色谱分析法实验实验一填充柱气相色谱进样技术练习一 实验目的

色谱分析法实验

实验一填充柱气相色谱进样技术练习

一、实验目的

1、熟悉填充柱色谱仪进样系统结构。

2、掌握微量注射器的使用方法。

3、练习进样技术。

二、仪器与试剂

1、仪器气相色谱仪一台，上海分析仪器厂。

2、试剂甲乙酮、环已烷、苯，均为色谱纯或优级纯。

三、实验步骤

1、色谱条件柱2 mX3mm不锈钢柱，载体：硅烷化白色载体(60—80目)固定液，DNP，配比：20：100，

柱温90℃，捡测器温度了90℃，气化室温度：130℃，

氢火焰离子化检测器。

2．操作：

(1) 调整仪器，使其正常运行

(2) 用1μl注射器分别取0.1μl三种纯物质，多次进样，

观察同一物质相同进样量情况下色谱峰重现性。

(3) 将三种物质按一定比例混合，制成混合样，用10μl

注射器进样0.2μl ，多次进样观察每次进样时色谱

峰重现情况。

四、问题讨论

1、为什么有时同一样品同一进样量时色谱峰形(如峰高)不同?

2．为什么有时进样后不出峰?

五、注意事项

1、一取好样后应立即进样，进样时整个动作应稳当、连贯、

迅速。

2、硅橡胶密封垫圈在几十次进样后容易漏气，需及时更换。

实验二有关色谱参数的测试及计算

一、目的要求

1、通过本实验基本色谱参数的测试与计算，定量地了解溶

质组分在色谱柱过程中热力学和动力学作用的量度。

2．理解各色谱参数的意义及其相互关系。

3、通过本实验进一步掌握柱效、柱选择性、分离能力、

保留值等性质，使之能选择出最佳色谱操作条件，得到

可靠的定性，定量结果。

二、基本原理

在规定的色谱条件下，测定惰性组分的死时间(tM)及被测组分的．保留时间(tR)、半高峰宽(wh/2)及峰宽(w)等参

数，便可计算出基本色谱参数值。

三、仪器与试剂

1 仪器气相色谱仪一套，色谱柱2000mmX3mm一支，

FID检测器；微量注射器(5—10μl)一支。

2 试剂甲烷(自制)，正己烷，正庚烷，正辛烷，乙酸正丁酯，102白色载体(60—80目)；Apienzon—L；

石油醚(低沸程馏分)；DNP，乙醚，二氯甲烷。

四、实验步骤

1．联结好仪器系统，检查并排除故障至正常工作状态。

2．制备填充色谱柱：

(1)Apienzon-L柱：经计算称取适量102白色硅烷化载

体(60–- 80目)和ApienzonlL油酯(以5%重量比计)，用

CH2Cl2将其溶解并均匀地涂渍在载体上，挥发溶剂至

干。负压装柱至均匀满口，按老化程序老化好待用。

(2)DNP柱：以15%重量比计算称取DNP足量，用

乙醚溶解，均匀涂渍在102白色硅烷化载体上，挥发

溶剂至于，装柱，老化待用。

3．色谱条件 Tj＝120℃，Tc＝100℃，Td＝120℃；

载气：N2流速30m1／min，H2流速40ml／min，空

气流速350m1／min记录仪灵敏度10mV／25cm,

纸速10mm／min；甲烷,乙酸正丁酯 n-C06n-C07 n-C08

混合样4μ1，信号衰减视灵敏度状况而定。

4．测试待仪器开启运行至基线平稳后，取自制纯净CH4

样品10μ1注入GC仪器系统(如信号过截则可以适当减

少进样量)，计时，准确记录保留时间(tM)。重复进样5－

10次，至tM值绝大多数重复为止。取其平均值，为本实

验的tM值[tM (甲烷)]。再取四种混合组分的样品溶液4μl

注入仪器系统，得到较理想谱图后，再重复进样3－ 5

次，取其平均保留时间为本实验各组分的保留时间[tR (乙

酸正丁脂)，tR (正已烷)、tR (正庚烷)、tR (正辛烷)]。

5．测试结果在仪器操作条件稳定无误的情况下，应得到

分离状况良好的色谱图。

五、数据处理

1、记录甲烷的tR值和四组分混合样的各保留值(平均值)。令

tn-1=tR(正己烷); tn=tR(正庚烷);tn 1=tR (正辛烷);ti=tR (乙

酸正丁酯)。

2．按g—4940—85色谱术语标准测量并记录各组分的半高

峰宽Wh/2和峰宽W值。

3．各基本参数计算：

(1)调整保留时间：以t 'R = tR －tM关系计算出t'n-1、 t'n 、t'n 1 及t'i；

(2)相对保留值(ri,s)：按ri,s=t 'R(i)/ tM的关系，计算出

γ正庚垸，正已垸，γ乙酸正丁酯，正已烷，γ正辛烷，正已垸(以正已烷作标准物时)；

(3)容量因子：根据K＝t 'R/tM的关系，计算出K' (正己烷)

K' (正庚烷)，K'(乙酸正丁脂)，K'(正辛烷)值;

