拟南芥MeIAA抗性突变体的筛选和初步图位克隆分析(1)

植物学报Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｂｕｌｌｅｔｉｎ　ｏｆ　Ｂｏｔａｎｙ２００９，　４４　（１）：　５２?５８，　ｗｗｗ．ｃｈｉｎｂｕｌｌｂｏｔａｎｙ．ｃｏｍ

收稿日期：　２００８－０６－２２；　接受日期：　２００８－０６－２６

基金项目：　国家自然科学基金（Ｎｏ．　３０６２５００２和Ｎｏ．　３０６２８０１２）?共同第一作者。＊　通讯作者。Ｅ－ｍａｉｌ：　ｑｕｌｊ＠ｐｋｕ．ｅｄｕ．ｃｎ

．研究论文．

拟南芥　ＭｅＩＡＡ抗性突变体的筛选和初步图位克隆分析

侯仙慧１?，　丁茂予１?，　刘赛男１，　李林川１，　瞿礼嘉１，　２＊

１

北京大学生命科学学院，　北京大学－耶鲁大学植物分子遗传和农业生物技术联合研究中心，　蛋白质工程和植物基因工程国家重点实验

室，　北京１００８７１；　２国家植物基因研究中心（北京），　北京１００１０１

摘要生长素是最重要的植物激素之一，　参与了植物生长发育的各个方面。植物体内游离的ＩＡＡ是生长素的主要活性形式，在ＩＡＡ甲基转移酶１（ＩＡＭＴ１）的作用下，　ＩＡＡ可以转变为ＩＡＡ甲酯　（ＭｅＩＡＡ）。ＭｅＩＡＡ本身没有活性，　在植物体内的ＭｅＩＡＡ酯解酶作用下可以重新转变为ＩＡＡ。　ＭｅＩＡＡ是非极性分子，　能够在植物体内自由扩散。利用ＭｅＩＡＡ的这种特殊性质筛选突变体，　可以分离到ＭｅＩＡＡ代谢途径或者ＩＡＡ途径中新的成分。我们对拟南芥种子进行ＥＭＳ诱变，　通过观察黑暗下下胚轴的生长情况，　筛选ＭｅＩＡＡ的抗性突变体。我们成功分离到了８株可能的抗性突变体，　并对其中的一个Ｍｅｔｈｙｌ－ＩＡＡ　ｒｅｓｉｓｔａｎｔ　１　（ｍｉｒ１）　突变体进行了深入分析。ＭｅＩＡＡ抗性突变体的筛选将为进一步了解ＭｅＩＡＡ的代谢、ＩＡＡ稳态调控和响应机理提供新的材料。

关键词生长素，　图位克隆，　ＭｅＩＡＡ，　抗性突变体

侯仙慧，　丁茂予，　刘赛男，　李林川，　瞿礼嘉　（２００９）．　拟南芥　ＭｅＩＡＡ抗性突变体的筛选和初步图位克隆分析．　植物学报　４４，　５２?５８．

生长素（ａｕｘｉｎ）是由荷兰科学家Ｆ．　Ｗ．　Ｗｅｎｔ通过燕麦胚芽鞘弯曲实验法　（Ａｖｅｎａ　ｃｕｒｖａｔｕｒｅ　ｔｅｓｔ）　首次分离出来的（Ｗｅｎｔ，　１９２６）。随后人们提取并鉴定得到了第１种生长素——吲哚－３－乙酸（ＩＡＡ）。大量的实验表明ＩＡＡ在高等植物中广泛存在，　是植物体内主要的生长素（Ｔｅａｌｅ　ｅｔ　ａｌ．，　２００６）。ＩＡＡ调控植物体内生长发育的许多过程，　如促进侧根形成、维管组织分化、胚胎发育、顶端优势及植物向性反应等（Ｗｏｏｄｗａｒｄ　ａｎｄ　Ｂａｒｔｅｌ，２００５ａ）。　生长素在体内主要通过色氨酸依赖途径进行生物合成，　可以与糖、氨基酸、肽以及醇形成缀合物进行贮存或运输，　也可以通过氧化失去激素活性　（Ｌｊｕｎｇ　ｅｔａｌ．，　２００１）。　生长素是一种极性分子，　是目前发现的唯一需要极性运输的激素，　ＰＩＮ蛋白家族是主要的生长素输出载体，　而ＡＵＸ１蛋白是生长素输入载体，　ＰＩＮ和ＡＵＸ１蛋白在细胞膜上具有不对称分布，　受到囊泡运输的调控（Ｌｅｙｓｅｒ，　２００３；　Ｈｏｂｂｉｅ，　２００６）。　生长素信号转导主要是由ＳＣＦＴＩＲ１介导的蛋白泛素降解途径，　高浓度的ＩＡＡ促进其受体ＴＩＲ１和转录抑制因子ＡＵＸ／ＩＡＡ家族蛋白的

结合而使ＡＵＸ／ＩＡＡ家族蛋白泛素化降解，　从而解除了对转录因子ＡＲＦ家族蛋白的转录抑制，　进而激活或者抑制下游基因的表达　（Ｗｏｏｄｗａｒｄ　ａｎｄ　Ｂａｒｔｅｌ，　２００５ｂ；　Ｔａｎｅｔ　ａｌ．，　２００７）。

本实验室发现拟南芥ＩＡＡ　ｃａｒｂｏｘｙｌ　ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎ－ｓｆｅｒａｓｅ１（ＩＡＭＴ１）基因的一个功能获得性突变体ｉａｍｔ１－Ｄ具有叶片上卷表型　（Ｑｉｎ　ｅｔ　ａｌ．，　２００５）。　当通过ＲＮＡｉ降低ＩＡＭＴ１的表达时，　转基因植株叶片下卷。而且，ＩＡＭＴ１的表达在叶片发育过程中受到严格的时空调控。叶片卷曲程度和ＩＡＭＴ１表达水平相关表明，　生长素的稳态调控对于扁平叶片的形成起重要作用　（Ｑｉｎ　ｅｔ　ａｌ．，２００５）。　在体外，　ＩＡＭＴ１蛋白能够把ＩＡＡ转化为ＩＡＡ甲酯　（ＭｅＩＡＡ）。Ｌｉ等通过研究ａｕｘｉｎ　ｒｅｓｉｓｔａｎｔ　１　（ａｕｘ１）突变体对ＭｅＩＡＡ、ＩＡＡ和ＮＡＡ的不同响应，　发现ＭｅＩＡＡ与其它ＩＡＡ缀合物一样，　也是没有活性的。但是由于ＭｅＩＡＡ是非极性的，　所以其进入细胞同ＮＡＡ一样不需要载体协助　（Ｌｉ　ｅｔ　ａｌ．，　２００８ａ）。ＭｅＩＡＡ的运动性暗示它与ＩＡＡ糖、氨基酸缀合物不同，　不是作为贮存或者降

５３侯仙慧等：　拟南芥　ＭｅＩＡＡ抗性突变体的筛选和初步图位克隆分析

解的形式，　而是通过微调ＩＡＡ的分布，　从而影响植物发育过程，　如叶片的形态等　（Ｌｉ　ｅｔ　ａｌ．，　２００８ａ）。Ｙａｎｇ等研究表明ＭｅＩＡＡ进入细胞后，　通过细胞内的一个或几个可能的酯解酶酯解后重新转变为ＩＡＡ起作用（Ｙａｎｇ　ｅｔａｌ．，　２００８）。他们鉴定了拟南芥ＡｔＭＥＳ１７基因，　其编码一个ＭｅＩＡＡ酯解酶，　在体外该蛋白能够将ＭｅＩＡＡ转变为ＩＡＡ。ＡｔＭＥＳ１７的缺失突变体表现出对ＭｅＩＡＡ的显著抗性，　而过量表达ＡｔＭＥＳ１７的转基因植株则对ＭｅＩＡＡ具有更强的敏感性，　同时这两种株系对ＩＡＡ的响应正常　（Ｙａｎｇ　ｅｔ　ａｌ．，　２００８）。

利用激素突变体来研究激素代谢及其分子机制已有不少成功的范例，　突变体分析不仅可以对某一复杂生物学过程提出合理的假设，　而且可更进一步精确找出研究生理和发育问题的新方法。由于在黑暗下ＭｅＩＡＡ比ＩＡＡ具有更强的下胚轴抑制能力，　利用ＭｅＩＡＡ筛选生长素抗性突变体将更加简单易行。本实验通过筛选经ＥＭＳ诱变产生的拟南芥突变体种子，　外源施加一定浓度的ＭｅＩＡＡ，　在黑暗下观察下胚轴生长，　筛选对ＭｅＩＡＡ具有抗性的突变体，　并做进一步的遗传和基因定位分析，　为深入了解ＩＡＡ的甲基化过程在ＩＡＡ信号转导和稳态调控中的作用提供新的方法。

１材料与方法

１．１植物材料和培养条件

本研究中所用的拟南芥（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ）除用于图位克隆的为Ｌａｎｄｓｂｅｒｇ　（Ｌｅｒ）　野生型外，　其余的都为Ｃｏ－ｌｕｍｂｉａ　（Ｃｏｌ－０）　背景。处理方法和培养条件见Ｌｉ等论文　（Ｌｉ　ｅｔ　ａｌ．，　２００８ｂ）。

１．２ＥＭＳ诱变

将２．５　ｇ拟南芥种子均分在２个５０　ｍＬ的Ｆａｌｃｏｎ试管中，　加入４０　ｍＬ去离子水室温过夜。向每个试管中加入１２０　μＬ　ＥＭＳ　（Ｓｉｇｍａ），　使ＥＭＳ终浓度为０．３％。在通风橱内翻转摇匀１５个小时。再用４０　ｍＬ去离子水漂洗种子６次以上，　最后将种子用０．１％　琼脂均匀悬浮，　铺在约２０个培养箱中。单箱收获得到Ｍ２代种子，　编号，室温保存。

１．３ＭｅＩＡＡ抗性突变体的筛选

将表面消毒后的种子点播在含有２．５　μｍｏｌ

．Ｌ－１　ＭｅＩＡＡ（Ｓｉｇｍａ）的ＭＳ培养基上，　用锡箔纸包裹避光。４°C春化２天，　然后放入２２°C培养箱中培养４天，　挑取下胚轴长度远远超过平均值的小苗（图１），　转移到ＭＳ培养基上，恢复培养５天，　再转移到土中。一个月后单收种子，　在ＭｅＩＡＡ培养基上鉴定该抗性是否可以遗传。

１．４突变体温度转移实验

将种子表面消毒后，　铺在ＭＳ培养基上，　４°C春化２天，然后转到２２°C，　水平萌发３天。转移大约２０棵小苗到新的ＭＳ平板上，　共转移２块。将其中一块仍然放在２２°C条件下，　另一块转至２９°C，　垂直培养３天。比较２个生长条件下的植株下胚轴长度，　并统计。

