肺癌细胞系中肿瘤干细胞的分离鉴定与功能分析
肿瘤细胞培养方法和培养基
肝癌细胞培养 一、培养基 1、RPMI-1640+10%胎牛血清培养基 2、DMEM+15%胎牛血清培养基 成分表
二、实验前准备工作: 操作者的皮肤、培养瓶的盖和外壁常用酒精消毒。用紫外线消毒实验室空气、工作台面和一些不能使用其他方法消毒的培养器皿。进无菌室前或做完实验后，均应开灯照射30min进行消毒。紫外线照射60min可以消灭空气中大部分细菌。 1、玻璃器皿的清洗灭菌（5％盐酸溶液、重鉻酸钾120ml、硫酸200ml、蒸馏水200ml）：（1）浸泡:新使用或重复使用的玻璃器皿须经5％盐酸溶液或自来水浸泡过夜或煮沸30min，水洗。以去除新购进玻璃器皿所带有灰尘、铅、砷等物质，并消除其弱碱性。 （2）刷洗:浸泡后用软毛刷和优质的洗洁精进行刷洗。刷洗后经行烘干。 （3）酸浸:刷洗后的玻璃制品酸浸前须适当晾干或烘干，以免造成酸浸液稀释，影响效果。将玻璃制品完全浸泡入清洁液中24h。清洁液具有极强酸蚀作用，操作过程需戴防护用具。（4）冲洗、烘干备用:浸酸后的玻璃器皿先用自来水充分冲洗，吸管需冲洗10min，器皿需每瓶灌满自来水、倒掉反复10次以上，不留任何酸浸液残迹，然后用蒸馏水漂洗2～3次，将清洗好的玻璃器皿放入烘干箱中，烘干后的玻璃器皿要求干净透明，无油烟，不能残留任何有害物质及化学药品等。 （5）包装灭菌:器材经清洗烤干或晾干后，先应严格包装，然后再行消毒灭菌处理，以防止消毒灭菌后再次遭受污染。包装材料常用包装纸、牛皮纸、硫酸纸、棉布、铝饭盒、玻璃或金属制吸管筒、纸绳等。
2、橡胶制品清洗消毒： 0.5mol/L NaOH煮沸15分钟，流水冲洗，0.5mol/L HCl煮沸15分钟，流水冲洗，自来水煮沸2次，蒸馏水煮沸20分钟，50℃烤干备用 3、塑料制品的清洗消毒（瓶盖、离心管）： 使用器皿后立即用清水清洗，浸于自来水过夜，用纱布或棉签和50℃清洗液刷洗，流水冲洗，晾干，浸于清洁液15分钟，流水冲洗（15－20遍）,蒸馏水浸洗三次，双蒸水泡24小时，晾干备用。 三、细胞复苏： 冻存细胞保存管保存在液氮中（-196℃），取出保存管后必须快速冷冻，以避免冰晶重新结晶而对细胞造成伤害，致使细胞死亡。在冻存细胞的保存管中含有对细胞有毒害的成分DMSO,故在解冻应马上将其去除。在冷冻活化前应在无菌台上将细胞培养液配好，然后将保存管从液氮中取出，放于37℃的温水中快速使细胞解冻。解冻后悬液快速移入培养液中混匀，离心去掉上清液，再加入细胞培养液。 实验人员穿上无菌实验室操作服用酒精喷于手上消毒，然后就位用酒精棉球擦拭实验台（1）取一15ml离心管用滴管在其内滴加5--9ml培养液（取8ml）。 （2）从液氮罐中取出冻存管，并迅速放入37℃水浴，不时摇动，使其急速融化，30～60s 内完成。 （3）冻存管用70％酒精擦拭消毒后，打开盖子，用吸管将细胞悬液转移入上述离心管中（用培养基把冻存管洗一遍，把粘在壁上的细胞都洗下来）。 （4）低速离心(1000r／min) 5min，去上清后再用8ml培养液再清洗离心一次。 （5）离心后倒掉上清液，在离心管中滴加3ml培养液（RPMI-1640），混匀（可用滴管轻柔吹打）。 （6）将离心管中的混合液转移到培养瓶中，并在培养瓶中滴加15滴10%小牛血清，盖上瓶盖，标好细胞种类和日期、培养人姓名等，将培养瓶平放，置于37°C培养箱中培养。2-3天换一次培养基。 四、细胞传代： 当观察到培养瓶中细胞铺满度为90%时（细胞生长处于对数期时），解冻复活成功后的细胞要进行分离培养，否则细胞会因生存空间不足或密度过大，营养障碍，影响细胞生长。细胞由原培养瓶内分离稀释后传到新的培养瓶中培养的过程称之为传代培养。传代细胞细胞株的最大利处在于提供了大量持久的实验材料，便于实验。 （1）试验台的消毒工作准备好，弃去旧培养液，用PBS液（不含钙，镁离子）洗1-2次，以免剩余培养液影响胰蛋白酶活性。（细胞贴壁生长）。 （2）向瓶内加入1ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mEDTA），置于37℃孵箱或室温（25℃温度）下进行消化，1--3min后把培养瓶放在倒置显微镜下进行观察，当发现胞质回缩、细胞间隙增大后，应立即中止消化（将培养瓶翻转过来，以保证细胞没有脱壁）。 备注：若细胞没有脱壁，生长良好，则直接倒掉消化液，加培养液8ml，离心收集细胞；若发现很多细胞已解离已脱壁（即解离过度），则直接加培养液进行离心收集细胞。 （4）倒出消化液，向瓶内用滴管加入培养液少量（约2ml），轻轻转动培养瓶，把残留胰蛋白液消化液冲掉，然后再加3ml培养液+15滴小牛血清。 （5）使用吸管，吸取瓶内培养液，按顺序反复轻轻吹打瓶壁细胞，使之从瓶壁脱离形成细胞悬液。吹打时动作要轻柔，以防用力过猛损伤细胞。 （6）将准备好的细胞悬液转入离心管中，离心(1000r／min) 5min。 （7）将离心后离心管中液体倒掉，在离心管中加入3ml培养液，并反复吹打细胞，制成细胞悬液。
肿瘤干细胞的动态演进及干预研究
项目名称：肿瘤干细胞的动态演进及干预研究首席科学家：刘强中山大学 起止年限：2012.1至2016.8 依托部门：教育部
