酶的发酵生产
酶工程
?第一章绪论
?第二章酶的发酵生产
?第三章酶的分离纯化
?第四章酶分子修饰
?第五章酶与细胞固定化
?第六章酶反应动力学
?第七章酶的应用
第一章绪论
?第一节酶的概述
?第二节酶工程概述
?第三节酶的生产方法
?第四节酶的应用前景
第一节酶的概述
一. 酶(enzyme)的概念
二. 酶的研究历史
三. 酶的分类与命名
四. 酶的活力测定
一. 酶(enzyme)的概念
1.酶是催化剂（catalyst）
所谓催化剂是一类能改变反应速度，但不改变反应性质、反应方向和反应平衡点，而且本身在反应前后也不发生变化的外在因素。酶在化学反应中就是充当这样的角色。
2.酶是一种特殊的催化剂
3.酶是生物催化剂
酶在催化反应时，具有与一般非酶催化剂不同的特点。其具有催化的高效性、高度专一性及化学本质是蛋白质的特点。
（1）酶具有催化的高效性
酶能在温和条件下（常温、常压和近中性PH），极大地提高反应速度，与非酶催化剂相比，酶的催化效率可高出107~1012倍。
如：2H2O2 2H2O + O2
该反应的催化剂可以有Fe+、血红素和过氧化氢酶，其催化反应的速度分别是：
5.6×10-4mol/mol Fe+.S、
6.0×10-1mol/mol血红素.S、
3.5×106mol/mol过氧化氢酶.S
（2）酶具有催化的高度专一性(specificity)
酶作用的的专一性是指酶在催化反应时，通常只作用一种或一类反应物发生相应的反应的特性。酶作用的专一性主要表现在以下几个方面：
a. 绝对专一性：
酶只能催化一种反应物发生反应的特性
如：谷氨酸脱氢酶只能催化L-谷氨酸脱氢，对其他氨基酸没有作用，其具有绝对专一性。
b. 相对专一性：
酶在催化反应时，允许底物分子有一些变化，即可以催化一类反应物发生反应。
如：酯酶催化酸与醇缩合成酯，但对反应物分子的侧链基团专一性不强。淀粉酶、蛋白水解酶也具有这种专一性。
c. 异构专一性：
酶对反应物分子的立体异构体和顺反异构体具有高度的选择能力。
如：延胡索酸（反丁烯二酸）酶只专一催化于L-苹果酸和反丁烯二酸，兼具立体异构与顺反异构专一性。
（3）酶的化学本质是蛋白质
酶的化学本质是蛋白质，主要从以下几个方面来认识：
a. 酶的化学本质是蛋白质的依据
b. 结合有辅助因子的酶中，蛋白质是其高效和高度专一催化特性的主导因素
c. RNA性质的生物催化剂的发现，并未否定“酶的化学本质是蛋白质”的结论
ⅰ. 酶与蛋白质一样是高分子胶体物质，且为两性电解质。
ⅱ. 导致蛋白质变性的因素，如酸、碱、热、紫外线以及其他蛋白变性剂，也能使酶失活
ⅲ. 酶也能被蛋白水解酶水解而失去活性。
ⅳ. 对高纯化的酶进行组成分析，表明其或者是单纯蛋白，或者是蛋白质与其他小分子物质构成的络合物（即结合蛋白）。
ⅴ. 根据核酸酶（RNase）的一级结构，人们已经从氨基酸开始，人工合成了具有催化活性的蛋白质产物。
ⅰ辅助因子：
通常是小分子物质，与酶结合在一起，共同完成酶的催化过程。包括辅酶和活化剂两种类型。
ⅱ辅酶与活化剂的区别：
ⅲ辅酶也具催化力，但其催化效率和专一性都较酶差。
如：血红素是过氧化氢酶的辅酶，但其催化效率是过氧化氢酶的百万分之一；
磷酸吡哆醛是转氨酶的辅酶，但其可以催化L-谷氨酸的转氨基、脱羧以及异构为D-谷氨酸等多种反应。
综上，在酶的化学组成中，虽然有除蛋白质以外的其他成分，但是，蛋白质仍然是酶高效和高度专一催化特性的主导因素。
ⅰRNA性质的生物催化剂的发现:
70年代末~80年代初期，由于某些发现，使“蛋白质是酶的化学本质”的观念受到强有力的冲击。此后，又有许多类似的报道。所有的事实都说明：某些RNA的确具有催化活性。
