产蛋白酶优良腐乳生产菌毛霉的分离筛选与鉴定
蛋白酶产生菌的筛选
蛋白酶产生菌的筛选 组别：第*组 班级：生工**班 组员：*** 指导老师：*** 一、实验目的 学习从自然界中分离蛋白酶产生菌
二、实验内容 蛋白酶产生菌的分离 三、实验原理 许多细菌和霉菌产生蛋白酶，细菌中的芽孢杆菌是最常见的蛋白酶产生菌。本实验将土壤样品悬液加热处理，杀死非芽孢细菌及其他微生物后进行划线分离得到芽孢杆菌，将其接种到奶粉培养平板并进行培养，根据奶粉平板的水解圈做初筛。将初筛的蛋白酶产生菌接入产酶培养基振荡培养，测定蛋白酶的活力，最终得到产蛋白酶的芽孢杆菌。也可直接将细菌接种到奶粉培养平板进行培养，分离筛选其他蛋白酶产生菌。 四、实验材料和用具 1.材料：土壤样品 2.试剂：牛肉膏蛋白胨培养及平板、奶粉培养基平板、45mL 无菌水（带玻璃珠）、芽孢染色液、 3.仪器及用具：紫外分光光度计、显微镜、恒温水浴锅、摇 床、酒精灯、接种针、游标卡尺、无菌移液 管、无菌试管、量筒、容量瓶、漏斗、试剂 瓶、漏斗、载玻片、滤纸、擦镜纸。 五、操作步骤
（一）配制所需培养基 按照以下配方配制所需的培养基 牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏 0.5g，蛋白胨 1g，NaCl 0.5g， 琼脂 1.5～2.0g，水 100ml，pH 7.2 配制200mL 奶粉培养基：牛肉膏 0.5g，蛋白胨 1g，NaCl 0.5g， 琼脂 2.0g，水 100ml，pH 7.0～7.2 脱脂奶粉 3g，配制200mL （二）分离 1.采集土壤样品，用无菌水植被1:10土壤悬液。 2.取1:10土壤悬液5 mL，注入已灭过菌的试管中，将此试 管放入75～80℃水浴中热处理10min以杀死非芽孢细菌。 3.取加热处理过的土壤悬液100～200μL，涂布接种到牛肉 膏蛋白胨培养平板，后将平板倒置，于30～32℃下培养24～48h. 4.对长出的单菌落进行编号，选择表面干燥、粗糙、不透明 的菌落，挑取少许菌苔涂片，做芽孢染色，判断是否为芽孢杆菌。 （三）筛选 1、从判定为芽孢杆菌的菌落处，分别挑取少许菌苔，先接种奶粉斜面培养基，再转接奶粉培养基平板上，30～32℃下培养24～48h。
酶的特性综述
酶的特性综述 酶通常是指由活细胞产生的、具有催化活性的生物大分子，大多数酶是蛋白质，少数是RNA，另有一些需要辅助因子的辅助。酶的特性主要体现在这几个方面： 一、高效性 1、酶的高效性是和非酶的催化剂比较而言。主要是指催化能力，蛋白质（环境适宜）的催 化能力是普通化学催化物质的10^5—10^8倍。生物分子之间的反应首先要进行分子碰撞接触，如果在没有酶作用的情况下，分子主要靠自然的热运动来随机进行接触，这样的几率比较小，而在酶的作用下，由于酶和作用底物有特异性结合位点，相当于把反应需要的分子给拉到一起去了，所以这样的效率要高很多。 2、酶的高效性实验探究 材料： 新鲜猪肝研磨液（含有H2O2酶)、3%的FeCl3溶液（催化过氧化氢分解的化学催化剂）、清水、试管5支、试管架、酒精炉、线香、打火机、量筒 步骤： 1、在5支试管中分别加入5mLH2O2溶液，依次编号置于试管架上。 2、在1号试管中加入一定量的清水；2号试管中加入与清水等量的新鲜猪肝研磨液；3号试管中加入等量的3%的FeCl3溶液；4号试管中加入经过高温煮过的等量的新鲜猪肝研磨液；5号试管中加入高温煮过的FeCl3溶液。 3、用点燃但无火焰的线香插入试管检验。 现象： 氧气量效果 1号：—无催化作用 2号：﹢﹢高效催化 3号：﹢低效催化 4号：—无催化作用 5号：﹢低效催化 结论：过氧化氢酶比FeCl3催化剂高效。酶具有高效性。
二、专一性 酶对所作用的底物有严格的选择性。一种酶仅能作用于一种物质，或一类分子结构相似的物质，促其进行一定的化学反应，产生一定的反应产物，这种选择性作用称为酶的专一性。 酶的专一性是指酶对底物及其催化反应的严格选择性。通常酶只能催化一种化学反应或一类相似的反应，不同的酶具有不同程度的专一性，酶的专一性可分为三种类型：绝对专一性、相对专一性、立体专一性；也可分为：结构专一性和立体异构专一性。 如过氧化碳氢酶只能催化过氧化氢分解，不能催化其他化学反应。细胞代谢能够有条不乱的进行，与酶的专一性是分不开的。 探究酶的专一性的实验 序 号 项目 试管 1 2 1 注入可溶性淀粉2mL / 2 注入蔗糖溶液/ 2mL 3 注入新鲜淀粉酶溶液2mL 振荡 4 60℃温水保温 5 min 5 加斐林试剂1mL 振荡 6 将试管下部放入60℃热水 中 2 min 7 观察实验结果有砖红色沉淀无砖红色沉淀结 论 淀粉酶只能催化淀粉水解，不能催化蔗糖水解 三、多样性 酶的种类很多，大约有5000多种，其中可以通过食用补充的酵素达2000多种；形态上主要有三种：专业级酵素为酵素胶囊，其次为酵素粉，而液体酵素含量低、效价低、易腐败而安全性较差一些，食用风险较高。 四、温和性
实验六十淀粉酶产生菌株的筛选
