一种新的 DNA 分子克隆方法
中国科学: 生命科学
2011年 第41卷 第9期: 722 ~ 729 SCIENTIA SINICA Vitae
https://www.360docs.net/doc/fe2008333.html, https://www.360docs.net/doc/fe2008333.html,
英文引用格式: Huang Y, Tao Y, Zhang W L, et al. A new method for DNA molecular cloning. SCIENTIA SINICA Vitae, 2011, 41: 722–729, doi: 10.1360/052011-309
《中国科学》杂志社
SCIENCE CHINA PRESS
论 文
一种新的DNA 分子克隆方法
黄媛, 陶颖, 张文露, 黄爱龙, 胡接力*
重庆医科大学, 感染性疾病分子生物学教育部重点实验室, 重庆 400016 * 联系人, E-mail: hujieli1977@https://www.360docs.net/doc/fe2008333.html,
收稿日期: 2011-05-13; 接受日期: 2011-08-25 国家自然科学基金(批准号: 81000732)资助项目 doi: 10.1360/052011-309
摘要 DNA 分子克隆是基本的分子生物学实验技术, 传统的分子克隆方法大多需经过酶切链接过程, 但在某些情况下, 没有合适的酶切位点往往会成为阻碍克隆进行的障碍. 本文描述了一种新的分子克隆方法, 称为不依赖酶切和链接的分子克隆(RLIC). 利用RLIC, 将3种不同大小的DNA 片段克隆到3种不同载体, 证明了这种方法的有效性和可靠性. 由于该方法不受限制性酶切序列限制, 省去了酶切连接步骤, 因此具有很大的灵活性和简便性, 在分子生物学研究方面有广泛应用前景.
关键词 DNA 分子克隆 方法
DNA 分子克隆是指将一段目的DNA 分子片段与特定载体DNA 分子连接, 形成重组DNA 分子. DNA 分子克隆是基本的分子生物学实验技术, 广泛用于生物学、医学等各个领域. 传统的DNA 分子克隆方法主要包含以下步骤: 目标DNA 分子制备、目标分子与载体酶切、连接、转化及筛选.
从分子克隆技术建立之初起, 针对传统DNA 分子克隆方法的改进就一直在进行, 其中很多技术改进已转化为商品化克隆试剂盒, 如T-A Cloning [1], TOPO Cloning, Gateway [2,3]技术等. 这些新技术在不同程度上简化了克隆过程, 提高了克隆效率, 也能满足大部分研究需求. 但是对于一些问题, 传统克隆方法和新技术仍不能很好地解决. 例如, 可能希望在已克隆了一个基因(以gene 1指代)的真核表达载体上再克隆另一个基因(如检测标记EGFP 或筛选抗性标记等, 以gene 2指代), 且gene 2需使用独立启动子来单独表达而非融合表达. 此时, 不能再选择该载体的多克隆位点来克隆gene 2. 因为, 第一, 可能已经没
有合适的酶切位点; 第二, 即使有合适的酶切位点, 在该部位插入gene 2将扰乱gene 1的表达. 理想的情况是, 在第一个基因表达框架之外(如polyA 序列下游)的载体骨架上, 找到合适的酶切位点, 插入gene 2表达片段(包括启动子、基因及转录终止信号). 然而, 在大多数商业化载体中, 往往很难找到合适的位点来进行这类操作.
如果有一种克隆方法, 可以不受插入部位的序列限制, 即不用限制性切割, 便可以解决上述问题. Aslanidis 和de Jong [4]建立过一种非连接依赖性克隆方法(ligation-independent cloning of PCR products, LIC-PCR), 基本原理是: 在PCR 片段末端及PCR 扩增的线性载体末端分别加上12 bp 核苷酸, 利用T4 DNA 聚合酶的外切活性, 产生末端为单链的上述两种分子, 由于这两种分子末端互补, 退火后转化可得到重组分子. Rashtchian 等人[5]将此方法进行了改进, 使末端12 bp 核苷酸含dUMP, 从而可以用尿嘧啶DNA 糖基化酶(UDG)进行特异切割, 便于产生单链
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末端. 各种LIC 方法本质上与T-A 克隆类似, 它们都需要线性化载体, 区别在于线性化载体及PCR 片段末端互补单链长度不同, T-A 克隆时分子末端仅有一个碱基互补, 而LIC 中, 分子末端具有更长的互补单链[6], 这使得分子间退火后无需使用DNA 连接酶. 虽然LIC-PCR 具有序列非限制性特点, 但此类方法均需获得线性化载体, 并且需要将载体和待克隆分子末端单链化, 步骤相对复杂繁琐. 本文描述了一种新的DNA 分子克隆方法, 它具有序列非依赖性特点, 同时操作较简便, 应用灵活, 可作为分子克隆的一种新选择.
1 材料与方法
1.1 材料
人乙型肝炎病毒(HBV)复制质粒PCH9/3091(约6.1 kb)由德国Nassal 实验室构建[7], 中国人民解放军第三军医大学西南医院兰林博士赠送. PCH9/3091含有HBV 1.1×全基因组DNA, 由CMV 启动子驱动HBV 前基因组RNA(pgRNA)转录, 该质粒在转入肝源性细胞后可支持HBV 复制. pEGFP-N1, pEGFP-C1 (Clontech 公司)和pEGFP-N1-SM22为本实验室保存[8]. pEGFP-N1-SM22以pEGFP-N1为骨架, 多克隆位点区插入了小鼠SM22启动子(长约2.2 kb). pCDNA3.1-pol 为本实验室构建, 该质粒以pCDNA3.1(Invitrogen)为骨架, 多克隆位点区克隆有HBV 多聚酶基因(pol, 长约2.5 kb). Lenti-GFP 为本实验保存, 该质粒以慢病毒骨架质粒pLentiLox3.7为骨架, 含有EGFP 基因表达框架. HepG2细胞为本实验室保存. PCR 试剂(PrimeSTAR HS)为TaKaRa 公司产品; 胶回收试剂盒为QIAGEN 公司产品; PCR 产物纯化试剂盒为Roche 公司产品; 小量质粒提取试剂盒为Promega 公司
产品; 地高辛标记检测试剂盒(DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit Ⅱ)及转染试剂Fugene HD 为Roche 公司产品; DNAase Ⅰ, 限制性内切酶Sal Ⅰ, Sma Ⅰ, Bgl Ⅱ, Bam H Ⅰ及Dpn Ⅰ均为Promega 公司产品; RNase A 为Merck 公司产品; 本文所用PCR 引物由上海Invitrogen 公司合成, 引物序列见表1.
1.2 方法
(1) 克隆策略. 最初在HBV 体外复制研究中, 希望控制PCH9/3091的转染效率. 共转染荧光表达质粒pEGFP-N1是一种较便于观察的方式, 但由于EGFP 从另一个质粒表达, 通过荧光表达情况来反映PCH9/3091的转染效率可能不太准确. 如果将EGFP 表达框架克隆到PCH9/3091, 则PCH9/3091的转染效率可以通过观察荧光得到更准确的反映. 为达到此目的, 首先需要得到一个完整的EGFP 表达框架, 包括启动子、增强子、EGFP 基因、终止信号, 然后将该片段插入HBV 复制元件以外的质粒骨架适当位置. 完整的EGFP 表达框架可以方便地从pEGFP-N1扩增而获得, 但将该片段插入PCH9/3091的合适位置却颇为困难, 因为在该质粒上没有合适的酶切位点. 为解决该问题, 本研究建立了一种新的克隆策略, 称为不依赖酶切和连接的分子克隆(restriction digestion and ligation-independent cloning, RLIC). RLIC 的基本原理类似于Stratagene 公司的DNA 定点诱变技术(site-directed mutagenesis). 图1(A)所示为Stratagene 定点诱变原理: 设计一对突变引物, 该引物含有一个突变目标碱基(用红色突起表示), 该突变碱基两侧序列与质粒相应位置互补, 此对引物与待突变质粒退火并线性扩增, 产物为带缺刻的环状分子, 该分子转化到感受态菌后被修复, 得到诱变质粒. 图1(B)为本
表1 PCR 引物序列a)
引物 序列(5′→3′)
F pch9-egfp
TCGAATTGATCTGATCAAATTCCG ACCGTATTACCGCCATGCAT
PCH9 EGFP
R pch9-egfp CATACGATTTAGGTGACACTATAG GGACAAACCACAACTAGAATGC
PCH9 EGFP
F cmv CCATTGACGCAAATGGGCGGTA
G R egfp CAGCTCGACCAGGATGGGCACCA
R p-lenti
CGTAGAATCGAGACCGAGGAGAGGGTTA TCACGGTGGTCTCCATGCGACGT pLenti-GFP V5 pol
a) 黑体示引物序列中与载体互补的部分; 下画线示引物序列中与待扩增片段互补的部分
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研究克隆策略, 将待克隆的DNA 片段(红色部分)看作待突变的点(或看作增加点突变中的红色突起数量), 该片段两侧末端(黑色部分)序列与载体相应区域(片段插入区间两侧)同源, 由于该同源片段的存在, 该双链片段即可看作是一对大引物(mega-primer), 它们可利用其末端与载体相应部位退火并延伸, 最终也得到含有目标片段的双链环状缺刻分子, 缺刻分子在转化后修补为完整质粒. 利用该策略, 将EGFP 表达片段插入到PCH9/3091中HBV DNA 下游, 另外还将此方法用于另外两个DNA 片段亚克隆.
