新鲜冰冻血浆的病毒灭活方法及其应用

新鲜冰冻血浆的病毒灭活方法及其应用

新鲜冰冻血浆（FFP）几乎含有全部凝血因子，主要用于多种凝血因子缺乏伴有严重贫血的患者，也用于大量失血或凝血试验异常而需要施行侵入性操作的患者以预防出血。虽然对FFP供者进行了严格的筛选和实验室病毒检测，但经血传播病毒的危险性仍然存在，原因在于：1）检测方法灵敏度有限；2）“窗口期”问题；3）新病毒的出现；4）目前我国检测病毒的种类仅为HIV 1/2、HBV、HCV；因此，检测结果阴性并不能排除病毒感染的可能。据估计，输用血浆的危险程度为10 000 U可发生75次不良反应，每1 000名患者有3 7起不良反应发生。1项研究在分析了48年来应用未经病毒灭活血浆和经病毒灭活血浆后发生不良反应需要救治的花费，发现应用病毒灭活血浆至少每年为美国节约200万美元，如果考虑非感染性并发症，如输血相关性急性肺损伤（TRALI），可以为英国每年节约5万英镑［1］。目前欧洲各国都已禁止使用未经病毒灭活的血浆，国内应用FFP非常广泛，但病毒灭活尚未普遍进行。目前国内外几种病毒灭活技术正在临床应用，血浆成分及其衍生物主要采用有机溶剂去污剂法（SD）和亚甲兰加可见光法（MBR）,补骨脂素加光照血浆（PLT）已经在欧洲应用。核黄素加光照（PRT）对血浆、红细胞和血小板3种成分中的病毒可能均有灭活作用，但仍处于研发阶段；除SD法外其它灭活剂的作用都是针对病毒核酸的［2］。现就血浆病毒灭活的方法和应用作一简介。

1 SD法

1.1灭活方法SD法由纽约血液中心发明，通常用磷酸3 N丁酯（TNBP）和吐温-80

或胆酸钠，二者协同作用可以溶解和去除病毒的脂包膜而使其灭活。SD法处理血浆是将＜2 500人份的同型、融化的FFP混合与1％TNBP和1％去污剂TritonX 100，在37℃孵育4h，用蔬菜油浸出液萃取之后，用C 18层析柱清除溶剂和去污剂。由此制备的血浆经无菌过滤，200ml分装，再次于-30℃冰冻保存。该法约使血浆稀释10倍，残留的微量TNBP(

1.2优点SD通过破坏脂包膜病毒外膜结构的完整性或靶细胞受体识别位点，使之丧失感染性，故对脂包膜病毒有较好的灭活效果。国外评价了几种病毒灭活方法后都认为，SD法对含脂包膜病毒的灭活效果最好，如HBV、HCV和HIV［3,4］。实验表明SD处理可使黑猩猩感染HBV和HCV的剂量（CID50）分别减少106和l05以上，使组织培养感染HIV的剂量(TCID50)减少106以上。SD法能有效杀灭非典型性肺炎（SARS）冠状病毒，但对非脂包膜病毒如HAV 和B19病毒无灭活作用。研究证实经SD处理后的血浆蛋白质量合格，制备技术简单，有利于大规模生产和临床应用［5］，且不会导致红细胞溶血，不会影响血小板的形态及功能。研究还证实SDP中凝血因子和蛋白抑制因子（PI）在冻溶后4℃保存8h或常温保存6h均较稳定，融化后除了蛋白S（PS）外，所有凝血因子和PI的活性在融化后4℃储存6d至少还有0 5 IU/ml［6］，保持了较高的质量，应用效能和安全性也没有因为PS和纤维蛋白抑制因子活性降低而受到限制。SDP混合后可通过血浆抗体和过敏原的中和作用消除TRALI，也可明显减少过敏反应的发生，并可移除残余的血细胞、细胞碎片和细菌，移除血管性血友病因子（vWF）等大分子物质。从质量角度而言，SDP汇集易于标准化，且易于过程质量控制，同一批中的各种凝血因子、纤维蛋白原(Fg)及总蛋白含量都是相同的，能给出准确含量，易于临床参照使用。1份研究报告显示，2×106U的SDP和11×106U经SD处理的血液制品输用后，尚未见发现病毒传播。因此认为SDP对临床使用有实际意义，适合大多数患者选择应用。