一、关键科学问题及研究内容 拟解决的关键科学问题： 肿瘤干细胞的动态演进及干预研究。本项目将围绕“肿瘤干细胞的动态演进及干预研究”这一关键科学问题，选择造血和消化系统恶性肿瘤为研究对象，以肿瘤干细胞动态演进过程为切入点，通过体内外功能实验及临床标本验证“干性”及转移潜能调控中的关键基因，明确肿瘤干细胞演进的分子机制、关键调控分子和信号通路，探索靶向肿瘤干细胞演进过程的干预方法和手段，阐明肿瘤干细胞的演进过程及靶向干预肿瘤细胞动态演进过程的干预新模式。本研究将为肿瘤干细胞的动态演进模型及创新性靶标药物的临床应用提供充实的理论和实验依据，为攻克肿瘤开创新的突破口。 围绕拟解决的关键科学问题，本项目的主要研究内容是： 1. 肿瘤干细胞的起始与动态演进机制：本课题组将运用TEL-AML1及PML-RARα白血病相关模型，探索白血病干细胞的动态演进过程（白血病起源细胞→白血病前癌干细胞→白血病干细胞）：（1）TEL-AML1 相关白血病起始和发展过程中起源细胞、Pre-LSC和LSC的鉴定，以及这些干细胞动态演进的遗传和表观遗传调控机制；（2）PML-RARα相关白血病起始和发展过程中不同阶段的干细胞鉴定和动态演进机制。另一方面，本课题组还将探讨肝癌干细胞在肝癌发生发展过程（原发、复发及转移）中的动态演进过程。 2. 肿瘤干细胞“干性”的分子调控及临床意义：（1）应用新一代高通量测序技术，系统分析全基因组、全外显子组、转录组、表观遗传组、代谢组等变化，绘制造血和消化系统肿瘤干细胞异质性相关基因序列谱、表达谱和表观遗传学图谱，分析肿瘤干细胞“干性”相关的调控分子及关键信号通路；（2）运用小鼠模型等体内外功能实验对候选分子在肿瘤干细胞动态演进过程中的功能进行鉴定，并通过临床标本检验肿瘤干细胞动态演进模型的临床意义；（3）结合本课题组已有工作基础，展开肿瘤干细胞细胞周期、非对称分裂等分子调控方面的细致研究。 3. 肿瘤干细胞转移潜能获得的分子机制：肿瘤干细胞的“干性”决定着其转移潜能，EMT作为肿瘤转移的重要机制，与肿瘤干细胞的动态演进过程紧密关联，剖析二者之间的相互作用，将为寻找肿瘤发生及转移的靶点提供有力的理论基础：（1）
肿瘤干细胞与EMT
肿瘤干细胞与EMT 肿瘤干细胞（cancer stem cell，CSC）学说认为,肿瘤实际上是由一小群具有无限增殖潜能和自我更新能力的干细胞样细胞及其产生的分化程度不均一的细胞团组成，其中具有自我更新能力并能产生异质性肿瘤细胞的细胞被称为肿瘤干细胞。肿瘤干细胞的两个重要特性:一是具有自我更新驱动肿瘤发生的能力，二是具有多向分化形成肿瘤的异质性的潜能1。 上皮间质转化（epithelial-to-mesenchymal transition，EMT）是具有极性的上皮细胞转化为具有移行能力的间质细胞，并获得侵袭和迁移能力的过程。EMT是一个多步骤的动态变化过程，上皮细胞间相互作用消失，组织结构松散，立方上皮细胞转变为纺锤形纤维细胞形态，并表现出侵袭性。实体肿瘤中央的细胞为上皮细胞表型，周围的细胞常常会呈间质细胞表型，其较强的运动能力使肿瘤细胞在局部产生浸润，并侵入血和淋巴管而转移至靶器官。到达靶器官后，癌细胞可发生间质上皮转化（MET）来重建细胞间连接及细胞骨架从而形成转移灶2。EMT与肿瘤转移密切相关，而且也可以作为得到肿瘤干细胞的方法3。 近年来，肿瘤干细胞与EMT之间的关联性逐渐受到研究者的关注，二者在肿瘤的复发、转移和耐药性上面有很多相似点4。肿瘤干细胞模型和EMT的概念试图从不同的角度来揭示肿瘤的发展，但两者都不能独立地解释所有生物学事件。诱导EMT能促使肿瘤细胞获得干细胞特性，通过诱导分化的肿瘤细胞最终形成肿瘤干细胞并维持干性，而肿瘤干细胞同样具有EMT特征。然而，EMT是通过何种分子机制转化干细胞样细胞的，目前尚不清楚。下面向大家介绍目前已知的关于EMT和肿瘤干细胞间分子机制上的关联性。 连接EMT与肿瘤干细胞的信号通路：
实验3 细胞核的分离与核酸的鉴定
实验3 细胞核的分离与核酸的鉴定 【实验目的】 1.掌握细胞核及细胞质的分离和纯化的一般原理和操作方法。 2.了解DNA在细胞中的分布和核酸鉴定的原理。 3.进一步掌握离心机的工作原理及正确使用方法。 【实验原理】 1.DNA主要存在于细胞核， RNA主要存在于细胞质。 2.细胞内不同结构的比重和大小都不相同，在同一离心场内的沉降速度也不相同，根据这一原理，常用不同转速的离心法，将细胞内各组分分级分离出来。 肝组织破碎后，柠檬酸能抑制脱氧核糖核酸酶的活性，维持染色质的正常结构和活性。如将此种细胞核保存在等渗（0.25M）蔗糖溶液中（内含微量钙离子，防止核聚集和脆性），可以比较好地保存其完整的正常结构。 在此条件下离心分离得到的是细胞核的粗制品，如离心时通过0.88M蔗糖的高渗溶液。适当调整离心力，可得到纯化的细胞核沉淀。
3.脱氧核糖核酸的鉴定： 【操作步骤】 1、0.5g肝组织＋5ml的1.5%柠檬酸溶液，研磨 2、肝匀浆，倾入离心管，离心：3000r/min；15′ 3、离心结束后，上清液移入另外一个试管中备用（此为细胞质液） 4、沉淀中加入1ml的0.25mol/L 蔗糖-柠檬酸溶液，玻棒搅匀后， 为核悬液。 5、另外取离心管一只，加9ml 的0.88mol/L蔗糖-柠檬酸液。用滴 管吸取核悬液。沿管壁缓慢铺于液面上。 6、离心：2000r/min；10′.上层液，弃去；沉淀为初步纯化的细 胞核。 7、核洗液5ml洗涤沉淀，离心：2000r/min，10 ′白色沉淀为纯
化的细胞核。 8、加10ml 0.02mol/L NaOH溶解细胞核，即为待测的核液。 9、脱氧核糖核酸的鉴定 （1）水解：取离心管二支，编号，按下表操作 混合各管 沸水浴(10’) 离心 3000r/min;5′ 上清液 (2)鉴定：取试管三支，编号，按下表操作: 混合各管 沸水浴(15’) 冷却 比较各管颜色(595nm) 编号 1 2 细胞质（ml） 2.0 - 核液（ml）- 2.0 1M过氯酸(ml） 2.0 2.0
肿瘤治疗新目标-肿瘤干细胞