(2) EGFP 表达片段扩增及克隆到PCH9/3091. 用引物F pch9-egfp 及R pch9-egfp 从pEGFP-N1扩增pCMV- EGFP-PolyA 片段, 该片段两端分别带有与PCH9/3091 HBV DNA 下游质粒骨架序列同源的序列(表1), 用QIAGEN 胶回收试剂盒回收该片段, 取1 μg 回收片段、50 ng PCH9/3091, 0.5 μL PrimeSTAR 聚合酶等建立50 μL 反应体系. 按如下条件扩增: 94℃预变性 2 min, 94℃ 15 s, 52℃ 15 s, 72℃ 4 min, 30个循环, 72℃ 3 min. 扩增产物用Roche PCR 产物纯化试剂盒纯化, 取1/3纯化产物用Dpn Ⅰ 37℃消化4 h, 然后取消化后产物1.5 μL 电转化JM109感受态细胞, 获得的克隆用酶切鉴定, 鉴定正确的克隆命名为PCH9-EGFP.
(3) PCH9-EGFP 功能鉴定.
(ⅰ) 细胞培养及转染. HepG2细胞用含有10%胎牛血清的MEM 培养基在37℃, 含5%CO 2的孵箱中培养. 转染前20 h, 将HepG2细胞接种于6孔板, 密度约为7×105个/孔, 用无抗生素培养基培养过夜. 第2天, 用Fugene HD 转染试剂将2.5 μg PCH9-EGFP 或2.5 μg PCH9/3091(比例为3:1)转入每孔, 各3孔, 转染后第2天更换新鲜培养基.
(ⅱ) 细胞内HBV 病毒DNA 分析. 转染后第5天, 用下述方法从HepG2细胞中提取胞浆核心颗粒HBV DNA. 细胞用PBS 洗涤后, 每孔加入400 μL 细胞裂解液(10 mol/L Tris-Cl pH 8.0, 1 mmol/L EDTA, 1%NP40, 2%蔗糖), 37℃孵育15 min; 15000×g 离心3 min, 将上清吸入另一个洁净EP 管中; 加入MgCl 2溶液至终浓度为10 mmol/L, 然后依次加入DNase Ⅰ和RNase A, 终浓度分别为40 U/mL 和1 mg/mL, 37℃孵育3 h; 反应完成后, 每管加入含有1.5 mol/L NaCl 的35% PEG 8000 140 μL, 冰浴1 h; 4℃, 11000×g 离心5 min, 弃上清; 每管加入400 μL 消化缓冲液(0.5%SDS, 2.5 mmol/L Tris-Cl pH 8.0, 10 mmol/L EDTA, 150 mmol/L NaCl)及终浓度为1 mg/mL 的蛋白酶K, 42℃消化3 h; 酚氯仿抽提, 乙醇沉淀, 产物溶于7.5 μL 灭菌超纯水中, -20℃保存备用.
HBV DNA 经1%琼脂糖凝胶电泳后, 转印至带正电荷尼龙膜(Roche), 烤干固定后进行预杂交、杂交(地高辛标记的HBV DNA 探针)、洗脱、检测, 具体操作按产品说明书进行.
(4) SM22启动子亚克隆. 用引物F cmv 及R egfp 从pEGFP-N1-SM22扩增pSM22片段, 该片段两端分别带有pCMV 3′末端及EGFP 5′末端序列. 用QIAGEN 胶回收试剂盒回收该片段, 取800 ng 回收片段、50 ng pEGFP-C1, 0.5 μL PrimeSTAR 聚合酶等建立50 μL 反应体系. 按如下条件扩增: 94℃预变性2 min, 94℃ 15 s, 55℃ 20 s, 72℃ 2.5 min, 30个循环, 72℃延伸3 min. 扩增产物用Roche PCR 产物纯化试剂盒纯化, 取1/3纯
图1 RLIC 原理
(A) Stratagene 定点诱变原理: 点突变引物与待突变载体退火并延伸, 合成带缺刻的分子, 这些分子转化细菌后, 可获得带有已发生点突变的
质粒; (B) RLIC 原理: 待插入片段可看作“大突变引物”, 该片段可采用类似(A)的方式克隆到载体
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化产物用Dpn Ⅰ 37℃消化 4 h, 然后取消化后产物1.5 μL 电转化JM109感受态细胞, 获得的克隆用酶切鉴定.
(5) HBV pol 基因亚克隆. 用引物F cmv 及R p-lenti
从pCDNA3.1-pol 扩增HBV pol 片段, 该片段两端分别带有pCMV 3′末端及部分V5 epitope 序列. 用
QIAGEN 胶回收试剂盒回收该片段, 取1 μg 回收片段, 30 ng pLenti-GFP, 0.6 μL PrimeSTAR 聚合酶等建立50 μL 反应体系. 按如下条件扩增: 94℃预变性 2 min, 94℃ 15 s, 55℃ 20 s, 72℃ 4 min 30 s, 30个循环, 72℃延伸5 min. 扩增产物用Roche PCR 产物纯化
试剂盒纯化, 取1/3纯化产物用Dpn Ⅰ 37℃消化4 h, 然后取消化后产物1.5 μL 电转化JM109感受态细胞,
获得的克隆做PCR 及测序鉴定.
2 结果
2.1 PCH9-EGFP 克隆及鉴定
要实现EGFP 独立表达, 需获得EGFP 完整表达框架, 包括启动子及终止信号. 首先从pEGFP-N1扩增EGFP 表达框架, 扩增片段长约1.6 kb(图2(B)), 然
后, 以胶回收纯化后的该 1.6 kb 片段为大引物, PCH9/3091为模板, 进行线性扩增(非指数扩增). 高质量的胶回收片段对于后面的RLIC 反应很重要, 不纯的片段可能会导致RLIC 反应产生较多非目标产物.
RLIC 产物经Dpn Ⅰ消化后, 起始的模板质粒PCH9/ 3091被去除, 而线性扩增产物被保留(未甲基化), 这
些带缺口的产物在转化大肠杆菌后被修复, 得到候选克隆. 图2显示了两个候选克隆的酶切鉴定电泳
图2 PCH9-EGFP 克隆及鉴定
(A) EGFP 表达片段克隆示意图. 首先, 利用引物F pch9-egfp 和R pch9-egfp 从pEGFP-N1扩增EGFP 表达片段, 包含CMV 启动子、EGFP 基因及polyA 信号序列, 该片段末端含有与PCH9/3091待插入位点两侧互补的序列; 利用RLIC 反应, 将该片段插入PCH9/3091中HBV DNA 序列下游, 得到质粒PCH9-EGFP. *: 示大引物中与载体同源的序列位置; (B) EGFP 表达片段扩增及候选克隆酶切鉴定电泳图. PCR 扩增的EGFP 表达片
段分子量约为1.6 kb. 含有正确插入片段的克隆应被Sal Ⅰ切为3.8 kb+3.9 kb 两段, 被Sma Ⅰ切为0.7 kb+7.0 kb 两段
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结果. 由于EGFP 表达片段含有多克隆位点(MCS), 该片段插入将引入另一个Sal Ⅰ及Sma Ⅰ位点, 结合原来PCH9/3091上这两个酶的单一位点(图2(A)), 可以鉴定克隆是否正确. 酶切结果显示, 这两个克隆均含有正确的插入片段.
2.2 PCH9-EGFP 可表达绿色荧光蛋白
为了解EGFP 表达片段克隆到PCH9/3091后是否具有正常功能, 将酶切鉴定正确的PCH9-EGFP 质粒转染HepG2细胞, 然后观察细胞是否表达绿色荧光蛋白. 结果显示, 在转染后48~120 h, 均可见明显绿色荧光细胞(图3, 仅显示部分结果), 提示EGFP 表达片段具有正常功能, 可以用来指示转染效率.