为了和蛋白质性质的生物催化剂-------酶（enzyme)相区别，Cech等将他们发现的RNA 性质的生物催化剂称为ribozyme。
其中几个典型的事例如下：
ⅱRibozyme 发现的生物学意义：
Ribozyme 的发现是现代生物学中的一个重大突破，其意义主要表现在以下几点：
①它表明RNA除了作为遗传信息的载体外，还可能有其他的生物学功能。
②它表明除了蛋白质性质的生物催化剂-----酶以外，还可能存在其他类型的生物催化剂。
③为分子生物学研究，尤其是RNA研究提供了一种新的工具，新的思路。
④为探索生命起源提供了一种新的、重要的信息。
ⅲRibozyme的发现并未否定“酶的化学本质是蛋白质”
①目前已知的酶，基本上都是蛋白质性质的，或是以蛋白质为主导核心成分。
酶是蛋白质性质的生物催化剂，并不排斥还存在其他类型的生物催化剂。
Enzyme和Ribozyme是两个并列的概念。
（1）所有的酶都是生物体产生的，几乎所有的生物体都能合成酶。
（2）酶和生命活动密切相关，主要表现在
a. 酶参与了体内所有的生命活动和生命过程
b. 酶组成分布是生物进化与组织功能分化基础
c. 酶在多种水平上可调节以适应生命活动的需要。
综上，对于酶，可以有如下概念
酶是一种由生物体产生的，具有高效和高度专一催化活性的，与生命活动密切相关的蛋白质性质的生物催化剂。
二. 酶的研究历史
1. 我国古代劳动人民积累了丰富的酶学经验，为后来酶的研究做出了贡献
2. 近代酶研究的历史概况
3. 现代酶学研究发展的方向
真正系统的对酶的认识和研究应从十九世纪开始，其中许多重要的事件标志着酶研究的进程。
（1）1833年Payen 和Persoz从麦芽抽提物中，用酒精沉淀得到了一种热不稳定的活性物质，他可促使淀粉水解为可溶性的糖。他们将这种物质称为淀粉酶（diastase）。
（2）19世纪中叶，巴斯德等对酵母的酒精发酵进行研究，指出酵母中存在一种能使葡萄糖转变为酒精的物质。
（3）1878年库尼首次提出酶的概念，将这种在酵母中使葡萄糖转变为酒精的物质称为酶（enzyme）。Enzyme这个字来自希腊文，意为“in yeast”（在酵母中）。
（4）1896年，巴克纳兄弟发现酵母无细胞抽提液，也能将葡萄糖转变为酒精。表明酶不仅胞内也可在胞外起催化作用。由此，酶的研究开始在化学研究已建立的基础上进行。
（5）1894年，Emil Fischer通过对糖代谢中一些酶的研究，发现了酶作用的专一性。提出了“锁钥学说”，来解释这种专一性。
（6）1913年Michaelis和Menten提出了中间产物学说，推导出了米氏方程。
（7）1926年，Sumner获得了第一个结晶的酶，即脲酶，并证明他具有蛋白质性质，提出了酶的化学本质是蛋白质的观点。
（8）1960年测出了核糖核酸酶的氨基酸顺序；1965年用x-射线技术推测了溶菌酶的三维结构，同时提出了酶作用机制的许多理论。
（9）1958年Koshland提出了诱导契合理论，解释酶的催化机制和专一性；1961年Monod及其同事提出了变构酶模型。
（10）1969年首次Gutte和Merrifield由氨基酸单体化学合成具有活性的牛胰核糖核酸酶。（11）1982年，Cech等发现了具有催化作用的RNA(Ribozyme)。
（12）1986年，Pollack等用预先设计好的某酶过渡态类似物为半抗原，免疫动物以后，制得可与该抗原相结合的抗体，该抗体具有催化活性，称为抗体酶（Abzyme）。抗体酶的出现，为酶结构与功能研究以及酶的应用等方面都开辟了一个全新的领域。