肿瘤治疗新目标——肿瘤干细胞【摘要】肿瘤干细胞是肿瘤细胞的祖细胞，是肿瘤的真正种子，它们虽然仅占肿瘤细胞中极少的一部分，但具有自我更新能力和不定分化潜能，是形成不同分化程度肿瘤和肿瘤不断生长的根源，是肿瘤发生、扩散、复发等过程中的“起始细胞”或“动力细胞”。传统的化疗药物不能有效靶向作用肿瘤干细胞，开发针对肿瘤干细胞的靶向治疗，能给肿瘤治疗模式带来全新的改变，有望彻底改善患者的预后。 【关键词】肿瘤干细胞 干细胞（stem cell）是一类具有自我更新能力和无限增殖分化潜能的原始细胞，这种细胞可分化为特定组织中一个或多个具有特定功能的细胞。随着对干细胞研究的深入，人们对肿瘤的发生、发展有了新的认识。有研究者提出恶性肿瘤是一种干细胞疾病，肿瘤来源于干细胞。这种干细胞，即肿瘤干细胞（cancer stem cell, CSC）在肿瘤组织中存在，虽为数不多，仅占肿瘤细胞的万分之一至百分之一左右，但具有自我更新能力和不定分化潜能，是形成不同分化程度肿瘤和肿瘤不断生长的根源，是肿瘤发生、扩散、复发等过程中的“起始细胞”或“动力细胞”。直接针对CSC的靶向治疗，可望带来肿瘤治疗模式的全新改变，彻底改善患者的预后。 1 肿瘤干细胞的发现 传统观念认为，所有肿瘤细胞均存在无限增殖的可能，每个发生转移的肿瘤细胞都具有再次形成肿瘤的能力。然而，1958 年Hewitt[1]把小鼠白血病细胞移植到同品系的小鼠体内,发现仅有1%～4%的移植
细胞能够形成脾脏内克隆。随后陆续有实验报道在白血病[2~5]、乳腺癌[6,7]、脑肿瘤[8,9]、胃肠肿瘤[10,11]等多种实体瘤中发现具有干细胞特性的一小部分肿瘤细胞，而且只有这些肿瘤细胞（而不是全部肿瘤细胞）具有致瘤性。于是，学者们提出了肿瘤来源于肿瘤干细胞（CSC）的学说。CSC学说认为肿瘤组织中都存在有CSC，这些CSC是肿瘤细胞的祖细胞，是肿瘤的真正种子，它们虽然仅占肿瘤细胞中极少的一部分，但在肿瘤的发生、发展、侵袭过程中发挥着重要的作用。 1.1 血液肿瘤干细胞 早在20 世纪 60年代，Bruce等[2]就发现鼠白血病细胞的一小部分亚群和正常造血干细胞及祖细胞一样，在体内外均能形成克隆。随后Park等[3]发现从大鼠腹水中获取的白血病细胞中仅有1‰～1%能在体外形成克隆细胞株；而且白血病细胞被输注入体内，也仅有1%～4%的细胞能形成脾克隆，这说明只有少数白血病细胞能在体内、外增生。Park据此推测可以形成克隆的白血病细胞是白血病干细胞，并由此提出了白血病干细胞（leukemic stem cell，LSC）的概念。Lapidot等[4]将一个与正常造血干细胞具有相同CD34+CD38-表型的白血病细胞亚群移植给NOD/SCID小鼠，发现此亚群细胞表现出干细胞样的自我更新和增殖能力，于是将此亚群细胞定义为SL-IC（SCID leukemia-initiating cell）。1997年，Bonnet等[5]用实验证实了大多数白血病细胞不能持续增殖，只有少数LSC能形成白血病细胞集落；人类急性髓细胞性白血病（acute myelocytic leukemia, AML）干细胞约占全部AML细胞的0.2%~1%，表达CD34+CD38-；这一细胞亚群具
脂肪干细胞的提取及鉴定
脂肪干细胞的提取及鉴定 一、脂肪干细胞(ASCs)的提取及鉴定 1、实验技术及原理: 运用细胞培养技术、流式细胞术(体外扩增后ACSs的表型会发生改变，主要体现在细胞表面蛋白和细胞因子表达的变化)，差异离心术(可将基质血管细胞沉淀与悬浮的成熟脂肪细胞分离，沉淀中除ASCs，还包括血细胞、成纤维细胞和内皮细胞，基质血管细胞沉淀可以接种到孰料培养瓶中，基质细胞可贴壁，造血和其他杂质细胞不贴壁，在随后的传代过程中被出去，最终得到的ASCs可再很长时间内保持摸分化状态)。取C57BL,6 WT小鼠2只，常规麻醉消毒，取腹股沟脂肪组织剪碎至糊状，PBS液冲洗去麻药及血液，0.075%II型胶原酶消化(37?，30分钟)以去除外基质，生理盐水终止胶原酶的消化，离心(1200g,10分钟)，去上清液及未消化的脂肪，10%FBS的DMEM重悬细胞沉淀，0.16mol/L氯化氨溶解剩余红细胞，离心洗涤，过200目铜网，得到单个核细胞。?镜下计数，按10个细胞/ml种植在培养瓶中，37?5%CO2孵箱培养，24小时后第一次换液，以后3天换液一次，80%融合后0.25% Trypsin,0.02%EDTA消化传代。细胞镜下作形态学观察及取第三代细胞用流式细胞仪作细胞周期及细胞免疫表型(CD29/CD44)的鉴定。 2、实验用品: 2.1 材料:C57BL,6 WT小鼠 2.2 试剂:PBS液，0.075%II型胶原酶消化，10%FBS，低糖DME M 2.3 仪器设备:超净工作台、恒温培养箱、普通显微镜、倒置显微镜、离心机、离心管、解剖剪、眼科剪、镊子(尖头、平头和有沟镊)、小烧杯，200目铜网过滤器，低糖DMEM、血球计数板、橡皮瓶塞、酒精灯、换药碗 3、细胞培养的方法与步骤:
肿瘤细胞培养(完整版)
第6章肿瘤细胞的培养 肿瘤细胞培养是研究癌变机理、抗癌药的敏感性、肿瘤细胞和癌分子生物学特性的重要手段。癌细胞是比较容易培养的细胞，当前所建立的细胞系中癌细胞是最多的。应用体外细胞培养技术进行肿瘤研究具有许多优点： (1)可免受机体内环境因素的影响，避免了个体差异性，便于探索各种物理、化和生物 因素对肿瘤细胞生命活动的影响。 (2)既便于从细胞水平上研究肿瘤细胞的结构与功能，又便于从基因及分子水平上研究 癌变的发生机理； (3)可长期传代、保存，便于观察肿瘤细胞生物学特性和遗传行为的改变。 (4)可用于快速筛选抗癌药物和研究耐药机理。 (5)研究周期短，比较经济。 但是它也有缺点，如长期培养可使细胞生物学特性发生改变；体外实验所得的结果不能完全代表体内的情况，应与体内试验结合研究更为合理等。 一、肿瘤细胞培养的生物学特性 1、形态和性状 形态不规则，细胞界限清晰，伸展较差，核膜、核仁轮廓明显，核仁多、核浆丰富。折光性强，电镜观察细胞表面微绒毛多而细密，与肿瘤细胞具不定向运动和铺着不依赖性有关。 2、生物特性 癌细胞在无血清或低血清(2%～5%)时仍能生长，营养要求不高，因能自分泌促增殖因子，在软琼脂培养时单个细胞能形成集落，生长方向性消失，再加上失去了接触抑制，癌细胞数量增多时可呈多层重叠生长，细胞饱和密度大，有丰富的三极有丝分裂，分裂指数高，细胞倍增周期短。 3、永生性 永生性也称不死性，在体外培养中表现为可无限制传代而不凋亡(Apoptosis)，体外培养的肿瘤细胞系(株)都表现有这种特性。但体外培养的永生性和体内肿瘤的恶性(包括侵润性)是两种性状，受不同基因调控的，因恶性肿瘤多数在体外培养时并不那么容易获得成功，生长增殖能力并不旺盛，有时只能传若干代，说明体外培养的永生性可在体外培养后获得的。另外，体外培养的许多细胞系，如NIH3T3、Rat-1 10T1/2等均具有永生性而无恶性。但两者有相关性，永生性可能是细胞恶性变的某一阶段。 4、侵润性 侵润性是肿瘤细胞扩张性增殖行为，体外培养的肿瘤细胞仍保持有这种特性，当与正常组织混合培养时，能侵润入其他正常组织中，甚至能穿透人工隔膜。 5、异质性 所有肿瘤细胞都是由增殖能力、遗传性、起源、周期状态等性状不同的细胞组成，属于异质性，其中有的衰老、退化，有的处于周期阻滞状态，只有那些处于活跃增殖的肿瘤干细胞才是支持肿瘤生长的成分，肿瘤干细胞易于生长增殖，分离培养干细胞的方法称干细胞培养(有干细胞系和数个亚系组成)。