１．５图位克隆

图位克隆（ｍａｐ－ｂａｓｅｄ　ｃｌｏｎｉｎｇ）参考Ｌｕｋｏｗｉｔｚ　等（２０００）描述的方法。实验中所用Ｍａｒｋｅｒ均来自拟南芥网站（ｗｗｗ．ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ．ｏｒｇ）。

２结果与分析

２．１ＭｅＩＡＡ抗性突变体筛选条件的确定

在进行大规模突变体筛选之前，　我们首先比较了ＩＡＡ和ＭｅＩＡＡ对黑暗下生长的拟南芥幼苗的下胚轴抑制程度。在０．１－２５　μｍｏｌ

．Ｌ－１浓度范围内，　随着激素浓度的升高，ＩＡＡ和ＭｅＩＡＡ对下胚轴的抑制程度都增强，　但是ＭｅＩＡＡ的抑制能力更强，　两者在２．５－１０　μｍｏｌ

．Ｌ－１范围内差异最为显著（图１Ａ）。在２．５　μｍｏｌ

．Ｌ－１　ＭｅＩＡＡ浓度下，　拟南芥幼苗下胚轴长约为ＭＳ培养基上的１０％。在大于２．５　μｍｏｌ

．Ｌ－１的浓度下，　ＭｅＩＡＡ对下胚轴的抑制程度随浓度变化很小（图１Ａ）。综合上述两种现象，　我们选取２．５　μｍｏｌ

．Ｌ－１的ＭｅＩＡＡ处理经ＥＭＳ诱变的Ｍ１代种子进行筛选。

野生型幼苗在２．５　μｍｏｌ

．Ｌ－１　ＭｅＩＡＡ培养基上暗培

54植物学报４４（１）２００９

养３天后，　下胚轴和主根生长几乎完全被抑制，　顶端钩消失（图１Ｂ）。将下胚轴长至少为野生型２倍以上的幼苗定义为候选ＭｅＩＡＡ抗性突变体（ｃａｎｄｉｄａｔｅ　ＭｅＩＡＡ　ｒｅ－ｓｉｓｔａｎｔ　ｍｕｔａｎｔｓ）。通过这种方法，　总共得到了约１５０个候选突变体单株。然后将候选突变体转移到培养箱中，　单株收种子后，　重新在２．５　μｍｏｌ．Ｌ－１　ＭｅＩＡＡ培养基上暗处理３天，　验证其对ＭｅＩＡＡ抗性表型是否可以遗传。最终共得到８株ＭｅＩＡＡ抗性突变体，　其中ｍｉｒ１、ｍｉｒ２、ｍｉｒ３和ｍｉｒ４如图１Ｂ所示。ｍｉｒ１、ｍｉｒ２和ｍｉｒ３的下胚轴和主根对ＭｅＩＡＡ具有很强的抗性，　而ｍｉｒ４仅在下胚轴对ＭｅＩＡＡ具有中度抗性（图１Ｂ）。２．２

部分ＭｅＩＡＡ抗性突变体对ＩＡＡ也具有抗性

由于ＭｅＩＡＡ是ＩＡＡ的非活性形式，　需要在体内的酯解酶作用下重新转变为ＩＡＡ起作用　（Ｌｉ　ｅｔ　ａｌ．，　２００８ａ；　Ｙａｎｇｅｔ　ａｌ．，　２００８）。那么，　ＭｅＩＡＡ抗性突变体绝大部分都应表现出对ＩＡＡ的抗性。和预期相一致，　ｍｉｒ１、ｍｉｒ２和ｍｉｒ３等在光下对ＩＡＡ也表现出了一定程度的抗性

（图２Ａ）。有趣的是，　ｍｉｒ４在光下并没有显示出对ＩＡＡ的抗性（数据未显示），　推测它与ｍｉｒ１、ｍｉｒ２及ｍｉｒ３等具有不同的抗性机制。

拟南芥幼苗从正常温度（２２°C ）转移到高温下（２９°C ）生长时，　下胚轴会比正常条件下显著伸长　（Ｇｒａｙ　ｅｔ　ａｌ．，１９９８）。进一步研究发现该现象主要是由于下胚轴中生长素的含量提高造成的，　而且该现象是生长素特异的反应。当突变体生长素稳态调控或信号通路出现缺陷时，其下胚轴不能伸长　（Ｇｒａｙ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９８）。　将野生型拟南芥和ＭｅＩＡＡ抗性突变体同时在２２°C 和２９°C 下培养，　在２９°C 下，　ＷＴ的下胚轴长度是２２°C 下的２倍左右，　而ｍｉｒ１、ｍｉｒ２和ｍｉｒ３的下胚轴没有明显的伸长（图２Ｂ），　暗示其体内生长素途径出现缺陷。然而，　ｍｉｒ４的下胚轴能够正常响应高温变化，　进一步暗示其抗性机制和其它突变体不同。２．３

ｍｉｒ１突变体的表型和遗传学分析

挑取ｍｉｒ１突变体作进一步表型分析。在２．５　μｍｏｌ．Ｌ－１

图１ＭｅＩＡＡ抗性突变体的获得

（Ａ）　黑暗下ＩＡＡ和ＭｅＩＡＡ对拟南芥幼苗下胚轴抑制曲线；　（Ｂ）　ＭｅＩＡＡ抗性突变体Ｆｉｇｕｒｅ　１Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃａｎｄｉｄａｔｅ　ＭｅＩＡＡ　ｒｅｓｉｓｔａｎｔ　ｍｕｔａｎｔｓ

（Ａ）　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　ｃｕｒｖａｔｕｒｅ　ｏｆ　ｈｙｐｏｃｏｔｙｌｓ　ｂｙ　ＩＡＡ　ａｎｄ　ＭｅＩＡＡ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｄａｒｋ；　（Ｂ）　ＭｅＩＡＡ　ｒｅｓｉｓｔａｎｔ　ｍｕｔａｎｔｓ，　ｍｉｒ１，　ｍｉｒ２，　ｍｉｒ３　ａｎｄ　

ｍｉｒ４

５５

侯仙慧等：　拟南芥　ＭｅＩＡＡ抗性突变体的筛选和初步图位克隆分析

图２ＭｅＩＡＡ抗性突变体生长素相关表型分析

（Ａ）　ＭｅＩＡＡ抗性突变体同样具有对ＩＡＡ的抗性；　（Ｂ）　ＭｅＩＡＡ突变体下胚轴在不同温度下的伸长情况

Ｆｉｇｕｒｅ　２Ａｕｘｉｎ　ｒｅｌａｔｅｄ　ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ　ｏｆ　ＭｅＩＡＡ　ｒｅｓｉｓｔａｎｔ　ｍｕｔａｎｔｓ

（Ａ）　ＭｅＩＡＡ　ｒｅｓｉｓｔａｎｔ　ｍｕｔａｎｔｓ　ａｌｓｏ　ｓｈｏｗ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　ｔｏ　ＩＡＡ；　（Ｂ）　Ｈｙｐｏｃｏｔｙｌ　ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＭｅＩＡＡ　ｒｅｓｉｓｔａｎｔ　ｍｕｔａｎｔｓ　ａｔ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｓ

ＭｅＩＡＡ培养基上黑暗下处理３天后，　ｍｉｒ１突变体的下胚轴和主根表现出显著的抗性（图３Ａ）。有趣的是，　ｍｉｒ１突变体在ＭＳ培养基上黑暗下培养３天后，　下胚轴比野生型短，　顶端钩消失（图３Ｂ）。在光下，　ｍｉｒ１突变体的子叶稍微上卷（图３Ｃ），　侧根数目显著少于野生型（图３Ｄ）。ｍｉｒ１突变体成株表现出叶柄短，　叶片上卷（图３Ｅ），　而且植株矮化，　分枝数多于野生型，　但花和角果正常（图３Ｆ）。

为了研究ｍｉｒ１突变的分子本质，　我们对ｍｉｒ１突变体进行了深入的遗传学分析。首先将ｍｉｒ１和Ｃｏｌ－０进行回交，　Ｆ１代幼苗在ＭｅＩＡＡ培养基上出现了抗性和感性的分离，　而且分离比例约为１：１　（表１），　暗示该突变是由一个显性单基因控制的。同样的结果也出现在ｍｉｒ１和Ｌｅｒ杂交的Ｆ１代中（表１）。单收ｍｉｒ１和Ｌｅｒ杂交的Ｆ１代种子，　点播后观察Ｆ２代的分离比，　发现抗性和感性植株的分离比约为３：１（表１），　进一步暗示ｍｉｒ１突变是由显性单基因突变所致。２．４ｍｉｒ１突变体的初步图位克隆

我们利用图位克隆方法对ｍｉｒ１突变进行基因定位。提取突变体和Ｌｅｒ杂交Ｆ２代中的野生型表型苗的ＤＮＡ，　利用ＴＡＩＲ网站上的引物（ｍａｒｋｅｒ）信息，　进行初定位（ｆｉｒｓｔ－ｐａｓｓ　ｃｌｏｎｉｎｇ）。经过初定位，　发现ｍｉｒ１突变与第１条染色体上端Ｍａｒｋｅｒ　ｎｇａ６３具有明显连锁，　重组率约为１５％；　在ｎｇａ６３两端分别设计引物进一步定位，　发现突变位点可能处于更靠近染色体顶端的２个ＭａｒｋｅｒＮＦ２１Ｂ７和ＮＴ１Ｇ１１之间。这一位置具有已知的４个

表１ｍｉｒ１突变体遗传学分析

Ｔａｂｌｅ　１Ｇｅｎｅｔｉｃ　ｓｅｇｒｅｇａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＭｅＩＡＡ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　ｉｎ　ｍｉｒ１

Ｎｏ．　ｏｆ　ｐｌａｎｔｓ

ＣｒｏｓｓＲｅｓｉｓｔａｎｔＳｅｎｓｉｔｉｖｅＴｏｔａｌＸ２０．９５

ｍｉｒ１ × Ｃｏｌ－０　（Ｆ１）２２２６４８－

ｍｉｒ１ × Ｌｅｒ　（Ｆ１）３２３０６２－

ｍｉｒ１ × Ｌｅｒ　（Ｆ２）２７８９８３７６

０．２３　（３：１）

56植物学报４４（１）２００９

图３ｍｉｒ１表型分析

（Ａ）　黑暗下在含有２．５　μｍｏｌ．Ｌ－１ＭｅＩＡＡ的培养基上生长３天的野生型和ｍｉｒ１的表型；

（Ｂ）　黑暗下在ＭＳ培养基上生长３天的野生型和ｍｉｒ１的表型；（Ｃ）　光下在ＭＳ培养基上生长７天的野生型和ｍｉｒ１的表型；（Ｄ）　２周大小的野生型和ｍｉｒ１的侧根表型；（Ｅ）　４周大小的野生型和ｍｉｒ１的叶片表型；（Ｆ）　６周大小的野生型和ｍｉｒ１的整体植株表型Ｂａｒ　＝　５　ｍｍ

