检测蛋白质与蛋白质之间相互作用的实验技术

一、检测蛋白质与蛋白质相互作用

① 技术（）

, ，即荧光共振能量转移技术。该技术的原理是用一种波长的光激发某种荧光蛋白后，它释放的荧光刚好又能激发另一 种荧光蛋白，使其释放另一波长的荧光，如下图所示：

CFP=蓝堀邑荧光蛋白 丫?肥苗色荧光蛋白

以下图为例，若要利用检测两种蛋白是否有相互作用，需将两种蛋白的基因分别与这两种荧光蛋白的基因融合，并在细 胞内表达出两种融合蛋白。然后只需用紫外光对进行激发，并检测是否放出绿色荧光。如果能检测到绿色荧光，那么可以说明

这两种蛋白可能有相互作用；反之，则是这两种蛋白没有相互作用

酵母双杂交系统主要用于考察两种蛋白是否有相互作用，其原理是典型的真核生长转录因子，如 4、4等都含有二个不同的 结构域，即和。这些转录因子只有同时具有这两个结构域时才能起始转录。由此，设计不同的两个载体，一个含有基因（假设 为A 载体），另一个含有基因（假设为 B 载体）。

一般将一个已知蛋白的基因连在 B 载体上，作为诱饵（），将未知蛋白的基因连在 A 载体上，将这两个载体都转到特定的酵 母细胞内，看未知蛋白与已知蛋白是否有相互作用。如果两者有相互作用，那么就可以启动报告基因的转录，从而使这个酵母 细胞能在选择培养基上显现出来或者生存下来；如果两者无相互作用，那么报告基因就无法表达，那么这个酵母细胞就无法在 择培养基上显现出来或者生存下来，如下图所示:

酵母双杂交系统

400-430 nm 470-4SO nm

530 nm

敢岀绿光

（B ）设有蛋白质相互作用

绿色荧光蛋白未被激发?只

检涮到蓝光

② 酵母双、三杂交技术（） （C ）蛋白质相互作用 编色荧光蛋白披激发.检撫到 绿色荧光

由于酵母双杂交系统不能鉴定膜蛋白间的相互作用， 因此又发展出了分离泛素酵母双杂 交系统。该系统的原理如下图所示：

如图所示，将泛素蛋白拆分为两个片段，即

C 端段()和N 端段()，并在C 端段的N 端接上一个16转录因子，此时它并 不能激活基因转录(因为它被限制在了 C 端段上，不能进入细胞核发挥作用)。

将该C 端段连到一个膜蛋白上，将 N 端段连接到另一个膜蛋白上。若两个膜蛋白有相互作用，那么两个膜蛋白在相互靠 近时会使泛素蛋白的N 端段和C 端段靠近结合，形成一个完整的泛素蛋白。此时泛素蛋白酶体会将这一段被泛素标记的片段降 解，那么连接C 端段的16转录因子掉落，即可进入细胞核启动标记基因的表达。

酵母三杂交的原理与双杂交一样，只是它研究的是两个蛋白和第三个成分间的相互作用，通过第三个成分使两个蛋白相 互靠近。第三个成分可以是：蛋白、或小分子，如下图所示：

四丨 ,r ?无转录

如上图所示，在加入第三种成分前，蛋白 X 与蛋白Y 之间并无直接相互作用，因此无法使和靠近，报告基因不能表达；当 加入第三种成分后，蛋白 X 与蛋白Y 的距离被拉近，和靠近，报告基因表达，从而可以被检测到。

③ 技术()

，即蛋白沉降技术，它是建立在蛋白质 亲和层析的基础上的一种检测蛋白质间相互作用的分析方法。亲和层析的原理如下 图所示，无转录 无转录 转录启动

不同蛋白对配体的亲和程度不同，因此可以先将非特异结合的蛋白用低浓度缓冲液给清洗出去，只剩目的蛋白与层析柱结合，然后再用洗脱液将目的蛋白洗脱下来，达到纯化目的蛋白的作用。