2.3 PCH9-EGFP 支持HBV 体外复制
RLIC 反应要利用DNA 聚合酶合成模板质粒骨架, 由于DNA 聚合酶有一定的错误合成率, 可能带来一些潜在风险, 即在模板质粒骨架中引入人为突变. 因此, 还有必要确认PCH9-EGFP 除了可以表达EGFP 外, 其他功能亦未受到影响, 本研究关注的最重要功能是支持HBV 体外复制. 为此, 将PCH9-EGFP 转染HepG2细胞, 转染后第5天提取细胞内核心颗粒HBV DNA, 并用Southern blot 检测. 如图4所示, 与PCH9/3091相同, PCH9-EGFP 在转入HepG2细胞后, 仍能支持HBV 复制, Southern blot 可以检测到HBV 复制中间体, 包括rcDNA(松弛环状DNA), dslDNA(双链线性DNA)及ssDNA(单链DNA).
2.4 SM22启动子亚克隆
上述结果显示, RLIC 已成功将EGFP 表达片段插入到PCH9/3091指定位置, 且未破坏质粒的原有功能, 提示RLIC 的有效性. 为进一步确认该方法的可靠性, 再次利用RLIC 策略, 将一段长约2.2 kb 的
图3 PCH9-EGFP 支持绿色荧光蛋白表达
图4 Southern blot 检测HBV 复制中间体
将PCH9/3091及PCH9-EGFP 分别转染HepG2细胞, 5天后提取细
胞内HBV 复制中间体, 并用Southern blot 检测. M: DNA marker; rcDNA: 松弛环状DNA; dslDNA: 双链线性DNA; ssDNA: 单链
DNA
DNA 片段(SM22启动子), 从pEGFP-N1载体亚克隆到pEGFP-C1. 图5(A)显示了该实验的流程. 与上述方法类似, 将pSM22从pEGFP-N1-SM22扩增出来, 该片段两端分别带有一小段CMV 启动子3′末端和EGFP 5′末端同源序列, 这些同源序列在后续RLIC 反应中可与pEGFP-C1相应序列退火(图5(B)). 由于pEGFP-N1与pEGFP-C1的差别仅在于MCS 位置不同, 前者位于EGFP 基因N 端, 而后者位于EGFP 基因C 端, 通过MCS 中的单一位点Bgl Ⅱ及Bam H Ⅰ酶切, 可鉴定出正确的克隆. 在本实验挑选鉴定的克隆中, 所有克隆均为正确克隆(图5(B)).
2.5 HBV pol 基因亚克隆
作为对RLIC 方法的又一次验证, 利用RLIC 将HBV DNA 聚合酶(pol )基因从pCDNA3.1亚克隆到Lenti-GFP 载体. pol 基因长度约2.5 kb, Lenti-GFP 约7.6 kb. 首先从pCDNA3.1-pol 扩增得到pol 基因片段, 该片段两端分别带有pCMV 3′末端及部分V5表位同源序列(位于EGFP 基因下游), 然后利用RLIC 反应将该片段克隆到Lenti-GFP. 图6(B)中PCR 鉴定结果及测序结果(结果未显示)显示, 本实验获得了含有正确插入片段的重组质粒.
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图5 pSM22亚克隆
(A) pSM22片段亚克隆示意图. 从pEGFP-N1-SM22扩增pSM22片段, 利用RLIC 反应将其克隆到pEGFP-C1. *: 示大引物中与载体同源的序列位置; (B) pSM22片段扩增及候选克隆酶切鉴定. 挑取8个候选克隆(1~8号)进行酶切鉴定. 正确的克隆应被Bam H Ⅰ切为6.2 kb+0.7 kb
两段, 被Bgl Ⅱ切为4.0 kb+2.9 kb 两段. 9为一个未被酶切的候选质粒
图6 HBV pol 基因亚克隆
(A) HBV pol 基因克隆示意图. *: 示大引物中与载体同源的序列位置; (B) pol 基因PCR 扩增及候选克隆的PCR 鉴定. P: 从候选克隆扩增pol
基因; M: DNA marker; N: 阴性对照
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3 讨论
本文描述了一种新的DNA 分子克隆方法, 称为RLIC. 以3种不同长度的插入片段(2.2, 2.5和3.4 kb)及3种不同的载体(pEGFP-C1[4.7 kb], PCH9/3091[6.1 kb], Lenti-GFP[7.6 kb])为例, 展示了该方法的有效性及简便灵活性. RLIC 突出的优点是, 它是一种序列非特异性克隆方法, 无需选择特异性酶切位点, 这为DNA 片段插入位点选择提供了极大的灵活性. 正如在将EGFP 表达片段克隆到PCH9/3091中一样, 经常没有合适的酶切位点, 这时要么对载体进行复杂的改造, 要么放弃当前实验方案. 由于RLIC 策略无需考虑酶切位点, 使得可以较容易地获得目的克隆, 从而有利于某些分子生物学实验的顺利开展.
RLIC 反应简单易行, 其基本原理类似定点诱变反应, 它以完全互补的双链目标片段为大引物(mega- primers, 图1). 需要注意的是, 保证在该大引物两端带有一定长度的克隆载体同源序列(与载体上插入位点两侧序列互补), 通过在片段扩增引物5′末端加上相应序列即可实现(如引物F pch9-egfp , R pch9-egfp 及R p-lenti ). 或当条件允许时, 直接从共有序列处开始扩增片段(如亚克隆SM22时所用引物F cmv 及R egfp ). 根据经验, 片段末端同源序列长度最好在25 bp 以上, 且长度越长, 克隆效率可能越高. RLIC 反应需用到Taq DNA 聚合酶, 而该类酶均存在一定的错误掺入率, 因此可能产生一个潜在缺点, 即在反应过程中可能在质粒骨架上引入突变. 本研究认为, 这种缺点的影响是有限的. 首先, RLIC 反应并非真正的PCR, 它是一个线性扩增过程, 即每一轮扩增都只能以初始的质粒为模板来进行, 而不能以前面循环的扩增产物为模板, 这就保证了每轮扩增模板的正确性, 避免了突变产物在后续循环中的指数积累; 其次, 即使偶尔出现突变, 这些突变应主要出现在质粒骨架上(因为插入片段本身不被扩增), 严重影响质粒自身功能的突变在转化筛选过程中因无法生存复制将被筛除, 而那些不影响质粒自身功能的突变则不会对后续实验造成重要影响; 另外, 通过选用保真度高的DNA 聚合酶, 可以在很大程度上防止人为突变发生. 本实验采用了Prime-STAR DNA 聚合酶进行RLIC 反应, 功能实验显示, 所得PCH9-EGFP 克隆的正常功能并未遭到破坏.
总之, RLIC 是一种有效的DNA 分子克隆新方法, 由于该方法不依赖限制性酶切位点, 使得在面临没有合适酶切位点的情况下, 能够方便地将目标片段克隆到载体. 同时, RLIC 省却了连接步骤, 操作简便易行, 这使得该方法在分子生物学研究方面有广泛的应用前景.
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中国科学: 生命科学 2011年第41卷第9期
A New Method for DNA Molecular Cloning
HUANG Yuan, TAO Ying, ZHANG WenLu, HUANG AiLong & HU JieLi
Key Laboratory of Molecular Biology on Infectious Diseases, Ministry of Education,
Chongqing Medical University, Chongqing 400016, China
DNA molecular cloning is an extensively used technique in molecular biology research. Traditional methods for molecular cloning usually include restriction digestion and ligation process. In many cases, however, cloning of a DNA fragment may be difficult because no appropriate restriction site can be found. In the present study, we have developed a new method for DNA molecular cloning, named Restriction digestion and Ligation-Independent Cloning (RLIC). We cloned three DNA fragments with different sizes into three different vectors by using RLIC, demonstrating the effectiveness of this method. Freeing from the limitation of restriction enzyme sites and omitting the ligation process, RLIC possesses great flexibility and may find broad applications in molecular biology research.