Ｆｉｇｕｒｅ　３Ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ　ｏｆ　ｍｉｒ１

（Ａ）　ＷＴ　ａｎｄ　ｍｉｒ１　ｇｒｅｗ　ｏｎ　２．５　μｍｏｌ．Ｌ－１　ＭｅＩＡＡ　ｆｏｒ　３　ｄ　ｉｎ　ｔｈｅｄａｒｋ；

（Ｂ）　ＷＴ　ａｎｄ　ｍｉｒ１　ｇｒｅｗ　ｏｎ　ＭＳ　ｆｏｒ　３　ｄ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｄａｒｋ；（Ｃ）　ＷＴ　ａｎｄ　ｍｉｒ１　ｇｒｅｗ　ｏｎ　ＭＳ　ｆｏｒ　７　ｄ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｌｉｇｈｔ；

（Ｄ）　Ｌａｔｅｒａｌ　ｒｏｏｔ　ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ　ｏｆ　ＷＴ　ａｎｄ　ｍｉｒ１　ｏｆ　ｔｗｏ　ｗｅｅｋｓ　ｏｌｄ；（Ｅ）　Ｌｅａｆ　ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ　ｏｆ　ＷＴ　ａｎｄ　ｍｉｒ１　ｏｆ　ｆｏｕｒ　ｗｅｅｋｓ　ｏｌｄ；（Ｆ）　Ｗｈｏｌｅ　ｐｌａｎｔ　ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ　ｏｆ　ＷＴ　ａｎｄ　ｍｉｒ１　ｏｆ　ｓｉｘ　ｗｅｅｋｓ　ｏｌｄＢａｒ　＝　５　ｍｍ

图４ｍｉｒ１在第１条染色体上端的初定位信息

图中由上至下依次标明所用Ｍａｒｋｅｒ的名称，　染色体序号，　各Ｍａｒｋｅｒ距该染色体最上端的物理距离，　各Ｍａｒｋｅｒ对应位置发生重组的植株数目及相应所检测染色体的数目，　最下方线段表示推测的突变位点所在位置。Ｆｉｇｕｒｅ　４Ｐｒｉｍａｒｙ　ｍａｐｐｉｎｇ　ｆｏｒ　ｍｉｒ１　ｏｎ　Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ　Ｉ

Ｔｈｅ　ｓｕｐｐｏｓｅｄ　ｍａｐｐｉｎｇ　ｐｏｓｉｔｉｏｎ　ｏｆ　ｍｉｒ１

　ｉｓ　ｂａｓｅｄ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　Ｎｏ．　ｏｆ　ｅａｃｈ　ｍａｒｋｅｒ　ｏｎ　ｔｈｅ　Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ　Ｉ．

５７侯仙慧等：　拟南芥　ＭｅＩＡＡ抗性突变体的筛选和初步图位克隆分析

Ａｕｘ／ＩＡＡ基因，　分别是ＩＡＡ３、ＩＡＡ１０、ＩＡＡ１２和ＩＡＡ１７。我们将通过进一步精细定位和测序确定突变位点。

３讨论

对于大规模的筛选工作，　筛选方法是突变体筛选成败的关键。越是专一的筛选条件，　就越有机会直接获得所期待的突变体。常用的方法有正筛选和负筛选。正筛选是设计一定的培养基或培养条件，　使得野生型不可以生长但突变体能生长；　而负筛选是野生型可以生长但突变体不能生长。正筛选通常得到的是抗性突变体，　而负筛选通常得到超敏感突变体。本研究中我们通过正筛选方法成功得到了ＭｅＩＡＡ抗性突变体。该方法的２个关键点是ＭｅＩＡＡ的浓度和筛选指标的确定。通过绘制ＭｅＩＡＡ和ＩＡＡ黑暗下对野生型幼苗下胚轴的抑制曲线，我们确定了２．５　μｍｏｌ

．Ｌ－１是ＭｅＩＡＡ和ＩＡＡ在区分度和对下胚轴的抑制程度上最佳的选择浓度。下胚轴长短这一筛选指标，　简单易行，　为我们大规模筛选突变体带来很大方便，　能够满足饱和筛选的条件。

ＭｅＩＡＡ是在　ＩＡＡ羧甲基转移酶１　（ＩＡＭＴ１）的作用下由ＩＡＡ甲酯化生成（Ｑｉｎ　ｅｔ　ａｌ．，　２００５），　是非极性的ＩＡＡ缀合物，　能够在体内自由扩散。同时，　ＭｅＩＡＡ是一种非活性的ＩＡＡ形式，　需要通过体内１个或多个ＭｅＩＡＡ酯解酶的作用重新转变为ＩＡＡ　（Ｙａｎｇ　ｅｔ　ａｌ．，　２００８）。这两个性质导致ＭｅＩＡＡ具有不同于ＩＡＡ以及ＩＡＡ的其它缀合物的化学特性（Ｌｉ　ｅｔ　ａｌ．，　２００８ａ），所以用ＭｅＩＡＡ来筛选抗性突变体具有比ＩＡＡ更大的优势。首先，　ＭｅＩＡＡ可以自由扩散，　所以筛选中能够排除部分生长素极性运输的影响，　得到的突变体可能仅与生长素的信号相关。另一方面，　在黑暗下，　ＭｅＩＡＡ对下胚轴的抑制程度强于ＩＡＡ，　在ＩＡＡ筛选中的弱抗性突变体可能在ＭｅＩＡＡ上表型更加明显，　所以通过ＭｅＩＡＡ筛选能够得到原来很难分离到的生长素信号突变体。此外，　ＭｅＩＡＡ代谢相关基因的突变也有可能通过这种方法得到。

在分离到的８个突变体中，　ｍｉｒ１、ｍｉｒ２和ｍｉｒ３对ＭｅＩＡＡ和ＩＡＡ都表现出抗性，　暗示这３个突变体应该是普通的生长素抗性突变体。ｍｉｒ１突变体具有明显的生长素相关发育缺陷，　如顶端钩消失、侧根少、叶片上卷表型。图位克隆分析表明，　ｍｉｒ１突变定位在第１条染色体上端的ＮＴ１Ｇ１１　Ｍａｒｋｅｒ附近。而在这个Ｍａｒｋｅｒ附近集中了ＩＡＡ３、ＩＡＡ１０、ＩＡＡ１２和ＩＡＡ１７　４个典型的Ａｕｘ／ＩＡＡ基因　（Ｌｅｙｓｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９６；　Ｔｉａｎ　ａｎｄ　Ｒｅｅｄ，１９９９；　Ｈａｍａｎｎ　ｅｔ　ａｌ．，　２００２）。　根据ｍｉｒ１的叶片表型和这些基因的已有报道相比较，　推测ｍｉｒ１可能是ＩＡＡ３的突变。进一步的测序和遗传学鉴定工作正在进行中。而ｍｉｒ４突变体具有对ＭｅＩＡＡ特异抗性，　而且这种抗性只特异地出现在下胚轴，　暗示该突变可能是ＭｅＩＡＡ特异突变，　为我们揭示ＭｅＩＡＡ代谢和活性调控提供了良好的材料。

参考文献

Ｇｒａｙ　ＷＭ，　Ｏｓｔｉｎ　Ａ，　Ｓａｎｄｂｅｒｇ　Ｇ，　Ｒｏｍａｎｏ　ＣＰ，　Ｅｓｔｅｌｌｅ　Ｍ　（１９９８）．Ｈｉｇｈ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ　ｐｒｏｍｏｔｅｓ　ａｕｘｉｎ－ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｈｙｐｏｃｏｔｙｌ　ｅｌｏｎｇａ－ｔｉｏｎ　ｉｎ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ．　Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ　９５，　７１９７－７２０２．Ｈａｍａｎｎ　Ｔ，　Ｂｅｎｋｏｖａ　Ｅ，　Ｂａｕｒｌｅ　Ｉ，　Ｋｉｅｎｔｚ　Ｍ，　Ｊｕｒｇｅｎｓ　Ｇ　（２００２）．Ｔｈｅ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ＢＯＤＥＮＬＯＳ　ｇｅｎｅ　ｅｎｃｏｄｅｓ　ａｎ　ａｕｘｉｎ　ｒｅ－ｓｐｏｎｓｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ　ＭＯＮＯＰＴＥＲＯＳ－ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｅｍｂｒｙｏｐａｔｔｅｒｎｉｎｇ．　Ｇｅｎｅｓ　Ｄｅｖ　１６，　１６１０－１６１５．

Ｈｏｂｂｉｅ　ＬＪ　（２００６）．　Ａｕｘｉｎ　ａｎｄ　ｃｅｌｌ　ｐｏｌａｒｉｔｙ：　ｔｈｅ　ｅｍｅｒｇｅｎｃｅ　ｏｆＡＸＲ４．　Ｔｒｅｎｄｓ　Ｐｌａｎｔ　Ｓｃｉ　１１，　５１７－５１８．

Ｌｅｙｓｅｒ　ＨＭ，　Ｐｉｃｋｅｔｔ　ＦＢ，　Ｄｈａｒｍａｓｉｒｉ　Ｓ，　Ｅｓｔｅｌｌｅ　Ｍ　（１９９６）．　Ｍｕ－ｔａｔｉｏｎｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ＡＸＲ３　ｇｅｎｅ　ｏｆ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｒｅｓｕｌｔ　ｉｎ　ａｌｔｅｒｅｄ　ａｕｘｉｎｒｅｓｐｏｎｓｅ　ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ　ｅｃｔｏｐｉｃ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　ＳＡＵＲ－ＡＣ１ｐｒｏｍｏｔｅｒ．　Ｐｌａｎｔ　Ｊ　１０，　４０３－４１３．

Ｌｅｙｓｅｒ　Ｏ　（２００３）．　Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｓｈｏｏｔ　ｂｒａｎｃｈｉｎｇ　ｂｙ　ａｕｘｉｎ．　ＴｒｅｎｄｓＰｌａｎｔ　Ｓｃｉ　８，　５４１－５４５．

Ｌｉ　Ｌ，　Ｈｏｕ　Ｘ，　Ｔｓｕｇｅ　Ｔ，　Ｄｉｎｇ　Ｍ，　Ａｏｙａｍａ　Ｔ，　Ｏｋａ　Ａ，　Ｇｕ　Ｈ，　ＺｈａｏＹ，　Ｑｕ　ＬＪ　（２００８ａ）．　Ｔｈｅ　ｐｏｓｓｉｂｌｅ　ａｃｔｉｏｎ　ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ　ｏｆ　ｉｎｄｏｌｅ－３－ａｃｅｔｉｃ　ａｃｉｄ　ｍｅｔｈｙｌ　ｅｓｔｅｒ　ｉｎ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ．　Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　Ｒｅｐ　２７，５７５－５８４．