(4)理论塔板数：以其中K'=2—5的某组分为代表，根据

n=5．54(tR／Wh/2)2或n=16(tR／W)2的关系计算出柱效率

(每米柱长所具有的理论塔板数);

(5)有效塔板数:neff=5．54(t'R／Wh/2)2或neff=16(t'R／W)2

的关系计算出有效塔板数(仍可用K'=2—5的组分)。当K'

值足够大时，n≈neff；

(6)分离度:可根据R=2(tR2－tR1)/(W1 W2)关系，计算出四

种组分中较难分离的二组分间的分离度;

(7)分离数：可根据TZ=(tR(Z 1)－tR(Z))/( Wh/2(Z) ＋Wh/2(Z 1)) 的关系，计算出任意二相邻正构烷烃峰之间的TZ值(即

二峰间可容纳的峰数)。

(8)保留指数：是色谱定性的重要指标，准确测量十分

重要。只要严格保证色谱条件的一致性(同文献Sandtler

保留指数的色潜条件比较)，该指数可作为未知物可靠的

定性指标。保留指数计算可按

I=100[(log t 'R(?)－log t 'R(z))/ (log t 'R(z 1)－log t 'R(Z)) z]的关系计算出任意二相邻正构烷烃伺某组分的I值。如载气

流速不非常稳定时,可用V'R(i), V'R(z), V'R(z 1),代替上述的

t 'R(?)、 t 'R(z)) 和t 'R(z 1)，这样可以使I值测量更准确些。

例在上述条件下测得以下实验数据：

乙酸正丁酯 t 'R(乙酸正丁脂)= 3.10min log3.10=0.4914

正庚烷 t 'R(正庚烷)=1.74min logl.74=0.2405

正辛烷 t 'R (正辛烷)=3.73min log3.73=0.5722

试计算乙酸正丁酯的保留指数。

解因z=7，所以

I(乙酸正丁脂)=100[(0.0914－0.2405)/(0.5722－0.2405]

=75.6 700.0=775.6

六、问题讨论

1．色谱基本参数测量与计算的关键问题是什么?

2．K'值及Wh/2值的大小与色谱柱过程的哪些因素有关?其原

因何在?控制哪些操作条件可以得到适宜K'值和Wh/2值?

3．保留指数的测定为什么选择组分的保留值介子二相邻正

构烷烃之间?选在碳原子数相差大于1的二相邻正构烷烃

间可否?为什么?

4、本实验测量8种色谱基本参数，它们之间的关系基础是

什么?试解释清楚。

5．色谱定性尚有一些色谱参数可以用，如tR ,t 'R , V'R,r'i,s等，

为什么说用I值最可靠?

七、注意事项

1．色谱基本参数的测定，要严格控制操作条件的稳定性,

否则易产生误单。

2．关于tM值的测量：从tM定义看，tM值的测量规定为惰性

组分从进样开始至柱后流出浓度极大点所对应的时间，即

该惰性组分不能与固定相发生任何作用(溶解或吸附)便流

出色谱柱。实际上不存在这种州想的惰性组分，或多或少

在柱中有保留作用，因此直接测量而得到的tM值，相对

说不那么准确，特别是数值小的tM，会引入一定的误差

(而数值大的沏误差往往可以略而不计)。因tM射值是诸色

谱参数的基淮数据，故有许多人研究它的准确计算方法。

Pe托rSOil及Haferkamp等／、利用三个同系物的保留值

来推算死时间。其三个同系物的碳数必须符合如下条件，

Cn－C(n－i)=C(n i)－Cn (3—1—1)

又根据同系物的碳原子．数与调整保留时间的对数呈线性

关系而推导出来的方程式，即

Cn=mlog t'n q= mlog (tn－tM ) q (3—1—2)

式中， Cn——同系物中的赖原子数3

tn——具有Cn同系物的保留时间;

t'n——Cn同系物的调整保留时间;

m、q——方程式中常数。

由此便可以准确计算出f"值。三个同系物(正己烷，正庚

烷，正辛烷)的t 'R值可分别设定为[t(n-i)－tM]、[tn－tM]、

[t(n＋i)－tM]，把它们代入(3—1—2)式；则得：

C(n－i)= mlog (t(n-i)－tM ) q (3—1—3)

Cn=mlog(tn－tM ) q (3—1—4)

C(n i)= mlog (t(n i)－tM ) q (3—1—5)

将(3—1—4)式减去(3—1—3)式，(3—1—5)式减去(3—1—4)

式得:

Cn－C(n－i)= mlog [(tn－tM )/(t(n-i)－tM )] (3—1—6)

C(n i)－Cn = mlog [(t(n＋i)－tM )/(tn－tM )] (3—1—7)

又因为存在(3—1—1)式的关系，所以得：

(tn－tM )/(t(n-i)－tM ) =(t(n＋i)－tM )/(tn－tM (3—1—8) 整理(3—1—8)式，得到最终结果：

tM＝（t(n＋i)·t(n-i)-tn2）/ (t(n＋i) t(n-i)－2tn (3—1—9)