1.3缺点SD法处理血浆后对凝血因子活性影响很大，Doyle等［7］研究发现，经SD处理后，血浆FⅤ、FⅧ和PS分别下降31%、28%和50%；而Heger等［6］研究SDP在冻溶后4℃保存8h或常温保存6h后的凝血因子活性，发现FⅨ、FⅩ、FⅪ、FⅫ、vWF:Ag、Fg和PC

（蛋白C）水平至少平均含有94%，FⅡ、FⅤ、FⅧ和抗凝血酶（AT）水平至少平均含有78%，立刻融化后FⅦ下降到83%，PS下降到43%，与FFP相比有很大差异，且FFP中FⅧ活性下降晚于SDP［8］。虽然经SD处理后血浆中各种凝血因子均有不同程度的下降，但是仍能满足临床的应用要求。从处理工艺上讲，大量混合后血浆原始成分可能发生变化，如大分子在vWF SDP及其制备的冷沉淀中缺失，在某种程度上又增加了感染病毒的危险性，其后还需去除血浆中的稳定剂或有毒的化学物质，技术要求高，投资大，且SD法处理还不能对血浆中的未知病毒灭活。

1.4临床应用SDP已成功地用于治疗DIC和因大量输血引起的凝血因子缺乏的患者，临床适应证同FFP，即主要用于各种凝血因子缺乏的患者和血栓性血小板减少性紫癜的患者，不能用做血浆容量扩充剂和蛋白支持疗法。SDP可代替各种凝血因子制剂，用于心脏手术和各种创伤性失血、烧伤、低蛋白血症、各种失血性休克以及血液置换治疗，对于TTP的治疗效果也很好。SDP副反应非常少，临床表现包括寒战、腹痛、气短等，总反应率为0 6％，发生变态反应比FFP低。有研究对比较了应用SDP和FFP对心脏手术后患者凝血功能紊乱治疗的效果，发现它们均使Fg、FⅧ、AT、PC、游离PS、α1 抗胰蛋白酶和纤溶酶原升高，PT和APTT下降，两者没有明显不同；但应用FFP后PS活性明显增加，PI明显下降，对凝血酶原片段（F1+2），D二聚体（DD）或Fg降解产物（FDP）没有明显影响；两者临床止血效果无明显不同，均无不良反应，提示2种成分对改善止血和纤溶的效果一样，这已经在严重的PS和PI缺陷的患者治疗中得到证实［9］。但是若患者有出血危险，准备外科手术或侵入性操作时，只能补充相应成分缺乏的血液，而不能应用SDP［10］。SDP中的Triton X 100能够改变α2 抗纤维蛋白酶活性，应用时应考虑可能发生纤溶的危险［11］，特别是对有肝病、继发性FⅤ缺陷和先天性或者获得性PS缺陷的患者应小心使用。

2 MBR法

2.1 灭活方法MBR法病毒灭活技术自20世纪90年代初期发展起来，目前主要集中于血浆病毒灭活的研究和临床应用，在欧美等发达国家己开展多年，是一项比较成熟的技术。MB属于吩噻嗪类染料，是一种光敏染料，可高效灭活含脂包膜病毒，包括逆转录病毒、疱疹病毒、囊膜病毒、黄热病毒等。MBR灭活病毒的原理为：不可逆的插入病毒核酸，诱导断裂缺口产生，导致病毒功能和遗传结构基础破坏，从而达到灭活病毒的效果。病毒灭活的效果与MB的浓度和接受光照的强度有关。实验证明极低浓度的MB(0 01μg/ml)与卤素灯光照结合可高效灭活血浆中的模型病毒。1966年，Pohi首次使用MBR血浆病毒灭活的方法，处理程序：首先冻融血浆，冻融后加入MB［(85—120)μg/U］，光源为白色荧光灯。该方法自1993年起在德国、瑞士等国输血中心使用，收到良好的临床效果，目前已在欧洲多数国家正式获准用于FFP的病毒灭活处理。