Ｌｉ　ＬＣ，　Ｑｉｎ　ＧＪ，　Ｔｓｕｇｅ　Ｔ，　Ｈｏｕ　ＸＨ，　Ｄｉｎｇ　ＭＹ，　Ａｏｙａｍａ　Ｔ，　Ｏｋａ　Ａ，Ｃｈｅｎ　Ｚ，　Ｇｕ　Ｈ，　Ｚｈａｏ　Ｙ，　Ｑｕ　ＬＪ　（２００８ｂ）．　ＳＰＯＲＯＣＹＴＥＬＥＳＳｍｏｄｕｌａｔｅｓ　ＹＵＣＣＡ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｔｏ　ｒｅｇｕｌａｔｅ　ｔｈｅ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｏｆｌａｔｅｒａｌ　ｏｒｇａｎｓ　ｉｎ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ．　Ｎｅｗ　Ｐｈｙｔｏｌ（ｉｎ　ｐｒｅｓｓ）

Ｌｊｕｎｇ　Ｋ，　Ｂｈａｌｅｒａｏ　ＲＰ，　Ｓａｎｄｂｅｒｇ　Ｇ　（２００１）．　Ｓｉｔｅｓ　ａｎｄ　ｈｏｍｅｏ－ｓｔａｔｉｃ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｏｆ　ａｕｘｉｎ　ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｉｎ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｄｕｒｉｎｇ　ｖｅｇ－

58植物学报４４（１）２００９

Isolation and Positional Cloning of Methyl-Indole-3-Acetic

Acid Resistant Mutants in Arabidopsis

Xianhui Hou 1?, Maoyu Ding 1?, Sainan Liu 1, Linchuan Li 1, Lijia Qu 1, 2*

National Laboratory for Protein Engineering and Plant Genetic Engineering, Peking-Yale Joint Research Center for Plant Molecu-lar Genetics and AgroBiotechnology, College of Life Sciences, Peking University, Beijing 100871, China; 2The National Plant

Gene Research Center (Beijing), Beijing 100101, China

Abstract Auxin is one of the most important plant hormones in that it regulates almost all aspects of plant growth and development. In plants, free indole-3-acetic acid (IAA) is the major active auxin and can be converted to methyl-IAA (MeIAA) with the activity of an IAA carboxyl methyltransferase 1 (IAMT1). However, MeIAA is also an inactive form of IAA and can be converted to IAA catalyzed by several esterases. MeIAA is a non-polar IAA form and can diffuse between cells, so MeIAA is suitable for screening new components in MeIAA metabolism or IAA biology. Here, we screened ethyl-methane-sulphonate (EMS)-mutagensis seedlings on MeIAA medium in the dark, with longer hypocotyls used as a criterion. We isolated 8 putative MeIAA-resistant mutants and carried out further experiments on one mutant, mir1. These new mutants will help shed light on MeIAA metabolism and the action mechanism of IAA.

Key words auxin, map-based cloning, MeIAA, resistant mutant

Ｈｏｕ　ＸＨ，　Ｄｉｎｇ　ＭＹ，　Ｌｉｕ　ＳＮ，　Ｌｉ　ＬＣ，　Ｑｕ　ＬＪ　（２００９）．　Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ｏｆ　ｍｅｔｈｙｌ－ｉｎｄｏｌｅ－３－ａｃｅｔｉｃａｃｉｄ　ｒｅｓｉｓｔａｎｔ　ｍｕｔａｎｔｓ　ｉｎＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ．　Ｃｈｉｎ　Ｂｕｌｌ　Ｂｏｔ　４４，　５２?５８．

　Ｔｈｅｓｅ　ａｕｔｈｏｒｓ　ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｄ　ｅｑｕａｌｌｙ　ｉｎ　ｔｈｉｓ　ｐａｐｅｒ．

＊　Ａｕｔｈｏｒ　ｆｏｒ　ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｅｎｃｅ．　Ｅ－ｍａｉｌ：　ｑｕｌｊ＠ｐｋｕ．ｅｄｕ．ｃｎ

（责任编辑：　刘慧君）

ｅｔａｔｉｖｅ　ｇｒｏｗｔｈ．　Ｐｌａｎｔ　Ｊ　２８，　４６５－４７４．

Ｌｕｋｏｗｉｔｚ　Ｗ，　Ｇｉｌｌｍｏｒ　ＣＳ，　Ｓｃｈｅｉｂｌｅ　ＷＲ　（２０００）．　Ｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ　ｃｌｏｎ－

ｉｎｇ　ｉｎ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ．　Ｗｈｙ　ｉｔ　ｆｅｅｌｓ　ｇｏｏｄ　ｔｏ　ｈａｖｅ　ａ　ｇｅｎｏｍｅ　ｉｎｉｔｉａ－ｔｉｖｅ　ｗｏｒｋｉｎｇ　ｆｏｒ　ｙｏｕ．　Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ　１２３，　７９５－８０５．

Ｑｉｎ　Ｇ，　Ｇｕ　Ｈ，　Ｚｈａｏ　Ｙ，　Ｍａ　Ｚ，　Ｓｈｉ　Ｇ，　Ｙａｎｇ　Ｙ，　Ｐｉｃｈｅｒｓｋｙ　Ｅ，　Ｃｈｅｎ

Ｈ，　Ｌｉｕ　Ｍ，　Ｃｈｅｎ　Ｚ，　Ｑｕ　ＬＪ　（２００５）．　Ａｎ　ｉｎｄｏｌｅ－３－ａｃｅｔｉｃ　ａｃｉｄｃａｒｂｏｘｙｌ　ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ　ｒｅｇｕｌａｔｅｓ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｌｅａｆｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．　Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　１７，　２６９３－２７０４．

Ｔａｎ　Ｘ，　Ｃａｌｄｅｒｏｎ－Ｖｉｌｌａｌｏｂｏｓ　ＬＩ，　Ｓｈａｒｏｎ　Ｍ，　Ｚｈｅｎｇ　Ｃ，　Ｒｏｂｉｎｓｏｎ

ＣＶ，　Ｅｓｔｅｌｌｅ　Ｍ，　Ｚｈｅｎｇ　Ｎ　（２００７）．　Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ　ｏｆ　ａｕｘｉｎ　ｐｅｒｃｅｐ－ｔｉｏｎ　ｂｙ　ｔｈｅ　ＴＩＲ１　ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ　ｌｉｇａｓｅ．　Ｎａｔｕｒｅ　４４６，　６４０－６４５．Ｔｅａｌｅ　ＷＤ，　Ｐａｐｏｎｏｖ　ＩＡ，　Ｐａｌｍｅ　Ｋ　（２００６）．　Ａｕｘｉｎ　ｉｎ　ａｃｔｉｏｎ：

ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，　ｔｒａｎｓｐｏｒｔ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｏｆ　ｐｌａｎｔ　ｇｒｏｗｔｈ　ａｎｄｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．　Ｎａｔ　Ｒｅｖ　Ｍｏｌ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ　７，　８４７－８５９．

Ｔｉａｎ　Ｑ，　Ｒｅｅｄ　ＪＷ　（１９９９）．　Ｃｏｎｔｒｏｌ　ｏｆ　ａｕｘｉｎ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄ　ｒｏｏｔ　ｄｅｖｅｌ－

ｏｐｍｅｎｔ　ｂｙ　ｔｈｅ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ　ＳＨＹ２／ＩＡＡ３　ｇｅｎｅ．　Ｄｅｖｅｌ－ｏｐｍｅｎｔ　１２６，　７１１－７２１．

Ｗｅｎｔ　Ｆ　（１９２６）．　Ｏｎ　ｇｒｏｗｔｈ　ａｃｃｅｌｅｒａｔｉｎｇ　ｓｕｂｓｔａｎｃｅ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｃｏｌｅｏｐｔｉｌｅ　ｏｆ

Ａｖｅｎａ　ｓａｔｉｖａ．　Ｐｒｏｃ　Ｋ　Ａｋａｄ　Ｗｅｔｅｎｓｃｈ　Ａｍｓｔｅｒｄａｍ　３０，　１０－１９．Ｗｏｏｄｗａｒｄ　ＡＷ，　Ｂａｒｔｅｌ　Ｂ　（２００５ａ）．　Ａｕｘｉｎ：　ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ，　ａｃｔｉｏｎ，　ａｎｄ

ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ．　Ａｎｎ　Ｂｏｔ　（Ｌｏｎｄ）　９５，　７０７－７３５．

Ｗｏｏｄｗａｒｄ　ＡＷ，　Ｂａｒｔｅｌ　Ｂ　（２００５ｂ）．　Ａ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ｆｏｒ　ａｕｘｉｎ．　Ｐｌａｎｔ

Ｃｅｌｌ　１７，　２４２５－２４２９．

Ｙａｎｇ　Ｙ，　Ｘｕ　Ｒ，　Ｍａ　ＣＪ，　Ｖｌｏｔ　ＡＣ，　Ｋｌｅｓｓｉｇ　ＤＦ，　Ｐｉｃｈｅｒｓｋｙ　Ｅ　（２００８）．

Ｉｎａｃｔｉｖｅ　ｍｅｔｈｙｌ　ｉｎｄｏｌｅ－３－ａｃｅｔｉｃ　ａｃｉｄ　ｅｓｔｅｒ　ｃａｎ　ｂｅ　ｈｙｄｒｏｌｙｚｅｄａｎｄ　ａｃｔｉｖａｔｅｄ　ｂｙ　ｓｅｖｅｒａｌ　ｅｓｔｅｒａｓｅｓ　ｂｅｌｏｎｇｉｎｇ　ｔｏ　ｔｈｅ　ＡｔＭＥＳｅｓｔｅｒａｓｅ　ｆａｍｉｌｙ　ｏｆ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ．　Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ　（ｉｎｐｒｅｓｓ）

实验十一紫外诱变技术及抗药性突变菌株的筛选

实验十一紫外诱变技术及抗药性突变菌株的筛选 Ⅰ. 紫外诱变技术一实验目的以紫外线处理细菌细胞为例，学习微生物诱变育种的基本技术。了解紫外线对细菌细胞的作用。二实验材料和用具菌株：大肠杆菌（Escherichia coli）培养基：营养肉汤（nutrient broth）固体和液体培养基生理盐水等器皿：10ml及1ml的移液管，无菌试管，无菌培养皿，无菌三角瓶（内有无菌的玻璃珠20~40粒），无菌漏斗（内有两层擦镜纸），无菌离心管，离心机，紫外诱变箱等。三实验原理以微生物的自然变易作为基础的筛选菌种的机率并不很高。因为自发突变率小，一个基因的自发突变率仅为10-6~10-10左右。为了加大突变频率，可采用物理或化学的因素进行诱发突变。物理因素中目前使用得最方便且十分有效是UV，UV诱变一般采用15w的紫外灭菌灯，其光谱比较集中在253.7nm处，这与DNA的吸收波长一致，可引起DNA分子结构发生变化，特别是嘧啶间形成胸腺嘧啶二聚体，从而引起菌种的遗传特性发生变易。在生产和科研中可利用此法获得突变株。四实验内容 1、对出发菌株进行处理，制备单细胞悬液； 2、紫外线进行处理； 3、用平板菌落计数法测定致死率；

