土壤中纤维素分解菌

土壤中纤维素分解菌
土壤中纤维素分解菌

土壤中纤维素降解菌的相关研究

一、实验目的

掌握选择培养基分离细菌的方法,以及对微生物菌落观察、大小的测定、染色观察细菌的形态特征;掌握提取细菌DNA的方法、PCR技术、菌种保藏技术,从分子角度鉴定细菌;比浊法测定细菌生长曲线。

二、实验原理

土壤中含有大量的纤维素,在植物残体和有机肥中含量占干重的35%~60%,纤维素是葡萄糖高分子缩聚物,在环境中比较稳定,只有在生产纤维素酶的微生物作用下,才被分解成简单的糖类。在地球表面不同环境中发育着不同类型的分解纤维素微生物,包括真菌、细菌、放线菌的很多类群。本实验通过以纤维素为唯一碳源的培养基、对土壤中常见的纤维素降解细菌进行分离。

1.测微尺测量降解菌细胞大小

(l)镜台测微尺为一专用的载玻片,中央有精确等分线将长为1mm 的直线等分成100 个小格,每格长10μm,将细菌与镜台测微尺放在相同的显微镜放大倍数下拍照后就可以直接用照片上的镜台测微尺去测量细菌的大小(2)球菌用直径表示大小;杆菌用宽和长来表示

2.降解菌染色

简单染色:简单染色法即只用一种染料对涂片进行染色,简单易行,适用于菌体的一般形态观察。在中性、碱性或弱酸性溶液中,细菌细胞通常带负电荷;碱性染料在电离时,其分子的染色部分带正电荷,易与细胞结合使其着色。细胞处于酸性条件下(如细菌分解糖类产酸),所带正电荷增加,可采用酸性染料染色。

革兰氏染色法:革兰氏阳性菌的细胞壁主要有肽聚糖形成的网状结构组成,在染色过程中,当用95%乙醇处理时,由于脱水而引起网状结构中的孔径变小,细胞壁通透性降低,使结晶紫-碘复合物被保留在细胞壁内而不易脱色,因此呈蓝紫色。革兰氏阴性菌的细胞壁中肽聚糖含量低,脂类物质含量高,当用乙醇处理时,脂类物质溶解,细胞壁的通透性增加,使结晶紫-碘复合物容易被乙醇抽提出来而脱色,然后又被染上了复染剂的颜色,因此呈现红色。

芽孢染色:芽孢染色法是利用细菌的芽孢和菌体对染料的亲和力不同,用不同的染料进行着色,从而使菌体和芽孢呈现不同的颜色。由于细菌的芽孢壁厚而致密、透性低。着色和脱色均较困难。因而需在加热条件下,用着色力强的染料促进标本着色,进入菌体的染料经水洗可脱去,而进而入芽孢内的染料难以透出,仍然保留,经复染后,菌体和芽孢可分别呈现不同的颜色。

3.降解菌菌落观察

微生物菌落即微生物聚集在一起的群体结构。在自然界中,我们肉眼所见到的微生物都是以菌落状态存在,不同种类的微生物有其特定的群体结构。因此,根据群体结构(菌落特征),我们可以初步把它们“分门别类”作粗略鉴定。通过对降解菌菌落的观察了解常见菌落的基本形态特征。

4.降解菌生物学鉴定

16SrRNA相对应的DNA序列,存在于所有细菌染色体基因中,它的内部结构由保守区及可变区两部分组成:(1),16SrDNA是细菌染色体上编码16SrRNA

相对应的DNA序列,存在于所有细菌染色体基因中,它的内部结构由保守区及可变区两部分组成。因此可用PCR扩增其相应的rDNA片断,来快速、灵敏地

检测样品中是否存在某些细菌或致病菌,或进行细菌多样性分析,尤其是那些人工无法培养的微生物。

(2)、PrimerA: (与E.coli16SrDNA基因位点5'端8-37位点碱基相同)

5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AGG-3'

PrimerB: (与E.coli16SrDNA基因位点1479-1506位点碱基相同)

5’-ACG GCA ACC TTG TTA CGA GTT-3'

无论采用何种保藏方法,首先应该挑选典型菌种的优良纯种来进行保藏,最好保藏它们的休眠体,如分生孢子、芽孢等。其次,应根据微生物生理、生化特点,人为地创造环境条件,使微生物长期处于代谢不活泼、生长繁殖受抑制的休眠状态。这些人工造成的环境主要是干燥、低温和缺氧,另外,避光、缺乏营养、添加保护剂或酸度中和剂也能有效提高保藏效果。