DNA, molecular cloning, method
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南方医科大学分生实验-绿色荧光蛋白(EGFP)的基因克隆
绿色荧光蛋白（EGFP）的基因克隆 南方医科大学学院 摘要 本实验旨在学习基因克隆并检验，绿色荧光蛋白基因转化入宿主细胞后很稳定，对多数宿主的生理无影响，是常用的报道基因，便于实验。本实验通过将含有目的基因GFP的pEGFP-N1质粒和pMD18-T载体进行酶切、电泳、回收、连接、转入、筛选之后，把GFP基因成功导入到大肠杆菌DH5α(克隆菌)中，从而实现荧光蛋白基因的克隆和表达。 关键词：绿色荧光蛋白克隆表达 实验名称绿色荧光蛋白的基因克隆 2015- ~ 实验日期 实验地点 2015- 合作者指导老师 评分教师签名批改日期 一、实验目的 1.学习使用限制性内切酶进行DNA酶切的原理和方法。 2.学习掌握琼脂糖凝胶电泳的基本原理和操作方法。 3.掌握PCR技术原理和PCR仪的操作方法。 4.学习PCR产物的TA克隆的基本原理和操作步骤。 5.了解和掌握大肠杆菌的制备方法的基本原理和操作要点以及DNA转化大肠杆菌的原理和方 法。
6.掌握双酶切法鉴定重组DNA的基本原理和操作步骤，以及菌落PCR鉴定重组DNA的基本原 理和方法。 7.掌握IPTG诱导GFP基因表达的基本原理和操作步骤 二、实验原理 1.pEGFP-N1质粒 2.T载体
三、材料与方法： 1.实验材料： 质粒：pEGFP-N1 T载体：pUCm-T 菌种：DH5(克隆菌) PCR引物： F——GGCATATGGTGAGCAAGGGCGA R——CGGGATCCCTTGTACAGCTCGTC Tm=56 实验试剂： 即用型蓝白T载体（pMD18-T vector cloning kit） 快速DNA连接试剂盒 限制性内切酶：EcoR I（Fermentas） Axygen质粒提取试剂盒 抗生素：氨苄青霉素(Amp)、卡那霉素(Kan) X-gal、IPTG等 实验仪器： 超净工作台，恒温摇床，高压灭菌锅，恒温培养箱，台式高速离心机，大容量冷冻离心机，PCR仪，紫外分光光度计，水平电泳槽，垂直电泳槽，电泳仪，凝胶成像系统，制冰机、超低温冰箱等 2.方法 分离目的基因→限制酶切割目的基因与载体→连接重组体→转入受体细胞→筛选重组体、转化子 四、实验具体流程 1.获取外源基因 1)碱裂解法提取质粒 使用Axygen质粒提取试剂盒
整个基因克隆实验流程完整
一、组织总RNA的提取 相关试剂：T rizol；氯仿；苯酚；异丙醇；75%乙醇；RNase-free水 相关仪器：制冰机；液氮&研钵/生物样品研磨仪；高速离心机；移液器（1ml、200μl、100μl/50μl）；涡旋振荡仪；恒温金属浴。 相关耗材：解剖工具，冰盒，离心管，离心管架，吸头（1ml，200μl/300μl），一次性手套，实验手套。 实验步骤 1.取暂养草鱼，冰上放置一段时间，然后解剖，剪取肠道50~100mg，放入研钵中，加入 液氮迅速研磨，然后加入1ml 预冷TRIzol试剂，充分研磨至无颗粒物存在。 2.转移到离心管中，室温放置5min，使细胞充分裂解； 3.按1ml Trizol加入200μl氯仿，盖上盖子，迅速充分摇匀15s，然后室温放置3min； 4.4℃，,12000g 离心15min； 此时混合物分为三层，下层红色的苯酚氯仿层，中间层和上层无色水相；RNA存在于无色水相中； 5.小心吸取上清液，千万不要吸取中间界面，否则有DNA污染；转移至一个新的离心管， 加入等体积的异丙醇，轻轻混匀； 6.室温放置10min；4℃，,12000g 离心10min； 7.弃上清，加入1ml 75%乙醇洗涤；涡旋，悬浮沉淀；4℃，,12000g 离心5min； 8.弃上清；可以再次用75%乙醇洗涤沉淀； 9.弃上清；用移液器轻轻吸取管壁或管底的残余乙醇，注意不要吸取沉淀；室温放置5min 晾干沉淀；（RNA样品不要过于干燥，否则极难溶解） 10.沉淀中加入30μl RNase-free水，轻弹管壁，使RNA溶解。 RNA质量检测 相关试剂：溴酚蓝，TEB/TAE电泳缓冲液，溴乙锭（EB） 相关仪器：（超微量分光光度计，移液器（2.5μl 或2μl 规格，10μl规格），电子天平，电泳仪，电泳槽，凝胶成像仪，微波炉，制冰机） 相关耗材：（无菌无绒纸，吸头，离心管架，PCR管，PCR管架，锥形瓶，烧杯，一次性手套，实验手套，冰盒） （1）RNA纯度的检测：测定其OD260和OD280的值，根据其OD260/ OD280的比值，当其比值在1.9~2.1之间，说明提取的总RNA纯度比较高，没有蛋白质和基因组的污染。 （2）RNA完整性的检测：取2μlRNA，与2μl溴酚蓝混匀，用1%的琼脂糖进行凝胶电泳，20min后，在凝胶成像系统中观察效果。当28S与18S条带清晰，且亮度比大约是2:1时，5S条带若隐若现，而且没有其它条带时，说明完整性不错，可以用于下游逆转录实验。
基因克隆及转基因方法
基因克隆及转基因 一、基因克隆及转基因过程 1、设计引物 软件是https://www.360docs.net/doc/fe2008333.html,sergene.v7.1，用到里面的PrimerSelect和EditSeq。 一般原则：1、长度：18-25； 2、GC含量：40-60％，正反向引物相差不要大于5%； 3、Tm值：55以上（到65），实在不行50以上也可以，正反向引物相差不要大 于5； 4、3’端结尾最好是GC，其次是T，不要A； 5、正反向引物连续配对数小于4； 6、在NCBI上的Primer Blast上看引物特异性如何； （如果克隆的话不能满足条件也没办法。） 不是必须条件，但可以考虑：多个基因设计引物时，可尽量使Tm值相似，方便PCR。 步骤： 一、打开PrimerSelect和EditSeq。 二、在EditSeq中输入你的序列。 引物有一对F和R 1、对于F是从5’到3’，在序列的前部分选择长度为18-25bp的碱基，如果你是要验证就随便选，如果你是要克隆就在最开始选，不符合原则就只能在你选的后边增或减碱基。 2、将选择的F引物输入到PrimerSelect中，在File中选择Enter New Primer，复制，OK，然后可以看到引物的情况，看看长度、Tm、GC含量是不是符合标准，不符合就继续选。 3、对于R是从3’到5’，选中序列，在EditSeq的Goodies中选择第一个“反向互补”，此时序列已反向互补，按照前面F的方法搜索R的引物。、 4、注意你想要的目的带的大小，比如序列是1000bp，你想PCR出来800大小的目的带，那就要看看F和R之间的长度在你想要的范围内。可以将R反向互补，在正向的序列中搜索R在的位置，就是在EditSeq中选择Search，点击第一个Find，开始搜寻。 5、搜索完引物在PrimerSelec中的Report中选择前两个查看二聚体情况。 6、在NCBI上的Primer Blast上看引物特异性如何。 7、因为是克隆，所以引物要有酶切位点，酶切位点的加入主要考虑所用到的表达载体，在NEBcutter网站中输入总序列查看可用的酶切位点。在引物上游加入酶切位点，注意加入时载体的表达的方向，前面的酶切位点在引物F上，后面的酶切位点在引物R上。一般在引物上游还要加上两个保护碱基。 2、提取醋栗DNA 3、PCR扩增与目的基因回收 PCR先找合适的退火温度，找到后回收时就可以多PCR几管，一般我们用20ul的体系，PCR5管就可以回收，就是琼脂糖凝胶回收，将目的基因用刀片切下来，用试剂盒回收。回收完可以再跑电泳检测一遍。 PCR： 20ul体系：灭菌水13.8ul，若模板为质粒灭菌水14.3ul； 2.5mMdNTP2.0ul；
基因克隆步骤
实验一大肠杆菌感受态细胞的制备及转化 [实验原理]（供参考，试剂盒的Solution SS成分未知） 细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态。转化是指质粒DNA 或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。其原理是：在0℃下的CaCl2低渗溶液中，细菌细胞膨胀成球形。转化缓冲液中的DNA形成不易被DNA酶所降解的羟基—钙磷酸复合物，此复合物粘附于细菌细胞表面。42℃短时间热处理（热休克），可以促进细胞吸收DNA复合物。将处理后的细菌放置在非选择性培养液中保温一段时间，促使在转化过程中获得的新的表型(如Amp抗性) 得到表达。然后再涂布于含有氨苄青霉素的选择性平板上，37℃培养过夜，这样即可得到转化菌落。[仪器、材料与试剂] (一)仪器1．小型高速离心机2．恒温摇床3．恒温箱4．‐20℃冰箱5．恒温水浴器 (二)材料1．氨苄青霉素2．大肠杆菌DH5a3．pUC194．1.5mL 离心管5．枪头、枪6．试管、培养皿 (三)试剂1．快速感受态细菌制备试剂盒（申能博彩公司产品）2．LB 培养液在950mL去离子水中加入：胰蛋白胨(tryptone) 10g酵母提取物(yeast extract) 5g NaCl 10g 摇动容器直至溶质完全溶解，用Na0H调节pH至7.0，加入去离子水至总体积为1L，121℃湿热灭菌20min。 3．氨苄青霉素(Amp)，用无菌水配制成100mg／mL 溶液，置‐20℃冰箱保存。 [实验步骤]