实验六十淀粉酶产生菌株的筛选 实验项目性质：设计性 所涉及的知识点：无菌技术、富集培养、纯种分离、淀粉酶性质、酶活测定 计划学时：8学时 一、实验目的 1．掌握从环境中采集样品并从中分离纯化某种微生物的完整操作步骤。 2．巩固以前所学的微生物学实验技术。 3．掌握产酶微生物筛选的方法。 二、实验原理 α-淀粉酶是一种液化型淀粉酶，它的产生菌芽孢杆菌，广泛分布于自然界，尤其是在含有淀粉类物质的土壤等样品中。从自然界筛选菌种的具体做法，大致可以分成以下四个步骤：采样、增殖培养、纯种分离和性能测定。 1、采样：即采集含菌的样品 采集含菌样品前应调查研究一下自己打算筛选的微生物在哪些地方分布最多，然后才可着手做各项具体工作。在土壤中几乎各种微生物都可以找到，因而土壤可说是微生物的大本营。在土壤中，数量最多的当推细菌，其次是放线菌，第三霉菌，酵母菌最少。除土壤以外，其他各类物体上都有相应的占优势生长的微生物。例如枯枝、烂叶、腐土和朽木中纤维素分解菌较多，厨房土壤、面粉加工厂和菜园土壤中淀粉的分解菌较多，果实、蜜饯表面酵母菌较多；蔬菜牛奶中乳酸菌较多，油田、炼油厂附近的土壤中石油分解菌较多等。 2、增殖培养（又称丰富培养） 增殖培养就是在所采集的土壤等含菌样品中加入某些物质，并创造一些有利于待分离微生物生长的其他条件，使能分解利用这类物质的微生物大量繁殖，从而便于我们从其中分离到这类微生物。因此，增殖培养事实上是选择性培养基的一种实际应用。 3、纯种分离 在生产实践中，一般都应用纯种微生物进行生产。通过上述的增殖培养只能说我们要分离的微生物从数量上的劣势转变为优势，从而提高了筛选的效率，但是要得到纯种微生物就必须进行纯种分离。纯种分离的方法很多，主要有：平板划线分离法、稀释分离法、单孢子或单细胞分离法、菌丝尖端切割法等。 4、性能测定 分离得到纯种这只是选种工作的第一步。所分得的纯种是否具有生产上所要求的性能，还必须要进行性能测定后才能决定取舍。性能测定的方法分初筛和复筛两种。 初筛一般在培养皿上根据选择性培养基的原理进行。例如要测定淀粉酶的活力可以把斜面上各个菌株一一点种在含有淀粉的培养基表面，经过培养后测定透明圈与菌落直径的比值大小来衡量淀粉酶活力的高低。 复筛是在初筛的基础上做比较精细的测定。一般是将微生物培养在三角瓶中作摇瓶培养，然后对培养液进行分析测定。在摇瓶培养中，微生物得到充分的空气，在培养液中分布均匀，因此和发酵罐的条件比较接近，这样，测得的结果更具有实际的意义。 三、实验用品 1．器材 （1）小铁铲和无菌纸或袋。
实验一腐乳产蛋白酶菌株的筛选1
实验一腐乳产蛋白酶菌株的分离 一、实验目的与要求 了解涂布分离和平板划线法从食物中分离食源性微生物的原理和方法，并熟练掌握该操作方法。 二、实验原理 微生物是蛋白酶的最佳来源，与动物和植物相比，微生物作为蛋白酶的来源具 有更多生理生化上的优越性。微生物来源的蛋白酶都是胞外酶，易于分离纯化，更 重要的是微生物易于培养和发酵，有广泛的生物化学多样性和遗传操作的感受性。 通过稀释涂布法或划线分离法在选择性平板上可以对产蛋白酶菌株进行分离。 稀释涂布平板法是一种将菌体按比例制备成若干个稀释度，再分别经涂棒涂布培养 而进行微生物分离纯化的方法；平板划线分离法是指把混杂在一起的微生物或同一 微生物群体中的不同细胞用接种环在平板培养基表面通过分区划线稀释而得到较 多独立分布的单个细胞，经培养后生长繁殖成单菌落，通常把这种单菌落当作待分 离微生物的“纯种”。有时这种单菌落并非都由单个细胞繁殖而来的，故必须反复分 离多次才可得到纯种。其原理是将微生物样品在固体培养基表面多次作“由点到线”稀释而达到分离目的的。 根据透明圈的大小来筛选目的菌株，透明圈越大的菌具有较强的产酶能力。对分离到的菌株进行纯化，得到高产蛋白酶菌株。 三、试验材料 1、材料与试剂 豆腐乳：市购豆腐乳 2、主要仪器与设备 无菌操作箱、恒温水浴锅、生化培养箱、高压灭菌锅、振荡培养箱 四、实验步骤与方法 1、培养基的制备 可溶性淀粉1%、酵母膏0.5%、酪蛋白1%、KH2PO40.1%、MgSO40.02%、琼脂2.0%，pH值为中性 配制方法：称取酪蛋白 1.0g，先用少量2%NaOH润湿，玻棒搅动，再加适量 的蒸馏水，在沸水浴中加热并搅拌，至完全溶解，补足水量至100mL，加入其他成分，调整pH，灭菌备用。 2、菌株纯化分离（涂布法和划线法每组选一种方法进行操作） （1）稀释法分离：采用无菌水，10倍梯度稀释豆腐乳的菌悬液到10-8，吸取
蛋白酶产生菌的筛选复习课程
蛋白酶产生菌的筛选
蛋白酶产生菌的筛选 组别：第*组 班级：生工**班 组员：*** 指导老师：*** 一、实验目的 学习从自然界中分离蛋白酶产生菌
二、实验内容 蛋白酶产生菌的分离 三、实验原理 许多细菌和霉菌产生蛋白酶，细菌中的芽孢杆菌是最常见的蛋白酶产生菌。本实验将土壤样品悬液加热处理，杀死非芽孢细菌及其他微生物后进行划线分离得到芽孢杆菌，将其接种到奶粉培养平板并进行培养，根据奶粉平板的水解圈做初筛。将初筛的蛋白酶产生菌接入产酶培养基振荡培养，测定蛋白酶的活力，最终得到产蛋白酶的芽孢杆菌。也可直接将细菌接种到奶粉培养平板进行培养，分离筛选其他蛋白酶产生菌。 四、实验材料和用具 1.材料：土壤样品 2.试剂：牛肉膏蛋白胨培养及平板、奶粉培养基平板、 45mL无菌水（带玻璃珠）、芽孢染色液、 3.仪器及用具：紫外分光光度计、显微镜、恒温水浴锅、 摇床、酒精灯、接种针、游标卡尺、无菌 移液管、无菌试管、量筒、容量瓶、漏 斗、试剂瓶、漏斗、载玻片、滤纸、擦镜 纸。
五、操作步骤 （一）配制所需培养基 按照以下配方配制所需的培养基 牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏 0.5g，蛋白胨 1g，NaCl 0.5g，琼脂 1.5～2.0g，水 100ml，pH 7.2 配制200mL 奶粉培养基：牛肉膏 0.5g，蛋白胨 1g，NaCl 0.5g， 琼脂 2.0g，水 100ml，pH 7.0～7.2 脱脂奶粉 3g，配制200mL （二）分离 1.采集土壤样品，用无菌水植被1:10土壤悬液。 2.取1:10土壤悬液5 mL，注入已灭过菌的试管中，将此试 管放入75～80℃水浴中热处理10min以杀死非芽孢细 菌。 3.取加热处理过的土壤悬液100～200μL，涂布接种到牛肉 膏蛋白胨培养平板，后将平板倒置，于30～32℃下培养 24～48h. 4.对长出的单菌落进行编号，选择表面干燥、粗糙、不透 明的菌落，挑取少许菌苔涂片，做芽孢染色，判断是否 为芽孢杆菌。 （三）筛选