（1）夏禹时代（距今约四千多年），我国古代劳动人民已能酿酒。酒即是酵母发酵的产物，是细胞内酶作用的结果。我国古代所言的酒母和曲，就含有大量的酵母和丰富的酶。
（2）约三千多年前，我国劳动人民就已能制饴糖（麦芽糖），这就是利用麦曲含有的淀粉酶将淀粉降解为麦芽糖。
（3）约公元十世纪，我国劳动人民已能用豆类制酱，豆酱主要是利用霉菌蛋白酶将豆类蛋白质水解所得的食品。将其压榨以后，可得酱油。
现代酶学研究主要沿着两个方向发展
（1）酶的分子生物学方向：其主要任务是要从分子水平上更深入揭示酶结构与功能的关系；酶催化机制和调节机制；酶与生命活动的关系等理论问题，进一步设计酶、改造酶、在基因水平上进行酶的调节控制。
（2）酶工程方向：其主要任务是研究如何经济有效地进行酶的生产、制备、应用，将基因工程、以及分子生物学的最新研究成果用于酶的生产，进一步开发固定化酶技术与酶反应器等。
三. 酶的分类与命名
1．酶的分类
酶的种类很多，目前发现的酶约有3700多种，为了更好地研究酶、应用酶，国际酶学委员会推荐了酶的分类系统，该系统根据酶的催化作用类型，将已知酶为六大类：
（1）氧化还原酶类（Oxidoreductases）
（2）转移酶类（Transferases）
（3）水解酶类（Hydrolases）
（4）解合酶类（Lyases）
（5）异构酶类（Isomerases）
（6）合成酶类（Ligases或Synthetases）
例2 催化D-已糖磷酸化为D-已糖-6磷酸反应的酶
习惯命名：已糖激酶（hexokinase）
系统命名：ATP：D-已糖6-磷酸转移酶
（ATP：D-hexose 6-phosphotransferase）
3．酶的标码
为了更简便清楚地识别每一种酶，国际酶学委员会对每一个酶都用4个数字进行编码，称为酶的标码。
如：醇脱氢酶，标码为EC 1.1.1.1
已糖激酶，标码是EC 2.7.1.1
其中EC代表酶委员会系统（Enzyme Commission），前三个数字分别表示酶所属的大类、亚类、亚亚类，根据这三个数字，可以判断出酶的催化类型和性质。第四个数字表示该酶在亚亚类中占有的位置，有了这四个数字，就可确定具体的酶。
四. 酶的活力测定
1．酶活力的含义
酶活力是指在一定条件下，酶所催化的化学反应进行的速度。反应速度越大，意味着酶活
力越高。
2．酶的活力测定
3．酶的活力单位
4．固定化酶的活力测定
2．酶的活力测定
测定酶活力，就是测定酶所反应的速度，并且是初速度。
（1）酶反应速度：指单位时间内底物的减少量或产物的增加量。
V ＝ds/dt＝dp/dt
（2）测定方法：
酶活力测定方法多种多样，总的要求是快速、简便，准确。
酶活力测定主要包括两个阶段:
其一，酶与其作用底物反应一段时间；
其二，测定反应液中底物或产物变化的量。
酶活力测定的一般步骤：
a. 根据酶的专一性，选择适宜的酶反应底物。
b. 根据资料或试验结果，确定酶促反应条件。
c. 在适宜条件下，进行酶反应，记下反应时间。
d. 反应一定时间后，终止反应，立即测定产物的生成量或底物的减少量。
终止酶反应的方法有：
①反应时间一到，立即取出适量的反应液，置于沸水浴中，加热使酶失活；
②立即加入适宜的酶变性剂，如三氯醋酸等，使酶变性失活；
③加入酸或碱溶液，使反应液的pH值迅速远离酶催化反应的最适pH，从而终止反应；
④将取出的反应液立即置于冰粒堆中，或冰盐溶液中，使反应液的温度迅速降低至o℃以下等等。
测定反应液中物质变化量的方法：
①光学检测法：
如：用分光光度法测定碱性磷酸酶催化硝基酚磷酸(NPP)水解生成的对硝基酚的量。