五操作步骤（一）出发菌株菌悬液的制备 1. 出发菌株移接新鲜斜面培养基，37℃培养16~24h ； 2. 将活化后的菌株接种于液体培养基，37℃ 110rpm 振荡培养过夜（约16h ），第二天，以20~30%接种量转接新鲜的营养肉汤培养基，继续培养2~4h ； 3. 取4ml 培养液与5ml 离心管中，10000rpm 离心3~5min ，弃去上清液，加4ml 无菌生理盐水，重新悬浮菌体，再离心，弃去上清，重复上述步骤用生理盐水恢复成菌悬液； 4. 将上述菌悬液倒入装有小玻璃珠的无菌三角瓶内，振荡20~30min ，以打散细胞； 5. 取诱变前的0.5ml 菌悬液进行适当稀释分离，取三个合适的稀释度倾注肉汤平板，每一梯度倾注两皿，每皿加1ml 菌液，37℃倒置培养24~36h ，进行平板菌落计数。（二）UV 诱变 1. 将紫外灯打开，预热30min ； 2. 取直径6cm 的无菌培养皿（含转子），加入菌悬液5ml ，控制细胞密度为107~108个/ml ； 3. 将待处理的培养皿置于诱变箱内的磁力搅拌仪上，静止1分钟后开启磁力搅拌仪旋纽进行搅拌，然后打开皿盖，分别处理5s 、10s 、15s 、30s 、45s ，照射完毕后先盖上皿盖，再关闭搅拌和紫外灯； 4. 取0.5ml 处理后的菌液进行适当稀释分离，取三个合适的稀释度倾注肉汤平板进行计数（避光培养）。六实验结果对平板菌落进行计数，并计算死亡率。 %100///?-=ml ml ml 照射前活菌数照射后活菌数照射前活菌数死亡率

【高中生物】功能基因的克隆及生物信息学分析

（生物科技行业）功能基因的克隆及生物信息学分析

功能基因的克隆及其生物信息学分析摘要：随着多种生物全基因组序列的获得，基因组研究正从结构基因组学（structuralgenomics）转向功能基因组学(functionalgenomics)的整体研究。功能基因组学利用结构基因组学研究获得的大量数据与信息评价基因功能(包括生化功能、细胞功能、发育功能、适应功能等)，其主要手段结合了高通量的大规模的实验方法、统计和计算机分析技术[1]，它代表了基因分析的新阶段，已成为21世纪国际生命科学研究的前沿。功能基因组学是利用基因组测序获得的信息和产物，发展和应用新的实验手段，通过在基因组或系统水平上全面分析基因的功能，使生物学研究从对单一基因或蛋白的研究转向多个基因或蛋白同时进行系统的研究，是在基因组静态的组成序列基础上转入对基因组动态的生物学功能学研究[2]。如何研究功能基因，也成为我们面临的一个课题，本文就克隆和生物信息学分析在研究功能基因方面的应用做一个简要的阐述。关键词：功能基因、克隆、生物信息学分析。 1.功能基因的克隆 1.1图位克隆方法图位克隆又称定位克隆，它是根据目标基因在染色体上确切位置，寻找与其紧密连锁的分子标记，筛选BCA克隆，通过染色体步移法逐步逼近目的基因区域，根据测序结果或用BAC、YAC克隆筛选cDNA表达文库寻找候选基因，得到候选基因后再确定目标基因。优点是无需掌握基因产物的任何信息，从突变体开始，逐步找到基因，最后证实该基因就是造成突变的原因。通过图位克隆许多

控制质量性状的单基因得以克隆，最近也有报道某些控制数量性状的主效基因（控制蕃茄果实大小的基因克隆[3]、控制水稻成熟后稻谷脱落基因克隆[4]以及小麦VRN2基因克隆[5]等）也通过图位克隆法获得。 1.2同源序列克隆目的基因首先根据已知的基因序列设计PCR引物，在已知材料中扩增到该片段，并经克隆测序验证，利用放射性同位素标记或其他非同位素标记该PCR片段作为探针，与待研究材料的cDNA文库杂交，就可以获得该基因cDNA克隆，利用克隆进一步筛选基因组文库，挑选阳性克隆，亚克隆并测序，从中就可以筛选到该基因的完整序列。 1.3结合连锁和连锁不平衡的分析方法结合连锁和连锁不平衡的分析方法是未知基因克隆研究领域发展的新方向[6]。(Linkagedisequilibrium,LD)。与连锁分析不同,连锁不平衡分析可以利用自然群体中历史发生的重组事件。历史上发生的重组使连锁的标记渐渐分布到不同的同源染色体上,这样就只有相隔很近的标记才能不被重组掉,从而形成大小不同的单倍型片段(Haplotypeblock)。这样经过很多世代的重组,只有相隔很近的基因,才能仍处在相同的原始单倍型片段上,基因间的连锁不平衡才能依然存在。所以基于连锁不平衡分析,可以实现目的基因的精细定位。林木大多为自由授粉的异交物种,所以连锁不平衡程度很低,林木基因组中的LD可能会仅局限于非常小的区域,这就为目的基因的精细定位提供了可能,结合SNP检测技术,科学家甚至可以将效应位点直接与单个的核苷酸突变关联起来,进行数量性状寡核苷酸

菌种筛选方法 (2)

菌种筛选方法在实际工作中，为了提高筛选效率，往往将筛选工作分为初筛和复筛两步进行。初筛的目的是删去明确不符合要求的大部分菌株，把生产性状类似的菌株尽量保留下来，使优良菌种不致于漏网。因此，初筛工作以量为主，测定的精确性还在其次。初筛的手段应尽可能快速、简单。复筛的目的是确认符合生产要求的菌株，所以，复筛步骤以质为主，应精确测定每个菌株的生产指标,测得的数据要能够反映将来的生产水平。 1 从菌体形态变异分析有时，有些菌体的形态变异与产量的变异存在着一定的相关性，这就能很容易地将变异菌株筛选出来。尽管相当多的突变菌株并不存在这种相关性，但是在筛选工作中应尽可能捕捉、利用这些直接的形态特征性变化。当然，这种鉴别方法只能用于初筛。有人曾统计过3,484个产维生素B2的阿舒假囊酵母(Eremoth ecium ashbyii)的变异菌落，发现高产菌株的菌落形态有以下特点：菌落直径呈中等大小（8-10毫米），凡过大或过小者均为低产菌株；色泽深黄色，凡浅黄或白色者皆属低产菌株。又如，在灰黄霉素产生菌荨麻青霉(Penicillium urticae)的育种中，曾发现菌落的棕红色变深者往往产量有所提高，而在赤霉素生产菌藤仓赤霉（Gibberell a fujikuroi）中，却发现菌落的紫色加深者产量反而下降。 2 平皿快速检测法平皿快速检测法是利用菌体在特定固体培养基平板上的生理生化反应，将肉眼观察不到的产量性状转化成可见的

"形态"变化。具体的有纸片培养显色法、变色圈法、透明圈法、生长圈法和抑制圈法等，见图。这些方法较粗放，一般只能定性或半定量用，常只用于初筛，但它们可以大大提高筛选的效率。它的缺点是由于培养平皿上种种条件与摇瓶培养，尤其是发酵罐深层液体培养时的条件有很大的差别，有时会造成两者的结果不一致。图平皿快速检测法示意图平皿快速检测法操作时应将培养的菌体充分分散，形成单菌落，以避免多菌落混杂一起，引起"形态"大小测定的偏差。 1) 纸片培养显色法将饱浸含某种指示剂的固体培养基的滤纸片搁于培养皿中，用牛津杯架空，下放小团浸有3%甘油的脱脂棉以保湿，将待筛选的菌悬液稀释后接种到滤纸上，保温培养形成分散的单菌落，菌落周围将会产生对应的颜色变化。从指示剂变色圈与菌落直径之比可以了解菌株的相对产量性状。指示剂可以是酸碱指示剂也可以是能与特定产物反应产生颜色的化合物。 2) 变色圈法将指示剂直接掺入固体培养基中，进行待筛选菌悬液的单菌落培养，或喷洒在已培养成分散单菌落的固体培养基表面，在菌落周围形成变色圈。如在含淀粉的平皿中涂布一定浓度的产淀粉酶菌株的菌悬液，使其呈单菌落，然后喷上稀碘液，发生显色反应。变色圈越大，说明菌落产酶的能力越强。而从变色圈的颜色又可粗略判断水解产物的情况。 3) 透明圈法在固体培养基中渗入溶解性差、可被特定菌利用的营养成分，造成浑浊、不透明的培养基背景。将待筛选在菌落周围就

《DNA复制、转录与翻译练习》参考答案

《DNA复制、转录与翻译练习》参考答案一、名词解释（略）二、问答题 1、答：DNA在复制时首先两条链之间的氢键断裂两条链分开，然后以每一条链分别做模板各自合成一条新的DNA链，这样新合成的子代DNA分子中一条链来自亲代DNA，另一条链是新合成的，这种复制方式为半保留复制(semiconservative replication)。并非所有的DNA复制都以半保留的方式进行，但双链DNA通常都以半保留方式复制。 2、答：在E.coli中，共发现了3种DNA聚合酶，即DNA聚合酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ。 DNA聚合酶Ⅰ是个多功能酶，具有5’--→3’聚合功能；3’--→5’外切功能以及3’--→5’外切功能。DNA聚合酶Ⅱ与DNA聚合酶Ⅰ功能相似，但没有5’--→3’外切功能。 DNA聚合酶Ⅲ与DNA聚合酶Ⅱ功能相同，但其聚合活性比DNA聚合酶Ⅰ高1000倍，是E.coliDNA复制中的最主要酶。 DNA聚合酶Ⅳ和Ⅴ是在1999年才被发现的,它涉及DNA的错误倾向修复(errorprone repair)。当DNA受到较严重损伤时, 即可诱导产生这两个酶,使修复缺乏准确性(accuracy),因而出现高突变率。其生物学意义在于高突变率虽会杀死许多细胞,但至少可以克服复制障碍, 使少数突变的细胞得以存活。 3、答：DNA的双螺旋结构中的两条链是反向平行的，当复制开始解链时，亲代DNA分子中一条母链的方向为5′～3′，另一条母链的方向为3′～5′。DNA聚合酶只能催化5′～3′合成方向。在以3′～5′方向的母链为模板时，复制合成出一条5′～3′方向的前导链，前导链的前进方向与复制叉的行进方向一致，前导链的合成是连续进行的。而另一条母链仍以3′～5′方向作为模板，复制合成一条5′～3′方向的随从链，因此随从链会成方向是与复制叉的行进方向相反的。随从链的合成是不连续进行的，先合成许多片段，即冈崎片段。最后各段再连接成为一条长链。由于前导链的合成连续进行的，而随从链的合成是不连续进行的，所以从总体上看DNA的复制是半不连续复制。 DNA复制时，在滞后链上，较短的DNA片段（大约1000-2000个核苷酸）是在分段合成引物的基础上，非连续合成的，这些不连续的DNA片段最先由日本科学家冈崎在电子显微镜下发现，故称为冈崎片断(Okazaki fragment)。引发体在滞后链上沿5'→3'方向不停的移动(这是一种相对移动，也可能是滞后链模板在移动)，在一定距离上反复合成RNA引物。DNA聚合酶Ⅲ从RNA引物的3，-OH 端合成冈崎片段。 4、答：DNA复制起始的体外实验表明需要6种蛋白,Dna A、Dna B、Dna C、组蛋白样蛋白(HU)回旋酶及单链结合蛋白(SSB)形成起始复合物。Dna A单体首先结合到复制起始点上4个含9 bp 的重复顺序上。然后20～40个Dna A单体结合到复制起始点形成一个核心。在Dna A蛋白的作用下位于复制起始点右侧的3个含13 bp的重复顺序开始解链形成开放复合体。Dna B/Dna C在复制起始区充当了起始的引发体（primosome）。Dna B?Dna C复合体转变为Dna B六聚物，形成复制叉。Dna B提供解旋酶（helicase）活性，使DNA解旋，可能它识别复制叉上潜在的单链结构，从13 bp的重复顺序上取代出Dna A，并开始解螺旋。Dna B在复制起始区域以很少的量（1－2六聚物）担负着催化作用。在那儿Dna B还具有激活Dna G引发酶的能力。解旋反应还需要另外两种蛋白，旋转酶（Gyrase）和SSB（单链结合蛋白）。旋转酶也就是Top Ⅱ，其作用是解