干细胞和肿瘤干细胞
干细胞和肿瘤干细胞： 干细胞和肿瘤干细胞的相同点： 肿瘤干细胞和干细胞在生物学特性和生长调控机制等诸多方面有着极其相似的生物学行为，主要相似之处有：①二者具有相似的调节生长的机制。有证据表明许多与肿瘤有关的调节途径也调节正常干细胞的发展，例如：凋亡抑制基因bcl-2可在体外增加HSC的数量。其他与癌变有关的信号途径如Wnt，Notch，Shh，Bmi-1等在调节干细胞自我更新的同时也在肿瘤中起作用[10-11]。②干细胞具有迁移的特性，而癌细胞有转移的能力。Tu等[12]认为干细胞的迁移和癌细胞的转移，皆受特异化学因子及其受体的调节。干细胞迁移到特定的组织和器官，而这可以解释肿瘤转移也有一定器官和组织特异性。③干细胞与癌细胞在一定的条件下是可以转化的，如生殖嵴或胚胎植入体内可以诱导成畸胎瘤，而畸胎瘤细胞注入鼠囊胚内细胞团可以形成正常胚胎。④肿瘤干细胞与HSC一样，可以分为肿瘤干细胞、短期增生细胞、分化细胞。⑤肿瘤起源于干细胞。有人认为单一细胞获得4~7次突变将发生恶性转化[13]。组织更新快的上皮组织、造血系统是肿瘤高发部位，组织自我更新越快，复制、转录过程中基因发生突变的概率越高。尽管大多数肿瘤转化突变的靶细胞并不清楚，但是已有相当多的证据表明某些结肠癌和白血病产生于积累多次突变的干细胞。⑥干细胞与肿瘤干细胞都具有端粒酶活性以及扩增的端粒重复序列，而人类终末分化体细胞不具有端粒酶活性。⑦二者均具有自我更新和无限增殖能力。⑧自我更新能力。⑨组织特异分化能力，肿瘤干细胞能够产生不同表型的肿瘤细胞，并在体内形成新的肿瘤。⑩不对称分裂能力。 干细胞和肿瘤干细胞的不同点：但肿瘤干细胞也具有不同于干细胞的特点：①自我更新信号传导途径的负反馈调节机制被破坏，肿瘤干细胞具有无限增殖和无自稳定性，而正常干细胞的增殖具有自稳性，其数目保持恒定。②缺乏分纯成熟能力，晚期肿瘤细胞没有分化为成熟细胞的能力，说明其分化程序异常，这与有着正常分化程序的干细胞不同。③肿瘤细胞倾向于积累复制错误，而正常干细胞的
脐带血间充质干细胞的分离培养和鉴定
脐带血间充质干细胞的分离培养和鉴定 【摘要】目的分离培养脐带血间充质干细胞并检测其生物学特性。方法在无菌条件下用密度梯度离心的方法获得脐血单个核细胞，接种含10%胎牛血清的DMEM培养基中。单个核细胞行贴壁培养后，进行细胞形态学观察，绘制细胞生长曲线，分析细胞周期，检测细胞表面抗原。结果采用Percoll(1.073 g/mL)分离的脐血间充质干细胞大小较为均匀，梭形或星形的成纤维细胞样细胞。细胞生长曲线测定表明接后第5天细胞进入指数增生期，至第9天后数量减少;流式细胞检测表明50%～70%细胞为CD29和CD45阳性。结论体外分离培养脐血间充质干细胞生长稳定，可作为组织工程的种子细胞。 【关键词】脐血;间充质干细胞;细胞周期;免疫细胞化学 Abstract: Objective Isolation and cultivation of mesenchymal stem cells (MSCs) in human umbilical cord in vitro, and determine their biological properties. Methods The mononuclear cells were isolated by density gradient centrifugation from human umbilical cord blood in sterile condition, and cultured in DMEM medium containing 10% fetal bovine serum. After the adherent mononuclear cells were obtained, the shape of cells were observed by microscope, then the cell growth curve, the cell cycle and the cell surface antigens were obtained by immunocytochemistry and flow cytometry methods. Results MSCs obtained by Percoll (1.073 g/mL) were similar in size, spindle-shaped or star-shaped fibroblasts-liked cells. Cell growth curve analysis indicated that MSCs were in the exponential stage after 5d and in the stationary stages after 9d. Flow cytometry analysis showed that the CD29 and CD44 positive cells were about 50%～70%. Conclusions The human umbilical cord derived mesenchymal stem cells were grown stably in vitro and can be used as the seed-cells in tissue engineering. Key words:human umbilical cord blood; mesenchymal stem cells; cell cycle; immunocytochemistry 间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)在一定条件下具有多向分化的潜能，是组织工程研究中重要的种子细胞来源。