式中i=1，2，3...；

tn-i ——第一个同系物的保留时间[(正己烷)l

tn ——第二个同系物的保留时间(正庚烷)]，

tn i——第三个同系物的保留时间[(正辛烷)]。

X，Guardino等人的验证认为(3—1–-9)式准确可靠，并

提出i值愈大则计算出来的tM值愈准确。

请同学们根据本实验测得的tn-i 、tn 、tn i值，试计算出

tM与甲烷组分实测值的比较值，观其误差。

实验三气—液填充色谱柱的制备及评价

一、目的要求

1．学会固定液的配制及涂渍方法。

2．掌握装柱及老化技术。

3．掌握评价柱性能的方法。

二、基本原理

实际中应用最广的是气—液填充色谱柱，其柱性能好坏，

灾于固定相的选择和制备技术。

由载体的堆比重和柱内体积即可估算所装载体质量。

V=πr2L

式中 r——柱内半径;L——柱长。

堆比重=载体质量/载体体积(g／m1)

应装载体质量＝堆比重×V(1 0.2)

按液载比，计算应称固定液的质量。

为保证固定液全部溶解，一般溶剂量为载体体积的1.3倍。

根据固定液性质、配比的不同，将固定液涂附在载体颗粒

表面的方法也不同。一般液载比大于5％以上，可用“常视”

涂渍法。

装柱要求均匀、紧密，载体不能破碎，一般采用泵抽法。

老化是为了进一步除去固定相中残余的溶剂和某些挥发

性杂质；使固定液涂布得更均匀、牢固，促使固定相装填更

加紧密。

制备好的柱子需测定其性能，考察柱制备技术和欲测对

象的分离情况。柱性能一般用以下指标来评价。

理论塔板数(n)或有效塔板数(neff)反映了柱效能，主要由

固定相的性质和动力学因素(操作参数)决定。

n =5.54(tR/wh/2)2 = 16(tR/w)2 4––1––2

neff =5.54(t'R/wh/2)2 = 16(t'R/w)2 4––1––3 式中 tR——保留时间(s);

t'R——调整保留时间(s);

wh/2–––半峰宽度(cm)

w——峰底宽度(cm)

柱效也可用塔板高度(H)和有效塔板高度(Heff)表示。

柱选择性(r2,1)也是评价填充柱性能的重要指标之一，它表

示相邻组分的分离情况, 主要考虑难分离物质对。

柱容量(k')是衡量平衡过程中色谱柱保留能力的重要参数。

由组分和固定液的热力学性质决定，与固定液的配比和分配

系数有关。

不同k'的物质具有不同的Heff值，Heff随k'值的增大而减

小。因此可采用k'为一定值时的Heff值来评价色谱柱的实际

操作效能。

分离度(R)是一个综合捐标，既反映柱效能，又反映了

柱选择性。由基本分离方程式，可明显看出它综合了色谱过

程热力学、动力学的各参数关系。

当R≥1.5时，二峰可达基线分离，即分离纯度可达99.7%. 当R=1.0时，分离纯度可达98%。

R需多大, 主要取决于分析的目的和要求。

三、仪器与试剂

仪器气相色谱仪，TCD;真空泵，红外灯，微量注身器，

量筒，培养皿(7－9cm)。

试剂丙酮(AR)，苯，环已烷，邻苯二甲酸二壬酯(DNP)，

上试101白色载体(60－80目)。

四、实验步骤

1．气－液填充柱的制备：

(1) 计算3mm× 2m不锈钢柱应装101白色载体的质量。

(2) 用微量烧杯在分析天平上称取液载比为10%的固定液

质量。

(3) 固定液涂渍采用“常视’’法：用丙酮将固定液转移至

培养, 待固定液全部溶解，加入载体，迅速摇匀，使溶

液正好淹没载体。室温下，置于通风橱内，待溶剂均匀

挥发近干, 在红外灯下(<80℃)烘干。

(4) 装柱将选好的不锈钢柱先用5一10%NaOH热溶液清

洗内壁，依次用自来水—稀盐酸—自来水冲洗至中性，

最后用蒸馏水和少量95%酒精冲洗，烘干后备用。用泵

抽法装柱：在柱一端塞上少许玻璃棉，用布包住，与真

空泵I橡皮管相连。另一端与装填漏斗相连。启动真空

泵，从漏斗上慢慢加I入固定相，并轻轻敲打柱，直至

固定相不再下沉为止，，将柱与漏斗脱I开并在柱的另一

端也塞上少许玻璃棉。

(5) 老化将装好的柱子的进填料一端接汽化室，另一端暂

不接检测器。开启载气，在5—10ml／min流速，柱温

高于操作温度5—10℃(低于固定液最高使用温度)的条

件下,老化15—18h,直至记录仪基线平直为止。

2．色谱条件3mm×2m不锈钢柱;10%DNP，101白色担体

(60一80目)；Tc= 80℃，Ti=100℃，Td=100℃; 载气

H2:30ml／min;桥电流120—180mA;进样量1μl;纸速自选。

3、柱性能测定将老化好的柱子的另一端与监测器相连，开

机待基线平直后，在最佳流速下，进苯、环己烷混合样

lμl，空气5μl 记录色谱图及tM、tR。

五、数据处理

1．填充柱制备记录：

2．根据色谱图，tM、tR、wh/2计算最佳流速时柱效能滑标。

六、问题讨论

1、常规涂渍时应注意些什么?