实验一 淀粉酶产生菌的筛选
实验一淀粉酶产生菌的筛选 一、实验要求： 1、写出完整的分离纯化淀粉酶产生菌的实验步骤； 2、写出分离培养基及其相关试剂所需的量、仪器、器皿所需的量； 3、掌握从土壤分离酵母菌的方法和技术，从样品中分离出所需菌株； 4、学习并掌握平板倾注法和斜面接种技术，了解培养淀粉酶产生菌的培养 条件和培养时间。 二、实验原理：用梯度稀释法来分离淀粉酶产生菌 三、实验材料： 1.培养皿、移液管、刮铲、显微镜等, 2.可选取厨房土壤、面粉加工厂和菜园土壤 ; 3.培养基与试剂 :牛肉膏、蛋白胨、NaCl 、可溶性淀粉、蒸馏水、琼脂粉。 四、实验步骤： 1、选定采土点后，铲去表土层2-3cm，取3-10cm深层土壤5g，装入灭过 菌的牛皮纸袋内，封好袋口，并记录取样地点、环境及日期。土样采集后应及时分离，凡不能立即分离的样品，应保存在低温、干燥条件下，尽量减少其中菌相的变化。 2、培养基的配置，(1) 分离培养基采用牛肉膏蛋白胨固体培养基加0.2%可溶性淀 粉 即牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl 5g、可溶性淀粉2g溶于1000mL蒸馏水中再加入15g琼脂粉 pH调至7.2 121℃灭菌15min 待冷却至50℃左右时 于超净工作台倒平板。注: 先将可溶性淀粉加少量蒸馏水调成糊状 再加到溶化好的培养基中 调匀; (2) 分离培养基液体培养基采用牛肉膏蛋白胨固体培养基加0.2%可溶性淀粉,即牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl 5g、可溶性淀粉2g溶于1000mL蒸馏水中 pH调至7.2,121℃灭菌15min。 3、取所采的土样5g加入到三角瓶中,加入无菌水45mL,30℃摇床振荡30min制成土 壤悬液 ,此时的稀释度为10-1。另取7支试管 分别记作10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8共8个梯度 每支试管内加入9mL无菌水。用无菌移液管从三角瓶中吸取1mL土壤悬液加入到10-2试管中混匀, 再从此试管中吸取1mL加入到10-2试管中, 依此类推直至10-7试管。分别从10-6、10-7、10-8三个稀释度的试管中吸取100uL悬液, 均匀涂布于分离培养基平板上, 于27℃培养1-2天，等长出菌落后, 将检测试剂卢戈氏碘液加入到平板中, 菌落周围形成水解圈的菌株即是产淀粉酶的菌株, 因淀粉遇碘变蓝色 ,如菌落周围有无色圈说明该菌能分解淀粉。将水解圈直径与菌落直径之比较大菌株,即产酶能力较强的菌株的进行编号。 4、纯化; 将保存的菌株用接种环沾取少量培养物至平板上, 并进行2-3次划线分离, 挑取单菌落至平板上, 培养后观察菌苔生长情况并镜检验证为纯培养。将纯化后产酶能力较强菌株保存至斜面培养基中培养.
实验十一 产蛋白酶菌株的筛选-2013
实验十一产蛋白酶菌株的筛选-2013 实验十一产蛋白酶菌株的筛选 碱性蛋白酶是一类最适宜作用pH为碱性的蛋白酶，在轻工、食品、医药工业中用途非常广泛。微生物来源的碱性蛋白酶都是胞外酶，具有产酶量高，适合大规模工业生产等优点，被认为是最重要的一类营业性酶类。 从自然界筛选获取有用的微生物资源一直是微生物学的一项重要工作，也是学习微生物学的学生应该掌握的基本技能。 一、基本原理 , 自能够产生胞外蛋白酶的菌株在牛奶平板上生长后，其菌落周围可形成明显的蛋白水解圈。 , 水解圈与菌落直径的比值常被作为判断该菌株蛋白酶产生能力的初筛依据。不同类型的蛋白酶都能在牛奶平板上形成蛋白水解圈，细菌在平板上的生长条件和液体环境中生长的情况相差很大，因此在平板上产圈能力强的菌株不一定就是碱性蛋白酶的高产菌株。 , 碱性蛋白酶活力测定按中华人民共和国颁布标准QB747-80进行。 , 原理:Folin试剂与酚类化合物(Tyr,Trp,Phe)在碱性条件下发生反应形成蓝色化合物，用蛋 白酶分解酪蛋白生成含酚基的氨基酸与Folin试剂呈蓝色反应，通过分光光度计测定可知酶 活大小。 二、实验目的 , 学习用选择平板从自然界中分离胞外蛋白酶产生菌的方法 , 学习并掌握细菌菌株的摇瓶液体发酵技术
, 掌握蛋白酶活力测定的原理与基本方法 三、实验器材 1(菌株 从自然界筛选获得的蛋白酶产生菌株 2(溶液和试剂 蛋白胨，酵母粉，脱脂奶粉，琼脂，干酪素，三氯醋酸，NaOH，NaCO，Folin 试剂，硼砂，23 酪氨酸，水等 3(仪器和用品 三角烧瓶，培养皿，吸管，试管，涂布棒，玻璃搅拌棒，水浴锅，分光光度计，培养摇床，高压灭菌锅，尺，玻璃小漏斗和滤纸 四、操作步骤 1. 培养基和试剂的配制 (1)牛奶平板:在普通肉汤蛋白胨固体培养基中添加终质量浓度为1.5%的牛奶 (2)发酵培养基:玉米粉4%，黄豆饼粉3%，NaHPO 0.4%，KHPO 0.03%，3 mol/l NaOH 调节2424 pH到9.0，0.1MPa 灭菌20min，250ml三角烧瓶的装瓶量为50ml。 (3)pH11硼砂- NaOH缓冲液:硼砂19.08克溶于1000ml水中;NaOH 4g，溶于1000 ml水中，二液等量混合。 (4)2%酪蛋白:称取2g干酪素，用少量0.5mol/l NaOH润湿后适量加入pH11的硼砂- NaOH缓冲液，加热溶解，定容至100ml，4?冰箱中保存，使用期不超过一周。 2. 酶活标准曲线的制作
淀粉酶产生菌的筛选