拟南芥的图位克隆技术

拟南芥基因的图位克隆技术浙江大学生命科学学院徐冰浙江杭州310029 1 国内外研究现状拟南芥（Arabidopsis thaliana）是一种模式植物，具有基因组小（125 Mbp）、生长周期短等特点，而且基因组测序已经完成（The Arabidopsis Genomic Initiative, 2000）。同时，拟南芥属十字花科（Cruciferae），具有高等植物的一般特点，拟南芥研究中所取得成果很容易用于其它高等植物包括农作物的研究，产生重大的经济效益，特别是十字花科中还有许多重要的经济作物，与人类的生产生活密切相关，因此目前拟南芥的研究越来越多地受到国际植物学及各国ZF的重视。从遗传学的观点来看，基因克隆的途径可概括为正向遗传学和反向遗传学两种。正向遗传学途径指的是通过被克隆基因的产物或表现型突变去进行；反向遗传学途径则指的是依据被克隆基因在染色体上的位置来实现。虽然一些模式生物（如拟南芥）的基因组测序已经完成，但还有40%的基因（在拟南芥中）的功能还是未知的。图1 图位克隆所需努力的比较（1995年和2002年）（Jander等，2002）图位克隆（map-based cloning）又称定位克隆（positional cloning），1986年首先由剑桥大学的Alan Coulson提出（Coulson等，1986），用该方法分离基因是根据目的基因在染色体上的位置进行的，无需预先知道基因的DNA序列，也无需预先知道其表达产物的有关信息。它是通过分析突变位点与已知分子标记的连锁关系来确定突变表型的遗传基础。近几年来随着拟南芥基因组测序工作的完成，各种分子标记的日趋丰富和各种数据库的完善，在拟南芥中克隆一个基因所需要的努力已经大大减少了（图1）。目前完成整个拟南芥的图位克隆过程大约需要一年时间。在这个过程中，我们从筛选突变体开始，逐渐找到和表型相关的基因。这和反向遗传学的方法正好相反。图位克隆能实现，关键在于全基因组测序计划的完成和各种分子标记的发现。这些数据被储存在专门的数据库中

基因图位克隆的策略与途径拟南芥

基因图位克隆的策略与途径拟南芥 Ting Bao was revised on January 6, 20021

拟南芥基因克隆的策略与途径拟南芥（Arabidopsis thaliana）是一种模式植物，具有基因组小（125 Mbp）、生长周期短等特点，而且基因组测序已经完成（The Arabidopsis Genomic Initiative, 2000）。同时，拟南芥属十字花科（Cruciferae），具有高等植物的一般特点，拟南芥研究中所取得成果很容易用于其它高等植物包括农作物的研究，产生重大的经济效益，特别是十字花科中还有许多重要的经济作物，与人类的生产生活密切相关，因此目前拟南芥的研究越来越多地受到国际植物学及各国政府的重视。基因(gene)是遗传物质的最基本单位,也是所有生命活动的基础。不论要揭示某个基因的功能,还是要改变某个基因的功能,都必须首先将所要研究的基因克隆出来。特定基因的克隆是整个基因工程或分子生物学的起点。本文就基因克隆的几种常用方法介绍如下。 1、图位克隆 Map-based cloning, also known as positional cloning, first proposed by Alan Coulson of the University of Cambridge in 1986, Gene isolated by this method is based on functional genes in the genome has a relatively stable loci, in the use of genetic linkage analysis or chromosomal abnormalities of separate groups will queue into the chromosome of a specific location, By constructing high-density molecular linkage map, to find molecular markers tightly linked with the aimed gene, continued to narrow the candidate region and then clone the gene and to clarify its function and biochemical mechanisms.图位（map-based clonig）又称克隆（positoinal cloning），1986年首先由剑桥大学的Alan Coulson提出。用该方法分离基因是根据功能基因在中都有相对较稳定的基因座，在利用分离群体的遗传连锁分析或将基因伫到染色体的1 个具体位置的基础上，通过构建高密度的分子连锁图，找到与目的基因紧密连锁的分子标记，不断缩小候选区域进而克隆该基因，并阐明其功能和生化。用该方法分离基因是根据目的基因在染色体上的位置进行的，无需预先知道基因的DNA序列，也无需预先知道其表达产物的有关信息。它是通过分析突变位点与已知分子标记的连锁关系来确定突变表型的遗传基础。近几年来随着拟南芥基因组测序工作的完成，各种分子标记的日趋丰富和各种数据库的完善，在拟南芥中克隆一个基因所需要的努力已经大大减少了（图1）。

易错pcr获得木聚糖酶xynh突变株筛选.doc

易错pcr获得木聚糖酶xynh突变株筛选易错pcr获得木聚糖酶xynh突变株筛选（一）项目简介易错pcr技术是在采用dna聚合酶进行目的基因扩增时，通过调整反应条件，来改变扩增过程中的突变频率，从而以一定的频率向目的基因随机引入突变，获得蛋白质分子的随机突变体。木聚糖水解酶系是一类降解木聚糖的酶系，包括β-1,4-内切木聚糖酶、β-木糖苷酶、α-l-阿拉伯糖苷酶、α-d-葡糖苷酸酶、乙酰基木聚糖酶和酚酸酯酶，可降解自然界中大量存在的木聚糖类半纤维素。易错pcr技术获得木聚糖酶xynh突变株筛选，是通过易错pcr技术使木聚糖酶发生突变，从突变株中筛选出木聚糖酶的降解能力、耐热性、酶活性提高的突变株，这些突变株就是我们所需的突变株。（二）国内外研究现状和发展动态 1.国内外研究现状木聚糖酶可以应用在酿造、饲料工业中。木聚糖酶可以分解酿造或饲料工业中的原料细胞壁以及β-葡聚糖，降低酿造中物料的粘度，促进有效物质的释放，以及降低饲料用粮中的非淀粉多糖，促进营养物质的吸收利用，并因而更易取可溶性脂类成分。国外对木聚糖酶的研究开始的较早。sorensen，1955年就对动物瘤胃和土

壤中的木聚糖酶进行了研究。1992年就已实现了木聚糖酶的工业化生产。目前国际上研究工作主要集中在对微生物木聚糖酶的诱导与调节机理研究，以及酶的提纯、鉴定方法，木聚糖酶基因分子的克隆和表达等（neeta 等，1999；raffaele等，2004）。自上世纪七十年代末开展木聚糖酶基因的研究工作以来，已有150多种来自真菌和细菌的木聚糖酶基因被克隆并在大肠杆菌中表达。我国在木聚糖酶方面的研究起步较晚，但发展迅速。上世纪八十年代初期，中国科学院微生物所在张树政院士(曾宇成等，1987)的带领下，开始了我国对木聚糖酶的早期研究工作，首次从海枣曲酶（aspergillus phoenicis）中纯化得到了四种木聚糖酶：酶i、酶ⅱ、酶ⅲ和酶ⅳ，并深人研究了活力较高的组分酶ⅲ的酶学性质。“九五”期间，山东大学微生物技术国家重点实验室曲音波教授等（曲音波等，2001）开展了木聚糖酶在造纸方面的应用研究，从碱性假单胞菌sp. g6-2分离出两种木聚糖酶xyna和xynb。目前，我国对木聚糖酶的研究大多停留在产酶菌株的筛选和驯化、木聚糖酶的纯化和理化性质研究方面，部分课题已涉及木聚糖酶的分子生物学研究、木聚糖酶基因克隆、表达和重组。 2.发展动态国内外目前对木聚糖酶的研究，主要是提高木聚糖酶的耐热性及低温酶活性。木聚糖酶原酶在国内外市场的发展迅速，占了酶制市场份额的12%左右。世界上规模化生产木聚糖酶的国家有许多，例如：丹麦、爱尔兰、芬兰、

抗药性突变株的获取和突变率测定

实验名称：抗药性突变株的获取和突变率测定姓名：学号：系别：实验日期：同组同学名单:

本实验利用紫外线诱变，获得大肠杆菌的链霉素抗性突变株，学习了解微生物诱变育种的基本技术。试验后，通过计算紫外照射造成的死亡率以及自发突变频率和诱导条件下突变频率，进一步加深对紫外诱导的认识。【实验目的】 1.掌握获取细菌自发和经诱变产生的突变株的基本方法。 2.了解突变株频率和突变率的计算。 3.了解微生物诱变育种的基本技术。 4. 【实验材料】 1.菌种大肠杆菌（E. coli） 2.培养基及试剂牛肉膏蛋白胨液体培养基、牛肉膏蛋白胨固体培养基、蒸馏水、链霉素（母液10 mg/mL；终浓度10 μg/mL）。 3.仪器及用具三角瓶（300 mL）、9 cm培养皿、6 cm培养皿、离心管（1.5 mL）、恒温摇床、恒温培养箱、紫外照射箱、磁力搅拌器、大头针、涂布器、酒精灯【实验方法及步骤】（一）出发菌株培养液的制备 1. 取斜面或冻存菌种划平板，获得单克隆一个。 2. 取单克隆，37°C条件下在牛肉膏蛋白胨液体培养基培养8~24h；稀释培养液，取102 ~103 个细菌个体转移到新鲜牛肉膏蛋白胨液体培养基，过夜培养。（二）培养基的制备倒牛肉膏蛋白胨固体培养基平板（非选择性培养基），以及含有链霉素的牛肉膏蛋白胨固体培养基平板（选择性培养基平板；链霉素终浓度10 μg/mL，在倒平板前加入到培养基中）（三）自发突变的测定取过夜培养液，稀释106倍（用1.5mL离心管装0.99mL 无菌蒸馏水，将10 μL 培养液加入到0.99 mL蒸馏水，震荡或吹打混匀，连续三次），取100μL 涂布在非