2.2优点实验表明MBR法几乎可灭活所有的含脂包膜的病毒，如经血传播的HBV、HCV、HIV 和HTLV等均有较好的灭活效果［12］，特别适用于单袋FFP的病毒灭活，但对无包膜病毒没有效果。经MBR处理后的血浆（MBRP）中Fg、FⅦ和FⅨ等的回收率均＞75%，能够满足临床应用要求。MBRP中丙种免疫球蛋白的二级结构没有明显的改变，基本保持完整，大多数血浆蛋白活性未受影响，处理前后血浆抗体活性没有明显改变，vWF多聚体没有明显的改变，ATⅢ、PC和vWF:Ag没有减少，MB移除过滤（MBRF）后没有激活C3a、C5a、F1

＋2和FⅫa［13］。MBR法可以避免血浆大量混合增加传播病毒和其它病原体的危险，对单人份血浆处理方法简单，效果好；而且用MBR法处理不会像SD法那样造成明显的vWF丢失，vWF多态性结构没有改变，但活性有下降。此外，MBR是治疗氰化物和亚硝酸盐中毒的解毒剂，临床使用剂量比血浆消毒的剂量要大数百倍，在毒理学方面对人体是比较安全的。MBR法用于单袋血浆处理，处理后对MB的去除也较为简单，临床使用效果肯定，未见副作用。MBR法具有高效、安全、简便、毒性低等特点，可大大降低因输血造成的病毒传播，

比较适用于我国血站系统。

2.3缺点研究发现采用高浓度MBR和延长光照时间处理血浆后，大多数血浆蛋白都有复杂的改变，包括纤维蛋白γ链、甲状腺激素结合蛋白和载脂蛋白A Ⅰ，因此应用MBR时浓度要严格限制［14］。有研究对MBR处理10份A型血浆后进行评估，凝血因子的损失程度为：Fg 23%，FⅤ10%，FⅧ26%，FⅨ11%和FⅪ13%［13］。而Aznar等［15］研究发现MBP 凝血因子的活性平均丧失25％，其中FⅧ29％，Fg 39％，FⅩⅢ16％，vWF 18％。vWF活性丧失明显低于FⅧ。用MBRP和冷沉淀对血管性血友病和FⅩⅢ和Fg缺乏症患者有一定的影响。MB和红光处理血浆对血浆的聚合凝结有影响，形成结构更为紧密的纤维凝块，但对纤维蛋白形成凝块的稳定性或纤溶没有影响［16］。虽然经MB处理和过滤后血浆FⅧ和F Ⅸ丧失15％，光照进一步导致10％—15％的其它凝血因子丧失，FⅧ和vWF回收率降低，但是不影响冷沉淀的制备［17］。MBR处理后的冷沉淀丧失最多的是FⅧ(23%)，其次是Fg、FⅩⅢ和瑞斯托霉素辅因子活性（vWF：RCo），分别是18%、14%和13%，vWF：Ag的丧失最小，仅3％, 对凝血系统的抑制因子很受有影响。经MBR处理后，Fg浓度有轻微减少，活性却下降31％，纤维蛋白的聚合指数仅有轻微的改变，在MBRF后也没有明显的改变；TT 延长了6s，经MBRF后没有进一步的改变。这种体外的改变类似于纤维蛋白功能失调患者的血浆改变，但通常没有明显的临床症状［18］。

MBR法对非脂包膜病毒，如HAV、B19等无效。另外，由于MBRP中各种凝血因子含量和总蛋白含量非标准化，所以临床使用无准确参考剂量。

2.4临床应用MBRP的适应证同FFP。MBRP及由其制得的冷沉淀均是临床无病毒传播的有效制品，可安全地治疗血管性血友病，FⅩⅢ和Fg缺乏症等。应当指出，MBRP不能用于血浆扩充和蛋白支持疗法。MB 冷上清（经MB处理后的FFP，制备冷沉淀后上清液）可以用于治疗血栓性血小板减少性紫癜，纠正全部或者部分凝血酶原复合物缺陷，特别是FⅤ和FⅪ不足［19］。