实验一淀粉酶产生菌的筛选 及酶活力测定 指导老师：辛树权 生命科学学院08级生物技术（三）班豆豆 同组人：xx xxx 摘要：自然界是微生物的大本营，实验室微生物几乎都是从自然界中选育出来的。我们从学校的花坛中采集一些土壤样本，拿到实验室中，进行淀粉产生菌的筛选。利用土壤制成菌液，将其涂抹在牛肉膏蛋白胨培养基上进行纯化，再用淀粉培养基培养，最后通过淀粉透明圈的大小来判断淀粉产生菌产淀粉的能力。再使用分光光度计精确测量淀粉酶的酶活力。关键词：淀粉酶；分离；纯化；透明圈；酶活力；摇瓶；分光光度计 一、实验目的： 1、学习从土壤中分离微生物的方法； 2、学习淀粉酶产生菌的筛选方法 3、了解分光光度计法测定酶活力的原理及方法。 二、实验原理： 土壤中含有大量的微生物，将土壤稀释液涂在不同类型的培养基上，在适宜的环境中培养几天，细菌或者是其他的微生物便能在平板上生长繁殖，形成菌落。将初次筛选得到的微生物接到淀粉培养基上培养，因为只有能够产生淀粉酶的细菌才能够利用培养集中的淀粉成分来完成自身的生命活动，才能够生存。故在淀粉培养基上长出的菌便是淀粉产生菌。在培养基上滴碘液，淀粉被分解掉的部分不显现蓝色，出现透明圈，可以通过透明圈的大小来初步判断菌种产淀粉的能力。
淀粉酶是指一类能催化分解淀粉分子中糖苷键的酶的总称，主要包括α－淀粉酶和β-淀粉酶等，α-淀粉酶可从淀粉分子内部切断淀粉的α-1,4糖苷键，形成麦芽糖、含有6个葡萄糖单位的寡糖和带有支链的寡糖，是淀粉的粘度下降，因此又称为液化型淀粉酶。淀粉遇碘呈蓝色。这种淀粉-碘复合物在660nm处有较大的吸收峰，可用分光光度计测定。随着酶的不断分作用，淀粉长链被切断，生成小分子的糊精，使其对碘的蓝色反应逐渐消失，因此可以根据一定时间内蓝色消失的程度为指标来测定α-淀粉酶的活力。 三、实验器材及试剂： 1.、材料：长春师范学院家属楼前小菜园 2培养基： （1）分离培养基：牛肉膏蛋白胨固体培养基（牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl 5g、溶于1000mL蒸馏水中，再加入15g琼脂粉，pH调至7.2，121℃灭菌15min，待冷却至50℃左右时，于超净工作台倒平板） （2）筛选培养基：淀粉培养基（可溶性淀粉 20g, 硝酸钾 1g, 磷酸氢二钾 0.5g, 氯化钠 0.5g, 硫酸镁 0.5g, 硫酸亚铁 0.01g, 琼脂 20g, 水 1000毫升，调整pH值到7.2～7.4。） （3）摇瓶培养：淀粉培养液。 3、试剂： 碘液、2%可溶性淀粉、pH6.0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、标准糊精溶液、 0.5mol/L乙酸、0.85%生理盐水。 4、器材： 培养皿、锥形瓶、高压灭菌锅、超净工作台、恒温水浴锅、分光光度计。
“产淀粉酶菌株的筛选”优秀设计
产淀粉酶（α-淀粉酶）细菌菌株筛选 一、实验目的： 1.掌握从环境中采集样品并从中分离纯化某种微生物的完整操作步骤。 2.巩固以前所学的微生物学实验技术。 3.学习淀粉酶活性的测定方法。 二、实验原理： 1.α-淀粉酶是一种液化型淀粉酶，它的产生菌芽孢杆菌，广泛分布于自然界，尤其 是在含有淀粉类物质的土壤等样品中。 2.从自然界筛选菌种的具体做法，大致可以分成以下四个步骤：采样、富集培养、初 步筛选、分离纯化和性能测定。 a)采样：即采集含菌种的样品 采集含菌样品前应调查研究一下自己打算筛选的微生物在哪些地方分布最多， 然后才可着手做各项具体工作。在土壤中几乎各种微生物都可以找到，因而土 壤可说是微生物的大本营。例如厨房土壤、面粉加工厂和菜园土壤中淀粉的分 解菌较多。 b)富集培养： 富集培养就是在所采集的土壤等含菌样品中加入某些物质，并创造一些有利于 待分离微生物生长的其他条件，使能分解利用这类物质的微生物大量繁殖，从 而便于我们从其中分离到这类微生物。 c)初步筛选： i.（选择培养基）初筛使用选择培养基对菌种进行培养，通过培养基的特殊 成分，来筛选出目的菌种，从而进行培养。 ii.（鉴别培养基）初筛利用鉴别培养基，通过添加一些特殊的试剂或成分来鉴别出目的菌种，从而筛选出来并对其进行培养。 d)分离纯化： 通过上述的筛选只能说我们要分离的目的菌种已经存在，但还要把夹杂在其中 的杂菌除去，从而得到纯种的菌落。纯种分离的方法很多，主要有：平板划线 分离法、稀释分离法、单孢子或单细胞分离法、菌丝尖端切割法等。 e)性能测定： 分离纯化得到的菌种之后，所分得的菌种是否具有实验所要求的性能，还必须 要进行性能测定后才能决定取舍。 三、实验材料： 1.培养基配制： a)培养基按以下比例配制后，加蒸馏水调至100%； b)富集培养基：可溶性淀粉1%、蛋白胨1%、葡萄糖0.5%、NaCl 0.5%、牛肉膏 0.5%、pH7.0； c)分离培养基：玉米粉2%、黄豆饼粉1.5%、琼脂粉0.8%、CaCl 0.02%、MgSO4 0.02%、 NaCl 0.25%、K2HPO40.2%、柠檬酸钠0.2%、硫酸铵0.075%（溶解后加入）、 Na2HPO40.2%、pH7.0。 2.主要试剂和溶液的配制： a)2%淀粉溶液：准确称取淀粉2g溶于100ml 0.1mol/L pH5.6的柠檬酸缓冲液中。 b)0.1mol/L的柠檬酸缓冲液、pH=1.0的盐酸
产蛋白酶菌的筛选及产酶条件优化
陇东大学 学士学位毕业论文（设计）蛋白酶产生菌的筛选及产酶条件优化 生命科学与技术学院 08生物技术班 作者： 指导教师： 蛋白酶产生菌的筛选及产酶条件优化 何泰杜旭谢丽娟，刘丽萍