②化学检测法：
如：用化学滴定法测定糖化酶催化淀粉水解生成的葡萄糖的量。
3．酶活力单位
酶活力的大小，可以酶活力单位表示。
（1）1961国际酶学委员会规定：在25O C,各种最适条件下，一分钟内转化一个微摩尔底物所
需的酶量为一个国际酶活单位（IU）。
（2）1972年，EC又推荐了一个新的酶活国际单位katal，符号为kat。
1个kat单位定义为：
在最适条件下，每秒钟能使1摩尔底物转换的酶量，有μkat、nkat、pkat 等单位。
1 kat=1mol/s=60mol/min=60×106μmol/min=6×107IU
1IU=1μmol/min=1/60 μmol/s=1/60 μkat=16.67nkat
4．固定化酶的活力测定
与水不溶性载体结合，在一定的空间范围内起催化作用的酶称为固定化酶。固定化酶的性质与游离酶有一些区别。所以固定化酶的活力测定与游离酶活力测定方法也有一些不同。
固定化酶活力测定方法：
(1) 振荡测定：
称取一定重量的固定化酶，放在一定形状，一定大小的容器中，加入一定量的底物溶液，在特定的条件下，一边振荡或搅拌，一边进行催化反应。经过一定时间，取出一定量的反应液进行测定。
注意：
固定化酶反应液的测定方法与游离酶反应液的测定方法完全相同。
固定化酶反应要在一定的振荡或搅拌速度下进行，过大过小都对反应速度有明显影响。
底物浓度，pH值，温度，反应时间等条件可与游离酶活力测定的条件相同。也可根据固定化酶的特性不同而选用适宜的条件。最好与实际应用的工艺条件相同的条件下进行测定。(2) 柱法测定：
将一定量的固定化酶装进具有恒温装置的反应柱中，让条件适宜的底物溶液，以一定的速率流过酶柱，收集流出的反应液。按常规方法测定底物的消耗量或产物的生成量。
注意：
测定方法与游离酶反应液的测定方法相同。
反应液流经酶柱的速度对反应速度有很大影响。在某一最适流速下，反应速度最大。故测定固定化酶活力要在固定的流速条件下进行。
酶柱的形状和径高比都对反应速度有明显影响，必须固定不变。
底物浓度，反应温度，pH值，反应时间，离子强度等条件可以与游离酶活力测定时相同，也可按固定化酶的最适条件。最好能与实际应用时的工艺条件相同。
(3) 连续测定：
利用连续分光光度法等方法可对固定化酶反应液进行连续测定，从而连续测定酶活力。测定时，可将振荡反应器中的反应液用泵连续引到连续测定仪(例如，双束紫外光分光光度计等)的流动比色杯中进行连续分光测定，或者使固定化酶柱流出的反应液连续流经流动比色杯进行连续分光测定。
酶活力的连续测定，可以及时并准确地知道某一时刻的酶活力变化情况，对利用固定化酶进行连续生产和自动控制有重大意义。
(4) 固定化酶的比活力测定：
固定化酶比活力：每1mg干固定化酶所具有的酶活力单位数表示，即为[单位／mg干固定化酶]。
测定固定化酶比活力时，首先用湿固定化酶测定其酶活力，然后将固定化酶在一定条件下干燥，称取固定化酶的干重，计算两者的商，得到固定化酶的比活力。也可称取一定量的干固定化酶，在一定条件下充分溶涨后进行固定化酶活力测定，再计算比活力。
对于酶膜，酶板或酶管等固定化酶，比活力：
以单位面积的酶活力单位表示。
即为[酶活力(单位)／cm2]
(5) 酶结合效率与酶活力回收率的测定：
将一定量的酶进行固定化时，不是全部酶都成为固定化酶，而总是有一部分酶没有与载体结合在一起。为了确定固定化的效果，需要测定酶的结合效率或酶活力回收率。
酶结合效率：
加入的总酶活力减去未结合的酶活力的差值与加入的总酶活力的百分比。
未结合酶活力，包括固定化后滤出固定化酶后的滤液以及洗涤固定化酶的洗涤液中所含有的酶活力的和。