3 S 59及光化学处理法

用补骨脂内酯衍生物S 59进行光化学处理血浆(PCT FFP)已经发展成为输血应用中灭活血浆中病原体和白细胞的重要方法。Singh等［20］用150μmol/L S 59加3J/ cm2的长波紫外线照射含病毒模型血浆，发现处理后血浆病毒灭活水平有对数级减少：HIV 1＞6 8/6 4Log、HTLV Ⅰ为4 5Log、HTLV Ⅱ＞5 7Log、HBV和HCV＞4 5Log、SARS为5 5Log、西尼罗病毒为6 8Log；对部分细菌、原虫、螺旋体等也有很强的杀灭作用。Fg 和FⅧ降低到原来水平的72％—73％，FⅡ、FⅤ、FⅦ、FⅨ、FⅩ、FⅪ、FⅩⅢ、PC、PS、AT和α 抗纤维蛋白酶基本不变，说明PCT FFP有广谱灭活病原微生物的作用，并且能够保留充足的凝血因子，可以应用于临床。先天性凝血因子(FⅠ、FⅡ、FⅤ、FⅦ、FⅩ、FⅪ、FⅩⅢ和PC) 缺乏和获得性凝血功能障碍性出血的患者用PCT FFP治疗，效果与FFP一样［21,22］。有研究对S 59加A段紫外光和MB加可见光两种病毒灭活的方法，在3个时间点（处理后立即测定、冷冻储藏30d后和4℃融化后24h）测定了凝血因子活性，结果显示：在PCT FFP和MBRP中FⅡ、FⅫ、FⅩⅢ、vWF:Ag、ADAMTS 13（血管性血友病因子裂解酶）、DD和PC均相等，在PCT FFP中PT、APTT缩短，而在MBRP中TT、Fg、FⅪ和PS 更高，在PCT FFP中FⅤ、FⅦ、FⅧ、FⅩ、vWF和vWF：RCo相等或更高于在MBRP中，在MBRP中的纤溶酶原、AT和血纤维蛋白溶酶抑制物则高于在PCT FFP中。总体上来说，PCT FFP的凝血因子水平和稳定性比MBRP更好［23］。S 59及光化学处理可用于血浆、血小板中病毒，细菌等病原微生物及白细胞的灭活，不利之处是不能用于红细胞制品的灭活，经S 59处理后的血液，需用特殊仪器将其去除。该法目前在欧洲已经开始应用。

4 巴斯德法

国内外已有研究将巴斯德液态加热法(Pasteurization)应用于多种血液制品的病毒灭活。对临床输注用血浆的病毒灭活尚在研究中。巴斯德消毒法血浆是在液体状态下，经60℃加热10h，可灭活脂膜病毒(如HCV、HBV、HIV等)和非脂膜病毒(如HAV、B19等)。其优点为可灭活各种病毒、安全性强，缺点为热处理对蛋白损伤较大，特别是凝血因子活性丢失较多。但血浆中凝血因子FⅧ活性丢失25%，Fg丢失20%，免疫球蛋白丢失在10%以内。处理程序：冰冻血浆被混合后，在30℃下融化，融化的血浆送到无菌容器中并添加稳定剂，二者混合后60℃加热10h，加热后对血浆进行超滤，去除稳定剂并对血浆进行浓缩，除菌分装。