(陇东学院生命科学与技术学院，甘肃庆阳745000) 摘要：采用陇东学院污水处理厂附近土壤、农田土壤及养殖场附近土壤作为样品，利用牛奶水解圈筛选模型从中分离筛选得到产蛋白酶能力较高的菌株whr1，初步鉴定该菌株属于芽孢杆菌。并对其产酶条件进行优化，结果显示该菌最适培养时间为24h，最佳碳源为质量浓度1% 蔗糖，最佳氮源为质量浓度1.5%酵母膏，最适初始pH值为6.0，最适发酵温度为35℃。 关键词：菌种筛选，鉴定，蛋白酶，条件优化 Protease produced the screening of the bacteria and the optimization of the enzyme production conditions （College of life science and technology, Longdong University, Qingyang 74500, Gansu, China） Abstract：The sewage treatment plant soil near east institute, soil and soil samples near farms .Using milk hydrolysis circle screening model separating screening in high ability get protease whr1 strains. Preliminary appraisal of the fungus belong to bacillus. After the optimization of the condition, the capability of whr1 was improved, the optimal condition is: The time is 24h; carbon source is sucrose 1%; nitrogen source is Y east extract 1.5 %, the pH is 6.0; fermentation temperature is 30℃. Keyword: Screening，Identified，Protease, Conditions optimization 0引言 蛋白酶是水解蛋白质肽键的一类酶的总称，是一类广泛应用于皮革、毛皮、丝绸、医药、食品、酿造等方面的重要工业用酶[1]，也是目前世界上产销量最大的商业酶，其市场占有率约占整个商品酶销售量的60％，微生物蛋白酶从微生物中提取，不受资源、环境和空间的限制，具有动物蛋白酶和植物蛋白酶所不可比拟的优越性[2,3]。目前，蛋白酶的研究仍注重于新品种的发掘，并通过分离筛选、发酵条件优化和诱变育种或构建基因工程菌等综合手段获得高产蛋白酶的优良菌株[4,10]。我国的蛋白酶研究还存在如微生物资源开发不足，蛋白酶种类较少，酶制剂品种单一等问题。 本论文从以下几方面对蛋白酶产生菌株进行较为系统的研究：从土壤中筛选出产蛋白酶能力较高菌株。对筛选出的菌株进行形态学的鉴定，将菌株初步确定到属。研究产蛋白酶菌株发酵产酶条件，对培养基成分和发酵条件进行优化，确定最佳培养基配方和发酵条件，进一步提高菌株的产酶活力。
蛋白酶产生菌的分离汇总讲解
蛋白酶产生菌的分离、活化选育、发酵及酶活力的测定 许多细菌和霉菌产生蛋白酶，细菌中的芽孢杆菌是常见的蛋白酶产生菌。本实验将土壤样品悬液加热处理，杀死非芽孢细菌及其它微生物后进行划线分离得到芽孢杆菌，将其接种到酪蛋白平板进行培养，根据酪蛋白平板的水解圈做初筛。也可直接将细菌或霉菌接种到酪蛋白平板进行培养，分离筛选其它蛋白酶产生菌。本实验主要包括：蛋白酶产生菌的分离纯化、产酶微生物菌种的选育、产酶微生物的发酵与酶活力的测定、蛋白酶产生菌的生长及生长曲线、培养基优化。 通过本实验项目，使学生学会从自然界中分离蛋白酶产生菌的方法，菌种的纯化技术、高产菌的选育技术；了解蛋白酶产生菌的生长情况，学会绘制其生长曲线；学会培养基优化的方法；了解蛋白酶的性质及蛋白酶的测定原理；掌握蛋白酶的发酵及酶活力测定方法。 1 实验材料 1.1 实验样品 校园内土壤样品 1.2实验仪器与材料 牛肉膏蛋白胨培养基平板、酪蛋白平板、无菌水（带玻璃珠）、芽孢染色液番红；显微镜、恒温水浴锅、酒精灯、接种针、游标卡尺、无菌移液管、无菌试管、血球计数板、试管、三角烧瓶、烧杯、量筒、，玻棒、电子天平、牛角匙、高压蒸汽灭菌锅、pH试纸（ pH 5．5—9．0）、棉花、牛皮纸、记号笔、麻绳、纱布、培养皿、胶头滴管、分光光度计（应符合GB9721的规定）等。 2实验方法与步骤 2.1 培养基的配制方法 1.称量 按培养基配方比例依次准确地称药品放入烧杯中。 2.溶化 在上述烧杯中可先加入少于所需要的水量，用玻棒搅匀，然后，在石棉网上加热使其溶解。待药品完全溶解后，补充水分到所需的总体积。 3.调pH 4.分装 按实验要求，可将配制的培养基分装入试管内或三角烧瓶内。 5．包扎 塞好棉花的试管和锥形瓶应盖上厚纸用绳捆扎，用记号笔注明培养基名称、组别、日期。
脂肪酶特性与应用
