感受态细胞制备及转化步骤

一感受态细胞的制备（材料：DH5α菌）

1.下午三点左右将大肠杆菌接种于培养管中（取冻存的大肠杆菌接种于5ml LB 培养基中或用牙签挑菌培养），以220rpm在摇床上震荡过夜培养。

2.第二天取已经摇好的的菌液50或100ul接种于盛有5mlLB培养基的培养管中，每隔20分钟观察一次（大肠杆菌大约20分钟繁殖一次），2到3个小时后培养基变浑浊，将培养管置于灯光下摇动会出现大肠杆菌的絮状条带，此时培养液的OD600nm≦0.5，细胞数小于10的8次方。

3.将培养好的大肠杆菌倒到1.5ml的eppendorf管中（将菌体混匀后再倒），以10000rpm，离心1min.倒掉上清液后将培养管中的液体混匀后继续倒到eppendorf管中并于冷冻离心机中离心，直至将培养管中的菌液全部离心完毕。

4.倒净上清液后将盛有菌体的eppendorf管置于冰上，加入100ul冰的氯化钙（0.1M）溶液，并将菌体与溶液混合均匀（用手指用力弹），置于冰上静置10min （此时勿忘将氯化钙同样至于冰上保持其冰冷）。

5.将eppendorf管置于冷冻离心机中以8000rpm，离心1min。

6.弃上清后加50ul的氯化钙溶液混合均匀，若有液体溅到eppendorf管壁上可以进行短时离心，此时已制成大肠杆菌的感受态细胞。大肠杆菌至于冰上备用，或于-80?C保存。

二转化（transformation）

1.另取1.5ml的eppendorf管置于冰上（做好相应标记），将含有感受态细胞的菌液混匀后取10ul的感受态细胞加入到eppendorf管中，随后加入1ul的质粒混匀（用手指肚轻弹），至于冰上静置30min。

2.将离心管置于42摄氏度的水浴锅中1到2min，随后迅速置于冰上，并向离心管中加入500ul LB培养基混匀后置于摇床上震荡培养1小时（37摄氏度，220rpm，使菌体恢复正常生长状态）。

3.用移液枪从离心管中取已经摇好的菌液100ul均匀的加入到相应的选择培养基上，用刮刀将菌液均匀的涂布到培养皿上过夜培养。

4．第二天用牙签挑取单个菌落接种到相应的选择培养基上，使其形成携带单克隆质粒的菌落。

5．于下午3点左右挑取少量大肠杆菌接种到5ml含有相应抗生素的LB液体培养基中，于摇床上以220rpm震荡过夜培养（最好不要超过16小时），第二天开始提取质粒。

三提取质粒

操作步骤：

1. 柱平衡步骤：向吸附柱CP3 中（吸附柱放入收集管中）加入500μl 的平衡液BL，12,000 rpm (~13,400×g ) 离心1 分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。（请使用当天处理过的柱子）

2. 取1–5 ml 过夜培养的菌液加入离心管中，12,000 rpm (~13,400×g )离心1 分钟，尽量吸除上清（菌液较多时可以通过几次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中）。

3. 向留有菌体沉淀的离心管中加入250 μl 溶液P1 （请先检查是否已加入RNaseA），使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌细胞沉淀。注意：如果有未彻

底混匀的菌块，会影响裂解，导致提取量和纯度偏低。

4. 向离心管中加入250 μl 溶液P2，温和地上下翻转6–8 次使菌体充分裂解。注意：温和地混合，不要剧烈震荡，以免污染基因组DNA。此时菌液应变得清亮粘稠，所用时间不应超过5 分钟，以免质粒受到破坏。

5. 向离心管中加入350 μl 溶液P3，立即温和地上下翻转6–8 次，充分混匀，此时会出现白色絮状沉淀。12,000 rpm (~13,400×g ) 离心10 分钟，用移液器小心地将上清转移到过滤柱CS（过滤柱放入收集管中），注意尽量不要吸出沉淀。注意：P3 加入后应立即混合，避免产生局部沉淀。如果上清中还有微小白色

沉淀，可再次离心后取上清。

6. 12,000 rpm (~13,400×g )离心2 分钟，小心地将离心后收集管中得到的溶液转移到吸附柱CP3 中（吸附柱放入收集管中），（如果过滤柱中有残余的液体说明步骤4 吸取的上清中杂质过多，可以延长离心的时间；如果离心后收集管底部有少量的沉淀，尽量的吸取上清）。

7. 12,000 rpm (~13,400×g ) 离心30–60 秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3 放入收集管中。

8. 向吸附柱CP3 中加入500 μl 去蛋白液PD，12,000 rpm (~13,400×g )离心30－60 秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3 放入收集管中。

9. 向吸附柱CP3 中加入700 μl 漂洗液PW（请先检查是否已加入无水乙醇），12,000 rpm (~13,400×g ) 离心30–60 秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。

10. 向吸附柱CP3 中加入500 μl 漂洗液PW，12,000 rpm (~13,400×g ) 离心30–60秒，倒掉收集管中的废液。注意：加入漂洗液PW后，如果室温静置2-5分钟，有助于更好地去除杂质。

11. 将吸附柱CP3 放入收集管中，12,000 rpm (~13,400×g ) 离心2 分钟，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除。注意：漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应（酶切、PCR 等）实验。为确保下游实验不受残留乙醇的影响，建议将吸附柱CP3开盖，置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

12. 将吸附柱CP3 置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加

50–100 μl 洗脱缓冲液TB，室温放置2 分钟，12,000 rpm (~13,400×g ) 离心2分钟，将质粒溶液收集到离心管中。注意：为了增加质粒的回收效率，可将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，

重复步骤12。洗脱液的pH 值对于洗脱效率有很大影响。若用水做洗脱液，应保证其pH 值在7.0-8.5 范围内(可以用NaOH 将水的pH 值调到此范围)，pH 值低于7.0会降低洗脱效率。洗脱缓冲液体积不应少于50 μl，体积过小影响回收效率。且DNA产物应保存在-20℃，以防DNA降解。

四琼脂糖凝胶电泳