输出量，且记录的实验结果准确，便于整理分析，得出正确结论。而且由于实验成功机率高，减少了实验动物及试剂的消耗，值得在教学及科学研究工作推广应用。 ［参考文献］ ［１］ＭｃＫｅａｎＴ，ＳｅｈｅｒｚｅｒＡ，ＰａｒｋＨ．Ｈｙｐｏｘｉａａｎｄｉｓｅｈａｅｍｉａｉｎｂｕｆｆｅｒ—ｐｅ删ｔｏａｄｈｅａｎｓ［Ｊ］．Ｊ脚Ｂｉｄ，１９９７，２００ （１９）：２５７５—２５８１． ［２］ＨｕｓｓｅｉｎＡＡ，ＮａｂｉｌＺＩ，ＺａｌａｔＳＭ，ｅｔａ１．Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅｓｔｕｄｙｏｆｔｈｅｖｅｎｏｍｓｆｒｏｍｔｈｒｅｅｓｐｅｃｉｅｓｏｆｂｅｅｓ：ｅｆｆｅｃｔｓｏｎｈｅａｒｔａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄｂｌｏｏｄ［Ｊ］．ＪＮａｔＴｏｘｉｎｓ，２００１，１０（４）：３４３—３５７．［３］任京力，赵树进，杨太成，等．肾上腺素能ｐ。受体亚型特异性抗体的制备及鉴定［Ｊ］．中山医科大学学报，２００２， ２３（１）：３７—３９，４３． ［４］高兴亚，汪晖，戚晓红，等主编．机能实验学［Ｍ］．北京：科学出版社，２００２．７２—７４． ［５］黄敏，冬冬主编．医学机能实验学［Ｍ］．北京：科学出版社，２（１０２．４８—５０． ［６］胡还忠主编．医学机能学实验教程［Ｍ］．北京：科学出版社，２００２．１３３—１３６． ［７］朱建平主编．生理科学实验教程［Ｍ］．北京：科学出版社，２００３．８２—８５． ［８］徐怡，汤剑清，刘少金，等．蛙心灌流实验中值得注意的几个问题［Ｊ］．数理医药学杂志，２００２，１５（５）：４０３— ４０４． ［９］季淑梅，王庆山，范振中，等．介绍一种简单、新型的主要用于蛙心灌注实验的计滴装置［Ｊ］．中国应用生理 学杂志，２００４，２０（１）：９５—９７． 万方数据