酶活力回收率：
固定化酶的总活力与用于固定化的酶总活力的百分比。
当固定化方法对酶活力没有明显影响时，酶结合效率与酶活力回收率的数值相近。然而固定化载体或固定化方法往往对酶活力有一定影响，两者的数值往往有较大的差别。所以，通常都通过测定酶结合效率来表示固定化的效果。
(6) 相对酶活力测定：
具有相同酶蛋白量的固定化酶活力与游离酶活力的比值称为相对酶活力。
固定化酶的相对酶活力与载体结构，颗粒大小，底物分子量大小及酶结合效率等有密切关系。
相对酶活力的高低表明了固定化酶应用价值的大小。相对酶活力太低(<75％)的固定化酶，一般没有实际应用价值。
故，在固定化酶的研制过程中，应从固定化载体，固定化技术等方面进行研究和改进，以提高固定化酶的相对酶活力。
第二节酶工程概述
一、酶工程的概念
酶工程就是利用酶催化作用，通过适当的反应器，工业化地生产人类所需要的产品或是达到某一特殊的目的。它是以现代酶学、现代生物学（包括生物化学、微生物学、遗传学及分子生物学等）的理论知识为基础，结合化学工程、生物技术、电子计算机等形成的一项高新技术。它包括酶的生产、制备与应用三个部分。
二、酶工程的种类
三、酶工程发展概况
二、酶工程的种类
酶工程主要分为化学酶工程和生物酶工程两类
1. 化学酶工程
又为初级酶工程，是酶学理论与化学工程技术相结合的产物。
化学酶工程研究的主要内容：
（1）酶的制备工艺（2）酶和细胞的固定化技术
（3）酶分子化学修饰（4）人工酶的合成
（5）酶反应器、酶传感器（6）酶的应用等。
2. 生物酶工程
是在化学酶工程基础上发展起来的，以酶学理论和以DNA重组技术为主的现代分子生物学技术相结合的产物，又称为高级酶工程（advanced enzyme engineering）。
生物酶工程研究的主要内容：
（1）克隆酶的生产：
即用DNA重组技术，大量生产酶。（例1）
（2）突变酶的生产：
即用蛋白质工程技术，定点改变酶结构基因，生产性能稳定，活性更高的酶。（例2）（3）新酶的生产：
即用蛋白质工程技术，设计新的酶结构基因，生产自然界中从未有过的性能稳定、活性更高的酶。
克隆酶的生产
例1：用DNA重组技术将人尿激酶原的结构基因，从人细胞转移到大肠杆菌细胞内，可以使大肠杆菌细胞生产尿激酶原。尿激酶酶原和尿激酶都是治疗血栓病的有效药物。
突变酶的生产
例2：酪氨酰-tRNA合成酶的突变酶，其为Ala 51取代了Thr 51，从而使该酶对底物ATP 的亲和活力提高了100倍。
1894年，日本的高峰让吉从米曲霉中制得高峰淀粉酶，用作消化剂。是有目的地进行酶的生产和应用的先例。
1908年，德国的罗姆(Rohm)制得胰酶，用于皮革的软化；
1908年，法国的波伊登(Boidin)制备得到细菌淀粉酶，应用于纺织品的退浆；
1911年美国的华勒斯坦(Wallerstein)制得木瓜蛋白酶，用于除去啤酒中的蛋白质浑浊。
由此以后的近半个世纪，酶的生产和应用虽然逐步发展，但仍停留于从动物、植物或微生物细胞和组织中提取酶并加以利用的阶段。由于原材料受限，加之工艺复杂，故难于进行大规模的工业化生产。
1949年，用液体深层培养法进行细菌α—淀粉酶的发酵生产。揭开了近代酶工业的序幕。
50年代以后，随着生化工程的发展，大多数酶制剂的生产已转向微生物液体深层发酵的方法。
1960年，法国的雅各(Jacob)和莫诺德(Monod)提出操纵子学说，阐明了酶生物合成的调节机制。使酶的生物合成可以按照人们的意愿加以调节控制。通过酶的诱导和解除阻遏，可以显著地提高酶的产量。
由于微生物种类繁多，生长繁殖迅速，可在任何季节、任何地理环境下进行生产，使得酶的生产大规模地发展起来。