1．从大肠杆菌DH5a平板上挑取一个单菌落接于2mL LB培养液的试管中，37℃振荡培养过夜。 2．取50mL菌液转接到一个含有5mL LB培养液锥形瓶中，37℃振荡培养2小时。以下步骤按修改后的试剂盒说明书进行。 3．用灭菌的枪头取0.5mL的大肠杆菌培养物于1.5mL灭菌离心管中，冰上放置3分钟后，加入0.5mL预冷的Solution SS。在冰上小心地用1mL 枪头将细胞悬浮起来。注意：1mL的取液器设定在500mL。悬浮细胞要轻，防止细胞进入枪内。 4．将上述细胞分装于1.5mL离心管(离心管要在放在冰上预冷) 中，每管0.1mL。细胞可以立即使用或储存。 5．将感受态细胞迅速转移到‐20℃或更低的低温冰中。注意：在转移过程中要防止温度升高，解决的办法之一是在塑料袋里装上低温冰块，将细胞迅速转移到塑料里，将整个塑料袋放到低温冰箱内。 转化：1．新鲜制备的或‐20℃下保存的100mL感受态细胞，置于冰上，完全解冰后轻轻地将细胞均匀悬浮。 2．加入5mL pUC19质粒，DNA浓度为10pg/mL，轻轻混匀。 3．冰上放置30分钟。 4．42℃水浴热激60秒。 5．冰上放置2分钟。 6．加400mL LB培养液，37℃ 250转／分振荡培养30分钟。 7．室温下4000rpm离心5分钟，用枪头吸掉400mL上清液，用剩余的培养液将细胞悬浮。
4植物基因克隆的策略与方法
4植物基因克隆的策略与方法 基因的克隆确实是利用体外重组技术,将特定的基因和其它DNA顺序插入到载体分子中。基因克隆的要紧目标是识不、分离特异基因并获得基因的完整的全序列,确定染色体定位,阐明基因的生化功能,明确其对特定性状的遗传操纵关系。通过几十年的努力由于植物发育,生理生化,分子遗传等学科的迅速进展,使人们把握了大量有关植物优良性状基因的生物学和遗传学知识,再运用先进的酶学和生物学技术差不多克隆出了与植物抗病、抗虫、抗除草剂、抗逆,育性、高蛋白质及与植物发育有关的许多基因。我们实验室对天麻抗真菌蛋白基因作了功能克隆的研究(舒群芳等,1995;舒群芳等,19 97),为了克隆植物基因也探讨了其它克隆方法,本文论述基因克隆的策略、方法及取得的一些进展。 1功能克隆(functional Cloning) 功能克隆确实是按照性状的差不多生化特性这一功能信息,在鉴定和已知基因的功能后克隆(Collis,1995)。其具体作法是:在纯化相应的编码蛋白后构建cDNA文库或基因组文库,DNA文库中基因的选择按照情形要紧可用二种方法进行,(1)将纯化的蛋白质进行氨基酸测序,据此合成寡核苷酸探针 从cDNA库或基因组文库中选择编码基因,(2)将相应的编码蛋白制成相应抗体探针,从cDNA入载体表达库中选择相应克隆。功能克隆是一种经典的基因克隆策略,专门多基因的分离利用这种策略。 Hain等从葡萄中克隆了两个编码白藜芦醇合成的二苯乙烯合成酶基因(Vst1和Vst2),葡萄中抗菌化合物白藜芦醇的存在,能够提升对灰质葡萄孢(B otrytis cinerce)的抗性,在烟草和其它一些植物中无二苯乙烯合成酶,因此克隆该基因通过转基因后,对有些植物产生对灰质葡萄孢的抗性专门有意义(H ain等,1985)。Kondo等1989年对编码水稻巯基蛋白酶抑制剂的基因组DN A做了克隆和序列分析(Kondo等,1989)。周兆斓等构建了水稻cDNA文库,分离了编码水稻巯基蛋白酶抑制剂的cDNA(周兆斓等,1996)。植物蛋白酶抑制剂是一类天然的抗虫物质,它可抑制摄食害虫对蛋白质的消化,使害虫因 缺乏所需氨基酸而导致非正常发育或死亡。胡天华等人从烟草中分离出流行于我国的黄瓜花叶病毒(Cucumber Mosaic virus)(CMV),并克隆了编码该
基因克隆载体上的各种常用蛋白标签
基因克隆载体上的各种常用蛋白标签 蛋白标签(proteintag)是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和纯化等。随着技术的不断发展，研究人员相继开发出了具有各种不同功能的蛋白标签。目前，这些蛋白标签已在基础研究和商业化产品生产等方面得到了广泛的应用。 美国GeneCopoeia(复能基因)为客户提供50多种蛋白标签，可以满足客户的不同需求，包括各种最新型的标签，如：SNAP-Tag?、Halo Tag?、AviTag?、Sumo等;也提供齐全的各种常用标签，如eGFP、His、Flag等等标签。 以下是部分蛋白标签的特性介绍，更加详细的介绍可在查询产品的结果列表里面看到各种推荐的蛋白标签和载体。 TrxHIS His6是指六个组氨酸残基组成的融合标签，可插入在目的蛋白的C末端或N末端。当某一个标签的使用，一是能构成表位利于纯化和检测;二是构成独特的结构特征(结合配体)利于纯化。组氨酸残基侧链与固态的镍有强烈的吸引力，可用于固定化金属螯合层析(IMAC)，对重组蛋白进行分离纯化。使用His-tag有下面优点： 标签的量小，只有~0.84KD，而GST和蛋白A分别为~26KD和~30KD，一般不影响目标蛋白的功能; His标签融合蛋白可以在非离子型表面活性剂存在的条件下或变性条件下纯化，前者在纯化疏水性强的蛋白得到应用，后者在纯化包涵体蛋白时特别有用，用高浓度的变性剂溶解后通过金属螯和去除杂蛋白，使复性不受其它蛋白的干扰，或进行金属螯和亲和层析复性; His标签融合蛋白也被用于蛋白质-蛋白质、蛋白质-DNA相互作用研究; His标签免疫原性相对较低，可将纯化的蛋白直接注射动物进行免疫并制备抗体。 可应用于多种表达系统，纯化的条件温和; 可以和其它的亲和标签一起构建双亲和标签。 Flag标签蛋白 Flag标签蛋白为编码8个氨基酸的亲水性多肽(DYKDDDDK)，同时载体中构建的Kozak序列使得带有FLAG的融合蛋白在真核表达系统中表达效率更高。FLAG作为标签蛋白，其融合表达目的蛋白后具有以下优点： FLAG作为融合表达标签，其通常不会与目的蛋白相互作用并且通常不会影响目的蛋白的功能、性质，这样就有利用研究人员对融合蛋白进行下游研究。 融合FLAG的目的蛋白，可以直接通过FLAG进行亲和层析，此层析为非变性纯化，可以纯化有活性的融合蛋白，并且纯化效率高。 FLAG作为标签蛋白，其可以被抗FLAG的抗体识别，这样就方便通过Western Blot、ELISA等方法对含有FLAG的融合蛋白进行检测、鉴定。
基因克隆技术的研究进展_钟军
第6卷第4期(专辑) 2002年12月 生命科学研究 Life Science Research Vol.6No.4(Suppl.) Dec.2002基因克隆技术的研究进展X 钟军,李,官春云 (湖南农业大学油料作物研究所,中国湖南长沙410128) 摘要:为能快速而准确地克隆目的基因,综述了一些基因克隆常用技术,包括差异表达基因分离技术、转座子标签技术、图位克隆技术、同源序列技术、表达序列标签技术的原理、应用及应用潜力,并对其作了简要的评价. 这些技术有利有弊,应根据不同的实验目的和水平来选择相应的技术. 关键词:基因;克隆;差异表达基因分离技术;转座子标签技术;图位克隆技术;同源序列技术;表达序列标签技术 中图分类号:Q78文献标识码:A文章编号:1007-7847(2002)S1-0148-05 Advances in Gene Cloning Technique ZHONG Jun,LI Xun,GUAN Chun-yun (T he Oil Crop Institute of H unan Agriculture University,Chan gsha410128,H unan,China) Abstract:To clone candidate gene quickly and correctly,advances about gene cloning included map-based cloning, transposon tagging,homology-based candidate gene method,expressed sequence tagging methods and some differen-tially expressed gene clone method are introduced and appraised.Because of the advantages and disadvanta ges of those techniques,various technique should be selected according special purpose and level. Key words:gene;clone;differentially e xpressed gene clone method;transposon tagging;map-based cloning;ho-mology-based candidate gene method;e xpressed sequence ta gging method (Li f e Science Research,2002,6(Suppl):148~152) 克隆基因的途径有两种,正向遗传学和反向遗传学途径.