2．装填固定相的方法有几种?使用泵抽法应注意些仕么?

3．柱老化的目的及要求是什么?

4、为什么要将装填料一端接汽化室，另一端接检测器?能否

颠倒?为什么?

七、注意事项

1．涂溃过程切勿图快用烘箱或在高温下烘烤。

2．蒸发溶剂时，不能用玻璃棒搅拌。填充过程中不得敲打

过猛，以免载体弄碎。

3．低沸点、易挥发的固定液不能用泵抽装填法。

4．气路应严格检漏、热导池出口端应用聚乙烯管连接并通

至室外放空，防止H2在室内积聚引起爆炸。

5、柱温切勿超过85℃，否则会因固定液流失而造成基线

漂移。

6．桥流根据仪器型号选定。

实验四毛细管柱安装及基本性能评价指标

的测定与计算

一、目的更生

通过本实验掌损毛细管柱的安装方法和柱性能评价指标

的测定与计算。

二、基本原理

毛细管固定相有大的相比和比渗透性以及高的柱效，因此，常用在复杂物质的分析。由于毛细管柱的性能会因涂渍方式、

膜的厚度、膜的均匀性、柱子安装技术等因素而变化，因此，

必须对毛细管柱的性能进行评价。柱评价通常选用κ≥3的组

分测定其保留时间与半峰宽度，计算它的理论板数；同时选

用难分离的一对物质测定其分离能力，通过观察峰的拖尾程

度评价柱避的惰性度。

三、仪器与试剂

1．仪器毛细管气相色谱仪，FID；

色谱柱：SE—30WCOT柱，25m×0.3mm;

2．试剂环己酮，2，4－二甲基苯胺，正辛醇－1，n-C12，

萘，2,4－二甲酚，n－Cl4。

四、实验步骤

1、毛细管色谱柱的安装:在安装前先检查毛细管口端有无异

物堵塞，按照图5—1—1将柱入口端与分流装置的附件接上，

通载气检查系统是否漏气(观察流量计转子是否下沉到底)，

是否通气。当气路畅通时将柱的另一端与装有尾吹装置的附

件接上。

2．注入甲烷气检查安装是否正确，当柱子连接好后将检测室

升温至150℃，通氢气和空气并点火，再通尾气(N2)，约

30ml／min，注入10μl甲烷气，待甲烷出峰后，调整分流比

约1:50或1:loo，线速约10cm／s。在此条件下，甲烷峰底峰

宽约在1s左右，说明安装正确，此时，可将柱温升到

80℃→110℃，TD:250℃，’载气线速u=15cm／S。

3．分流比的测定与计算：分流管的流速用皂膜流量计测定，

柱流速根据柱体积和tM求得，将两个流速校正在同一温度下

进行比较即得分流比。

4．色谱条件 (1)标准混合物的配制将上述试剂配成1％正

乙烷溶液。(2)色谱条件Tc=110℃,Ti=200℃,TD=180℃;进样量：

0.2μl ,分流比：100:1；尾吹气(N2)40m1／min，载气(N2)

(99.995%)；线速:10cm／s。

五、数据处理

1．理迫塔极数的测定与计算：以正十四烷作标准测定其保留

值和半宽度，根据下式计算n值。

n=5．54(tR／Wh/2)2。

2、计算n－C12和n—C14的分离度

R=2(tR C14－tR C12)/(WC12 WC14)

3．观察2,4－二甲基苯胺和2，4－二甲酚的峰形是否拖尾。

六、问题讨论

1．简述毛细管色谱法的优缺点。

2．细内径毛细管柱分析时为什么要采用分流方式?怎样测定分流比?

3．怎样评价毛细管柱的特性?

七、注意事项

1．毛细管两端不能被异物堵塞。

2．毛细管应插入气化室的载气高流速区，保证样品分流时不

失真，接检测器的一端要超过尾吹气和氢气的进口部位，使

柱末端处在气体高流速区，这样有利于柱出口组分的峰形拔尖。

实验五氢火焰离子化检测器(FID)

基本性能指标的测量

一、目的要求

1．掌握FID的结构、检测原疵及调试方法，

2．学会FID基本性能指标的测矗和计算方法。

二、基本原理

FID为质量型检测器，其灵敏度高、响应快、线性范围宽，

主要用于测定有机化合物。

FID结构的核心是离子室，室内有喷咀、发射极和收集极

等三主要部件。载气和氢气按比例从入口混合进入喷咀，空

气为助燃气，点螂后的氢焰是组分离子化的能源。在极化极

和收集极之间施加一定的直流电压，构成一个外加电场，使

离子化产生的离子流定向移动。

检测器只有载气通过时，因极微量有机杂质被电离形成

的离子流(10－11—10－12A)，称为“基流”。当载气携带样品

进入喷咀时，由于“有杌物在火焰中热裂解生成自由基，自

由基与其他分子碎片或原子相互碰撞便产生了离子，这时离

子流可增大为10－7A。在一定范围内，离子流的大小与引入

火焰中的有机物的质量、速率成正比。但这种电梳需经高阻(107—1010?)转变成电压信号，再经放大器放大后，由记录仪

记录下来。

FID灵敏度其物理意义是单位质量速率下，溶质在检测器中产生的瞬时电信号值。

因为输出信号放大了，检测器中电子部件的噪声也同时被放大，有时甚至噪声掩盖了响应信号，所以判断FID的质

量，不仅要看灵敏度，还要看检测限。FID检测限指检测器

恰能产生2倍于噪声信号时，单位时间(s)，通过检测器的质

量，它是衡量检测器性能好坏的主要指标。

三、仪器与试剂

1．仪器气相色谱仪，FID，1μl微量注射器，秒表。2．试剂苯(色谱纯)，CS2(AR)，SE-30(色谱级)，上试102白色

载体(60—80目)。·’