技术利用的是亲和层析技术以及特异的配体（如或者镍） 。以下图为例，将的基因与蛋白 X 的基因融合，表达出融合蛋白 将该融合蛋白的溶液过带有配体的层析柱，那么这一融合蛋白就能结合在配体上，然后将待测蛋白的溶液过柱，并让其与融合 蛋白反应一段时间

X 无相互作用，那么在开始清洗的时候就会被洗下来；如果在用洗脱液洗脱后才

是基于 发展而来，其原理如下图所示。将样品蛋白用 非变性的胶 分离，然后转膜、

封闭、洗膜，加入待测蛋白，使其与

已在膜上的样品蛋白进行相互作用。接着加入带有标记（如）的待测蛋白的抗体反应，最后进行显色（如加入的底物）

，观察实 验

结果 高浓度洗脱液

「洗脱液）

?杂蛋白

接着开始进行洗脱。如果待测蛋白与蛋白 能在收集到的样品中发现待测蛋白（以及蛋白

X ），说明待测蛋白与蛋白X 可能有相互作用

加人筠蛋日；［肓吗互作.甲的

螢白

用娥脱菠斡这一扳白复合休 忧

脱下来.弁进行检明

⑤免疫共沉淀（）（）

免疫共沉淀是探测活体细胞内蛋白间的相互作用的一门技术。 它的原理是当细胞在非变

性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质一蛋白质间的相互作用被保留了下来。

如 果用蛋白X 的抗体免疫沉淀 X ，那么与X 在体内有相互作用的蛋白 Y 也能沉淀下来。

的原理如下图所示，首先从细胞中提取蛋白质，获得蛋白提取液，并将其与抗体孵育， 使抗体与蛋白X 结合。将预处理过的 G 琼脂糖珠（）加入到抗体与蛋白提取液的孵育液中 反应，使抗体与 G 结合。通过离心将琼脂糖珠沉降到管底，去除上清液，然后再用缓冲液 将琼脂糖珠冲洗数次，最后用 （或）进行检测。

1、检测蛋白质与相互作用

① （）

的原理如下图所示。将的一个 3'端用32p 标记，然后将分成两份，一份直接用

I 进行不完全酶切；另一份先与待测蛋白 混合反应一段时间，然后再用 I 进行不完全酶切。然后将两份样品用 变性的胶进行电泳，观察电泳结果。下图中，由于待测蛋

2.将电泳后的蛋白进行转膜

3封闭膜（用BSA 或脱脂奶 掰,

然石洗膜

RANE

int

6.将膜与HRP 的底物一起孵

进行显色，获得结

果

Copynqht Visiscience.cDm FAR WESTERN BLOT HRP ：辫根过氧化物酶

5-将膜与目的蛋白的抗体 （含HRF 标记）一同进行 孵肓

4.仙入特测蛋白’让它 与己在膜上的蛋白进 行相互作用

白与结合的部位无法被 I 酶切降解，因此它的电泳结果中与直接用

I 进行处理的样品相比，会缺少一段；如果待测蛋白与无

相互作用，那么这两组的电泳结果应当一致。 ②（）

, ，又称凝胶阻滞实验。其原理是与蛋白质结合的在胶（非变性胶）上比没有结合蛋白的移动速率要慢，因此通过电泳

即可看到的变化，如下图所示。

该方法又成为原位筛选法，用于检测文库中的蛋白与探针之间的相互作用。其原理和实验流程如下图所示，首先是用噬菌

体（）侵染大肠杆菌，然后将这些大肠杆菌涂到平板上。接着进行转膜，将膜泡于水溶液中数小时，然后将该膜放于平板上，

培养数小时（能诱导大肠杆菌表达文库蛋白）。将膜取出，进行变性、复性和封闭（过夜），然后与放射性标记的探针进行反应, 最后洗膜、晾干并用胶片曝光。如果胶片上出现了条带，说明该文库蛋白与探针有相互作用；反之则说明两者无相互作用。

艮卩标记的片段

凝胶电泳观察结果

无蛋白 1D 蛋白

不经变性

因弓蛋白结合,

DMA 的飯储

率下降

未与蚩白齬合加DM