寻找来源丰富并不受伦理学制约的间充质干细胞成为近年来的研究热点[1]。脐血(umbilical cord blood, UCB)在胚胎娩出后，与胎盘一起存在的医疗废物。与骨髓相比，UCB来源更丰富，取材方便，具有肿瘤和微生物污染机会少等优点。有人认为脐血中也存在间充质干细胞(Umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells，UCB-MSCs)。如果从脐血中培养出MSCs，与胚胎干细胞相比，应用和研究则不受伦理的制约，蕴藏着巨大的临床应用价值[2,3]。本研究将探讨人UCB-MSCs体外培养的方法、细胞的生长曲线、增殖周期和细胞表面标志等方面，分析UCB-MSCs 作为间充质干细胞来源的可行性。
卵巢癌肿瘤干细胞标记物研究的新进展_肖远
★ 基金项目：国家自然科学基金项目资助（81201730）；中国博士后科学基金面上资助（2012MS21565）；湖南省科学技术厅科技计划项目（2010FJ3078）；湖南省卫生厅科研基金项目（132011-088）。 作者简介：肖远，男，副主任药师，研究方向：肿瘤药学，E-mail ：csxy531@https://www.360docs.net/doc/dc9196672.html,。 * 通讯作者：曾勇，男，博士，副主任药师，研究方向：肿瘤药理学、生物医学，E-mal ：valzeng@https://www.360docs.net/doc/dc9196672.html,。 ●综 述● 卵巢癌肿瘤干细胞标记物研究的新进展★ 肖 远，伍 奕，任华益，曾 勇* （中南大学湘雅医学院附属肿瘤医院 药学部，湖南 长沙，410013） 摘要：卵巢癌是女性生殖系统一种常见的恶性肿瘤，一般在治疗的初始阶段患者能够获得较好的疗效，但在治疗后期，部分患者会复发，这与卵巢癌干细胞之间有着密切的联系。肿瘤干细胞在肿瘤组织中数量稀少，对常规化疗耐药，能够形成新的肿瘤细胞，是导致肿瘤复发的根源之一。近年来，人们针对卵巢癌干细胞的鉴定与分离开展了大量的研究，分析了该类细胞特征性的标志物。目前已被证实的卵巢癌干细胞标志物主要有CD133、乙醛脱氢酶、CD44、CD117、CD24等。本文旨在对这些卵巢癌干细胞的标志物的相关研究及其在卵巢癌的诊断与治疗中的作用进行综述。 关键词：肿瘤干细胞；卵巢癌；标志物； 中图分类号：R737.31 文献标识码：A 文章编号：2095-1264（2013）03-0172-04 d oi ：10.3969/j.issn.2095-1264.2013.041 Advances of Biomarkers of Ovarian Cancer Stem Cells ★ Xiao Yuan, Wu Yi, Ren Huayi, Zeng Yong * (Pharmacy Department of the Tumor Hospital Affiliated to Xiangya School of Medicine, Central South University, Changsha, Hunan, 410013, China) Abstract: Ovarian cancer is a common malignant tumor in the reproductive system of women, for which at the time of initial treatment we can obtain complete clinical remission. However, some will relapse in the later stage of the disease. This phenomenon may be correlated to the cancer stem cell. The cancer stem cell possesses several properties, which includes rare cells, resistance to chemotherapy, ability to arise the daughter cells. It is one of the roots of neoplasm recurrence. In recent years, a huge amount of study has been carried out on the method of isolation and identification of the cancer stem cells, as well as on the markers of such kind of cells. This review will focus on the biomarkers of the ovarian cancer stem cell and their application in the diagnosis and therapy of the disease. Key words: Cancer stem cells; Ovarian cancer; Biomarker 前言 肿瘤干细胞占肿瘤细胞总数的0.01～0.1%，具有无限增殖的潜能，能够通过对称分裂与不对称分裂两种形式进行增殖，形成新的肿瘤干细胞、肿瘤初始细胞、肿瘤初始样干细胞、肿瘤前体细胞等［6-8］。