四、实验步骤

1．色谱条件3mm×2m不锈钢柱，20％SE-30；Tc=85℃,

Ti=100—120℃,TD=100—120℃；载气；N2 30ml／min，

H2 40ml／min，Air 400—500ml／min;放大器灵敏度：

103，衰减：1／2;记录仪量程1mV;纸速16mm／min;

样品：10－4g／ml苯的二硫化碳溶液，进样量0.5－1μl 。

2．仪器调试：

(1) 先通裁气，再接通主机电源；

(2) 将检测室(不低于100℃)、柱室和汽化室升到所需温度；

(3) 打开“微电流放大器”电源和开关；

(4) 打开记录仪电源和记录笔开关，调整放大器“零调”，

使记录笔位于适当位置；

(5) 把空气流量调到400—500m1／min，氢气流量约100m1

／min；

(6) 点火，约10s后，即把引燃开关拨下。火焰刚点着时

能听到“噗”声，这时记录仪指针巳不在原来位置，说

明氢焰巳点燃(也可通过改变氢气流量大小或切换灵敏度

开关，观察指针是否有反应，来确定火是否点燃)；

(7) 将H2流量慢慢调到需要值；

(8) 调“基补”电位器，将记录笔调到所需位置；待基线平

直后即可进行测定(不同型号的仪器操作见其说明书)。

3．仪器运转正常后，记录半小时内基线飘移和噪声。

4．灵敏度的测定吸取10－4g／ml苯的CS2溶液0.5μl ，进

样分析，记录色谱图，重复进样3次，取其平均值，计

算灵敏度。

5．关机先关H2、空气，再关各电器部件的电源，待柱温降至室温时再关栽气。

五、数据处理

1、测定灵敏度在达到规定指标情况下的基线飘移和噪声。

2．根据色谱图测量峰面积，计算FID的灵敏度。

3．由RN和S计算检测限D。

4．由Wh/2和D计算最小捡知量mmin。

5．由mmin和进样量计算cmin。

六、问题讨论

1．如何判断氢焰是否点燃?

2．如果基线的噪声太大，可采取哪些措施以降低噪声?

3．说明控制FID与TCD检测室的温度对灵敏度的影响有

何不同?

4、氢焰点不着火的原因有哪些?如何排除?

七、注意事项

1．通H2后，待管道中残余气体排出后，应点火，并保证火

焰是点着的。

2．氢焰点燃后，必须将“引燃”开关及时扳下，不然放大器

无法工作。

3．使用FID时，离子室外罩须罩住，以保证良好的屏蔽和防

止空气侵入。如果离子室积水，可将端盖取下，待离子

室温度较高时，再盖上。工作状态下，取下检测器罩盖，

不能触及极化极，以防触电。

4．离子室温度应大于100℃，待层析室温度稳定后，再点火，

否删离子室易积水，影响电极绝缘而使基线不稳。

实验六保留值定性

一、目的要求

1．掌握用保留值定性的方法。·

2．了解影响定性准确度的因素。·

二、基本原理

在一声的色谱条件下，组分有固定不变的保留值。在具

备已知标准样情况下，可采用保留值直接对照定性。

三、仪器与试剂

1．仪器 SP-2305气相色谱仪，1μl微量注射器，FID检

测器。

2．试剂 C5—C10合成醇样品；正戊醇；正已醇；正庚醇；

正辛醇；正壬醇；正癸醇(均为分析纯)。

四、实验步骤

1．实验条件色谱柱：2000mm×4mm不锈钢柱，固定

相：20％PEGA＋1.5% H3P04／ChrOmosotbWAWDMCS

(80－100目)，Tc=190℃,Ti=250℃,TD=200℃；H2 35ml／min;

N2 45m1／min;空气 450ml／min。

2．开启色谱仪，调节放大器与记录仪零点，选择上述分析

条件，待直线稳定后开始分析。

首先,注入0．4μl C5—C10合成醇样品，准确测定每个峰的保留值。

分别加入正戊醇、正己醇，正声醇，正辛醇、正壬醇、

正癸醇标准样，准确测定保留时间，列表。

五．数据处理

对照标准物与合成醇中组分的保留搜步对合成醇样品

定性。

六、问题讨论

1．影响保留值重现性的因素主要有那些?

2．用保留时间定性的优缺点有哪些?

3．保证本实验定性准确的关键问题是什么?