冷冻干燥保存法的原理是首先将微生物冷冻,然后在减压下利用升华现象除去水分。事实上,从菌体中除去大部分水分后,细胞的生理活动就会停止,因此可以达到长期维持生命状态的目的。

将一定数量的细菌,接种于适宜的液体培养基中,在适温下培养,定时取样测数,以菌数的对数为纵坐标,生长时间为横坐标,作出的曲线称为生长曲线。该曲线表明细菌在一定的环境条件下群体生长与繁殖的规律。一般分为延缓期、对数期、稳定期及衰亡期四个时期,各时期的长短同菌种本身特征、培养基成分和培养条件不同而异。

比浊法是根据细菌悬液细胞数与混浊度成正比,与透光度成反比关系,利用光电比色计测定细胞悬液的光密度(即OD值),用于表示该菌在本实验条件下的相对生长量。

三、实验器材

1.培养基

纤维素分解菌培养基:羧甲基纤维素钠(CMC-Na)培养基(g/L):

CMC-Na 20 ;Na2HPO4 2.5 ;KH2PO4 1.5 ;蛋白胨2.5 ;琼脂20 ;

pH 7.0—7.5

2.试剂及器皿

(1)无菌水、土壤样品生理盐水、石炭酸复红染色液、结晶紫染色液、路戈氏碘液、95%乙醇、番红染色液、5%孔雀绿水溶液、香柏油、二甲苯、(2)25~28℃恒温箱、显微镜、镜台测微尺、擦镜纸、载玻片、接种环、酒精灯、火柴、吸水纸、镊子

(3)XSJ-2 落射荧光显微镜、YXQ.WY21-600 灭菌锅、TH-CB-403 超净工作台、DHP-9162 恒温培养箱

斜面传代保藏法:标签试管接种环酒精灯超净台酒精冰箱无菌胶塞冷冻干燥保藏:无菌脱脂牛乳安瓶管滴管真空冷冻干燥器100ml烧杯

真空泵冰箱

培养基和试剂:200ml蛋白胨纤维素培养液(PCS):5.0g蛋白胨,5.0g纤维素(新华滤纸),5.0g氯化钠,2.0g碳酸钙,1.0g酵母粉溶解在1L水中,接种量5%(体积分数)

器材:1mL无菌吸管、摇床、冰箱、光电比色计、标签、10支试管等。

四、操作步骤

I、土壤分解菌分离、纯化

(1)取样品:去稻田或树林有落叶处,取离地面3~5厘米处土样若干。

(2)接种:将土样揉成小土粒,放在羧甲基纤维素钠(CMC-Na)培养基,将培养基放于32℃培养3天。

(3)菌落形态观察:

(4)如需继续分离纯化,可用纤维素琼脂培养基,用稀释平板法继续进行。用已溶化至50℃羧甲基纤维素钠(CMC-Na)培养基倒平板。用接种环挑取上述菌落少许,在冷凝平板上划线分离,而后置28℃培养3天。划线方法如图:

(一)纯化、镜检,得到纯种培养

(1)平板上出现单菌落,按无菌操作移入羧甲基纤维素钠(CMC-Na)培养基斜面试管中,28℃培养3~4天。

(2)镜检:将斜面菌株进行涂片、染色、镜检。样式以上面诉说的为准,如果不纯,继续培养。

(3)将得到纯化的菌株,已接到羧甲基纤维素钠(CMC-Na)培养基斜面管,28℃培养3天。即获得培养菌,可冷冻保存,备用。

II、纤维素降解菌的酶活力的测定

1.试剂配制

3, 5- 二硝基水杨酸试剂(DNS试剂)

称取182.0 g 酒石酸钾钠, 溶解于500 mL蒸馏水中, 加热(不超过50℃) , 于热溶液中依次加入 6.3 g 3, 5- 二硝基水杨酸、21.0 g 氢氧化钠、5.0 g 苯酚、5.0 g无水硫酸钠, 搅拌均匀至溶解, 冷却后用蒸馏水定容至1 000 mL, 储存于棕色瓶中, 室温保存, 7~10 d 后使用。

柠檬酸缓冲液:

配制0.1 mol /L的柠檬酸溶液(准确称取4.2 g 柠檬酸, 用少量蒸馏水溶解并定容至200 mL)和0.1 mol /L的柠檬酸三钠溶液(准确称取 5.88 g 柠檬酸三钠, 用少量蒸馏水溶解并定容至200 mL)。量取89.5 mL 0.1 mol /L的柠檬酸溶液和110.5 mL 0.1 mol /L的柠檬酸三钠溶液混匀, 即得pH4.85的0.1 mol /L柠

檬酸缓冲液, 4℃冰箱保存备用。量取57 mL 0.1mol /L的柠檬酸溶液和43 mL 0.1 mol /L的柠檬酸三钠溶液, 再量取100 mL蒸馏水混匀, 配成pH4.4 的0.05 mol /L柠檬酸缓冲液, 4℃冰箱保存备用。

乙酸- 乙酸钠缓冲液:

配制A液(准确量取 6 mL冰醋酸,用蒸馏水定容至 1 000 mL)和B液(准确称取8.2 g 醋酸钠, 用少量蒸馏水溶解并定容至 1 000 mL)。将A、B液按4∶6 混合, 即配成pH4.8 的0.1 mol /L乙酸-乙酸钠缓冲液, 低温冷藏备用。

1 mg/mL葡萄糖标准溶液:准确称取1 000 mg 分析纯葡萄糖( 预先干燥至恒重) , 用少量蒸馏水溶解并定容至 1 000mL, 4℃冰箱保存备用。

2.标准曲线的绘制

采用3, 5- 二硝基水杨酸比色定糖法测定酶解液中还原糖的含量。分别取 1 mg/mL葡萄糖标准溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 mL, 依次加入9 支20 mL 的比色试管中, 以蒸馏水补加到 2.0 mL, 再加入DNS 试剂1.5 mL,在沸水中煮沸 5 min, 流水冷却, 用蒸馏水定容至20 mL 摇匀,在波长490 nm 处进行比色测定, 用空白管溶液调零点, 记录吸光度值, 以葡萄糖浓度为横坐标, 吸光度值为纵坐标绘制标准曲线(图1)。

3.滤纸分解度的观察

在试管中加入酶液8 mL, 再加入pH4.4 的柠檬酸缓冲液 2 mL, 摇匀后加入滤纸条( 1 cm ×6cm)和几滴二甲苯, 置50℃恒温水浴中静置反应24 h 后稍加振动, 观察其酶活力的分解强度: ( +)为滤纸边缘膨胀, ( ++)为滤纸整齐膨胀并下弯, ( +++)为滤纸不定形, ( ++++)为全成糊状。

4.羧甲基纤维素酶( CMC) 酶活力测定移取酶液0.5 mL于试管中, 加入含0.5% CMC- Na 的柠檬酸缓冲液( 0.05 mol /L,pH4.4) 1.5 mL, 在50℃水浴锅中准确作用30 min 后, 立即按DNS法测定糖。

酶活力[ (mg/mL)·30 min] =葡萄糖量1 /4

葡萄糖量为从标准曲线上查得的葡萄糖值(mg) , 1 /4 为1mL待测液中原酶液的含量(mL)。

5.滤纸( FPA) 酶活力测定将新华Ⅰ号滤纸( 1 cm ×6cm) 卷成小卷, 放

进试管内, 加入 1.5 mL乙酸- 乙酸钠缓冲液( pH4.8) , 再加入0.5 mL 酶液, 轻轻摇匀, 使滤纸完全浸泡在液体中, 50℃保温 1 h 后按DNS法测定糖。

酶活力[ (mg/mL)·h] =葡萄糖量1 /4

葡萄糖量为从标准曲线上查得的葡萄糖值(mg) , 1 /4 为1mL待测液中原酶液的含量(mL)。

6.天然纤维素酶活力测定

称取 1 g 碱处理过的秸秆粉置于50 mL带塞的三角瓶中, 加入稀释酶液8 mL、pH4.85 的0.1mol /L柠檬酸缓冲液3 mL、蒸馏水4 mL, 摇匀, 50℃水浴锅中酶解24 h, 过滤, 按DNS法测定还原糖。