饲料研究FEED RESEARCH NO .6,2011 5 脂肪酶特性与应用 陈倩婷广州博仕奥集团 饲料资源不足一直是我国养殖业面临的一个大问题，在耕地和水资源严重紧缺的情况下，粮食产量很难提高。我国动物生产中饲料转化率低，猪、鸡和奶牛等的饲料转化率均比国际先进水平低0.3 %~0.6 %，使饲料资源不足的问题更加严峻。饲料用酶制剂的开发和应用极大的缓解了饲料资源的不足，酶制剂在饲料工业中的有效应用使得饲料工业和养殖业安全、高效、环保和可持续发展成为可能。 目前研究较多的饲用酶制剂有蛋白酶、甘露聚糖酶、β-葡聚糖酶、木聚糖酶、纤维素酶及植酸酶等。脂肪酶也是一种重要的酶制剂，它能够水解脂肪（三脂酰甘油或三酰甘油）为一酰甘油、二酰甘油和游离脂肪酸，最终产物是甘油和脂肪酸。 产物脂肪酸为动物体生长和繁殖提供能量，部分中链脂肪酸能抑制肠道有害微生物，改善肠道菌落环境，从而促进消化，起到类似抗生素的作用，脂肪酶在常温常压下反应，反应条件温和，转化率高，具有优良的立体选择性，不易产生副产物，避免因化学催化法而带来的有害物质，不会造成环境污染，因此，在食品、皮革、医药、饲料和洗涤剂等许多工业领域中均有广泛的应用。 1 脂肪酶的特性 1.1 脂肪酶的来源 脂肪酶按其来源主要分为3类：1）动物源性脂肪酶，如：猪和牛等胰脂肪酶提取物；2）植物源脂肪酶，如：蓖麻籽和油菜等；3）微生物源性脂肪酶。由于微生物种类多、繁殖快且易发生遗传变异，具有比动植物更广的作用pH、作用温度范围及底物专一性，且微生物来源的脂肪酶一般都是分泌性的胞外酶，所以，微生物脂肪酶是主要的研究对象。产微生物脂肪酶菌种的研究主要集中在真 菌包括，根霉、黑曲霉、镰孢霉、红曲霉、黄曲霉、毛霉、犁头霉、须霉、白地霉、核盘菌、青霉和木霉；其次是细菌，如：假单胞菌、枯草芽抱杆菌、大肠杆菌工程菌、无色杆菌、小球菌、发光杆菌、黏质赛氏杆菌、无色杆菌、非极端细菌和洋葱伯克霍尔德菌等；另外还有解酯假丝酵母和放线菌。1.2 特性1.2.1 催化特性 脂肪酶不同活性的发挥依赖于反应体系的特点，在油水界面促进酯水解，而在有机相中可以酶促合成和酯交换。其催化特性在于：在油水界面上其催化活力最大，溶于水的酶作用于不溶于水的底物，对均匀分散的或水溶性底物不作用，反应在2个彼此分离的完全不同的相的界面上进行。Macrae 等研究表明：在油水界面上油脂量决定脂肪酶活性，增加乳化剂量，可提高油水界面饱和度，从而提高脂肪酶活性，增加油水界面面积，可承载更多脂肪酶分子，也可增加催化反应速率。而在水体系中，大多数脂肪酶活性很低或没有活性。 由于脂肪酶在非均相体系中表现出的高催化活性，且在酶催化反应中不需要辅酶，所以可利用非水相中的脂肪酶催化完成各种有机合成及油脂改性反应，如：酯化、酸解、醇解、转酯、羟基化、甲基化、环氧化、氨解、酰基化、开环反应和聚合等反应。 1.2.2 底物特异性 不同来源脂肪酶对底物不同碳链长度和饱和度脂肪酸表现出不同反应性，圆弧青霉和金黄色葡萄球菌脂肪酶水解短链(低于C 8)脂肪酸所形成的三脂酰甘油，黑曲霉和根霉对中等长链(C 8~C 12)脂肪酸形成的三脂酰甘油有强烈特异性，猪葡萄球菌脂肪酶偏爱磷脂为底物，也可以水解脂肪酸链长短不一的各种油脂。解脂无色杆菌对饱和脂肪酸表现出 收稿日期：2011 - 05 - 09
实验十一 产蛋白酶菌株的筛选
实验十一产蛋白酶菌株的筛选 碱性蛋白酶是一类最适宜作用PH为碱性的蛋白酶，在轻工、食品、医药工业中用途非常广泛。微生物来源的碱性蛋白酶都是胞外酶，具有产酶量高，适合大规模工业生产等优点，被认为是最重要的一类营业性酶类。 从自然界筛选获取有用的微生物资源一直是微生物学的一项重要工作，也是学习微生物学的学生应该掌握的基本技能。 一基本原理 ?自能够产生胞外蛋白酶的菌株在牛奶平板上生长后，其菌落周围可形成明显的蛋白 水解圈。 ?水解圈与菌落直径的比值常被作为判断该菌株蛋白酶产生能力的初筛依据。 不同类型的蛋白酶都能在牛奶平板上形成蛋白水解圈，细菌在平板上的生长条件和液体环境中生长的情况相差很大，因此在平板上产圈能力强的菌株不一定就是碱性蛋白酶的高产菌株。 ?碱性蛋白酶活力测定按中华人民共和国颁布标准QB747-80进行。 ?原理：Folin试剂与酚类化合物（Tyr,Trp,Phe）在碱性条件下发生反应形成蓝色化 合物，用蛋白酶分解酪蛋白生成含酚基的氨基酸与Folin试剂呈蓝色反应，通过分光光度计测定可知酶活大小。 二实验目的 ?学习用选择平板从自然界中分离胞外蛋白酶产生菌的方法 ?学习并掌握细菌菌株的药瓶液体发酵技术 ?掌握蛋白酶活力测定的原理与基本方法 三实验器材 1 菌株 从自然界筛选获得的蛋白酶产生菌株 2 溶液和试剂 蛋白胨，酵母粉，脱脂奶粉，琼脂，干酪素，三氯醋酸，NaOH，Na2CO3,Folin试剂，硼砂，酪氨酸，水等 3 仪器和用品 三角烧瓶，培养皿，吸管，试管，涂布棒，玻璃搅拌棒，水浴锅，分光光度计，培养摇床，高压灭菌锅，尺，玻璃小漏斗和滤纸 四操作步骤 1 培养基和试剂的配制 （1）牛奶平板：在普通肉汤蛋白胨固体培养基中添加终质量浓度为1.5%的牛奶 （2）发酵培养基：玉米粉4%，黄豆饼粉3%，Na2HPO4 0.4%,KH2PO4 0.03%,3 mol/l NaOH 调节pH到9.0,0.1MPa 灭菌20min,250ml三角烧瓶的装瓶量为50ml。 （3）PH11硼砂- NaOH缓冲液：硼砂19.08克溶于1000ml水中；NaOH4g，溶于1000ml 水中，二液等量混合。 （4）2%酪蛋白：称取2g干酪素，用少量0.5mol/l NaOH润湿后适量加入pH11的硼砂- NaOH 缓冲液，加热溶解，定容至100ml，4℃冰箱中保存，使用期不超过一周。 2 酶活标准曲线的制作 用酪氨酸配制0~100μg/mL的标准溶液，取不同浓度的酪氨酸1mL与5mL 0.4mol/l Na2CO3、1mL Folin试剂混合，40 ℃水浴显色30min，680nm测定吸收值并绘制标准曲线，求出观密度为1是相当的酪氨酸质量（μg ），及K值。 3 用选择平板分离产蛋白酶产生菌株
毛霉蛋白酶的催化特性及动力学研究