前者是依据目标基因所表现的功能为基础,通过鉴定其产物或某种表型突变而进行的;后者则着眼于基因本身,通过特定的序列或在基因组中的位置进行.近几十年来,许多重点实验室致力于植物基因的克隆,到1992年取得了突破性进展.基因的克隆一般采用下列技术:差异表达基因分离技术、转座子标签技术、表达序列标签技术、图位克隆技术和同源序列技术等. 1差异表达基因分离技术 1.1扣除杂交技术 扣除杂交技术的原理是用有特异性表达基因的目标样提取mRNA经逆转录形成cDNA探针,与无特异性表达基因的参照样的过量mRNA或cDNA杂交,经两轮充分杂交后,移去杂交分子和过量的无特异性表达基因的参照样mRNA或cD-NA,将不形成杂交体的有特异性表达基因的目标样cDNA纯化富集、扩增,建立相应cDNA文库即为差异表达基因cDNA文库.此技术最早是由Lamar和Palmer于1984年提出[1],他们先用超声波打断雌性小鼠的DNA,用Mbo1完全消化雄性小鼠DNA;将两者一起变性、复性,再将产物克隆入表达载体的Bam H I位点中,只有那些两端有GATC序列的基因才能被克隆入载体,这样就达到了扣除两者共有序列的目的,并得到雄性小鼠 X收稿日期:2002-06-11;修回日期:2002-10-14 作者简介:钟军(1973-),女,湖南沅江人,博士研究生,从事分子遗传学研究.Tel:+86-0731-*******,E-mail:zhhjp@s https://www.360docs.net/doc/fe2008333.html,
拟南芥基因克隆的策略与途径
拟南芥基因克隆的策略与途径 拟南芥（Arabidopsis thaliana）是一种模式植物，具有基因组小（125 Mbp）、生长周期短等特点，而且基因组测序 已经完成（The Arabidopsis Genomic Initiative, 2000）。同时，拟南芥属十字花科（Cruciferae），具有高等植物 的一般特点，拟南芥研究中所取得成果很容易用于其它高等植物包括农作物的研究，产生重大的经济效益，特别是十字 花科中还有许多重要的经济作物，与人类的生产生活密切相关，因此目前拟南芥的研究越来越多地受到国际植物学及各 国政府的重视。 基因(gene)是遗传物质的最基本单位,也是所有生命活动的基础。不论要揭示某个基因的功能,还是要改变某个基因的功 能,都必须首先将所要研究的基因克隆出来。特定基因的克隆是整个基因工程或分子生物学的起点。本文就基因克隆的 几种常用方法介绍如下。 1、图位克隆 Map-based cloning, also known as positional cloning, first proposed by Alan Coulson of the University of Cambridge in 1986, Gene isolated by this method is based on functional genes in the genome has a relatively stable loci, in the use of genetic linkage analysis or chromosomal abnormalities of separate groups will queue into the chromosome of a specific location, By constructing high-density molecular linkage map, to find molecular markers tightly linked with the aimed gene, continued to narrow the candidate region and then clone the gene and to clarify its function and biochemical mechanisms. 图位克隆（map-based clonig）又称定位克隆（positoinal cloning），1986年首先由剑桥大学的Alan Coulson提出。用该方法分离基因是根据功能基因在基因组中都有相对较稳定的基因座，在利用分离群体的遗传连锁分析或染色体异常将基因伫到染色体的1个具体位置的基础上，通过构建高密度的分子连锁图，找到与目的基因紧密连锁的分子标记，不断缩小候选区域进而克隆该基因，并阐明其功能和生化机制。 用该方法分离基因是根据目的基因在染色体上的位置进行的，无需预先知道基因的DNA序列，也无需预先知道其表达产物的有关信息。它是通过分析突变位点与已知分子标记的连锁关系来确定突变表型的遗传基础。近几年来随着拟南芥基因组测序工作的完成，各种分子标记的日趋丰富和各种数据库的完善，在拟南芥中克隆一个基因所需要的努力已经大大减少了（图1）。
基因图位克隆的策略与途径拟南芥
基因图位克隆的策略与途 径拟南芥 Ting Bao was revised on January 6, 20021
拟南芥基因克隆的策略与途径 拟南芥（Arabidopsis thaliana）是一种模式植物，具有基因组小（125 Mbp）、生长周期短等特点，而且基因组测序已经完成（The Arabidopsis Genomic Initiative, 2000）。同时，拟南芥属十字花科（Cruciferae），具有高等植 物的一般特点，拟南芥研究中所取得成果很容易用于其它高等植物包括农作物的研究，产生重大的经济效益，特别是 十字花科中还有许多重要的经济作物，与人类的生产生活密切相关，因此目前拟南芥的研究越来越多地受到国际植物 学及各国政府的重视。 基因(gene)是遗传物质的最基本单位,也是所有生命活动的基础。不论要揭示某个基因的功能,还是要改变某个基因的 功能,都必须首先将所要研究的基因克隆出来。特定基因的克隆是整个基因工程或分子生物学的起点。本文就基因克隆 的几种常用方法介绍如下。 1、图位克隆 Map-based cloning, also known as positional cloning, first proposed by Alan Coulson of the University of Cambridge in 1986, Gene isolated by this method is based on functional genes in the genome has a relatively stable loci, in the use of genetic linkage analysis or chromosomal abnormalities of separate groups will queue into the chromosome of a specific location, By constructing high-density molecular linkage map, to find molecular markers tightly linked with the aimed gene, continued to narrow the candidate region and then clone the gene and to clarify its function and biochemical mechanisms.图位（map-based clonig）又称克隆（positoinal cloning），1986年首先由剑桥大学的Alan Coulson提出。用该方法分离基因是根据功能基因在中都有相对较稳定的基因座，在利用分离群体的遗传连锁分析或将基因伫到染色体的1 个具体位置的基础上，通过构建高密度的分子连锁图，找到与目的基因紧密连锁的分子标记，不断缩小候选区域进而克隆该基因，并阐明其功能和生化。 用该方法分离基因是根据目的基因在染色体上的位置进行的，无需预先知道基因的DNA序列，也无需预先知道其表达产物的有关信息。它是通过分析突变位点与已知分子标记的连锁关系来确定突变表型的遗传基础。近几年来随着拟南芥基因组测序工作的完成，各种分子标记的日趋丰富和各种数据库的完善，在拟南芥中克隆一个基因所需要的努力已经大大减少了（图1）。
基因工程原理讲义：目的基因的克隆
第九讲目的基因的克隆 中国科学院遗传与发育生物学研究所 2017年8月