酶活力[ (mg/mL)·d] =葡萄糖量×n8 /15

葡萄糖量为从标准曲线上查得的葡萄糖值(mg) , n 为酶液稀释倍率

1.测量降解菌细胞大小

(1)制片:在载玻片上滴一滴蒸馏水,按无菌操作,挑取纤维素降解菌均匀涂片,然后盖上盖玻片

(2)将“水浸片”标本置于载物台上,先用低倍镜观察到目标后,转换高倍镜观察,并用显微镜拍照;将镜台测微尺放在相同高倍镜下拍照。

(3).菌体大小的测定

用照片上的镜台测微尺去测量照片上的降解菌的大小,测量100个菌体。

2.降解菌的染色

(1)简单染色

涂片:取一干净的载玻片,滴一滴蒸馏水在玻片中央。接种环经灼烧后,按无菌操作要求,用接种环挑取少量培养物至于中央水滴中,与水混合并轻轻涂布成直径约1cm的均匀薄层。

干燥:将涂片至于酒精灯上微热烘干,或在室温下干燥。

固定:涂片标本面向上,快速通过酒精灯火焰2~3次,进行固定。

染色:标本玻片水平放置,滴加1~2滴石炭酸复红染色覆盖涂片区域,时间20~30S。

水洗:染色时间到后,倒去染液,斜置玻片,自玻片上端用自来水冲洗至流下的水无色为止。

干燥、镜检:自然晾干,或用吸水纸吸去水分,完全干燥后,用油镜检查。

(2)革兰氏染色

涂片将培养14—16小时的枯草芽孢杆菌和培养24小时的大肠杆菌分别作涂片(注意涂片切不可过于浓厚),干燥、固定。固定时通过火焰1—2次即可,不可过热,以载玻片不烫手为宜。

初染:加草酸铵结晶紫一滴,约一分钟,水洗。

媒染:滴加碘液冲去残水,并覆盖约一分钟,水洗。

脱色:将载玻片上面的水甩净,并衬以白背景,用95%酒精滴洗至流出酒精刚刚不出现紫色时为止,约20—30秒钟,立即用水冲净酒精。

复染:用番红液染1—2分钟,水洗。

镜检:干燥后,置油镜观察。革兰氏阴性菌呈红色,革兰氏阳性菌呈紫色。以分散开的细菌的革兰氏染色反应为准,过于密集的细菌,常常呈假阳性。

(3)芽孢染色

将纤维素降解菌,作涂片、干燥、固定。

滴加3—5滴孔雀绿染液于已固定的涂片上。

用木夹夹住载玻片在火焰上加热,使染液冒蒸汽但勿沸腾,切忌使染液蒸干,必要时可添加少许染液。加热时间从染液冒蒸汽时开始计算约4—5分钟。这一步也可不加热,改用饱和的孔雀绿水溶液(约7.6%)染10分钟。

倾去染液,待玻片冷却后水洗至孔雀绿不再褪色为止。

用番红水溶液复染1分钟,水洗。

待干燥后,置油镜观察,芽孢呈绿色,菌体呈红色。

3.降解菌菌落观察

用肉眼观察生长在琼脂平板上的各种霉菌菌落,并根据下列要求对每种霉菌的菌落特征加以描述。

菌落的大小:局限生长或蔓延生长,菌落的直径和高度。

菌落的颜色:正面和背面的颜色,培养基的颜色变化。

菌落的形态:棉絮状、网状、疏松或紧密、同心轮纹、放线状的皱褶等。

降解菌的分子生物学鉴定

(1) 降解菌DNA的提取

1、挑取适量菌落于装有1000ul无菌水的离心管中12000rpm离心5min。吸去水,使细菌沉淀尽可能干燥。

2、向装有细菌沉淀的离心管中加入600ul 细胞裂解液,再加20ul 10mg/ml 的蛋白酶K,然后200 ul 1%SDS,混匀,55℃保温1 h。12000 rpm 离心5 m

i n,取上清液于另一离心管中。

3、向上清液中加入等体积的酚:氯仿:异戊醇( 2 5:2 4 :1 ),反复混匀,1200 rpm离心5 m i n,取上清液于另一离心管中。

4、向上清液中加人2倍体积的无水乙醇,混匀,冰上放置10 m i n ,12000rp 离心5 m i n 。

5、倒去上清液,把离心管倒扣在吸水纸上,吸干液体。加入30ulTE缓冲液( 其中含有20 ug/ml的胰R N A酶),使DNA完全溶解,一2 0℃保存备用。

(2)16s rDNA的扩增

PCR扩增体系(50μL)

ddH20 37μL

10×PCR buffer 5μL

dNTP 1μL

PrimerA 2μL

PrimerB 2μL

模板DNA 2μL

Tag酶1μL

合计50μL

(3)、1.加样:在灭过菌的Eppendorf管中加入反应体系个成分(最后加Taq 酶)

2.PCR反应:将加好样的Eppendorf管放入PCR反应仪中,设定程序,开始反应.

