HPLC法测定虎杖白藜芦醇的含量及其稳定性研究

HP LC 法测定虎杖白藜芦醇的含量及其稳定性研究

Ξ

C AO Y

曹　庸1,2,于华忠2,张　敏2,李国章2,萧浪涛1

(1.湖南农业大学省教委植物激素重点实验室,湖南长沙410128;2.吉首大学湖南省林产化工工程重点实验室,湖南张家界427000)

摘　要:　白藜芦醇已被列为抗心血管、抗癌最有前途的药物之一。由于白藜芦醇对光、热不稳定,本研究建立了一套简单而提取率高的从虎杖中提取白藜芦醇的样品处理方法,研究了高效液相色谱法测定虎杖白藜

芦醇的条件。采用色谱柱:岛津Shim 2park C LC 2ODS (150mm ×6.0mm ,i.d.5μm ),以乙腈∶水(体积比为41∶59

)溶液为流动相,流速1.0m L/min ,检测波长306nm 。在此条件下,样品溶液进样质量浓度范围在500～1000μg/

m L 时,白藜芦醇含量与峰面积呈良好的线性关系。检出限为10ng/m L ,且回收率高。

关键词:　虎杖;白藜芦醇;高效液相色谱法

中图分类号:T Q91;S789 文献标识码:A 文章编号:0253-2417(2004)02-0061-04

HP LC DETERMINATION OF RESVERATRO L CONTENT IN PO L YG ONUM

CUS PIDATUM AND THE ST ABI LITY OF RESVERATRO L

C AO Y ong 1,2,Y U Hua 2zhong 2,ZH ANG Min 2,LI G uo 2zhang 2,XI AO Lang 2tao 1

(1.Hunan Provincial K ey Laboratory o f Phytohormones ,Hunan Agriculture Univer sity ,Changsha 410128,China ;2.K ey laboratory o f Hunan Forest Product &Chemical

Industry Engineering ,Jishou Univer sity ,Zhangjiajie 427000,China )

Abstract :Resveratrol is one of the m ost feasible medicine for preventing human cancer.It is unstable against light and heat.An extracting method was established in this study ,which is simple ,and of high yield.S tudy on theconditions of high perfor 2mance liquid chromatography for the determination of resveratrol content was investigated to be as follow :Shim 2park C LC 2ODS column (150mm ×6.0mm ,i.d.5μm ),m obil phase CH 3CH 2C N ∶H 2O (14∶59),flow rate 1.0m L/min ,wavelength 306nm.The lineal correlation between content of resveratrol and peak area is g ood.The lower detection limit was 10ng/m L.K ey w ords :Polygonum cuspidatum ;resveratrol ;HP LC

虎杖(Polygonum cuspidatum Sieb.et Zucc )为蓼科蓼属小灌木,为传统中药。其根茎有祛风利湿,散痰定痛,止咳化痰的作用[1]。白藜芦醇的化学名称为反-3,4′,5-三羟基二苯乙烯,分子式C 14H 12O 3,分子质量228.25[2]。存在于虎杖、葡萄等植物中,虎杖中白藜芦醇含量远远高于葡萄等其他植物[3]。现代药理学试验表明白藜芦醇对人体具有许多医药保健作用。主要包括降低血脂[4],抑制血小板活性[5],对动脉粥样硬化、冠心病具有保护作用[6],对癌症具有预防作用[7～8],实验证明它对5种人体肿瘤细胞模型均有抑制作用[9],并具有雌激素样作用[10]。20世纪90年代以来,国外对葡萄酒中白藜芦醇的保健作

Ξ

收稿日期:2003-09-28

　基金项目:湖南省科技厅重点科技攻关资助项目(03J ZY 3020)　作者简介:曹庸(1966-),男,湖南泸溪人,副教授,博士生,从事天然产物开发及生物化学的研究。

第24卷第2期2004年6月

林　产　化　学　与　工　业Chemistry and Industry of F orest Products

V ol.24N o.2June 2004

用、测定方法进行了大量研究[11～12]。国内尚未见到对白藜芦醇稳定性及虎杖中白藜芦醇含量测定报道。摸索一套虎杖白藜芦醇提取工艺,建立HP LC 分析的稳定方法,是检测虎杖中白藜芦醇含量的关键。本文报道用HP LC 法测定虎杖白藜芦醇含量及其稳定性研究结果。