5 核黄素光化学技术

核黄素即维生素B2，是一种多环平面结构的芳香族化合物，它以平面结构插人核酸后，在紫外线A（UA）或可见光的照射下，通过电子转移使核苷酸中鸟嘌呤碱基氧化并形成共价加成化和物，介导核酸骨架链的断裂，达到灭活病毒的目的。研究表明核黄素联合可见光照射灭活血浆病毒技术，具有可靠的安全性［25，26］。有学者将FFP融化后与模型病毒孵育，再加人核黄素，并用UA照射，在照射过程中不断摇匀，将温度控制在30℃左右，结果发现该方法可将血浆中模型病毒灭活，而且对有包膜病毒和无包膜病毒都有效。美国研究人员将其应用于血小板、血浆和红细胞悬液中病毒灭活研究，发现使用核黄素经450 nm可见光照射能灭活混入血液制品中的细胞内及胞外HIV、牛腹泻病毒（BVDV，HCV的模型病毒)、伪狂犬病毒和B19病毒等。虽然处理后的血浆凝血因子活性有所下降，但仍处于正常范围内，能够满足临床应用。目前，核黄素光化学技术主要用于血小板制品，欧洲已经有灭活制品问世。核黄素光化学法与其它病毒灭活方法相比，核黄素来源广泛，价格相对便宜，安全无毒副作用，光源吸收广，且对血液及血液制品活性成分的影响较小，具有较为广阔的发展和应用前景。

6 压力循环技术

压力循环技术是2000年美国报道的1项血浆病毒灭活的最新技术［26］，处理程序为：新鲜血浆用干冰冷冻并放入为压力循环技术设计的压力室，接近0℃、压力100—200 MPa，经流体静力压至大气压，多次循环以达到病毒灭活的效果。灭活的可能机制为在低温和循环压力下，病毒内多种蛋白质亚单位及蛋白 核酸复合物发生解离，造成病毒的死亡。该技术已成功用于食品消毒，对血浆病毒灭活还处于试验阶段。通过应用接近0℃、高压、增加循环次数的方法，使噬菌体浓度在10—20 min内降低近6Log CID50，在血浆蛋白IgG、IgM、FⅩ分别为其初始值的104％、89％、80％的条件下，达到对病毒的灭活效果［27］。

7 去白细胞

用过滤法去除白细胞的效率＞99％，在预防输血反应，如非溶血性发热反应、HLA同种免疫和血小板输注耐受等方面，已取得了十分满意的效果；此外，它对防止输血相关病毒的传染也有显著的效果。血浆中的残留白细胞虽浓度较低，但仍可能引起输血反应，更重要的是可携带如CMV、HTLV 1、HIV等输血相关病毒。研究发现，使用去白细胞滤器可有效地防止输血前血清学阴性骨髓移植患者发生CMV感染，还可有效地去除HIV感染的白细胞［28］。虽然血浆在临床使用前要经过一个冻融过程，但据文献报道白细胞的浓度下降却不到

1 0Log［29］。所以单一依靠的冻融过程不能完全去除其中的白细胞和其可能携带的病毒，而过滤的方法则可以去除血浆中的白细胞＞

2 Log，去除率＞99 4％，因此是一种很好的病毒去除方法。有不少国家的血浆制品都是经过滤白细胞处理后再用其它的物理化学病毒灭活技术进行病毒灭活，而国内过滤白细胞还未普遍开展，病毒灭活也在发展阶段。

8 结语

目前没有一种病毒灭活技术可以对所有类型的病毒进行灭活而不影响血浆的质量。SD 法、MBR法对HIV和HCV亚型实际上没有灭活作用，反倒减少了凝血因子和抑制因子的活性［30］。病毒灭活应根据成分血的具体要求选用恰当的广谱、高效、安全的灭活方法，主张联合使用2种以上原理不同的去除和/或灭活病毒的方法，严格质量管理和灭活方法的确认，以最大限度地提高输血的安全性。血浆除应用病毒灭活技术外，还由于其中存在大量的白细胞，即便经过冷冻和输血前的复溶，白细胞已完全崩解，但白细胞基质仍有可能刺激受者产生相应的HLA抗体，故还宜采用白细胞过滤技术；另外，血浆中还残留有少量红细胞基质，其免疫原性已下降到为原来的1%，但是仍有产生相应不规则抗体的可能。因此，寻求一个理想的病毒灭活方法，如能对广谱病毒及其它病原体灭活，并最大限度保留凝血因子活性和其它血浆蛋白功能的研究尚在探索中。

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