目前的研究认为，肿瘤干细胞可能起源于正常干细胞的基因突变。因此，在肿瘤原发病灶中寻找表达干细胞标志物的肿瘤细胞成为研究肿瘤干细胞的一种途径。卵巢癌与其他肿瘤一样，具有明显的异质性。在肿瘤组织中，存在各种表达不同 标志物的肿瘤细胞，且这些细胞具有不同的增殖、转移能力及对化疗和放疗的敏感性［1-5］。传统观念认为卵巢癌的发生是因为月经导致上皮组织的周期性破坏，并导致肿瘤的发生。近期病理学研究发现，许多卵巢癌发生于输卵管的末梢，甚至可能发生于子宫内膜的损伤处［9-10］。但是，由于卵巢癌的确切起源目前还不足够明确，上述方法具有一定的争议。大部分的卵巢癌肿瘤干细胞表现为对化学治疗以及放射治疗的耐受性，且被认为是卵巢癌复发的根源，但卵巢癌肿瘤干细胞的特异性标志目前
人表皮干细胞的体外分离、培养及鉴定
人表皮干细胞的体外分离、培养及鉴定 何黎顾华 昆明医学院第一附属医院皮肤性病科云南 [摘要] 目的：探索实验条件下人表皮干细胞的体外分离、培养及鉴定。 方法：利用细胞工程方法进行组织分离及细胞培养：通过免疫组化方法，利用角蛋白单克隆抗体对培养的角质形成细胞进行鉴定，并利用表皮干细胞的相对特异标识分子——CK19对其进行检测分析。 结果：表皮自真皮较完整分离，电镜及免疫组化证实培养细胞为角质形成细胞，免疫组化结果显示：CK反应阳性，部分细胞CK19阳性，表明有表皮干细胞存在。 结论：体外分离、培养角质形成细胞成功，且分离得到的角质形成细胞中有表皮干细胞存在。 [关键词]：角质形成细胞表皮干细胞细胞培养角蛋白——19 对于烧伤、急性创伤、某些疾病导致的皮肤缺损，尤其是大面积烧伤一直以自体皮移植作为首选方案，而自体皮肤不足是临床遇到的主要问题。随着细胞培养技术和组织工程的出现，使许多脏器或组织体外重建成为可能。人工皮肤的研制就是一个典型例子。在这一技术中，种子细胞——角质形成细胞的体外培养，以及体外分离到的角质形成细胞中是否有在体外能大量增殖的表皮干细胞决定了能否成功构建人工皮肤。为此本课题采用组织分离方法及细胞培养方法进行角质形成细胞体外分离及培养；通过免疫组化方法，利用人广谱单克隆抗体对培养细胞进行鉴定；并利用CK19对体外培养细胞中是否有表皮干细胞进行检测。 材料和方法 一、材料 1、取材 选择6-26岁健康男性，行包皮环切术切除的包皮。 2、主要培养基及试剂 (1)磷酸盐缓冲溶液（PBS和D-Hank’s液）：（2）培养基：K-SFM（Gibco公司），编号：37010，内含2.5ug表皮细胞生长因子（EGF）和25mg小牛垂体(BPE)：（3）分离酶：dispase（4）胰蛋白酶；（5）抗人广谱角蛋白单克隆抗体；（6）CK19单克隆抗体；（7）SP 超敏免疫组化试剂盒。 二、方法 1、取材
细胞生物学设计性实验：细胞核的分离鉴定
细胞生物学设计性实验：细胞核的分离鉴定 医学细胞生物学设计型实验设计报告 班级10级k-7班 评分 实验项目： 细胞核的分离与鉴定 实验原理：1、细胞内各种结构的比重和大小不同，在同一离心场内其沉降速度也不同。所以，用差速离心法可将细胞内各种细胞器及组分分级分离出来。差速离心法也是用来研究亚细胞成分的化学组成，理化特性及其功能的主要手段。 2、分离细胞核最常用的方法是将组织制成匀浆，在特定的条下进行离心分离，然后分析鉴定。 3、匀浆是指在低温条下，将组织放入匀浆器，加入等渗匀浆介质进行研磨，破碎细胞，使之成为各种细胞器及其包含物的匀浆液。 实验步骤：1、处死：断头处死小白鼠，手提尾部使其学业尽量流出。 2、取材：迅速开腹取肝，在盛有生理盐水的小烧杯中反复洗涤，称取湿重约为1g的肝组织放在烧杯中。 3、匀浆：加油8ml预冷的0.25mol/L蔗糖0.003mol/L绿化高永夜于烧杯中，尽量剪碎肝组织，将剪碎的刚组织倒入玻璃匀
浆器，是匀浆器下端侵入盛有冰块的器皿（如冰盘）。左手握持匀浆器，右手将匀浆捣杆垂直插入管中匀浆，直至看不到明显的组织块。 4、过滤： 用8层纱布（先用少量生理盐水或蔗糖液润湿纱布）过滤匀浆液于离心管中。 5、离心：在天平上平衡每对离心管，2500r/min离心 15min，取上清液于另一离心管中。 6、涂片：取上清液制一张涂片（涂片1）。将原离心管中剩余上清液吹打成沉淀成悬液，另制一张涂片（涂片2），自然干燥。 7、染色：分别在涂片1和2上低价甲苯胺蓝染液 ，染色5到7分钟（即滴染）。 8、洗涤：冲去染液，晾干。 9、镜检：结合实验结果的描述，镜下观察分析。 注意事项：1.操作规范，防止试剂污染。 2.细胞悬液的涂片制作要轻柔。 3.使用离心机要注意平衡，转速从低到高。 预期结果：低倍镜下找到标本，再换高倍镜，可见肝细胞核已游离出来，被染成蓝紫色，圆形，中央有2到4个甚至更多个深蓝色的核仁。 实验用品：材料：小白鼠肝脏。
乌索酸对肿瘤及肿瘤干细胞的作用
中国组织化学与细胞化学杂志 CHINESE JOURNAL OF HISTOCHEMISTRY AND CYTOCHEMISTRY 第28卷第4期2019年8月 V ol .28.No .4August .2019 〔收稿日期〕2019-05-06 〔修回日期〕2019-08-10 〔作者简介〕杨凌，女（1981年），汉族，副研究员 *通讯作者(To whom correspondence should be addressed)：xlsu@https://www.360docs.net/doc/dc9196672.html, 乌索酸对肿瘤及肿瘤干细胞的作用 杨凌，苏秀兰 * （内蒙古医科大学附属医院，临床医学研究中心，呼和浩特010050） 〔摘要〕乌索酸( ursolic acid , UA) 作为植物界广泛存在的五环三萜类化合物，在疾病的预防与治疗中已经展现出许多有益作用，如抗氧化、抗菌、抗炎、抗癌、抗高脂血、镇痛、保肝、护胃、抗溃疡、抗HIV 、抗动脉粥样硬化和免疫调节作用。