(5)、反应前预变性(94℃﹚5min

.94℃变性1min

.52℃退火1min

.72℃延伸 1.5min

.共30个循环

.循环结束后应延伸(72℃)10min,4℃保存

3.凝胶电泳检测:反应结束,取3~5μl反应液进行凝胶电泳分析(0.8~1.0%琼脂糖凝胶)

4. 凝胶分析:在紫外分析仪下对电泳条带进行分析

III、菌种保藏

(1)斜面传代保藏法(常温保藏)

①贴标签取各种无菌斜面试管数支,将注有菌株名称和接种日期标签贴上,贴在试管斜面的正上方,距试管口2~3cm处。

②斜面接种将待保藏的菌种用接种环以无菌操作法移接至相应的试管斜面上,细菌和酵母菌宜采用对数生长期的细胞,而放线菌和丝状真菌宜采用成熟的孢子。

③培养细菌37℃恒温培养18~24h,酵母菌于28~30℃培养36~60h,放线菌和丝状真置于28℃培养4~7d。

④保藏斜面长好后,可直接放入4℃冰箱保藏。为防止棉塞受潮长杂菌,管口棉花应用牛皮纸包扎,或换上无菌胶塞,亦可用熔化的固体石蜡熔封棉塞或胶塞。

每隔一定时间(保藏期)再转接至新的斜面培养基上,生长后继续保藏,如此连续不断。

此法的缺点是容易变异,污染杂菌的机会较多。

(2)冷冻干燥保藏

①用灭菌长滴管取出2滴(约0.1ml)无菌脱脂牛乳,置于无菌安瓶管中然后用另一支无菌滴管取出等体积的浓菌液,同样置于此安瓶管中,充分混匀。

②集中安瓶管,置于100ml烧杯中,将烧杯装进真空冷冻干燥器的钟罩内,开机并开冷却水后,使菌液在-20℃温度下迅速冻结成固体,然后抽真空使水分

升华,2小时后,可以停止冷冻并在稍高的温度下进行干燥,直至全干为止。

③最后取出安瓶管,并将其与真空泵连接,再抽真空后,迅速将安瓶管熔封,最后冰箱保存。

由于此法同时具备低温、干燥、缺氧的菌种保藏条件,因此保藏期长,一般达5~15年,存活率高,变异率低,是目前被广泛采用的一种较理想的保藏方法。除不产孢子的丝状真菌不宜用此法外,其他大多数微生物如病毒、细菌、放线菌、酵母菌、丝状真菌等均可采用这种保藏方法。但该法操作比较烦琐,技术要求较高,且需要冻干机等设备。

VI、降解菌的液体发酵及其生长曲线的测定

1)接种:取9支装有10ml蛋白胨纤维素培养液的试管,贴上标签(注明菌名、培养处理、培养时间、组号)。按无菌操作法用1mL无菌吸管向每管准确加入0.2mL的分解菌培养液,接种后,轻轻摇荡,使菌体混匀。另取一管不接种的培养管注明CK(对照)。

2)培养:将接种后的培养管置于摇床上,在37℃下振荡培养。其中9支培养管分别于培养的0、1.5、3、4、6、8、10、12和14h后取山,放冰箱中贮存,待测定。

3)比浊:将培养不同时间、形成不同细胞浓度的细菌培养液进行适当稀释,使光密度值在0.0-0.4范围内,以未接种的蛋白胨纤维素培养液培养基调零点,在光电比色计上,选用440nm波长的滤光片进行比浊,从最稀浓度的菌悬液开始,依次测定。

五、绘制曲线

1、将测定的OD值填入下表:

时间(h) 对照0 1.5 3 4 6 8 10 12 14

光密度值(OD440)

2、以细菌悬液的光密度值(OD)为纵坐标,培养时间为横坐标,给出分解菌在正常生长的生长曲线。

六、细菌含量的测定

将上述培养0,1.5,3,4,6,8,10,12,14h的细菌悬液用稀释平板测数法进行测数,测出不同时间的含菌数,以菌悬液比浊的光密度值为横坐标,以细菌的数量为纵坐标,绘制一标准曲线,这样在测得了任一培养时间的菌悬液光密度值后,就可以在此标淮曲线上查出含菌数。

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