实验十抗性菌株筛选

实验十用梯度平板法筛选大肠杆菌抗药性突变株【实验目的】：了解并熟悉抗药性突变株的筛选原理和方法【实验原理】：经诱变处理后的微生物群体中，虽然突变的数目大大增加，但所占的比例仍然是整个群体中的极少数。为了快速、准确地得到所需的突变体，必须设计一个合理的筛选方法，以杀死大量的未发生突变的野生型，而保留极少数的突变型。梯度平板法是筛选抗药性突变型的一种有效简便方法，其操作要点是：先加入不含药物的培养基，立即吧培养皿斜放，待培养基凝固后形成一个斜面，再将培养皿平放，倒入含一定浓度药物的培养基，这样就形成一个药物浓度梯度由浓到稀的梯度培养基，然后再将大量的菌液涂布于平板表明上。经培养后，在高浓度药物处出现的菌落就是抗药性突变型菌株。【材料和器皿】：（1）菌种：大肠埃希氏菌（2）培养基：牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，2×（2倍浓度）牛肉膏蛋白胨培养液（分装于小三角瓶中，每瓶装20ml），生理盐水。（3）器皿：培养皿，涂布棒，移液管，滴管，离心机【方法和步骤】： 1 制备菌液从已活化的斜面菌种上挑一环大肠埃希氏菌于装有5ml牛肉膏蛋白胨培养液的无菌离心管中（接2支离心管），置37℃条件下培养16h左右，离心（3500r/min，10min），弃去上清液后再生理盐水洗涤2次，弃去上清液，重新悬浮于5ml的生理盐水中。并且将2支离心管的菌液一并倒入装有玻璃珠的三角瓶中，充分振动以分散细胞，制成108/ml的菌液。然后吸3ml菌液于装有磁力搅拌棒的培养皿中。 2 紫外线照射（1）预热紫外灯：紫外灯功率为15W，照射距离30cm。照射前先开灯预热30min。（2）照射：将培养皿放在磁力搅拌器上，先照射1min后再打开皿盖并计时，当照射达2Min 后，立即盖上皿盖，关闭紫外灯。 3 增殖培养（在暗室红灯下操作）照射完毕，用无菌滴管将全部菌液吸到含有3ml 2×牛肉膏蛋白胨培养液的小三角瓶中，混匀后用黑纸包裹严密，置37℃培养过夜。 4 制备梯度培养皿取10ml 牛肉膏蛋白胨琼脂培养基于直径9cm的培养皿中，立即将培养皿斜放，使高处的培养基正好位于皿边与皿底的交接处。待凝固后，将培养皿平放，在加入含有链霉素（100μg/ml）的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基10ml。待凝固后，便得到链霉素从到0逐渐递减的浓度梯度培养皿。然后在皿底做一个“↑”符号标记。 5 涂布菌液将增殖后的菌液进行离心（3500r/min，10min），弃去上清液，再加入少量生理盐水（约0.2ml），制成浓的菌液后将全部菌液涂布于梯度培养皿上，并将它倒置于37℃恒温箱中培养24h，然后将出现于高药物浓度区内的单菌落分别接种到斜面上，经培养后再做抗药性测定。 6 抗药性测定（1）制备含药平板：取链霉素溶液（750μg/ml）0.2、0.4、0.6、0.8ml，分别加到无菌培养皿中，再加入融化并冷却到50℃左右的牛肉膏蛋白胨培养基15ml，立即混匀，平置凝固后即成一个对照平板（不含药物）。（2）抗药性的测定：将上述每个皿底的外面用记号笔画成8等分，并注明1~8号，然后将

拟南芥基因克隆的策略与途径

拟南芥基因克隆的策略与途径拟南芥（Arabidopsis thaliana）是一种模式植物，具有基因组小（125 Mbp）、生长周期短等特点，而且基因组测序已经完成（The Arabidopsis Genomic Initiative, 2000）。同时，拟南芥属十字花科（Cruciferae），具有高等植物的一般特点，拟南芥研究中所取得成果很容易用于其它高等植物包括农作物的研究，产生重大的经济效益，特别是十字花科中还有许多重要的经济作物，与人类的生产生活密切相关，因此目前拟南芥的研究越来越多地受到国际植物学及各国政府的重视。基因(gene)是遗传物质的最基本单位,也是所有生命活动的基础。不论要揭示某个基因的功能,还是要改变某个基因的功能,都必须首先将所要研究的基因克隆出来。特定基因的克隆是整个基因工程或分子生物学的起点。本文就基因克隆的几种常用方法介绍如下。 1、图位克隆 Map-based cloning, also known as positional cloning, first proposed by Alan Coulson of the University of Cambridge in 1986, Gene isolated by this method is based on functional genes in the genome has a relatively stable loci, in the use of genetic linkage analysis or chromosomal abnormalities of separate groups will queue into the chromosome of a specific location, By constructing high-density molecular linkage map, to find molecular markers tightly linked with the aimed gene, continued to narrow the candidate region and then clone the gene and to clarify its function and biochemical mechanisms. 图位克隆（map-based clonig）又称定位克隆（positoinal cloning），1986年首先由剑桥大学的Alan Coulson提出。用该方法分离基因是根据功能基因在基因组中都有相对较稳定的基因座，在利用分离群体的遗传连锁分析或染色体异常将基因伫到染色体的1个具体位置的基础上，通过构建高密度的分子连锁图，找到与目的基因紧密连锁的分子标记，不断缩小候选区域进而克隆该基因，并阐明其功能和生化机制。用该方法分离基因是根据目的基因在染色体上的位置进行的，无需预先知道基因的DNA序列，也无需预先知道其表达产物的有关信息。它是通过分析突变位点与已知分子标记的连锁关系来确定突变表型的遗传基础。近几年来随着拟南芥基因组测序工作的完成，各种分子标记的日趋丰富和各种数据库的完善，在拟南芥中克隆一个基因所需要的努力已经大大减少了（图1）。

功能基因的克隆及生物信息学分析

功能基因的克隆及其生物信息学分析摘要：随着多种生物全基因组序列的获得，基因组研究正从结构基因组学（structural genomics）转向功能基因组学(functional genomics)的整体研究。功能基因组学利用结构基因组学研究获得的大量数据与信息评价基因功能(包括生化功能、细胞功能、发育功能、适应功能等)，其主要手段结合了高通量的大规模的实验方法、统计和计算机分析技术[1]，它代表了基因分析的新阶段，已成为21世纪国际生命科学研究的前沿。功能基因组学是利用基因组测序获得的信息和产物，发展和应用新的实验手段，通过在基因组或系统水平上全面分析基因的功能，使生物学研究从对单一基因或蛋白的研究转向多个基因或蛋白同时进行系统的研究，是在基因组静态的组成序列基础上转入对基因组动态的生物学功能学研究[2]。如何研究功能基因，也成为我们面临的一个课题，本文就克隆和生物信息学分析在研究功能基因方面的应用做一个简要的阐述。关键词：功能基因、克隆、生物信息学分析。 1.功能基因的克隆 1.1 图位克隆方法图位克隆又称定位克隆，它是根据目标基因在染色体上确切位置，寻找与其紧密连锁的分子标记，筛选BCA克隆，通过染色体步移法逐步逼近目的基因区域，根据测序结果或用BAC、YAC克隆筛选cDNA表达文库寻找候选基因，得到候选基因后再确定目标基因。优点是无需掌握基因产物的任何信息，从突变体开始，逐步找到基因，最后证实该基因就是造成突变的原因。通过图位克隆许多控制质量性状的单基因得以克隆，最近也有报道某些控制数量性状的主效基因（控制蕃茄果实大小的基因克隆[3]、控制水稻成熟后稻谷脱落基因克隆[4]以及小麦VRN2 基因克隆[5]等）也通过图位克隆法获得。

紫外诱变技术及抗药性突变菌株的筛选

紫外诱变技术及抗药性突变菌株的筛选姓名：张鑫淼班级：生工1301 一．实验目的以紫外线处理细菌细胞为例，学习微生物诱变育种的基本技术。了解细菌抗药性突变株的筛选方法二．实验材料菌株：大肠杆菌（Escherichia coli）培养基：营养肉汤（nutrient broth）固体和液体培养基试剂：2mg/ml链霉素，（Str）母液，无菌生理盐水。仪器：1ml的移液管17个，10ml移液管11个，无菌试管9个，无菌培养皿15个，无菌三角瓶7个（其中一个内有无菌的玻璃珠20~40粒），无菌漏斗（内有两层擦镜纸），无菌离心管1个，离心机，紫外诱变箱等营养肉汤蛋白胨10g牛肉膏3g氯化钠5g蒸馏水1000mLpH 7.4 营养琼脂蛋白胨10g牛肉膏3g氯化钠5g琼脂15～20g蒸馏水1000mL 三．实验原理以微生物的自然变易作为基础的筛选菌种的机率并不很高。因为自发突变率小，一个基因的自发突变率仅为10-6~10-10左右。为了加大突变频率，可采用物理或化学的因素进行诱发突变。物理因素中目前使用得最方便且十分有效是UV，UV诱变一般采用15w 的紫外灭菌灯，其光谱比较集中在253.7nm处，这与DNA的吸收波长一致，可引起DNA 分子结构发生变化，特别是嘧啶间形成胸腺嘧啶二聚体，从而引起菌种的遗传特性发生变易。在生产和科研中可利用此法获得突变株。链霉素属氮基糖昔类抗生素，其杀菌机理是作用于核糖体小亚基，使其不能与大亚基结合组成有活性的核糖体，从而阻断细菌蛋白质的合成。细菌对链霉素产生抗药性的作用机理一般是由于编码核糖体蛋白S12的rpsL基因或其他基因发生突变，导致相应的核糖体蛋白发生改变，是蛋白质合成不再受链霉素抑制。四．实验内容与操作步骤（一）出发菌株菌悬液的制备 1. 出发菌株移接新鲜斜面培养基，37℃培养16~24h； 2. 将活化后的菌株接种于液体培养基，37℃ 110rpm振荡培养过夜（约16h），第二天，以20~30%接种量转接新鲜的营养肉汤培养基，继续培养2~4h； 3. 取1ml培养液与1.5ml离心管中，10000rpm离心3~5min，弃去上清液，加1ml无菌生理盐水，重新悬浮菌体，再离心，弃去上清，重复上述步骤用生理盐水恢复成菌悬液； 4. 将上述菌悬液倒入装有小玻璃珠的无菌三角瓶内（预先加入9ml无菌生理盐水），振荡20~30min，以打散细胞； 5. 取诱变前的0.5ml 菌悬液进行适当稀释分离，取三个合适的稀释度倾注营养琼脂平板，每一梯度倾注两皿，每皿加1ml菌液，37℃倒置培养24~36h，进行平板菌落计数。同时选取合适浓度的菌悬液0.1ml涂布营养琼脂+Str平板（Str终浓度8ug/ml），37℃倒置培养24~36h,进行诱变前抗药菌落计数。（二）UV诱变 1. 将紫外灯打开，预热30min； 2. 取直径6cm的无菌培养皿（含转子），加入菌悬液5ml，控制细胞密度为107~108个/ml；