1　实验部分

1.1　实验仪器、试剂及材料

1.1.1　实验仪器及实验试剂　高效液相色谱(日本岛津LC-9A ),组织匀浆机(日本Y AM AT O ),超声波(日本Y AM AT O ),旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂),微波炉(格兰仕),十万分之一天平(日本岛津AE L -40S M ),紫外分光光度计(日本岛津UV-160A ),乙腈(色谱纯),甲醇(色谱纯、AR ),乙酸乙脂(AR ),超

纯水。1.1.2　实验材料　虎杖样品2001年7月采于吉首大学张家界校区后山。武陵大学植物教研室鉴定;白藜芦醇对照品为SIG M A 公司生产。1.2　实验方法1.2.1　白藜芦醇不同放置时间及温度条件下的稳定性　取含量为15μg/m L 的白藜芦醇对照品甲醇溶解液,在常温下分别放置0、2、4、6、8、16、48和120h 后,利用紫外可见分光光度计测定306nm 处吸光值的大小。再取同样含量的样品分别在30、40、50、60、70和80℃的恒温水浴锅中密封加热30min 后取出,补充甲醇液,测306nm 处吸光值的变化及200～1100nm 范围内全波长扫描。1.2.2　白藜芦醇对光稳定性　取含白藜芦醇对照品10μg/m L 的甲醇溶解液各3m L 加入烧杯,各重复2次。分别在紫外照射灯下、直射太阳光下以及室内各放置20min ,在200～11000nm 下进行全波长扫描,同时准确测出306nm 处吸光值(A )。

1.2.3　样品液的准备及标样的配制　在十万分之一天平上准确称取白藜芦醇标准品0.00554g ,然后

用1m L 甲醇溶解,定容至5m L ,配成白藜芦醇标样。将准确称取的样品置入匀浆机内并加入适量的乙酸乙脂进行匀浆捣碎,然后定容至50m L ,超声波提取30min 后,放入微波炉中处理5次,每次30s ,最后置入4℃冰箱中,浸提48h 后,用砂心漏斗过滤,滤液在45℃条件下减压浓缩至干,称其干物质重,将粗提物用甲醇溶解,置入10m L 容量瓶中,定容。将上述样品经0.45μm 脂溶性微孔滤膜过滤,样品经稀释3倍后用HP LC 进行检测。1.2.4　HP LC 测定条件　日本岛津Shim-park C LC-ODS 柱(150mm ×6.0mm ,i.d.5μm ),柱温35℃,流动相为41.6%的乙腈,流速为1m L/min ,进样量:1～20μL ,检测波长306nm 。采用外标法进行定量测定。

2　结果与讨论

图1　白藜芦醇室内放置不同

时间吸光度的变化

Fig.1　Abs orbance changes of

resveratrol after different storage time in room

图2　白藜芦醇在不同温度下

吸光度变化

Fig.2　Abs orbance changes of

resveratrol at different temperatures

2.1　白藜芦醇稳定性实验2.1.1　白藜芦醇对热稳定性　图1

是白藜芦醇在常温下放置时间对含量的影响。结果表明在无直射光照射的室内,常温放置16h ,对白藜芦醇影响不大。若超过48h ,会发生部分分解,故制备白藜芦醇应尽可能避光。

关于白藜芦醇对热的稳定性,图2显示在30～60℃范围内,加温30min ,吸光度变化不大,即对白藜芦醇的影响不大,但在较高温度时,

如60℃以上,加温30min 后,A 值下降,白藜芦醇发生部分分解。故提取、纯化、保存过程应尽可能在较

62　林　产　化　学　与　工　业第24卷

低温度下进行。

2.1.2　白藜芦醇对光稳定性　通过紫外灯和太阳光直接照射20min 后,进行全波长扫描,发现白藜芦醇紫外图谱变化很大,最大吸收峰已不在306nm ,说明白藜芦醇受到严重破坏,导致分解。而在室内无直射太阳光下,20min 内白藜芦醇A 值几乎不变。故在虎杖提取纯化过程中严格避免直射太阳光,包括阴干等方法都是非常必要和关键的。否则将损失较多的白藜芦醇。2.1.3　提取方法的改进　根据以上实验,白藜芦醇对光热较敏感易分解,用常规法提取时活性受影响而且提取率低,故采用微波提取法。微波提取是近年才发展起来的一项新技术,与常规提取相比,其最

表1　提取方法对虎杖鲜根茎白藜芦醇提取率的影响T able 1　E ffects of extraction meth od on the yield of resveratrol 提取方法extraction methods 提取时间/min extraction time 提取温度/℃extraction tem p.白藜芦醇含量/%resvratrol content 得率/%yield