毛霉是腐乳发酵生产的主要菌种，在腐乳生产工艺中其主要作用是分泌蛋白酶水解豆腐胚内的大豆蛋白。腐乳成品中的蛋白质主要是以多肽的形式存在的，具有相当高的水解程度，并且已经从中分离出多种具有生理活性的多肽[1-2]。而对众多腐乳产品的感官分析也表明，腐乳产品通常不具有一般蛋白水解物所特有的苦味。综合以上 结果来看，毛霉蛋白酶在解决大豆蛋白水解率低、水解物的苦味等难题方面具有很大的潜力。毛霉虽然在发酵工业中的应用有着悠久的历史，但是对这类菌种胞外蛋白酶系的研究却并未完全开展。仅有极少数学者对该菌种的发酵产酶特性及粗酶的催化、水解特性进行过探讨[3-5]。然而，毛霉由于长期受到高蛋白环境条件的驯化， Catalytic and kinetic properties of one protease from Mucor PAN Jin-quan (Life Science and Technology School,Zhanjiang Normal University,Zhanjiang 524048)Abstract:One protease was purified from extracellular of Actinomucor elegans AS3.2778and its catalytic and kinetic properties were also investigated.The results show that the purified protease was one alkaline serine protease,which has relatively higher activity at pH8.5～9.5and 60℃,and is stable at pH6.0~9.0at ＜45℃.At 40℃,the kinetics of casein hydrolysis by the protease fit the Mchaelis-Mentonequation:V=22.8S S+8.857,and the energy of activation (Ea)of this hydrolysis reaction below 45℃is 44.09kJ.The protease was unstable at 50℃,and the kinetics of deactivation fit the model:a=exp(－0.218t). Key words:Actinomucor elegans;protease;catalytic properties;kinetics 潘进权 (湛江师范学院生命科学与技术学院，湛江524048) 摘要：从雅致放射毛霉胞外分离纯化出一蛋白酶组分，以酪蛋白为底物对其催化特性及动力学 进行了分析。结果表明：该蛋白酶组分是一种碱性丝氨酸蛋白酶；在pH8.5～9.5、60℃具有最大催化活性，在pH6～9和低于45℃具有很好的稳定性；在40℃该蛋白酶水解酪蛋白的反应符合米氏方程：V=22.8S S+8.857；在4～45℃的范围内，该蛋白酶水解酪蛋白反应的活化能Ea 为44.09 kJ ；该蛋白酶在50℃不稳定，其热失活规律符合一级指数衰减动力学模型：a=exp(－0.218t)。关键词：雅致放射毛霉；蛋白酶；催化特性；动力学 中图分类号：TS 201.2 文献标志码：A 文章编号：1005-9989(2010)11-0036-05 毛霉蛋白酶的催化特性及 动力学研究 收稿日期：2010-03-13 基金项目：广东省自然科学基金项目(9452404801001943)。 作者简介：潘进权(1978—)，男，博士，讲师，主要从事酶与发酵工程相关领域的研究工作。 ·36 ·
淀粉酶产生菌的筛选及酶活力测定
南昌大学实验报告 淀粉酶产生菌的筛选及酶活力测定 一、实验目的： 1、学习从土壤中分离微生物的方法； 2、学习淀粉酶产生菌的筛选方法 3、了解分光光度计法测定酶活力的原理及方法。 二、实验原理： 土壤中含有大量的微生物，将土壤稀释液涂在不同类型的培养基上，在适宜的环境中培养几天，细菌或者是其他的微生物便能在平板上生长繁殖，形成菌落。将初次筛选得到的微生物接到淀粉培养基上培养，因为只有能够产生淀粉酶的细菌才能够利用培养集中的淀粉成分来完成自身的生命活动，才能够生存。故在淀粉培养基上长出的菌便是淀粉产生菌。在培养基上滴碘液，淀粉被分解掉的部分不显现蓝色，出现透明圈，可以通过透明圈的大小来初步判断菌种产淀粉的能力。 淀粉酶是指一类能催化分解淀粉分子中糖苷键的酶的总称，主要包括α－淀粉酶和β-淀粉酶等，α-淀粉酶可从淀粉分子内部切断淀粉的α-1,4糖苷键，形成麦芽糖、含有6个葡萄糖单位的寡糖和带有支链的寡糖，是淀粉的粘度下
降，因此又称为液化型淀粉酶。淀粉遇碘呈蓝色。这种淀粉-碘复合物在660nm处有较大的吸收峰，可用分光光度计测定。随着酶的不断分作用，淀粉长链被切断，生成小分子的糊精，使其对碘的蓝色反应逐渐消失，因此可以根据一定时间内蓝色消失的程度为指标来测定α-淀粉酶的活力。 三、实验器材及试剂： 1、培养基： （1）分离培养基：牛肉膏蛋白胨固体培养基（牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl5g、溶于1000mL蒸馏水中，再加入15g琼脂粉，pH调至，121℃灭菌15min，待冷却至50℃左右时，于超净工作台倒平板） （2）筛选培养基：淀粉培养基（可溶性淀粉20g,硝酸钾1g,磷酸氢二钾,氯化钠,硫酸镁,硫酸亚铁,琼脂20g,水1000毫升，调整pH值到～。） （3）摇瓶培养：淀粉培养液。 2、试剂： 碘液、2%可溶性淀粉、磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、标准糊精溶液、L乙酸、%生理盐水。 3、器材： 培养皿、锥形瓶、高压灭菌锅、超净工作台、恒温水浴锅、分光光度计。 四、实验步骤：
高产蛋白酶菌株的选育.总结