本文综述了近年来UA 在多种肿瘤，包括消化系统、泌尿和生殖系统、呼吸系统、神经系统、内分泌系统和皮肤系统的肿瘤和肿瘤干细胞中治疗及其作用机理的研究进展。 〔关键词〕乌索酸，肿瘤，治疗，肿瘤干细胞 〔中图分类号〕R730.5 〔文献标识码〕A DOI ：10.16705/ j. cnki. 1004-1850. 2019. 04. 013 The effect of ursolic acid on tumor and tumor stem cells Yang Ling, Su Xiulan * (Clinical Medical Research Center, The Affiliated Hospital of Inner Mongolia Medical University, Hohhot 010050) 〔Abstract 〕Ursolic acid (UA), a pentacyclic triterpenoid widely found in the plant kingdom, has shown many beneficial effects on the prevention and treatment of diseases, such as antioxidant, antibacterial, anti-inflammatory, anti-cancer, anti-hyperlipemia, anal -gesia, liver and stomach protection, anti-ulcer, anti-HIV , anti-atherosclerosis and immune regulation. This review summarizes recent advances in the treatment role of UA and its mechanism in a variety of cancers, including the cancers from digestive system, the urinary and reproductive systems, the respiratory system, the nervous system, the endocrine system, the dermal systems, as well as in the cancer stem cells. 〔Keywords 〕Ursolic acid; cancer; treatment; cancer stem cells 乌索酸（ursolic acid , UA 或3β-hydroxyurs-12-en-28-oic acid ）是在植物界普遍存在的三萜类化合物，可从各种植物如迷迭香、马郁兰、薰衣草、百里香和有机香草等的叶子、水果如苹果果皮、花和浆果中分离提取。近年来，关于UA 的活性和低毒性的研究不断增加，并且受到了广泛的关注。研究表明， UA 通过介导一些药理过程和调节几种信号通路而预防慢性病的发展，它表现出抗炎、抗癌、抗氧化、抗糖尿病、抗肥胖、肝脏保护、神经保护、心脏保护、抗骨骼肌萎缩等作用，多应用在运动补充剂、化妆品和保健品中。最近十年中，很多的研究都致力于从各种水果，植物和草药中分离和纯化这种三萜类化合物，制备更有效的水溶性衍生物，同时通过药理学和分子生物学探讨了UA 在各种疾 病中的临床应用价值。本文分别从呼吸系统、消化系统、泌尿生殖系统、神经系统、内分泌系统和皮肤系统肿瘤和肿瘤干细胞这七个方面对U A 应用于肿瘤治疗的研究进行综述，详细阐述了UA 在肿瘤治疗中的作用及其机制的研究进展。1 乌索酸 UA （图1）是五环三萜类羧酸化合物（C30H48O3）分子量为456.71。其来源多种多样，包括植物的叶、花朵和药用植物的果实如枇杷（eri -obo trya japonica ）、帚石楠（calluna vulgaris ）、迷失香（rosmarinusofficinalis ）和乌墨蒲桃（eugeniajam -bolana ）[1]。根据异戊二烯单元的数量，萜类化合物是一种通过角鲨烯环化合成的天然物质[2]。五环三萜类化合物是含有六个异戊二烯单元的分子，基本分子式为C 30H 48O x ，它们普遍在骨架上有5个环[3]。文献报道五环三萜类化合物具有很多的功能，是研 究的热点。这类化合物可能通过诱导抗炎反应，细胞保护和诱导细胞凋亡对癌症、肥胖症、骨质疏松症、动脉粥样硬化和心血管疾病等相关的慢性疾病产生疗效[4]。
脂肪干细胞的提取及鉴定
一、脂肪干细胞（ASCs）的提取及鉴定 1、实验技术及原理： 运用细胞培养技术、流式细胞术（体外扩增后ACSs的表型会发生改变，主要体现在细胞表面蛋白和细胞因子表达的变化），差异离心术（可将基质血管细胞沉淀与悬浮的成熟脂肪细胞分离，沉淀中除ASCs，还包括血细胞、成纤维细胞和内皮细胞，基质血管细胞沉淀可以接种到孰料培养瓶中，基质细胞可贴壁，造血和其他杂质细胞不贴壁，在随后的传代过程中被出去，最终得到的ASCs可再很长时间内保持摸分化状态）。取C57BL／6 WT小鼠2只，常规麻醉消毒，取腹股沟脂肪组织剪碎至糊状，PBS液冲洗去麻药及血液，0.075%II型胶原酶消化（37℃，30分钟）以去除外基质，生理盐水终止胶原酶的消化，离心（1200g,10分钟），去上清液及未消化的脂肪，10%FBS的DMEM重悬细胞沉淀，0.16mol/L 氯化氨溶解剩余红细胞，离心洗涤，过200目铜网，得到单个核细胞。镜下计数，按10⒋个细胞/ml种植在培养瓶中，37℃5%CO2孵箱培养，24小时后第一次换液，以后3天换液一次，80%融合后0.25% Trypsin,0.02%EDTA消化传代。细胞镜下作形态学观察及取第三代细胞用流式细胞仪作细胞周期及细胞免疫表型 （CD29/CD44）的鉴定。 