图位克隆基因研究进展

图位克隆基因研究进展宋成标摘要图位克隆是在不清楚基因产物结构和功能的情况下，根据基因在染色体上都有稳定的基因座实现的。随着各种分子标记技术和高质量基因组文库构建技术的发展，图位克隆现已经成为分离生物体基因的一种常规技术。本文主要概述了图位克隆的一般步骤，包括目的基因的初步定位、精细定位和遗传做图、染色体步行和登陆及利用功能互补实验鉴定目的基因。最后，对图位克隆技术存在的局限和发展前景作了初步的分析。关键词图位克隆, 分子标记, 精细定位, 基因组文库 Abstract Map-based cloning is based on the functional genes have their particular gene locus on chromosomes,when we know about the structure and function of gene products unclearly.With the rapid development of molecular marker technologies and constructing high quality genomic library technologies, map-based cloning had already become a common bio—technique for gene isolation. This article summarized mainly the processes of the map-based cloning in principle,including first-pass mapping of candidate gene、fine scale-mapping and building genetic map、chromosome walking or landing and finally complement experiment for identifing candidate gene. Finally the problems and the prospects in the map-based cloning are analyzed Keywords Map-based cloning, Molecular marker, Fine maping, Genomic library 从遗传学观点来看，基因克隆有两条途径：正向遗传学途径和反向遗传学途径。正向遗传学途径指的是通过被克隆基因的产物或表型突变去进行，如传统的功能克隆及近年来迅速发展的表型克隆；反向遗传学途径是根据被克隆的目的基因在染色体上都有稳定的位置来实现的。由于在多数情况下，我们并不清楚基因产物的结构和功能，很难通过正向遗传学途径克隆基因，而反向遗传学途径则显示了较好的前景。其中可以利用的主要有三种方法，分别是转座子标签法、随机突变体筛选法和图位克隆法。转座子标签法中受转座子的种类、转座频率及有些植物存在内源转座子等的影响，随机突变体筛选法则随机性较大且不能控制失活基因的种类和数量等，限制了它们的应用。图位克隆（map-based cloning）又称为定位克隆（positional cloning），1986年首先由剑桥大学的Coulson 等提出，用该方法分离基因是根据目的基因在染色体上的位置进行的，无需预先知道基因的DNA序列，也无需预先知道其表达产物的有关信息。它是通过分析突变位点与已知分子标记的连锁关系来确定突变表型的遗传基础。随着模式物种（拟南芥、水稻）全基因组测序的完成，各种分子标记技术的发展促进了高密度分子标记连锁图谱的建立和各种数据库的完善。图位克隆技术越来越成熟，已经成为分离生物基因的一种常规方法。本文将对图位克隆技术的相关策略作一介绍。 1图位克隆的策略自1992年图位克隆技术首次在拟南芥中克隆到ABI3(Girauda et al., 1992)基因和F AD3 (Arondel et al., 1992)基因以来，图位克隆技术在其它相关技术快速发展的支持下迅速发展起来。它是依据功能基因在生物基因组中都有相对稳定的基因座，在利用分子标记技术对目的基因进行精细定位的基础上，用与目的基因紧密连锁的分子标记筛选已构建的DNA文库（如Cosmid、YAC、BAC等文库），构建出目的基因区域的遗传图谱和物理图谱，再利用此物理图谱通过染色体步行、跳跃或登陆的方式获得含有目的基因的克隆，最后通过遗传转化和功能互补实验来验证所获得的目的基因（图1）。初步定位（First-pass maping）-------构建遗传图谱（constructing genetic map）-----精细定位（fine maping）---------构建物理图谱( constructing physical map)------染色体步移、登陆（chromosomal walking、landing）-------确定侯选基因（Consider candidate genes）----遗传互补验证目的基因（Through genetic complementation (transformation) to identify candidate gene）（请帮我画一个简易图表，把内容填进去）图1 图位克隆的主要步骤 Figure 1 Key steps in map-based cloning process

拟南芥的一般生物学特性

一、拟南芥的一般生物学特性 1. 形态学描述拟南芥（Arabidopsis thaliana）为十字花科拟南芥属。一年生细弱草本植物（图21-1 A）。株高15至30厘米，随生长环境或培养条件变化。基生叶多数，长圆形或椭圆形，呈莲座状排列。茎生叶具短柄或无柄。总状花序顶生，花瓣白色；雄蕊6枚，花药黄色；雌蕊圆柱状。长角果线形，长约10至16毫米，成熟时开裂。种子呈卵形，长约1毫米，成熟时红褐色。有关拟南芥的各种形态特征、形态发生及个体发育的过程等在许多文献中已有很详尽的描述，为研究人员利用拟南芥为实验材料提供了很好的基础和方便。 2. 个体小、易于栽培管理与其它大多数高等植物相比，拟南芥的个体较小。成熟个体株高在15至30厘米之间。由于个体小，很容易在面积有限的温室或人工气候室内大批量地种植。特别是对于一些有特殊要求的研究工作，甚至可以在培养器皿中完成生活史（如有时需要在无菌条件下进行培养等）。而且，拟南芥对生长条件的要求并不十分严格，这一特点使得在实验工作中很容易实现拟南芥的栽培管理。 3. 生长周期较短在一般的温室或人工气候室条件下，从拟南芥种子的春化至第一批角果成熟大约需8周左右时间。当然，也可以通过改变生长条件以达到使拟南芥提前或推后开花结实的目的。如延长每天的光照时间，可使拟南芥明显地提前开花结实，利用每天接近24小时的光照条件培养，甚至在6周左右即可收获第一批成熟角果。拟南芥的这一特性使实验工作周期大大缩短，特别是对于许多遗传分析工作，比利用一般的高等植物材料（如麦类、豆类作物）可以成倍地节约时间。二、拟南芥的普通遗传学特性 1. 既可自交、又可人工杂交在自然条件下，拟南芥是典型的自交繁殖植物，这使得拟南芥在种植繁种过程中得以保持其遗传上的稳定性。同时在实验过程中，根据研究目的又可方便地实施人工杂交，使得遗传分析工作很容易完成。 2. 种子结实量大虽然拟南芥植物个体较小，但其种子结实量非常之大。一个角果可结实数十至上百粒种子；在生长良好的情况下，单株结实量可达上万粒之多！这使得很容易进行后代的遗传分析工作，也很容易扩增所需突变体的种子库。 3. 容易被诱变产生所需突变体拟南芥在正常条件下通过自交产生后代，在遗传上表现出较高的稳定性。但拟南芥在特殊条件处理后较易发生突变，如利用物理的（如辐射处理）、化学的（如EMS处理）、及遗传转化（如T-DNA插入）等方法进行人工诱变处理，可获得具有各种不同表型性状的突变体。利用这些人工诱变方法产生的突变是随机的，可进一步通过对突变体库的有目的筛选而获得所需的突变体。 4. 染色体结构通过对细胞周期的中期（metaphase）染色体观察，可以清晰地辨认单倍体拟南芥有5条染色单体（2倍体为10条染色体）。对拟南芥遗传图谱的连锁关系分析，也证实了单倍体拟南芥包含5个遗传连锁群。除去着丝粒、端粒等区域及一些重复序列，目前已经完成测序的第一条至第五条染色体的DNA序列长度依次为29.1 Mb、19.6 Mb、23.2 Mb、 17.5 Mb、26.0 Mb（总长为115.4 Mb），而包括所有序列在内的拟南芥单倍体基因组总长约为125 Mb（注：此数据为2000年12月14日《自然》杂志公布的数据，随着拟南

蛋白质工程的定点突变

20世纪80年代以来，基因克隆技术与DNA化学合成方法相结合，建立和发展了定点突变技术。可以按照预定设计，在已知的DNA序列中增删或转换核苷酸，精确地是靶基因在特定位点发生碱基序列的变化，进而使基因表达及调控，基因产物发生相应改变。这种快速精确的基因突变已经被广泛地应用与基因工程和蛋白质工程之中。定点突变有多种方法，有的改变特定核苷酸，有的则是对一段最可能影响蛋白质功能的基因序列进行随机突变，产生一系列突变蛋白质。寡核苷酸诱导的定点突变基本上分两类：一类是用单链噬菌体M13作载体的寡核苷酸介导的单链模板定点突变；另一类用双链质粒作载体，双引物法定点突变。为了在体外导入特定的点突变，小的限制性片段可以切除，并被包含所需要突变的合成接头所替代（称为盒式诱变）。如果不行，插入片段可以克隆到产生单链DNA的噬菌粒载体中，由所设计的错配引物知道DNA复制，产生异源双链的复制型，并在下面的复制循环中产生野生型和突变的复制型。 (图）单链噬菌体作载体的定点突变的基本原理是，用已知序列的环状DNA变性后为模板，人工合成一段引物，将所要设计的定点突变寡核苷酸置于引物中，也就是说人工所合成的引

物不是完全和模板互补，而是在某个位点有意识地让碱基突变，和模板上的碱基不能配对，由于其他的碱基是互补的，所以任然可以通过复性，使引物和模板特异性结合。在M13单链环状模板上杂交一段寡核苷酸引物，利用DNA聚合酶和连接酶的作用，从引物延伸合成链，得到一个闭合环状的异源双链分子。由于预先在寡核苷酸引物中人为地引入碱基的错配对，插入或缺失，然后在将杂合双环DNA转化到细菌中，因此异源双链DNA经转化和筛选就可以分离到带有相应突变的DNA克隆。由于复制是半保留复制，经克隆后将有一半的后代环状DNA产生了定点突变，另一半和正常的亲代链一样。环状双链质粒DNA作为载体进行基因的改造有它的优点。待改造基因中如有两个适当的限制性内切酶切点，可以用人工合成双链DNA片段置换两切点之间原有序列，在人工合成的双链DNA片段中包含有突变的序列。但是这种置换方法收到限制酶酶切位点的限制。 1.用M13DNA进行的寡核苷酸引物介导的定点突变：寡核苷酸引物介导的定点突变的步骤是用含有突变碱基的寡核苷酸片段作引物，在聚合酶的作用下启动DNA分子进行复制。主要过程是：（1）将待突变基因克隆到突变载体上； 2.制备含突变基因的M13DNA单链模板； 3.引物与模板与模