功能基因组学的研究方法

功能基因组学的研究方法

基因组学（genomics），研究生物基因组和如何利用基因的一门学问。它的研究包括两方面的内容：以全基因组测序为目标的结构基因组学（structural genomics）和以功能鉴定为目标的功能基因组学（functional genomics）。随着测序的完成，功能基因组学成为研究的热门。由于本人的SRT项目是做关于水稻突变方面的，故本文将围绕功能基因组学的研究方法及水稻突变体展开。

功能基因组学，往往又被称为后基因组学（postgenome）。它是利用结构基因组学提供的信息和产物，力图从基因组和系统水平上全面分析基因的功能。目前，大规模、高通量分析基因功能主要借助表达序列标签、cDNA微阵列和DNA 芯片、蛋白质组学、生物信息学以及反向遗传学等方法来实现：

1 表达序列标签(EST)

表达序列标签(Expfessed Sequence Tag，EST)是指从不同组织来源的cDNA 文库中随机挑取克隆,对其进行大规模测序所获得的部分cDNA的5’或3'端序列。一个EST对应于某一种mRNA的cDNA克隆的一段序列，长度一般为300～500bp。建立这些序列的数据库即为EST文库。将测序所得到的ESTs与dbEST等数据库中的数据进行相似性分析,根据核酸或蛋白质序列的同源性比较，即可鉴定出哪些EST代表已知基因，哪些EST代表未知基因,并对所得各基因的EST进行基因表达情况和表达丰度分析。这也是近几年来分离与克隆新基因及基因功能研究的一个行之有效的手段。

2 cDNA微阵列和DNA芯片

cDNA微阵列(cDNA micro-array)和DNA芯片(DNA chip)都是基于Revese Northern杂交以检测基因表达差异的技术。二者的基本原理是利用光导化学合成,照相平板印刷以及固相表面化学合成等技术,在固相支持物上固定成千上万个cDNA、EST或基因特异的寡核苷酸探针，并与放射性同位素或荧光标记的靶DNA进行杂交，然后用相应的检测系统进行检测。根据杂交信号强弱及探针的位置和序列，即可确定靶DNA的表达情况以及突变和多态性的存在。

3 蛋白质组学(Proteomics)

蛋白质组学是以蛋白质组为研究对象,分析细胞内动态变化的蛋白质组成成分、表达水平与修饰状态，了解蛋白质之间的相互作用与联系,在整体水平上研究蛋白质的组成与调控活动规律的一门新兴学科。基因是遗传信息的携带者，而生命活动的执行者却是蛋白质,即基因表达产物。因此对基因功能的研究就离不开对蛋白质功能的研究。随着后基因组学时代的到来，对蛋白质功能的研究必将会从对特定蛋白质的研究上升到对生物体全部蛋白质的表达模式及功能模式的研究，即蛋白质组学的研究。

4 生物信息学（Bioinformatics）

生物信息学是将分子生物学和数学、计算机信息处理技术相结合，用数理和信息科学的观点、理论和方法研究生命现象、组织和分析呈指数增长的生物学数据的一门新兴学科，即以DNA和蛋白质为研究对象，以计算机为主要工具，发展各种软件，对日益增长的海量的DNA和蛋白质的序列结构进行收集、整理、储存、加工、分析和研究，目的是通过这样的分析认识生命的起源、进化、遗传和发育的本质，破译隐藏在DNA序列中的生物信息。它由数据库、计算机网络和应用软件三大部分组成。

5 反向遗传学(Reverse genetics)

传统的遗传学或称为正向遗传学，主要研究自发或诱变突变体中某一突变形状的遗传行为，如控制突变形状的基因的数目及其在染色体上的位置、突变体性状在后代中的传递规律等。而反向遗传学是相对正向遗传学而言的，是在基因功能序列已知的基础上分析基因研究基因功能，一般通过创造功能丧失突变体来研究突变体所造成的表型效应，并推测在生物体内基因的作用。

各种方法各有优缺点，往往结合使用能很好的分析基因组，取得很好的结果。

了解了分析基因组的方法，我们还要有好的材料才能有效地研究水稻。突变体是某个性状发生可遗传变异的材料，或某个基因发生突变的材料。长期以来，水稻育种家尽力地发现和分离有价值的自然突变和变异材料。突变的本质就是DNA序列的改变，包括单个碱基或大的片段发生突变、插入、缺失或结构重排，从而导致遗传信息的改变。突变的目前，水稻突变体的创制常有以下方法：1自发突变