常规法conventional

30

50

0.13180.8微波法microwave

3.040

0.154

95.1

大特点是作用时间短、速度快、提取效

率高、提取温度低(<45℃

)。微波用于虎杖白藜芦醇的提取,可最大限度

地避免提取过程中受光、热影响而分解,提取率大大提高。表1为微波提取白藜芦醇的提取情况。2.2　虎杖白藜芦醇含量测定方法图3　白藜芦醇标准品

的色谱图

Fig.3　Chromatogram of

resveratrol standard

2.2.1　固定相、流动相及色谱条件选择　首先选用80%乙腈以12%CH 3C N/m in 浓度递增,作为流动相,洗脱时虽能出现白藜芦酸的峰,但分离效果差。然后选用Shim-pack C LC -ODS 150mm ×6.0mm ,i.d.5μm 色谱柱,流动相:CH 3C N 分

别为0.46、0.48和0.50m L/min ,水0.54、0.52和0.50m L/min ,最后选择出峰最好的CH 3C N 0.52m L/min 、水0.48m L/min 作为流动相,保留时间为5.2min 。若选用甲醇作流动相,也可作为检测用,但考虑其出峰时间太长,故选择了本文所提色谱柱。流动相:重蒸水∶80%乙腈为0.52mg/min ∶0.48m L/min ,总流速1m L/min ,检测器为紫外306nm 检测,灵敏度0.32AUFS (吸光度单位满刻度),

柱温25℃,进样量1～20μ

L 。按以上条件白藜芦醇标准品的HP LC 图见图3。2.2.2　线性关系的测定　样品溶液质量浓度在50～1000μg/m L 时,以白藜芦醇不同浓度标准溶液进样,得到相应峰面积,进行线性回归,得浓度与峰面积的线性关系,线性方程为:

Y =9.538×10

-5

S +0.144

式中:Y —白藜芦酸质量浓度,μg/m L ;S —色谱峰面积,mm 2,相关系数r =0.9999,最小检出限为10ng/m L 。

2.2.3　回收率与重复性　根据以上确定的色谱条件,进行了白藜芦醇回收实验,数据列入表2,平均回收率达98.19%。在此基础上又做了虎杖根茎样品中白藜芦醇含量的检测(见表3),表现出较好的重复性,实验误差在允许范围内。据此认为可将此法用于实际样品分析。

表2　HP LC 回收率测定结果

T able 2　Results of recovery by HP LC

添加量/mg

added 回收量/mg

found 回收率/%recovery 相对误差/%

RS D

4.425 4.36898.504.425 4.33297.914.425 4.31497.50 4.97

4.425 4.34098.094.425

4.367

98.75

表3　HP LC 重复性测定结果

T able 3　Results of reproducibility by HP LC 样品/g

sam ples 白藜芦醇/%

resveratrol 相对误差/%

RS D

5.0012

0.1725.00220.1665.00230.169 5.7

5.00210.1715.0023

0.168

第2期曹　庸,等:HP LC 法测定虎杖白藜芦醇的含量及其稳定性研究63

　

图4　样品色谱图

Fig.4　Chromatogram of

sample

2.2.4　实际样品分析　按1.2.3节方法提取的虎杖根茎的白藜芦醇进行HP LC 分析,得到图谱(见图4)。2.3　虎杖各部位的白藜芦醇含量测定

数据见表4。由表4可以看出,鲜根茎中白藜芦醇含量最高为0.157%,其次为干根茎粉含量为0.059%,为鲜根茎的1/3。鲜茎含量极少,鲜叶几乎没有,等量鲜根茎、干根粉的干物质中白藜芦醇含量出现差异的原因,可能与鲜根茎在干燥过程中白藜芦醇损失有关。

3　结论

通过白藜芦醇的稳定性实验可知,白藜芦醇对光、热均不稳定。进一步实验表明利用微波提取法,可在低温下高效地提取白藜芦醇。同时建立了高效液相色谱法测定虎杖白藜芦醇的检测体系,在此条件提取和测定,快速准确,且符合HP LC 检测精度、重复性、回收率等的要求。

表4　HP LC 法测定虎杖中各部位白藜芦醇的含量

T able 4　Determination of resveratrol in different tissues of Polygonum cuspidatum by HP LC

样品sam ples 样品质量/g

weight 样品干质量/g

dry weight 50m L 液中干物质量/g

dry weight in 50m L s olution

进样量/μL

inject v olume

峰面积

peak area 白藜芦醇含量/%

resveratrol content

鲜根茎fresh root stem 2512.30.214210406210.157鲜茎fresh stem 2512.30.1281018330.013鲜叶fresh leaf

2511.50.19310<5000.000干根茎粉dry root stem 10

9.0

0.029

10245920.059

标样standard

10

22447

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