目录 一、基因克隆的一般概念 1．基因克隆定义 2．“克隆”的不同含义 3．基因克隆的过程 4．DNA片段的产生与分离 5．基因文库 二、基因克隆与分离的实验策略 1．物理策略 2．生物策略 3．克隆样品的选择 4．基因文库库容测算 三、cDNA基因克隆 1．概述 2．cDNA文库的构建 3．低丰度mRNA之cDNA克隆 4．稀少mRNA的cDNA克隆 5．全长cDNA的合成 6．cDNA克隆的优越性 四、基因组DNA克隆
1．cDNA克隆的局限性 2．基因组DNA克隆的优越性 3．构建基因组文库的载体类型五、基因定位定隆 1．基因定位克隆概述 2．RFLP分子标记 3．RFLP作图原理与步骤 4．染色体步移 5．大尺度物理图谱的构建
目的基因的克隆 一、基因克隆的概念 1．基因克隆的定义 基因克隆亦叫做DNA克隆(DNA cloning)，它是指将外源基因或DNA片段插入到克隆载体的分子上，构成重组的DNA群体，并转化到寄主细胞进行复制和繁殖，以便从大分子DNA或DNA片段混合物中分离纯化目的基因或特定DNA片段的实验操作，叫做基因克隆。严格地说，基因克隆应叫做DNA克隆，因为被克隆的是基因组的全部(理论上)的DNA片段，而并不是所有的DNA片段都编码有基因。 *要注意基因克隆与基因分离两者在概念上的差别！完成了基因克隆并不等于完成了基因的分离！尽管两者之间存在密切的相互关系。因此在日常交谈中或是一般文字叙述中，甚至于某些正式有关文件中，常把“基因克隆”与“基因分离”等同使用，不作区分，是不妥当的。 *有时我们所说的基因克隆，即所谓的“分子克隆”(Molecular cloning)，实质上包含着目的基因的分离与鉴定两个主要的内容，基因克隆的全过程包括如下四个步骤：
1.基因克隆的步骤
基因克隆的步骤 一、RNA的提取 1. 提取RNA前将洗净干燥的瓷研钵放入-70℃预冷10 min； 2. 从液氮罐中取出样品组织放入预冷的研钵中，加液氮淹没后立即研磨，边研磨边加液氮，整个过程都 不要使液氮挥干； 3. 趁冷，将样品粉末50-80 mg加入1.5 mL离心管后再加入1 mL Trizol，样品体积应不超过所使用Trizol 体积的10%，然后按照Trizol试剂盒说明操作； 4. 室温静止5-15 min。对于某些蛋白、多糖或脂含量很高的细胞或组织Trizol裂解后可能会有不溶物或 油脂状漂浮物，需12000g、4℃离心10 min，然后吸取澄清的Trizol裂解产物至一新的离心管中；5. 每mL Trizol中加0.2 mL氯仿。小心盖上离心管，剧烈地涡旋振荡15 sec，室温（24℃）静置3-5 min； （必需步骤） 6. 12000 g、4℃离心15 min，此时混合物分成三部分：底层为苯酚-氯仿层，中间层，上层水相层，RNA 完全存在水相中； 7. 把小于80%的水相层（每mL Trizol约可吸0.5-0.55 mL）转移至一新的离心管中，并弃去下面的有机 相（小心避免吸到中间层）。往水相中加入异丙醇来沉淀RNA，每使用1 mL Trizol，便加500 uL的异丙醇，颠倒混匀，室温下孵育样品10 min； 8. 4℃、12000 g离心样本10 min弃去上清，每mL Trizol加入1 mL 75%乙醇，涡旋混匀，室温沉淀10 min 后，7500 g、4℃离心5 min，弃上清。再用离心机甩一下（5000rpm，离心1 s）； 9. 小心吸走乙醇，短暂地在室温下置2-5 min，让RNA团风干，不要用离心干燥装置或真空干燥装置， 因为过度干燥会导致很难用水重新溶解RNA，然后在55-60℃温浴10 min，然后-70℃保存。[RNA]（ng/uL）=A260×40×稀释倍数 [DNA]（ng/uL）=A260×50×稀释倍数 纯DNA：OD260/OD280≈1.8（＞1.9，表明有RNA污染；＜1.6，表明有蛋白质、酚等污染） 纯RNA：1.7＜OD260/OD280＜2.0（＜1.7时表明有蛋白质或酚污染；＞2.0时表明可能有异硫氰酸残存） 二、M-MLV RT反转录 1. oligo dT 1 uL + dNTP（ 2.5 mM）4 uL + 1-5 ug total RNA + 水= 12 uL Heat mixture to 65℃ for 5 min and quick chill on ice； 2. 上述12 uL液体+ 5×Buffer 4 uL + 0.1 M DTT 2 uL + RNase OUT 1 uL Mix contents of the tube，incubate at 37℃for 2 min 3. 上述19 uL液体加M-MLV RT 1 uL
基因克隆的几种常见方法
基因克隆得几种常见方法 基因（gｅｎe)就是遗传物质得最基本单位,也就是所有生命活动得基础。不论要揭示某个基因得功能,还就是要改变某个基因得功能,都必须首先将所要研究得基因克隆出来。特定基因得克隆就是整个基因工程或分子生物学得起点。本文就基因克隆得几种常用方法介绍如下。 1 根据已知序列克隆基因 对已知序列得基因克隆就是基因克隆方法中最为简便得一种。获取基因序列多从文献中查取，即将别人报道得基因序列直接作为自己克隆得依据。现在国际上公开发行得杂志一般都不登载整个基因序列,而要求作者在投稿之前将文章中所涉及得基因序列在基因库中注册，拟发表得文章中仅提供该基因在基因库中得注册号(acｃｅssion numｂer）,以便别人参考与查询。目前，世界上主要得基因库有１）EMBL,为设在欧洲分子生物学实验室得基因库，其网上地址为; （2)Genbank，为设在美国国家卫生研究院(ＮIＨ）得基因库，其网上地址为;（3)Swｉssport与TＲEMBＬ,Swissport就是一蛋白质序列库,其所含序列得准确度比较高,而TREMBＬ只含有从EＭBＬ库中翻译过来得序列。目前,以Geｎbａnk得应用最频繁。这些基因库就是相互联系得,在Genbank注册得基因序列,也可能在Swisspoｒt注册。要克隆某个基因可首先通过Inｔeｒnet查询一下该基因或相关基因就是否已经在基因库中注存。查询所有基因文库都就是免费得,因而极易将所感兴趣得基因从库中拿出来,根据整个基因序列设计特异得引物，通过PＣＲ从基因组中克隆该基因,也可以通过RＴ-PCＲ克隆cＤNA。值得注意得就是,由于物种与分离株之间得差异,为了保证PＣR扩增得准确性,有必要采用两步扩增法,即neｓted PCR。 根据蛋白质序列也可以将编码该蛋白质得基因扩增出来。在基因文库中注册得蛋白质序列都可以找到相应得ＤNA或cDNＡ序列。如蛋白质序列就是自己测定得，那么需要设计至少１对简并引物(dｅgｅneｒated ｐrimeｒ),从cDNA文库中克隆该基因。以这种方法克隆得基因必须做序列测定才能鉴别所扩增产物得特异性。 另外,在基因克隆之后，如还要进一步做表达研究，所使用得PCR酶最好不用Taq DNA聚合酶，而采用其她有自我检测（reading proｏf)功能得酶,如pfｕ。这样可以避免由于扩增过程中出现得点突变或终止密码子而导致整个研究结论得错误。 ２根据已知探针克隆基因 这也就是基因克隆得一种较直接得方法。首先将探针作放射性或非放射性标记,再将其与用不同内切酶处理得基因组DNＡ杂交,最后将所识别得片段从胶中切下来，克隆到特定得载体（质粒、噬菌体或病毒)中作序列测定或功能分析。这种方法不但可以将基因克隆出来,还能同时观察该基因在基因组中得拷贝数。
基因克隆的技术
基因克隆技术 摘要：基因克隆技术是分子生物学的核心技术，其目的是获得某一基因或DNA 片段的大量拷贝，用于深入分析基因的结构与功能，并可达到人为改造细胞以及物种遗传性状的目的。本论文主要从以下几个方面来介绍基因克隆技术：目的基因的获得、目的基因和载体的连接、重组分子的扩增和鉴定。 关键词：目的基因；限制性内切酶；克隆；重组分子 ABSTRACT：Gene cloning technology is the core of molecular biology technology, its purpose is obtain a gene or DNA fragments of the copy, used for in-depth analysis the structure and function of genes, and may achieve human cells and the transformation of the species genetics purpose.This thesis mainly from the following several aspects to introduce gene cloning technology: the purpose of the gene for the purpose, genes and carrier, restructuring of the molecules connected amplification and identification. Keywords：purpose gene;restriction endonuclease;clone;restructuring molecules 基因克隆是70年代发展起来的一项具有革命性的研究技术，可概括为∶分、切、连、转、选。“分”是指分离制备合格的待操作的DNA，包括作为运载体的DNA和欲克隆的目的DNA；“切”是指用序列特异的限制性内切酶切开载体DNA，或者切出目的基因；“连”是指用DNA连接酶将目的DNA同载体DNA连接起来，形成重组的DNA分子；“转”是指通过特殊的方法将重组的DNA分子送入宿主细胞中进行复制和扩增；“选”则是从宿主群体中挑选出携带有重组DNA分子的个体。基因克隆技术包括把来自不同生物的基因同有自主复制能力的载体DNA在体外人工连接，构建成新的重组DNA，然后送入受体生物中去表达，从而产生遗传物质和状态的转移和重新组合。 1. 目的基因的获得 目的基因是指所要研究或应用的基因，也就是将要克隆或表达的基因。获得目的基因是分子克隆过程中最重要的一步。基因工程流程的第一步就是获得目的DNA片段,。所需目的基因的来源, 不外乎是分离自然存在的基因或人工合成基因。常用的方法有PCR 法、化学合成法、cDNA法及建立基因文库的方法来筛选[1] 1.1 PCR方法