七、注意事项

色谱保留值受操作条件影响很大，因此，分析样品与标

准物时，实验条件一定要重复，尤其是柱温与载气流速。

实验七保留指数定性

一、目的要求

1．掌握保留指数的概念及测定方法。

2．在没有标样情况下，学会利用文献上的保留指数定性。·二、基本原理

在一定的色谱条件下，组分的保留指数为一定值，可

用下式计算：Ix=100[(log γx,z)/ (logγz＋1,z ) z] (9－2－1) 计算结果与文献值对照即可定性，本实验用此方法定性酯类

混合样中乙酸正丁酯。

三、仪器与试剂

1．仪器上海分析仪器上的103气相色谱仪，1μl微量注

射器，FID检测器。

2．试剂正己烷、正庚烷、正辛烷、正壬烷(均为分析纯)

酯类混合样。

四、实验步骤

1．实验条件色谱柱：3000mm×4mm不锈钢柱，固定相,

10%阿皮松L/6201载体; Tc=100℃,Ti=120℃,TD=120℃； N2

40ml／min;H2 30ml／min;空气 280ml／min。

2．实验操作按上述实验条件调好色谱仪，待基线稳定后

开始分析。

首先注入甲烷标样，然后注入0.3μl正己烷、正庚烷、

正辛烷和正壬烷混合样，准确测其调整保留时间。

在同样条件下注入酯类混合样，准确测定每个峰的调整

保留值，列表。

五、数据处理

根据公式9－2－1，分别计算A、B、C、D峰值，与

文献值对照确定乙酸正丁酯。

六、问题讨论

1．利用文献保留指数定性需注意什么问题?

2．除公式计算外，还可用什么方法获得保留指数?

七、注意事项

在分析的四种正构烷烃中，选取作标准的两正构烷烃，保留值应分别在乙酸正丁酯的前后。

实验八内标法定量分析

(聚苯乙烯中苯乙烯、乙苯的分析)

一、目的要求

1．掌握内标法原理及测试方法。

2．学会测定聚苯乙烯中挥发性组分。

二、基本原理

聚苯乙烯树脂中含有多种挥发性成分，测定其中的几

种，采用内标法分析，以正十二烷作内标物，比较样品峰高

与标准品峰高，计算样品中相当的含量。

三、仪器与试剂

l．仪器上海分析仪器厂的102G气相色谱仪，FID检

测器，微量注射器。．

2．试剂乙二醇丁二酸聚酯(固定液)；釉化6201载体；

正十二烷；乙苯；异丙苯(均为分析纯)，二硫化

碳；聚苯乙烯样品。

四、实验步骤

1．实验条件色谱柱，4000mm×4mm不锈钢柱；固定相，

20％乙二醇丁二酸聚酯／60—80目釉化620l红色载体。

Tc=130℃,Ti=200℃,TD=150℃；载气(N2)柱前压1.8—2.0MPa,

H2 50m1／min；空气 700m1／min。

2．操作步骤：

(1) 标准曲线的绘制。取25m1容量瓶5只，每一容量瓶中

准确称入不同质量的乙苯、苯乙烯纯标准品，见9－6－1。用

二硫化碳溶解并稀释至刻度，再准确加入5μl正十二烷，充分

振摇，混合均匀后，在上述色谱条件下，分别多次进样，量取

内标物，正十二烷与乙苯，苯乙烯的，峰高，并分别计算其比值，即可绘制蜂高比值与各组分汝度(质量百分浓度相对1g样

品计算)的标瞄醢线图。

(2) 样品测定。取1.0000±0.0002g聚苯乙烯，置于25m1容

量瓶中，加二硫化碳溶解，并稀释至刻度。准确加入5μl 正

十二烷，充分振摇，待混合均匀后，取0.4μl 注入色谱仪，色

谱峰流出后，精密量取被测组分与正十二烷的峰高，并计算其

比值，按所得峰高比值，由标准曲线图查出各组分的浓度(质

量百分浓度)

五、数据处理

认真绘制标准曲线，根据组分与内标物的峰高比值，在曲线上找出缉分的含量。

六、问题讨论

1．由内标法定量计算公式，说明内标工作曲线法的原理。

2．内标工作曲线法有什么特点?