2、实验用品： 2.1 材料：C57BL／6 WT小鼠 2.2 试剂：PBS液，0.075%II型胶原酶消化，10%FBS，低糖DMEM 2.3 仪器设备：超净工作台、恒温培养箱、普通显微镜、倒置显微镜、离心机、离心管、解剖剪、眼科剪、镊子（尖头、平头和有沟镊）、小烧杯，200目铜网过滤器，低糖DMEM、血球计数板、橡皮瓶塞、酒精灯、换药碗 3、细胞培养的方法与步骤： 3.1无菌操作的要领和要求。 3.2细胞原代培养： 3.2.1操作步骤 a．培养用品消毒后，安放在超净工作台内，紫外线消毒，做好洗手等准备工作。 b. 取材：取C57BL／6 WT小鼠2只，常规麻醉消毒，取腹股沟脂肪组织剪碎至糊状，PBS液冲洗去麻药及血液。 c. 消化：将漂洗后的组织至于平皿中,加入胶原酶（0.075%II型胶原酶, PH），用量（0.1-0.3ug/ml或200U/ml），再用移液管移至烧瓶中，置于37℃水浴或恒温箱中30分钟），每隔5-10min振荡一次。30min后，生理盐水终止胶原酶的消化。 d. 离心和计数：将离心管做好标记，平衡后以（1200g,1200r/min 10分钟），去上清液及未消化的脂肪，10%FBS的DMEM重悬细胞沉淀，0.16mol/L氯化氨溶解剩余红细胞，将收集的细胞悬液经200目铜网过滤，1200r/min 离心10分钟（先后顺序），得到单个核细胞。加入培养液吹打混匀后取样计数。根据计数结果调整细胞浓度为10⒋个细胞/ml。
肿瘤干细胞标志物ALDH1的研究进展
肿瘤干细胞标志物ALDH1的研究进展 摘要：1978年美国召开的人类免疫与肿瘤免疫诊断会上首次提出了肿瘤标志物 概念，之后随着研究深入，其在临床、辅助诊断、疗效评价等方面均发挥了重要 的作用。乙醛脱氢酶1（ALDH1）作为催化细胞中将乙醛氧化为乙酸的主要细胞 溶脂酶，逐渐成为正常与肿瘤干细胞（CSC）主要标志物。为了进一步探讨肿瘤 肝细胞标志物ALDH1的研究进展，本文进行了综述。 关键词：肿瘤肝细胞；标志物；乙醛脱氢酶1；研究进展 随着肿瘤标志物概念提出，以及对其研究逐渐深入，近几年大部分学者已经将乙醛脱氢酶1（ALDH1）作为最为主要的肿瘤干细胞标志物进行研究[1]。ALDH1属于乙醛脱氢酶家族成员之一，主要作用在于催化细胞中的乙醛氧化为乙酸，是一类细胞溶脂酶，可参与各类组织的 分化及基因表达，作用十分广泛。本文就其在肿瘤干细胞标志物中的研究进展进行如下综述。 1 ALDH1概述 人体ALDH1的基因表达场所为细胞质，其中基因克隆与定位主要发生在9q21染色体，构 成碱基对有53×103个，基因启动区则含有ATA盒与CCAAT盒各一个，前者位于转录起始部 位上游32bp处，而后者位于74bp处[2]。经ProtParam进行分析可知，其蛋白质分子质量大 约为54.86kDa，推测总原子数目达到7700多个，而半衰期可达到30小时。此外，其不稳定 系数不足30，可见其蛋白质有一定稳定性，而疏水性平均值约为-0.16，可见其蛋白质亲水性很强。 2 ALDH1作为肿瘤干细胞标志物的研究情况 CSC的鉴定比较复杂，一般需经过实验证明，证明该群细胞有自我更新与多向分化潜能， 而且是一类强致癌性细胞[3]。随着研究深入，ALDH1被认定为乳腺癌、肺癌、胰腺癌等CSC 通用标记物，成为研究热点，尤其是在乳腺癌干细胞标志物研究中最为突出，现总结如下。2.1 乳腺癌干细胞标志物中ALDH1应用情况 乳腺癌作为临床主要肿瘤疾病，研究十分广泛，从近几年实验报告中可知，ALDH1的高表达对乳腺癌发生、进展、转移及预后等均有极大影响。笔者参阅文献与研究后发现，首次利 用ALDH1在乳腺癌实体组织中发现乳腺癌干细胞在2007年，发现者为Ginestier等，他们对577份乳腺癌组织样本实施分组，分为U.M组与I.P.C组2组，均采取免疫组化技术处理，2 组共计标本481份，前者136份，后者345份，均进行ALDH1染色处理，结果显示前者有19%（24/136）表达ALDH1+，而后者则有30%（102/345）表达[4]。之后他们将表达的 ALDH1+乳腺癌细胞进行肿瘤形成实验，显示仅仅采取500个便可形成肿瘤，但采取ALDH1- 细胞实验，即便是50000个也无法形成肿瘤，可见ALDH1+有很强致癌能力。从该研究中不 难看出，乳腺癌干细胞为ALDH1+细胞，而ALDH1自然成为干细胞标志物。近期Morimoto等学者针对203例乳腺癌患者采取免疫组化技术处理，显示乳腺癌生物学侵袭性行为的显型为ALDH1+，并且与PR-、ER-、TOP2A+等呈现正相关，而与患者的年龄、肿瘤大小及是否绝经等无相关性。此外，部分研究显示ALDH1+乳腺癌干细胞与分型也有一定关系，主要与HER2过 表达型、basal-like型有关[5]，而这两种类型在乳腺癌基因亚型中的存活期极短，同时预后效 果也最差，可见对于ALDH1+乳腺癌而言，取得的预后效果极不理想。 2.2 ALDH1+干细胞分离与鉴定 肿瘤干细胞标志物ALDH1的研究关键之一在于ALDH1+干细胞的分离与鉴定，最早的分离 鉴定在1995年，当时Jones等学者设计一种名为DAAA的ALDH1荧光底物，进而采取流式细胞技术对其进行检测，通过DAAA荧光强度可将小鼠体内的HSC分离出来，并将其与成髓细 胞受体结合。这种技术在当时受限于落后的科学，效果并不理想，但利用紫外线照射继发底物，促使细胞基因突变，这个想法是可取的，而且至今也在沿用。DAAA发射光谱后和其他 荧光染料重叠，导致HSC很难继续产生和自身高纯度所需的肝细胞标志物。之后，Storms等 学者总结前述研究的缺点后，设计新型系统检测ALDH1，将维拉帕米对多药耐药基因抑制与 人脐血单核细胞中一个比较特殊的染色体即AldefluorR染色结合，从而获取富含CD34+、Lin- 细胞及其他HSC的细胞亚群[7]。同理，Hess等学者利用两步走，先将Lin-细胞系分离出后，