基因克隆的几种常见方法
基因克隆的几种常见方法 基因(gene)是遗传物质的最基本单位,也是所有生命活动的基础。不论要揭示某个基因的功能,还是要改变某个基因的功能,都必须首先将所要研究的基因克隆出来。特定基因的克隆是整个基因工程或分子生物学的起点。本文就基因克隆的几种常用方法介绍如下。 1 根据已知序列克隆基因 对已知序列的基因克隆是基因克隆方法中最为简便的一种。获取基因序列多从文献中查取,即将别人报道的基因序列直接作为自己克隆的依据。现在国际上公开发行的杂志一般都不登载整个基因序列,而要求作者在投稿之前将文章中所涉及的基因序列在基因库中注册,拟发表的文章中仅提供该基因在基因库中的注册号(accession number),以便别人参考和查询。目前,世界上主要的基因库有1)EMBL,为设在欧洲分子生物学实验室的基因库,其网上地址为 https://www.360docs.net/doc/fe2008333.html,/ebi-home.html;(2)Genbank,为设在美国国家卫生研究院(NIH)的基因库,其网上地址为 https://www.360docs.net/doc/fe2008333.html,/web/search/index.html;(3)Swissport和TREMBL,Swissport是一蛋白质序列库,其所含序列的准确度比较高,而TREMBL只含有从EMBL库中翻译过来的序列。目前,以Genbank的应用最频繁。这些基因库是相互联系的,在Genbank注册的基因序列,也可能在Swissport注册。要克隆某个基因可首先通过Internet查询一下该基因或相关基因是否已经在基因库中注存。查询所有基因文库都是免费的,因而极易将所感兴趣的基因从库中拿出来,根据整个基因序列设计特异的引物,通过PCR从基因组中克隆该基因，也可以通过RT-PCR克隆cDNA。值得注意的是,由于物种和分离株之间的差异,为了保证PCR 扩增的准确性,有必要采用两步扩增法,即nested PCR。 根据蛋白质序列也可以将编码该蛋白质的基因扩增出来。在基因文库中注册的蛋白质序列都可以找到相应的DNA或cDNA序列。如蛋白质序列是自己测定的,那么需要设计至少1对简并引物(degenerated primer),从cDNA文库中克隆该基因。以这种方法克隆的基因必须做序列测定才能鉴别所扩增产物的特异性。 另外,在基因克隆之后,如还要进一步做表达研究,所使用的PCR酶最好不用Taq DNA聚合酶,而采用其他有自我检测(reading proof)功能的酶,如pfu。这样可以避免由于扩增过程中出现的点突变或终止密码子而导致整个研究结论的错误。 2 根据已知探针克隆基因 这也是基因克隆的一种较直接的方法。首先将探针作放射性或非放射性标记,再将其与用不同内切酶处理的基因组DNA杂交,最后将所识别的片段从胶中切下来，克隆到特定的载体(质粒、噬菌体或病毒)中作序列测定或功能分析。这种方法不但可以将基因克隆出来,还能同时观察该基因在基因组中的拷贝数。但在探
DNA结构与复制中的相关计算的三种常用方法
DNA结构与复制中的相关计算的三种常用方法 一、特值法： 先按照碱基比例假设DNA片段中碱基总数为100或200等整百数，再根据碱基互补配对原则（A－T，C－G）图解分析求解。 例：一个DNA分子中，G和C之和占全部碱基数的46％，又知在该DNA分子的一条链中，A和C分别占碱基数的28％和22％，则该DNA分子的另一条链中A和C分别占碱基数的（）。 A．28％、22％B．22％、28％C．23％、27％D．26％、24％ 【解析】假设DNA每条链的碱基数为100，依题意得：（图略） ∵甲链: A=28, C=22,G+C=46, ∴甲中G=24, T=100-28-46=26。则乙中A=26，C=24。故选D。 练习：分析某生物的双链DNA，发现腺嘌呤与胸腺嘧啶之和占全部碱基的64％，其中一条链上的腺嘌呤占该链全部碱基的30％，则对应链中腺嘌呤占整个DNA分子碱基的比例是（） A．17％B．32％C．34％D．50％
二、首尾法： 根据DNA复制的过程与特点可以知道：一DNA分子复制n次后，将得到2n个DNA分子，其中保留原来母链的DNA 数目为2个。在处理与此相关的计算题过程中，我们只需要考虑开始和结尾的差异就可以顺利求解，笔者习惯于称之为首尾法。 例：假如一个DNA分子含有1000个碱基对（P元素只是32P）,将这个DNA分子放在只含31P的脱氧核苷酸的培养液中让其复制两次,则子代DNA分子的相对分子量平均比原来( )。 A.减少1500 B.增加1500 C. 增加1000 D.减少1000 【解析】每个碱基对应一个脱氧核苷酸，含1个磷酸基，即1个磷原子。复制两次后形成4个DNA分子，8条单链。其中两条含32P，6条含31P，因而相对分子量减少6000，4 个DNA平均减少1500。故选A。 练习：已知14N-DNA和15N-DNA的相对分子量分别为a和b。现让一杂合DNA分子在含14N的培养基上连续繁殖两代，则其子代DNA的平均相对分子量为（） A.(3a+b)/4 B.(a+3b)/4 C.(7a+b)/8 D.(a+7b)/8 三、公式法： 基于DNA的半保留复制，我们可以归纳出公式：X=m(2n-1)。
基因克隆步骤完整版
1总RNA提取 令狐采学 (1) 液氮研磨或冰上匀浆实验资料；先将1mlTrizol加到离心管中待用 (2) 将研磨好的样品加到离心管中混匀，室温放置5 min；掀开离心机预冷 (3) 加200 μL氯仿，振荡15 sec，室温放置3 min，分层； (4) 4oC，12,000g，离心15 min； (5) 取上清，加500 μL异丙醇，混匀，室温放置10 min； (6) 4oC，12,000g，离心10 min； (7) 弃上清，加1 mL75%乙醇，漂浮洗涤沉淀，振荡充分；再用100%乙醇清洗 (8) 4oC，7,500g，离心5 min； (9) 弃上清，离心，用枪吸取过剩液体，放在超净台里干燥后，加50 μL DEPC水，－80oC保管。 此操纵中所用到的器皿均需经过DEPC灭活RNA酶处理。提取的总RNA需经RNA电泳检测质量，并用紫外分光光度计测定浓度。OD260值为核酸的吸收值，OD280值为卵白的吸收值，OD260/280值在1.82.0间一般说明该核酸卵白含量在允许的规模内，可正常使用；另外还有OD230值为多糖和酚类的吸收值，比较干净的核酸OD260/230值能达到2.2左右。RNA浓度计算公式：总RNA 浓度
（μg/mL）=A260×稀释倍数×40。 2反转录/cDNA第一链的合成 纯化RNA以去除基因组DNA，操纵按TaKaRa公司的PrimeScript RT reagent with gDNA Eraser(Perfect Real Time)说明书进行。其体系为： Total RNA 1μg 5× gDNA Eraser Buffer 2μL gDNA Eraser 1μL RNase Free dH2O 补齐至10μL 条件为：42oC，2min； RNA纯化后，即可进行反转录。其体系为： 5×PrimeScript Buffer 2（for Real Time）4μL PrimeScript RT enzyme mix Ⅰ1μL RT Primer Mix 1μL 上一步的反响液10μL RNase Free dH2O 补齐至20μL 操纵条件为： (1) 37oC放置15 min； (2) 85oC，5 sec； (3) 4oC保管。 3 PCR 按TaKaRa公司的Premix Taq Version 2.0操纵，，PCR反响体系如下： Premix Taq 25μL 模板5μL