1971年第一次国际酶工程学术会议在美国召开，当时主要的议题就是固定化酶。
1973年，日本在工业上成功地利用固定化大肠杆菌菌体中的天门冬氨酸酶，由反丁烯二酸连续生产L—天门冬氨酸。
70年代后期，出现了固定化细胞(又称固定化活细胞或固定化增殖细胞)技术，固定化细胞是指固定在载体上，在一定的空间范围内进行生命活动(包括生长、增殖、新陈代谢)的细胞，可以反复或连续使用在发酵生产上。
1978年，日本的铃木等人用固定化细胞生产α—淀粉酶研究成功。
1986年开始，华南理工大学生物工程研究所用固定化原生质体发酵生产碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶，谷氨酸脱氢酶等的研究相继取得成功，为胞内酶的连续生产开辟了崭新的途径。
酶和细胞的固定化克服了酶在应用中许多不足（稳定性差、不能反复使用、产物难于分离纯化等），使人们能更加有效地利用酶，而固定化酶和细胞技术的迅猛发展，为酶工程带来了巨大的生机。
第三节酶的生产方法
酶的生产是指经过预先设计，通过人工操作控制而获得所需的酶的过程。酶的生产方法可分为提取法、发酵法和化学合成法。
一、提取法
二、发酵法
三、化学合成法
1. 提取法的含义：
采用各种提取、分离技术从动物、植物或微生物细胞或组织中将酶提取分离出来。
2. 实例：
从动物胰脏中提取胰蛋白酶；从动物胃中提取胃蛋白酶；从木瓜中提取木瓜蛋白酶等
3. 提取法的特点：
提取法是最早采用的一种酶的生产方法，该法直接、简便易行，尤其适合动、植物资源丰富的地区。但动植物生长周期长，易受气候、地理环境的影响，不适于大规模工业化生产。且产品杂质较多，分离纯化困难。
1. 发酵法含义：
利用细胞，主要是微生物细胞的生命活动而获得所需要的酶的方法。
2. 实例：
用桔青霉发酵生产磷酸二酯酶；黑曲霉发酵生产淀粉酶；链霉菌发酵生产葡萄糖异构酶等。
3. 发酵法特点：
产酶种类多，凡是动植物体内有的酶，几乎都可以从微生物中找到，并根据应用特点，筛选最佳产酶菌株。
繁殖快，生长周期短，培养简便，能通过控制培养条件提高酶产量。
可采用各种遗传变异手段，培育出新的、更理想的菌株。
1. 化学合成法：
根据酶的一级结构，以氨基酸单体为底物，用化学的手段合成一个酶。
2. 实例：
1969年，美国首次用化学合成法得到核糖核酸酶
3. 特点：
合成成本高，难度大，以这条途径进行酶的生产还有许多经济和技术的问题有待解决。故该法目前仍停留在实验室阶段。
第四节酶的应用前景
酶在食品加工、轻工业、医学、分析检测、生物工程、能源开发、环境保护等多方面都有非常广阔的应用前景。
一、酶在医药方面的应用
?用酶进行疾病的诊断
?用酶进行疾病的治疗
?用酶制造各种药物
?健美生消化酶—帮助肠胃蠕动
【产品规格】90片／瓶
【食用方法】成人每日3片，随主餐服用
【成分(每片含)】
1)消化蛋白质：木瓜蛋白酶50毫克、菠萝蛋白酶30毫克；
2)消化脂肪：脂肪酶30毫克；
3)消化碳水化合物/淀粉：淀粉酶50毫克；
4)消化乳制品：乳糖酶30毫克；
5)消化纤维：纤维素酶15毫克。
另含：能抑制过多胃酸的葡萄糖酸钙，能缓解反胃薄荷叶和茴香【适用人群】
·消化不良者
·肠胃疾病患者
·大病初愈者
三、酶在轻工、化工方面的应用
?用酶进行原料处理
?用酶生产各种轻工、化工产品
?用酶增强产品的使用效果。
四、酶在环境保护中的应用
?环境监测
?废水处理
–过氧化物酶
–多酚氧化酶
?可降解材料开发
五、酶在生物技术方面的应用
?除去细胞壁
?大分子切割
?大分子连接