课堂报告名称：高产蛋白酶菌株的选育方法 武汉轻工大学食品学院王宏勋 一、课堂报告依据的知识背景 1、遗传变异的物质基础 遗传变异有无物质基础以及何种物质可承担遗传变异功能的问题，是生物学中的一个重大理论问题。利用微生物这一实验对象进行了三个著名的实验，才以确凿的事实证实了核酸尤其是 DNA 才是遗传变异的真正物质基础。三个经典实验是: 一是1928年进行的转化实验。二是美国人1952年开展的噬菌体感染实验。三是1956年创立的植物病毒的重建实验。 朊病毒的发现和思考。无论是 DNA 还是 RNA 作为遗传物质的基础已是无可辨驳的事实。但朊病毒的发现对“蛋白质不是遗传物质的定论也带来一些疑云。 PrP 是具有传染性的蛋白质致病因子，迄今未发现蛋白内有核酸，但已知的传染性疾病的传播必须有核酸组成的遗传物质，才能感染宿主并在宿主体内自然繁殖。那么这是生命界的又一特例呢？还是因为目前人们的认识和技术所限而尚未揭示的生命之谜呢？还有待于生命科学家去认识和探索。 2、遗传物质在细胞内的存在形式 除部分病毒的遗传物质是 RNA 外，其余病毒及全部具有典型细胞结构的生物体的遗传物质都是 DNA 。按其在细胞中存在形式可分成染色体 DNA 和染色体外 DNA 。原核细胞和真核细胞中的 DNA 存在形式不完全相同。
1）DNA 在原核细胞中的存在方式 原核细胞最大的细胞学特点就是无核膜与核仁的分化，只有一个核区称拟核。其染色体 DNA 处于拟核区，无组蛋白，近年来发现与非组蛋白结合。结构上为双链环状 DNA 。几种微生物染色体的物理特性见表。原核细胞的染色体外DNA 主要指质粒（如 F 因子、 R 因子、 Col 因子）。 2）DNA 在真核细胞中的存在方式 真核细胞 DNA分为核 DNA和核外 DNA。核 DNA即染色体 DNA ，它与组蛋白结合构成具有复杂结构的染色体。核外DNA是指线粒体和叶绿体等DNA ，其结构与原核细胞的 DNA相似，亦能编码结构蛋白。 3、基因和性状 1）基因的概念 基因是由丹麦生物学家 W ． Johansen 于 1909 年提出来的，他用“基因”这个述语来代替孟德尔的“遗传因子”。直到本纪世 50 年代以后，“基因”才有一个较明确的概念。概括地说：“基因”是一个具有遗传因子效应的 DNA 片段，它是遗传物质的最小功能单位。2）性状的决定——基因表达 性状是构成一个生物个体的有关结构、形态、物质和功能等各方面特征的总称。基因表达是遗传信息表现为生物性状的过程，这一过程是通过基因产物的生物学功能来完成的。基因决定性状，而性状则是基因表达的最终结果。基因依其功能的差别可分成调节基因、操纵基因和结构基因 3 大类。
产淀粉酶菌株的筛选
发酵工程实验报告产淀粉酶菌株的筛选 姓名：×× 班级：生物技术 学号：×× 指导老师：×××
产淀粉酶菌株的筛选 ×× （长春师范大学生命科学学院生物技术） 【摘要】为筛选产淀粉酶的高产菌株, 利用淀粉水解圈作为筛选模型, 从学校附近土壤中筛选得到产淀粉酶能力较强的细菌。对其酶活力进行测定, 最终得到产淀粉酶的高产菌株。 【关键词】淀粉酶;水解圈;酶活力;高产菌株 Screening of Strains Producing Starch ×× (Technology of Biological Life Science College of Changchun Normal University) [Abstract] for the high-yield strains were screened for amylase, the starch hydrolysis circle as a model for screening, screening from the school near the soil produced amylase ability of the bacteria. Determination of the enzyme activity, high yield strain eventually produced amylase. [Key words] Amylase;Hydrolysis circle;Enzyme activity;Producing strain 前言：生活中的微生物无处不在，某些微生物给人们带来困扰，但更多的微生物对我们人类有必不可少的作用。淀粉酶是水解淀粉和糖原的酶类的总称,广泛存在于动植物和微生物中, 是最早实现工业生产并且迄今为止用途最广、产量最大的酶制剂品种。特别是20世纪60年代以来,由于酶法生产葡萄糖,以及用葡萄糖生产异构糖浆的大规模工业化, 淀粉酶的需要量越来越大,几乎占整个酶制剂总产量的50% 以上。微生物的许多种类都能产生淀粉酶。淀粉酶种类繁多,特点各异且用途广泛。因为淀粉酶的用途广泛, 各国在对淀粉酶产生菌的筛选方面都做了大量的研究工作,目前所得淀粉酶活力最高可达到260 U /mL左右。虽然不少微生物能产生淀粉酶,但适合商业生产需要的菌株仍然很少, 在淀粉酶生产过程中选择适合的菌株是最重要的前提条件。本文以土壤作为原料, 从中筛选出具有产淀粉酶能力的出发菌株,并对所得的出发菌株进行酶活力测定,使其给工业生产带来经济效益做大量的准备工作。 1. 材料与方法 1.1器材 ①培养皿、量筒、试管、滴管、吸水纸、烧杯、移液管、三角瓶、酒精灯、玻璃棒、接种环、镊子、天平、滤纸、pH试纸、试管架、容量瓶等。 ②恒温培养箱、高温灭菌锅、无菌操作台、控温摇床、分光光度计、离心机。 ③棉花、牛皮纸、记号笔、线绳、称量纸、试管架、药匙、吸耳球、镊子、酒精棉、废液瓶、胶塞、火柴。 1.2试剂 ①牛肉膏、蛋白胨、琼脂、可溶性淀粉、NaCl、蒸馏水、1mol/L NaOH、1mol/L HCl、无菌水、95%乙醇、75%酒精、酵母膏、KH2PO4、碘液、淀粉溶液（0.5%）、蔗糖溶液（1%）、3,5