七、注意事项

绘制标准曲线时，组分浓度为相对1g样品而言的质量百

分浓度。

实验九 HPLC柱填充技术和柱性能考察

一、目的要求

1．掌握匀浆法装柱技术。

2．掌握考察色谱柱基本特性的方法。

二、基本原理

1、色谱柱的填充：

色潜柱分离效能的好坏，不仅与填料特性和填充方法有

关，而且与从事装柱工作的经验有关。

柱的填充方法主要决定手填充剂颗粒性质及大小。对填充的总要求是：均匀、颗粒不破碎且紧密、大小不同的颗粒

在柱内不分级和不产生缝隙。在HPLC中使用的微粒固定相

直径为3—10um，由于微小颗粒具有很高的表面能，因此它

们在干燥状态容易聚集，并粘附于柱壁。使用，干法填充，

不能获得分离效能好的色谱柱。目前，一般都采用湿法匀

浆法装柱。

匀浆法，就是选择一种合适的液体作为分散介质，制成微粒在介质中高度分散的固定相悬浮液，在整个填充过程中，

微粒不沉降或凝聚。然后，用高压输液泵在高于实际操作压

力下，用顶替液将该悬浮液迅速压入柱内。

匀浆法填充色谱柱的装置见主教材。匀浆罐为容积在lOOml左右的圆柱形。匀浆罐上面的放空阀是为了在装柱时

先排掉罐上部残存的气体。在匀浆罐和色谱柱之间的一小段

短柱称为预柱。装柱时，色谱柱和预柱都装满固定相，其作

用是保证色谱柱上端的装填密度。另外，在使用过程中，当

柱头下陷时，可用预柱进行修补。

2．柱性能考察：

评价液相色谱柱的性能是否优良，有不同的方法和考察

指标。本实验用理论塔板数和峰对称性二个方面进行考察。

(1) 理论塔板数：色谱柱的分离效率(简称柱效)，可定量

地用理论塔板数来表示，理论塔板数反映色谱柱本身的特性，

表明柱效受填料颗粒度、柱内径、流动相流速和粘度、进样

方式等影响，是一个具有代表性的参数。

(2) 峰对称性：若色谱柱充填不均匀或柱子经长期使用及

保存不当，都会引起色谱峰不对称。峰不对称性用峰不对称

因子(Peak Asymmelry Factor)表示。其计算方法为，

由峰顶向基线作垂线，并在峰高10%处作基线平行线，得A、

C、B三交点，则峰不对称因子可由下式计算求得。

PAF=CB/AC （10-1-1）

一根良好的色谱柱，峰不对称因子应在0.8—1.2范围内。

三、仪器与试剂

1、气动放大恒压泵（流量1l/h）超声波发生器，不锈钢色谱

柱(15cm×φ4mm)。

2．YWG-C18。(5um或10um)，甲醇：水=60：40，试验混合

物：硝基苯—苯乙酮—甲苯

四、实验步骤

1．色谱柱的填充：

(1) 将色谱柱依次用氯仿、丙酮、甲醇，洗涤剂、水、甲醇

清洗，然后吹干，在柱下端装上过滤片及带密封垫的螺母，

按主教材接好装置。

(2) 检查泵系统是否正常，是否泄漏。

(3) 将500m1顶替液置于超声波发生器上，脱气处理15-20 min。

(4) 称取超过色谱柱实际用量15%的填料，倒入小烧杯中，加入分散介质(5-10m1/g填料)，摇匀，用超声波处理l0min，

制成均匀的匀浆液。

(5) 迅速将匀浆液倒入匀浆罐中。

(6) 压紧顶盖，打开放空阀，从出气扫加入少量分散介质，

使排气管充满液体，关闭放空阀。

(7) 打开高压阀，使压力迅速升至400-500MPa厂让顶替液

迅速将匀浆液压入柱中，待流出100-150ml液体后，逐渐降

低压力，至停泵。待柱中不再流出液体时，卸下柱子，装上

过滤片及密封螺母。

2、色谱柱性能考察

(1) 将填充好的色谱柱接入色谱系统。

(2) 启动仪器，待基线平稳后即可进样。

(3) 记录仪纸速10mm/min，检测器UV-254nm，0.02AUFS，

注入3-5ul试验混合物溶液，记录色谱图。

五、数据处理

根据柱长(cm)，组分的保留时间tR(min)，组分的半高峰宽Wh/2(mm)，计算每米柱的理论塔板数、理沦塔板高度和合

组分的不对称因子。

六、问题讨论

1．很据数据处理的结果，评价所填充的色谱柱性能。

2．简述评价液相色谱柱的方法和考察指标。

七、注意事项

1．所配制的匀浆液浓度不宜过高，否则将影响固定相在分散

介质中的均匀分散。通常，悬浮液中含填料10%左右。

2．填充过程所施加的压力，一般在200—600MPa的范围内。

压力过高，柱内填充床可能产生裂纹或结块，压力过低，固

定相不够紧密，柱效降低。

3．考察柱效时，要避免使用强极性溶质和高粘度的溶剂。对

硅皮柱，常用庚烷或己烷作流动相，苯、萘和苯酚混合物作

试验用溶贡。对C18柱，试验用溶质和硅胶柱相同，但流动

相为甲醇与水的混等物。

4．因为理论塔板数甲和柱长有关；通常夕在没有说明柱长时，

都是指每米柱长的数值。对柱长15－30cm，固定相粒度5－10

μl 的液相色谱柱，如填充良好，在最佳操作条件下，其理论

塔板数约为1×10-4。

实验十 HPlC几个基本实验技术