自发突变即在自然环境下发生的遗传信息的变异或突变，但突变率低，一般少于％。水稻的单蘖突变体mocl就属于自发突变。

2 物理、化学诱变

用物理、化学方法可快速获得较广的突变谱及稳定的遗传变异，可导致多位点的变异，比较容易得到饱和突变体库,且具随机突变优点,突变率可达3％左右。

物理方法主要应用辐射产生水稻突变体，电离辐射主要是X射线、y射线、紫外线、α粒子及?粒子、质子及中子等。一般水稻大部分以处理干种子为主，也可处理幼穗分化的植株。化学诱变剂的种类很多，可分为4类：(1)碱基类似物及有关的化合物，5-溴-尿嘧啶、5-溴去氧尿核苷、2-氨基-嘌呤和8-乙氧基咖啡碱；(2)抗生素，重氮丝氨酸、丝裂霉素C和链霉黑素；(3)烷化剂，甲基磺酸乙酯、甲基-N-亚硝基脲烯亚胺、亚硝基乙基尿烷和亚硝基乙基尿；(4)其他种类的诱变剂，亚硝酸和吖啶。

3 插入突变法

插入突变法主要包括T-DNA插入法和转座子法。

T-DNA插入法：T—DNA是来自根癌农杆菌Ti质粒，约20 kb，包含专化冠瘿碱生物合成和冠瘿瘤生长的基因，随机地整合到植物染色体上。自Hiei等(1994)首次报道用农杆菌介导法对水稻成功地实现遗传转化以来，该方法在水稻遗传转化中得到广泛应用并不断完善，并被广泛应用于水稻T—DNA插入突变体库的构建。

转座子法：转座子(transposon)是染色体上一段可移动的DNA片段，它可从染色体的一个位置跳到另一个位置。当转座子跳跃而插入到某个功能基因时，就会引起该基因的失活，并诱导产生突变型，而当转座子再次转座或切离这一位点时，失活基因的功能又可得到恢复。遗传分析可确定某基因的突变是否由转座子引起。用转座子引起的突变的转座子DNA为探针，从突变株的基因组文库中钓出含该转座子的DNA片段，并获得含有部分突变株DNA序列的克隆，进而以该DNA 为探针，筛选野生型的基因组文库，最终得到完整的基因。

不同的研究方法利用了不同的突变机制，突变的本质就是DNA序列的改变，包括单个碱基或大的片段发生突变、插入、缺失或结构重排，从而导致遗传信息的改变。突变的机制主要有以下几种：

1直接作用于DNA模板

亚硝酸和烷化剂等化学诱变剂可直接作用于DNA，改变模板的性质或干扰复制，使错误的碱基插入而产生突变。如最常用的EMS化学诱变所导致的DNA突变。

2 碱基类似物诱变

DNA复制时渗透入并且与互补链上的碱基生成氢键而配对，从而抵抗DNA酶的3’外切核酸酶活性的校对功能,如5一溴一尿嘧啶、5一溴去氧尿核苷、2一氨基一嘌呤、8-乙氧基咖啡碱所导致的DNA突变。

3 移码突变

吖啶橙、原黄素和吖黄素等吖啶类染料分子均含有吖啶稠环。这种三环分子的大小与DNA的碱基对大小差不多，可以嵌合到DNA的碱基对之间，于是原来相邻的两个碱基对分开一定的距离，含有这种染料分子的DNA在复制时，由于某种目前尚不知晓的原因，可以插入一个碱基，偶尔也有两个。这样就出现一个或几个碱基对的插入突变。有时也有很低频率的单碱基缺失突变。所有这些突变，都引起阅读框的改变。

4 转座成分的致突变作用

生物体内含有许多转座成分，它们一般长数百至数千bp，可以通过一种复杂的转座机制将其一个复制拷贝插入到基因组的另一个位点。如果这个位点处于一个基因内部，这种大片段的插入常常造成基因失活。

5 紫外线等的致突变作用

紫外线照射DNA，由于高能粒子的直接作用和自由基的间接作用，引起DNA 分子的各种损伤，嘧啶二聚体是其中一种重要的损伤。这些损伤诱发了错误潜伏的SOS修复系统，从而导致很高的突变率。

我国功能基因组学研究虽然启动时间较短，但也取得了一定的进展，我以后进入实验室应该会更多的接触到相关知识。这次的论文在一定程度上扩充了我的知识面，增长了我的见识，虽然完成它用了不少时间，我觉得还是值得的。