一、色谱柱的保养

在正常情况下，色谱柱至少可以使用3—6个月，，能完成数篇次以上的分离。但是，若操作不慎，将使色谱柱很易

损坏而不能使用。因此，为了保持拄效、柱容量及渗透性，

必须对色谱柱进行仔细地保养。

1．色谱柱极易被微小的颗粒杂质堵塞，使操作压力迅速升高

而无法使用。因此必须将流动相仔细地蒸馏或用0.455μm孔

径的滤膜过滤。在流动相贮槽与色谱柱间，安装0.45μm孔径

的过滤器，在柱子上端接头处装上多孔过滤片，以防止固体

颗粒进入色谱柱中。在水溶液流动相中，细菌容易生长，可

能堵塞筛板，加入0.01%NaN3。能防止细菌生长。

2、最好使用进样阀进样，以防止注射器进样时，注射隔膜碎

屑堵塞柱子入口。

3、对硅胶基键合相填料，水溶液流动相的pH值不得超出2—

8.5的范围，使用温度不宜过高。柱子在酸性或碱性条件下使

用之后，应依次用水、甲醇清洗，对暂时不用而需要较长时

间保存的柱子，要用纯甲醇清洗，柱子两端用金属螺帽封闭，

保存于纯净的有机溶剂中。

4．要防止色谱柱被振动或撞击，否则柱内填料床层产生裂缝

和空隙，会使色谱峰出现“驼峰”或“对峰”。

5．要防止流动柑逆向流动，否则将使固定相层位移，柱效下

降。

6、使用保护柱。连续注射含育未被洗脱样品时，会使柱效下

降，保留值改变。为了延长柱寿命，在进样阀和分析橙间加

上保护柱，其长度一般为2—5cm，填充与分析柱性质相似的

表面多孔型固定相，因此可干法填装，而且价廉，更换容易。

实验表明，使用保护柱后，除了使K’为零的组分的塔板数

减少外，其柱效下降很少。

二、色谱柱的再生

一般情况下，硅胶和ODS等化学键合固定相再生是困难的。有时，采用下述方法可能提高柱效。

1、由于杂质微粒等因素，使柱上端固定相变色，柱效下降。

这时，可仔细地将变色部分除去(约3mm左右)，再补充新的

固定相。

2、当色谱柱吸附未被洗脱成分时，柱效将明显下降，可选择

合适的溶剂进行洗净。

3．对离子交换树脂柱，先经1mol／L HCl和1mol／L NaOH

溶液洗净，再以1-2mol／L NaCl水溶液平衡，以超声波发生

器进行清洗，通常可获良好的效果。

4、当采用梯度洗脱时，柱在重复使用前，用泵把几倍子柱体

积的起始溶剂压经柱子，以重新建立起始的平衡来得到再生。

三、实验前准备工作

1．流动相溶剂的处理：

(1) 水将一股的蒸馏水，加入少许高锰酸钾，在pH9-10

的条件蒸馏，可用于常规洗脱。用于梯度洗脱的水，应进行

二次蒸馏。

(2) 有机溶剂的提纯通常用蒸馏法可除掉大部分有紫外吸

收的杂质。将溶剂通过氧化铝或硅胶柱可除去极性化合物。

氯仿中含有的少量甲醇，可先经水洗再经蒸馏提纯。试剂级

的四氢呋喃由于含抗氧剂丁基甲苯酚而强烈吸收紫外线，可

经蒸馏除去难挥发的丁基甲苯酚。为了防止爆炸，蒸馏终止

时，在蒸馏瓶中必须剩余一定量的液体。

(3) 溶剂的过滤和脱气。流动相溶剂在使用前必须先用0.45

um孔径的滤膜过滤，以除去微小颗粒，防止色谱柱堵塞；同

时要进行脱气处理，因为溶解在溶剂中的气体会在管道，输

液泵或检测池中以气泡形式逸出，影响正常操作的进行。

1) 溶剂中的CO，使得电导检测器的背景增大。

2) 检测池中的气泡，使得信号不稳定，常出现系列假峰(特

别是当柱子加温使用时)

3) 色谱柱内的气泡，使柱效降低。

4) 输液泵内的气泡，使盾塞动作不稳定，流量变动，严重时

无法输液。

溶剂脱气的方法很多，常用的方法有：用惰性气相(如氦气)驱除溶剂中的气体；加热回流；真空脱气和超声波脱气。

其中，以超声波脱气最为方便、安全、效果良好，只需将溶

剂瓶放入加有水的毫波发生器槽中，处理10-15min即可。

2．试样溶液的制备配制分析试液的溶剂应当使用色谱分离

的流动相或可与其混溶的溶剂，配制好的试液需经0.45um孔

径的滤膜过滤，以除去固体微粒物质。

四、样品处理技术

在某些试样中，常含有多量的蛋白质、脂肪及糖类等物质。它们的存在，将影响待测组分的分离测定，同时容易堵

塞和污染色谱柱，使柱效降低，所以常需对试样进行预处理。

样品的预处理方法很多，如溶剂萃取、吸附、超速离心及超

过滤等。

1．溶剂萃取溶剂萃取适用于待测组分为非极性物质。在试

样中加入缓冲溶液调节pH，然后用乙醚或氯仿萃取待测组分。

但如身测组分和蛋白质结合，在大多数情况下言难以用萃取

操作来进行分离。

2．吸附将吸附剂直接加到试样中，或将吸附剂填充于柱进

行吸附。亲水性物质用硅胶吸附广而疏水性物质可用聚苯乙

烯—二烯基苯等类树脂吸附。

3．除蛋白质向试样中加入三氯醋酸或丙酮；乙腈、甲醇，

蛋白质被沉淀下来，然后经超迷离心，吸取上层清液供分离

测定用。

4、超过滤用孔径为10×10-10-500×10-10cm的多孔膜过滤

可除去蛋白质等高分子物质。